Politechnika Wrocławska Wydział Elektroniki Mikrosystemów i Fotoniki Autoreferat rozprawy doktorskiej Badania i właściwości czujników biochemicznych na bazie macierzy mikrodźwigni sprężystych Autor: Konrad Nieradka Promotor: prof. dr hab. inż. Teodor Gotszalk Wrocław 2016
1. Wprowadzenie, cel i teza pracy Czujniki mikrodźwigniowe zostały po raz pierwszy zaprezentowane w pierwszej połowie lat 90-tych XX wieku. Są pochodną prac nad technikami mikroskopii bliskich oddziaływań (ang. scanning probe microscopy, SPM). Ich zastosowanie jako pierwsi zaproponowali i zademonstrowali członkowie grup badawczych przy laboratorium IBM w Zurychu i Uniwersytecie w Bazylei[1]. Wykorzystali oni zjawiska dotychczas uważane za pasożytnicze, tj. dryf temperaturowy, tłumienie ośrodka, a także zmianę masy czujnika i generowanie naprężeń powierzchniowych pod wpływem sorpcji molekuł z otoczenia, do obserwacji przebiegu reakcji chemicznych. Już po kilku latach Hans-Peter Lang dokonał przeglądu szerokiego wachlarza zastosowań dla mikrodźwigni [2]. Przedstawia je Rysunek 1. Rysunek 1. Zastosowania czujników mikrodźwigniowych wg H.P. Langa [2]. Wyróżnia się dwa tryby pracy czujników mikrodźwigniowych tryb statyczny i dynamiczny. W trybie statycznym dokonuje się pomiaru zmiany statycznego ugięcia czujnika. Obie strony czujnika są tak sfunkcjonalizowane, aby reagować na bodźce otoczenia w odmienny sposób, prowadząc do wytworzenia różnicy naprężeń powierzchniowych, kompensowanych poprzez jego ugięcie (Rysunek 2). W trybie dynamicznym dokonuje się pomiaru różnych modów drgań rezonansowych czujnika (Rysunek 3). Związana z mikrodźwignią masa powoduje zmianę jej częstotliwości rezonansowej.
Rysunek 2. Reakcja warstwy receptorowej na obecność analitu i przetwarzanie powstałej różnicy naprężeń powierzchniowych na ugięcie mikrodźwigni. giętne skrętne z y giętne x podłużne Rysunek 3. Podstawowe rodzaje drgań belki jednostronnie zamocowanej o przekroju prostokątnym. Wyjątkowe właściwości i potencjalnie szerokie zastosowania czujników mikrodźwigniowych sprawiły, że postanowiono poświęcić im podprojekt Zastosowanie matryc czujników mikromechanicznych do detekcji bakterii Gramujemnych i ich endotoksyn projektu Mikro- i Nanosystemy w Chemii i Diagnostyce Biomedycznej (MNS-DIAG), Nr POIG.01.03.01-00-014/08. Projekt był realizowany w latach 2009-2012 w ramach ogólnopolskiego konsorcjum placówek badawczych i naukowych, przy udziale autora rozprawy. Autor niniejszej rozprawy postanowił dowieść słuszności tezy: Możliwa jest detekcja endotoksyn bakterii Gram-ujemnych za pomocą sfunkcjonalizowanych macierzy mikrodźwigni sprężystych z optyczną detekcją wychylenia czujnika. Jako etapy dowodzenia słuszności tezy autor wyszczególnił następujące zadania: skonstruowanie platformy pomiarowej dla rozwijanych czujników, zademonstrowanie działania mikrodźwigni jako czujnika wielkości fizycznych i chemicznych,
