Ocena potencjału oczyszczalni hydrofitowej do biotransformacji i usuwania modelowych substancji farmaceutycznych

POLITECHNIKA ŚLĄSKA WYDZIAŁ INŻYNIERII ŚRODOWISKA I ENERGETYKI KATEDRA BIOTECHNOLOGII ŚRODOWISKOWEJ Ocena potencjału oczyszczalni hydrofitowej do biotransformacji i usuwania modelowych substancji farmaceutycznych mgr inż. Monika Nowrotek Promotor: prof. dr hab. inż. Korneliusz Miksch Promotor pomocniczy: dr inż. Adam Sochacki GLIWICE, 2018

Spis treści I Wprowadzenie... 3 I.1 Substancje farmaceutyczne w środowisku... 3 I.2 Diklofenak (DCF) i sulfametoksazol (SMX) jako modelowe substancje farmaceutyczne występujące w środowisku wodnym... 4 I.3 Pośrednie produkty transformacji farmaceutyków jako potencjalne zagrożenie dla środowiska naturalnego... 7 I.4 Zastosowanie oczyszczalni hydrofitowych do usuwania substancji farmaceutycznych ze ścieków... 9 II Teza badawcza, cel i zakres pracy... 12 III Metodyka badań... 12 IV Wyniki i ich podsumowanie... 14 V Wnioski... 17 VII Literatura... 20 2

I Wprowadzenie I.1 Substancje farmaceutyczne w środowisku Intensywny rozwój przemysłu farmaceutycznego, ciągły wzrost zużycia leków, a potem ich wydalanie przez człowieka i zwierzęta, a także ich niecałkowite usunięcie w konwencjonalnych oczyszczalniach sprzyja przedostawaniu się tych substancji do wód powierzchniowych, gruntowych, czy nawet wody pitnej. Związki farmaceutyczne pojawiają się w środowisku przyrodniczym głównie wraz z wprowadzanymi tam oczyszczonymi ściekami, co może dowodzić także niedoskonałości obecnie stosowanych systemów oczyszczania ścieków i uzdatniania wód. Ze względu na specyfikę farmaceutyków, które zaprojektowane zostały tak, by wywoływać efekty farmakologiczne w organizmach żywych substancje te mogą wywierać również negatywny wpływ na ekosystemy wodne i lądowe. W ostatnich latach zaobserwowano znaczny wzrost zainteresowania obecnością substancji farmaceutycznych w środowisku, na co może wskazywać rosnąca liczba publikacji naukowych poświęconych tej tematyce. Niemniej jednak, wciąż trudno jest określić długoterminowy wpływ farmaceutyków na zdrowie, biorąc pod uwagę obecność tych związków w wodzie pitnej. Obecność substancji farmaceutycznych w wodzie w często śladowych stężeniach w zakresie od ng/l do kilku µg/l, jak również w niższych, rzędu pg/l, klasyfikuje te związki jako mikrozanieczyszczenia [1-8]. Wśród negatywnych skutków wpływu związków farmaceutycznych na ekosystemy wodne wymienia się feminizację ryb [2], uszkodzenie narządów wewnętrznych u ryb [4, 5], nabycie odporności na patogeny [7], czy zmniejszenie różnorodności planktonu [3]. Negatywny wpływ substancji farmaceutycznych na zdrowie ludzkie, stwierdzono między innymi w przypadku długotrwałej ekspozycji na diklofenak [4]. Również mieszanina różnych substancji farmaceutycznych (atenolol, karbamazepina, cyprofloksacyna, furosemid, ibuprofen sulfametoksazol) może wykazywać negatywny wpływ na proliferację ludzkich komórek embrionalnych [6]. Pierwsze informacje dotyczące obecności substancji farmaceutycznych w środowisku pojawiły się w Stanach Zjednoczonych w połowie lat 70. W przebadanych ściekach oczyszczonych wykazano obecność kofeiny i kwasu salicylowego [9]. W wykonanych w latach 1999-2000 przez agencję U.S. Geological Survey analizach 3