opracowanie procedury funkcjonalizacji macierzy czujników dla detekcji endotoksyn, zademonstrowanie detekcji endotoksyn. Wszystkie postawione zadania zostały pomyślnie zrealizowane, a tezę potwierdziły wyniki przeprowadzonych badań, opublikowane w licznych czasopismach naukowych z listy filadelfijskiej. 2. System pomiarowy czujników mikrodźwigniowych Jednym z założeń w pracy autora było wykorzystanie optycznej metody detekcji wychylenia czujnika metodę ugięcia wiązki optycznej, OBD (ang. optical beam deflection). Metoda polega na obiciu od powierzchni mikrodźwigni zogniskowanej wiązki świetlnej i skierowaniu jej na fotodetektor. Uginanie się bądź skręcanie mikrodźwigni powoduje zmianę kąta padania, a więc i kąta odbicia wiązki, która w rezultacie przesuwa się po powierzchni detektora. Porównanie fotoprądów detektora pozwala odtworzyć zmiany orientacji powierzchni mikrodźwigni. Metoda ta zapewnia brak kontaktu elektrycznego do mierzonego medium, ułatwiając pomiary w środowisku cieczowym. Znacznie upraszcza też konstrukcję samych czujników, zmniejszając koszt ich produkcji i upraszczając ich integrację z systemem pomiarowym. Jednocześnie metoda OBD charakteryzuje się bardzo wysoką czułością, porównywalną z metodą interferometryczną [3]. Wyzwaniem dla autora było takie zmodyfikowanie metody, aby umożliwiała pomiar wielu czujników jednocześnie. Problem ten rozwiązany został rozwiązany poprzez wprowadzenie do optyki formującej wiązkę świetlną astygmatyzmu. Zamiast pojedynczej soczewki sferycznej, ogniskującej wiązkę, wprowadzono dwie ortogonalnie do siebie ustawione soczewki cylindryczne. Uformowana przez nie wiązka ma dwa osobne ogniska w dwóch prostopadłych do siebie osiach. Rozwiązanie to przedstawia Rysunek 4.
Płaszczyzna Wiązki Odbitej Płaszczyzna Wiązki Padającej a) Optyka Sferyczna b) Optyka Cylindryczna Przód (XZ) Soczewka Kolimatora Bok (YZ) Przód (XZ) Soczewka Kolimatora Bok (YZ) Soczewka Sferyczna Soczewki Cylindryczne Ognisko Ognisko w Osi X i Y Ognisko w Osi Y w Osi X X Y X Y Macierz mikrodźwigni Macierz mikrodźwigni Płaszczyzna detekcji Płaszczyzna detekcji Z Z Z Z Rysunek 4. Metoda EBD na przykładzie macierzy 2-dźwigniowej [4] a) optyka sferyczna (nieostra), b) optyka cylindryczna (astygmatyczna). Po odbiciu tak uformowanej wiązki od powierzchni macierzy mikrodźwigniowej powstaje seria wiązek odbitych, niosących indywidualną informację o ruchu każdego z czujników. Umożliwia to w pełni jednoczesny pomiar wielu czujników w kompaktowym systemie odczytowym, z zachowaniem wszystkich zalet klasycznej metody OBD. Nowa metoda została przez autora nazwana metodą ugięcia rozszerzonej wiązki, EBD (ang. expanded beam deflection) [4]. Do pomiaru częstotliwości rezonansowej czujników autor zaproponował nową metodę ekstrakcję krzywych rezonansowych z szumu termicznego mikrodźwigni w czasie rzeczywistym [5]. Metoda polega na pobieraniu kolejnych próbek sygnału szumu, transformacji do dziedziny częstotliwości, uśrednianiu kolejnych otrzymanych widm, celem poprawy ich jakości, i dopasowania do wybranych pików rezonansowych krzywych Lorentza za pomocą algorytmu Levenberga Marquardta (L-M). Parametry dopasowanych krzywych dostarczają informacji o częstotliwości rezonansowej drgań i tłumieniu ośrodka, a pośrednio o zmianie związanej na czujniku masy. Kilka etapów uśredniania widma szumowego mikrodźwigni przedstawia Rysunek 5.
Rysunek 5. Etapy uśredniania widm szumowych mikrodźwigni. Metodę EBD zaimplementowano w zmodyfikowanej głowicy optycznej mikroskopu bliskich oddziaływań, wykonanej w Zakładzie Metrologii Mikro i Nanostruktur Politechniki Wrocławskiej. Zaprojektowana została dedykowana elektronika odczytowa dla detektorów położenia plamki oraz stworzone dedykowane oprogramowanie kontrolno-pomiarowe w środowisku LabVIEW, realizujące algorytm ekstrakcji modów drgań z szumu termicznego. Gotowy system pomiarowy przedstawia Rysunek 6. a) Układ Arytmetyczny Moduł Lasera b) Optyka EBD Przetworniki I/U Fotodetektor Celka Przepływowa Laser Celka Przepływowa Próbka Macierz Pompa Mikrodźwigniowa Fotodetektor I/U UA A/C PC Rysunek 6. Moduły systemu pomiarowego MCAS. System pomiarowy pozwala wykorzystywać dwa rodzaje detektorów położenia plamki. Pierwszy detektor to macierz detektorów typu LE-PSD (ang. lateral effect position sensitive detector). Składa się ona z 16 detektorów mierzących przesunięcie plamki w jednej osi. Każdy detektor cechuje liniowa funkcja przetwarzania, pozwalająca w prosty sposób wyznaczyć wartość wychylenia wiązki. Drugim typem detektora jest detektor wielosekcyjny, podobny do tych, stosowanych w mikroskopach sił atomowych. Stanowi go macierz 16 fotodiod na wspólnym podłożu, wyprodukowana w Instytucie Technologii Elektronowej w
Warszawie. Cechuje go silna nieliniowość, ale znacznie większa czułość, niż detektor typu LE-PSD. Oba detektory przedstawia Rysunek 7. a) b) Rysunek 7. Detektory położenia plamki a) macierz detektorów LE-PSD (SiTek Electro Optics), b) detektor wielosekcyjny 2 8 (ITE). W ramach pracy doktorskiej zaprojektowano i przetestowano całą rodzinę celek przepływowych. Ostateczną wersją, użytą w większości prezentowanych pomiarów, były dwie celki: BioCell i UniCell. Celka BioCell cechuje się zminimalizowaną objętością roboczą, uproszczoną procedurą instalowania czujnika i przeznaczona jest do zastosowań biochemicznych. Celka UniCell to celka wszechstronna, wzbogacona o elektrody, umożliwiające połączenie pomiarów mikromechanicznych z metodami elektrochemicznymi. Obie celki wykonano z biokompatybilnego materiału polietereteroketonu, ang. polyether ether ketone, PEEK). Pozbawione są one elektrycznego kontaktu do mierzonego medium (poza elektrodami) i umożliwiają pomiary zarówno w ośrodku gazowym, jak i cieczowym. a) b) Rysunek 8. Celki przepływowe systemu MCAS a) celka biochemiczna BioCell, b) celka uniwersalna UniCell. Działanie celki potwierdzone zostało przeprowadzeniem licznych eksperymentów na mikrodźwigniach, między innymi obserwacji tworzenia samoorganizujących się warstw molekularnych - Rysunek 9.