wykazano, że najczęściej występującymi farmaceutykami w wodach powierzchniowych są niesteroidowe leki przeciwzapalne, hormony oraz antybiotyki [10]. Farmaceutki najpowszechniej występujące w środowisku to [11]: substancje z grupy niesteroidowych leków przeciwzapalnych: naproksen, diklofenak, ibuprofen, kwas acetylosalicylowy, ibuprofen, substancje z grupy leków regulujących gospodarkę lipidową: bezafibrat, kwas klofibrowy, substancje z grupy środków hormonalnych: estron (E1), estradiol (E2), etinyloestradiol (EE2), substancje z grupy β-blokerów: metoprolol, atenolol, propanolol, substancje z grupy leków psychotropowych: karbamazepina, fluoksetyna, substancje z grupy antybiotyków: erytromycyna, trimetoprim, sulfametoksazol. Spośród wymienionych związków, diklofenak (DCF) oraz sulfametoksazol (SMX) są jednymi z najczęściej występujących związków w środowisku wodnym (zarówno w wodach powierzchniowych, gruntowych czy w odpływach z oczyszczalni ścieków) [12, 13]. Zarówno SMX oraz DCF zostały zakwalifikowane przez międzynarodową organizację The Global Water Research Coalition w 1 klasie jako substancje priorytetowe obecne w środowisku wodnym i zagrażające jego stabilności [14]. I.2 Diklofenak (DCF) i sulfametoksazol (SMX) jako modelowe substancje farmaceutyczne występujące w środowisku wodnym Powszechne występowanie substancji farmaceutycznych w środowisku dotyczy zwłaszcza niesteroidowych leków przeciwzapalnych i przeciwbólowych takich jak diklofenak, ibuprofen, kwas mefenamowy i naproksen Związki te, często w niezmienionej formie, obecne są w różnych częściach środowiska w niskich stężeniach (rzędu ng/l), aż do stężeń na poziomie od kilku do kilkunastu mg/l [15, 16] Substancje te często występują w lekach powszechnie dostępnych, często bez recepty, co zwiększa ich globalną konsumpcję i tym samym częstość występowania w środowisku naturalnym. Jednym z najczęściej stosowanych na świecie leków przeciwbólowych jest diklofenak (DCF) [17]. Nazwa diklofenak pochodzi od nazwy chemicznej związku: kwas 2-(2,6-4

dichloranilino)fenylooctowy. Produkcję tego związku rozpoczęto w 1973 roku w szwajcarskiej firmie Ciba-Geigy, obecnie należącą do koncernu Novartis. Ze względu na mnogość środków w których występuje DCF, a także częste stosowanie tego związku w weterynarii, trudno oszacować jego globalne zużycie. Niemniej jednak, ocenia się, że roczna konsumpcja DCF na całym świecie może wynosić nawet 940 ton [18]. W raporcie przygotowanym w 2012 roku przez firmę Fierce Pharma DCF został wymieniony na 12 miejscu w zestawieniu przedstawiającym ranking popularności zastosowania substancji farmaceutycznych wśród ludzi. W 2011 roku sprzedaż DCF osiągnęła wartość ok 1,61 miliarda dolarów [19]. Analizując dotychczasowe zużycie DCF na świecie, szacuje się, że roczna konsumpcja tego związku może niebawem przekroczyć 1000 ton rocznie. Ponadto, najnowsze raporty wskazują na istotny wzrost stosowania, a tym samym sprzedaży DCF na rynkach wschodzących, takich jak: Indie, Chiny czy Brazylia, gdzie spożycie tego związku w różnych postaciach osiąga wartości około 60 ton w skali rocznej [20]. Oszacowane spożycie DCF nie obejmuje znacznej zapewne ilości stosowania tego związku w weterynarii ze względu na brak danych, może zatem okazać się, że konsumpcja DCF na świecie jest znacznie wyższa. Spośród krajów europejskich, największe spożycie DCF stwierdzono w Niemczech 86 ton w ciągu roku [21], w Austrii 6,14 ton rocznie [22], natomiast we Francji 16 ton rocznie [23]. Ocenia się, że całkowite spożycie DCF w Europie wynosi 179,8 ton rocznie [23]. Dokładne zużycie DCF w Ameryce Północnej nie jest znane, jednak szacuje się, że w Stanach Zjednoczonych średnie zużycie wzrasta średnio o 5-6% w ciągu roku, natomiast w Kanadzie o 17% [24]. O istotność problemu obecności substancji farmaceutycznych w środowisku mogą świadczyć decyzje podejmowane na arenie międzynarodowej. Przykładem może być zatwierdzony przez Parlament Europejski w ramach Dyrektywy 2013/39/UE wykaz substancji priorytetowych i priorytetowo niebezpiecznych w dziedzinie polityki wodnej. W ramach Dyrektywy 2013/39/UE rozszerzono liczący wcześniej 39 do 45 wykaz substancji, dla których ustanowione zostały środowiskowe standardy jakości obowiązujące na terenie wszystkich państw Unii Europejskiej. Środowiskowe standardy jakości (z ang. environmental quality standards EQS) to pojęcie stosowane do określenia stężenia danej substancji w środowisku wodnym, które nie może zostać przekroczone. 5