Rysunek 9. Wiązanie cząsteczek CEA do złotej powierzchni mikrodźwigni (a) i powiększenie początkowego etapu reakcji (b). 3. Procedura funkcjonalizacji macierzy czujników Odpowiednie warstwy sensorowe są niezbędne do zapewnienia czujnikowi czułości i selektywności. Warstwy pasywne na dźwigniach aktywnych i referencyjnych pozwalają za to zwiększyć selektywność i uniezależnić pracę czujnika od sygnałów wspólnych, takich jak zmiany temperatury czy ph ośrodka. Zadaniem autora było zidentyfikowanie substancji, pozwalających efektywnie wiązać lub blokować białka na powierzchni złota i tlenku krzemu oraz opracowanie procedur ich osadzania na dźwigniach. Badania w tym zakresie przeprowadzono we współpracy z grupą dr. Jacka Rybki z Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk. W tym celu przeprowadzono serię eksperymentów, których wynik weryfikowano metodą kolorymetrii. Metoda ta polega na potraktowaniu próbek roztworem zawierającym cząsteczkę (w tym przepadku białko Sav streptoawidynę) z przyłączonym enzymem (w tym przypadku HRP peroksydazą chrzanową). Po trwającej przez ściśle określony czas ekspozycji próbki przepłukuje się buforem, a następnie poddaje działaniu roztworu zawierającemu substrat 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę (TMB). Pod wpływem pozostałego na próbkach, zimmobilizowanego enzymu i w obecności nadtlenku wodoru substrat barwi roztwór. Po określonym czasie reakcję barwienia przerywa się poprzez podanie 1 M kwasu siarkowego (H 2 SO 4 ). Stężenie barwnika mierzy się za pomocą spektrofotometru, wyznaczając względną zawartość oznaczanej substancji z różnicy absorbancji dla dwóch długości fali światła (450 nm i 570 nm). Im wyższy wynikowy sygnał, tym wyższa zawartość oznaczanej substancji. Tabela 1 i Rysunek 10 przedstawiają odpowiednio, etapy proponowanych procedur funkcjonalizacji powierzchni tlenku krzemu do immobilizacji i blokowania białek oraz wyniki badań kolorymetrycznych. W pierwszym etapie na powierzchni tlenku krzemu wytwarzano warstwę samoorganizującą się z roztworu (3-aminopropylo)trietoksysilanu (APTES) lub (n-oktylo)trietoksysilanu (OTES) w etanolu. W drugim etapie do warstwy APTES przyłączano cząsteczki mpeg-nhs lub aldehydu glutarowego (GA). W ostatnim
etapie jednego zestaw powierzchni APTES-GA potraktowano roztworem surowiczej albuminy wołowej (BSA). Jeden zestaw powierzchni pozostawiono niezmodyfikowany. Tabela 1.Procedura funkcjonalizacji powierzchni tlenku krzemu do immobilizacji i blokowania białek. Zestaw Etap 1 Etap 2 Etap 3 1 APTES mpeg-nhs - 2 APTES GA - 3 APTES GA BSA 4 OTES - - 5 - - - Najsilniej cząsteczki białka adsorbowała czysta powierzchnia krzemu, co można wytłumaczyć siłami van der Waalsa. Niemal równie dobrze im mobilizował białka aldehyd glutarowy na warstwie APTES. Hydrofilowe warstwy mpeg na warstwie APTES wykazywały natomiast bardzo dobre właściwości blokujące białka. Warstwy OTES wykazywały właściwości pośrednie. Rysunek 10. Wyniki badania metodą kolorymetrii adsorpcji białek do powierzchni SiO2 oraz wytworzonych na niej warstw wiążących lub blokujących. Tabela 2 i Rysunek 11 przedstawiają odpowiednio, etapy proponowanych procedur funkcjonalizacji powierzchni złota do blokowania białek oraz wyniki ich weryfikacji metodą kolorymetrii. W oparciu o doświadczenia z tlenkiem krzemu skupiono się na warstwach hydrofilowych, głównie glikolach polietylenowych (mpeg). Na jednym zestawie wytworzono warstwę hydrofilowego merkaptoetanolu (ME). Na czterech zestawach powierzchni wytworzono warstwy tiolu glikolu metoksypolietylenowego (mpeg-sh)
o długich łańcuchach w postaci czystej i trzech rozcieńczeniach cząsteczkami ME. Na jednym zestawie wytworzono najpierw warstwę cysteaminy (CEA), do której przyłączono cząsteczki mpeg o krótkich łańcuchach. Jeden zestaw pozostawiono niezmodyfikowany. Tabela 2.Procedura funkcjonalizacji powierzchni złota do blokowania białek. Zestaw Etap 1 Etap 2 1 - mpeg-sh 2 - mpeg-sh / ME 1:10 3 - mpeg-sh / ME 1:50 4 - mpeg-sh / ME 1:100 5 - ME 6 CEA mpeg-nhs 7 - - Niesfunkcjonalizowana powierzchnia złota okazała się niespecyficznie adsorbować badane białka. Silną adsorpcję wykazywała także powierzchnia ME. Zarówno krótkie łańcuchy mpeg dołączone do warstwy CEA, jak i silnie rozcieńczone (w stosunku 1:50 i 1:100) długie łańcuchy mpeg wiązane bezpośrednio do złota wykazywały słabe właściwości blokujące w porównaniu z niemodyfikowaną powierzchnią złota. Natomiast czyste warstwy mpeg-sh i te rozcieńczone w stosunku 1:10 wykazywały bardzo dobre właściwości blokujące białka.