W 2015 roku w ramach Dyrektywy 2013/39/UE Komisja Europejska ustanowiła listę obserwacyjną (z ang. watch list), gdzie wymienione zostały substancje, które stanowią potencjalne zagrożenie dla środowiska wodnego i organizmów tam występujących. Na liście obserwacyjnej znalazło się 10 nowych substancji na przykład DCF, bądź grup substancji, takich jak: wybrane antybiotyki makrolidowe oraz estrogeny (naturalne bądź syntetyczne). Decyzja Komisji Europejskiej zobowiązuje wszystkie państwa członkowskie do monitorowania substancji znajdujących się na liście obserwacyjnej przez okres co najmniej 12 miesięcy w wybranych stacjach monitorujących [25, 26]. Spośród różnych klas związków farmaceutycznych, antybiotyki mają szczególne znaczenie ze względu na szerokie zastosowanie tych substancji w leczeniu ludzi czy w weterynarii. Szacuje się, że roczne spożycie antybiotyków na świecie mieści się w granicach od 100 000 do 200 000 ton. Ze względu na wydalanie z organizmu (często w niezmienionej formie), do 90% spożytej dawki antybiotyku, związki te często występują w stężeniach rzędu miligram na litr w ściekach surowych dopływających do oczyszczalni ścieków [27]. Należący do grupy sulfonamidów, sulfametoksazol (SMX), czyli 4-amino-N-(5-metylo-1,2-odsazol-3-ilo)benzenosulfonamid to syntetyczny antybiotyk szeroko stosowany jako lek bakteriostatyczny (nie prowadzący do śmierci bakterii, a jedynie zatrzymujący ich rozwój), jednocześnie będący jednym z najczęściej stosowanych antybiotyków zarówno wśród ludzi, jak również w weterynarii ze względu na niski koszt produkcji, szerokie spektrum działania i stosunkowo niewielką toksyczność [28]. Działanie SMX polega na hamowaniu wytwarzania w komórkach bakteryjnych kwasu dihydrofoliowego, niezbędnego do prawidłowego funkcjonowania bakterii [29]. Związek ten, ze względu na szerokie i częste zastosowanie, jest także jednym z najczęściej wykrywanych antybiotyków w środowisku wodnym, często w stężeniu przekraczającym wartość miligramów na litr. Obecność tego związku została również stwierdzona w wodzie pitnej, w stężeniu na poziomie nanogramów na litr [30-32]. Ocenia się, że około 45-70% przyjętego doustnie przez człowieka sulfametoksazolu, może być wydalana w niezmienionej postaci po 24 godzinach [33]. Obecność SMX w środowisku może stanowić zagrożenie dla roślin wodnych, zwierząt, mikroorganizmów, negatywnie wpływając na ogólną biocenozę bakteryjną ekosystemów wodnych i lądowych [34-38]. Obecność w środowisku antybiotyków może indukować 6

oporność na te związki u bakterii poprzez zachodzącą presję selekcyjną, mutacje genomowe, albo horyzontalny transfer genów. Zjawisko horyzontalnego transferu genów jest głównym czynnikiem nabywania i rozprzestrzeniania się genów oporności na antybiotyki, polega na wymianie bądź przyswajaniu z środowiska bądź innych komórek mobilnych elementów genetycznych takich jak plazmidy, transpozony, bakteriofagi. Istotną rolę nabywaniu i rozpowszechnianiu oporności na antybiotyki u bakterii odgrywają również integrony [39-41]. Oporność bakterii na sulfonamidy jest związana z genami sul1, sul2 oraz sul3. Co więcej, geny sul1 oraz sul2, a także gen inti1 (związane z integronami) są jednymi z najczęściej występujących genów w środowisku. Postuluje się, aby wspomniane determinanty genetyczne zostały wskaźnikami oceny statusu antybiotykooporności w środowisku [42]. Wobec globalnego zagrożenia związanego z rozprzestrzenianiem się oporności na antybiotyki nie pozostają obojętne europejskie i światowe instytucje zdrowia publicznego. W polskiej legislacji na istotność problemu walki z antybiotykoopornością zwraca się uwagę w ustawie o zwalczaniu zakażeń i chorób zakaźnych u ludzi, jak również w rozporządzeniu w sprawie listy czynników alarmowych, rejestrów zakażeń szpitalnych oraz czynników alarmowych i raportów o bieżącej sytuacji epidemiologicznej szpitala [43-45]. Wymienione dokumenty regulują obowiązki związane z organizacją działań epidemiologicznych, a także wymieniają listę patogenów alarmowych, które podlegają raportowaniu i rejestracji. W obecnej ustawie o zdrowiu publicznym uzupełniono wykaz zakażeń i chorób zakaźnych o zakażenia czynnikami chorobotwórczymi opornymi na antybiotyki, podkreślając znaczenie tego problemu [43-45]. I.3 Pośrednie produkty transformacji farmaceutyków jako potencjalne zagrożenie dla środowiska naturalnego Poza substancjami farmaceutycznymi, w środowisku często występują również pośrednie produkty transformacji tych związków. W środowisku mogą występować pośrednie produkty transformacji pochodzenia ludzkiego (czyli takie, które powstały w wyniku niekompletnego rozkładu związku w organizmie ludzkim), bądź takie, które powstały już w środowisku, w wyniku oddziaływania np. światła słonecznego, bądź przemian zachodzących w oczyszczalniach ścieków. Częstokroć pośrednie produkty transformacji danych związków farmaceutycznych mogą wykazywać większą toksyczność 7