Rysunek 11. Wyniki badania metodą kolorymetrii adsorpcji białek do wytworzonych na powierzchni Au warstw blokujących. Tabela 3 i Rysunek 12 pokazują odpowiednio, kolejne etapy proponowanych procedur funkcjonalizacji powierzchni złota do wiązania cząsteczek białka i wyniki ich weryfikacji metodą kolorymetrii. Wszystkie zestawy powierzchni zostały pokryte warstwami samoorganizującymi się kwasu 11-merkaptoundekanowego (MUA), rozcieńczonego w różnych proporcjach cząsteczkami merkaptoetanolu (ME), merkaptoheksanolu (MH) i 1-undekantiolu (UDT). W kolejnym etapie grupy karboksylowe MUA zostały aktywowane za pomocą mieszaniny EDC/NHS (1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu i N-hydroksybursztynyloimidu). Tabela 3.Procedura funkcjonalizacji powierzchni złota do wiązania białek. Zestaw Etap 1 Etap 2 1 MUA / ME 1:5 EDC / NHS 2 MUA / ME 1:20 EDC / NHS 3 MUA / MH 1:5 EDC / NHS 4 MUA / MH 1:20 EDC / NHS 5 MUA / UDT 1:5 EDC / NHS 6 MUA / UDT 1:20 EDC / NHS Czysta warstwa MUA okazała się być bardzo mało efektywna w wiązaniu białek, dając najmniejszy z zarejestrowanych sygnałów. Warstwy rozcieńczone krótkimi (ME) i średniej długości (MH) łańcuchami alkilowymi wykazywały nieco lepsze właściwości wiążące, bez
wyraźnych różnic między sobą. Najlepszy rezultat osiągnięto w przypadku warstw rozcieńczonych długimi (UDT) łańcuchami alkilowymi, o liczbie atomów węgla równej tej w wiążącej cząsteczce MUA (11 atomów). Rysunek 12. Wyniki badania metodą kolorymetrii adsorpcji białek do wytworzonych na powierzchni Au warstw wiążących. 4. Detekcja endotoksyn W oparciu o opracowane procedury funkcjonalizacji powierzchni złota i tlenku krzemu opracowano macierz mikrodźwigni, w której na dwóch czujnikach zimmobilizowano przeciwciała na endotoksyny dwóch różnych szczepów bakterii Gram-ujemnych, a trzecią wyblokowano. Odpowiedź macierzy mikrodźwigniowej na podanie roztworu endotoksyn endotoksyny Hafnia alvei szczepu 1185 przedstawia Rysunek 13. Zgodnie z oczekiwaniem, reaguje jedynie czujnik czuły na badaną endotoksynę. Rysunek 13. Detekcja endotoksyn bakterii Hafnia alvei szczepu 1185[6].
W przypadku szczepu 1186 zaobserwowano nieprawidłową reakcję obydwu czujników, co przedstawia Rysunek 14. Przeprowadzona weryfikacja wyników metodą ELISA wykazała, że w użytym przez autora buforze endotoksyna szczepu 1186 wiąże się niespecyficznie z przeciwciałem na szczep 1185. Tym samym, wynik standardowego testu ELISA został przewidziany przez wynik pomiaru czujnikiem mikrodźwigniowych. Rysunek 14. Detekcja endotoksyn bakterii Hafnia alvei szczepu 1186 [6]. 5. Podsumowanie Prace zrealizowane w ramach rozprawy zaowocowały powstaniem szerokiego studium na temat czujników mikrodźwigniowych, ze szczególnym nastawieniem na macierze mikrodźwigniowych czujników chemicznych i biochemicznych. W oparciu o opracowaną nową metodę pomiaru ruchu mikrodźwigni, nowatorskie konstrukcje detektorów położenia plamki i celek pomiarowych, skonstruowano działający system pomiarowy. Przeprowadzone badania dowiodły możliwości zastosowania czujników mikromechanicznych do detekcji i rozpoznawania bakterii Gram-ujemnych. Do najważniejszych osiągnięć uzyskanych w trakcie realizacji rozprawy należy zaliczyć: 1. Opracowanie nowatorskiej metody pomiaru ruchu wielu mikrodźwigni za pomocą pojedynczej i stacjonarnej wiązki światła. 2. Opracowanie nowatorskiej metody ekstrakcji modów drgań z szumu termicznego mikrodźwigni. 3. Skonstruowanie systemu wszechstronnego pomiarowego, wykorzystującego powyższe wynalazki. 4. Opracowanie procedury funkcjonalizacji macierzy czujników, uwzględniającej tworzenie powierzchni blokujących i wiążących cząsteczki białka. 5. Zademonstrowanie detekcji endotoksyn bakterii Gram-ujemnych za pomocą mikrodźwigni sprężystej. 6. Zademonstrowanie rozpoznawania szczepu bakterii Gram-ujemnych tego samego gatunku za pomocą mikrodźwigni sprężystej.
W opinii autora, zaprezentowane wyniki i osiągnięcia spełniają wszystkie postawione przez autora cele i dowodzą postawionej tezy o możliwości wykrywania endotoksyn bakterii Gram-ujemnych za pomocą sfunkcjonalizowanych macierzy mikrodźwigni sprężystych z optyczną detekcją wychylenia czujnika.
Literatura [1] J.K. Gimzewski, Ch. Gerber, E. Meyer, R.R. Schlittler, Observation of a chemical reaction using a micromechanical sensor, Chemical Physics Letters 217:589 594, 1994. [2] H.P. Lang, M.K. Baller, R. Berger, Ch. Gerber, J.K. Gimzewski, F.M. Battiston, P. Fornaro, J.P. Ramseyer, E. Meyer, H.J. Güntherodt, An artificial nose based on a micromechanical cantilever array, AnalyticaChimicaActa 393:59 65, 1999 [3] C.A.J. Putman, B.G. De Grooth, N.F. Van Hulst, J. Greve, A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy, Journal of Applied Physics 72:6-12, 1992. [4] K. Nieradka, G. Małozięć, D. Kopiec, P. Grabiec, P. Janus, A. Sierakowski, T. Gotszalk, Expanded beam deflection method for simultaneous measurement of displacement and vibrations of multiple microcantilevers, Review of Scientific Instruments 82:105112, 2011. [5] K. Nieradka, T. Gotszalk, G. Schroeder, A novel method for simultaneous readout of static bending and multimode resonance-frequency of microcantilever-based biochemical sensors, Sensors and Actuators B: Chemical 170:172-175, 2012 [6] K. Nieradka, K. Kapczyńska, J. Rybka, T. Lipiński, P. Grabiec, M. Skowicki, T. Gotszalk, Microcantilever array biosensors for detection and recognition of Gram-negative bacterial endotoxins, Sensors and Actuators B: Chemical 198:114 124, 2014.