względem innych organizmów niż związki, z których powstały. Dodatkowo, na podstawie obecności danych produktów transformacji można wnioskować o procesach biotycznych bądź abiotycznych biorących udział w przemianie związków podstawowych. Ze względu na trudności analityczne oraz brak dostępnych standardów analitycznych, wiedza na temat obecności i struktury pośrednich produktów transformacji substancji farmaceutycznych obecnych w środowisku jest wciąż ograniczona, stąd należy nadal prowadzić badania w tym zakresie, jednocześnie określając potencjalną toksyczność tych związków względem środowiska naturalnego [46, 47]. W przypadku DCF z zalecanej przez Światową Organizację Zdrowia dziennej dawki leku wynoszącej 100 mg, mniej niż 1% jest wydalana w niezmienionej postaci, natomiast około 11 mg jest wydalane jako produkty transformacji DCF. Główne metabolity DCF wydalane przez człowieka to formy hydroksylowane, takie jak: 4 -hydroksydiklofenak, 5 - hydroksydiklofenak, 3 hydroksydiklofenak i 4,5-dihydroksydiklofenak [48, 49]. W środowisku naturalnym, DCF degradowany jest głównie przy udziale światła słonecznego. Zidentyfikowane główne produkty transformacji DCF w procesie fotodegradacji to 2-chloro oraz 2,6-dichlorodifenyloamina, a także 8-hydroksy i 8- chlorokarbazolowe pochodne DCF [50, 51]. W przeprowadzonych dotychczas badaniach wykazano znaczny wzrost toksyczności metabolitów DCF względem podstawowego związku [52, 53]. Sulfametoksazol (SMX) jako jeden z najczęściej stosowanych antybiotyków, często wykrywany jest w ekosystemach wodnych [30-32]. Po aplikacji doustnej, około 45-70% zastosowanej dawki SMX jest uwalniana z organizmu w ciągu 24 godzin od momentu przyjęcia leku, przy czym tylko 15-25% bez modyfikacji, 43% występuje w postaci N4-acetyl-SMX, a 9-15% w postaci sulfametoksazolo-n-glukuronidu [54-56]. W przypadku biologicznego rozkładu SMX, opisane jak dotąd produkty transformacji tego związku to N4-acetylosulfametoksazol, N4-hydroksyacetylosulfametoksazol, N4- hydroksysulfametoksazol, 4-nitro-sulfametoksazol oraz produkty rozpadu SMX, takie jak 3-amino-5-metyloizoksazol, benzenosulfonamid, anilina. Niektóre pochodne SMX są niestabilne w środowisku i mogą ulegać dalszym przekształceniom [47]. Informacje dotyczące występowania produktów transformacji substancji farmaceutycznych w środowisku są nadal ograniczone. Poznanie struktury metabolitów związków 8

farmaceutycznych może być pomocne w określeniu mechanizmu rozkładu tych substancji. Istotne jest również określenie toksyczności tych związków. Pominięcie analizy produktów degradacji farmaceutyków w badaniach może skutkować błędną oceną efektywności usunięcia związków macierzystych, które są nadal obecne w analizowanych próbkach, ulegają jedynie transformacji. Istotną kwestią jest również możliwość transformacji powstałych metabolitów do związków macierzystych. I.4 Zastosowanie oczyszczalni hydrofitowych do usuwania substancji farmaceutycznych ze ścieków Obecność związków farmaceutycznych w środowisku skłania do poszukiwania nowych technologii efektywnego usuwania tych związków. Zastosowanie zaawansowanych procesów utleniania, adsorpcja na węglu aktywnym czy bioreaktorów membranowych wiąże się ze znacznymi kosztami, co często eliminuje zastosowanie tych procesów na dużą skalę. W związku z tym, poszukuje się alternatywnych i tańszych metod usuwania substancji farmaceutycznych. Interesującym rozwiązaniem okazują się oczyszczalnie hydrofitowe, zwane także sztucznymi mokradłami (z ang. constructed wetlands), czyli systemy odwzorowujące naturalne warunki zachodzące w ekosystemach bagiennych, gdzie procesy oczyszczania zachodzą przy współudziale roślin, biocenozy bakteryjnej obecnej w wypełnieniu złoża jak również w strefie ryzosfery (czyli strefie korzeniowej roślin), a także dzięki kombinacji procesów fizycznych, chemicznych i biologicznych takich jak sorpcja, biodegradacja, fotodegradacja czy pobieranie zanieczyszczeń przez rośliny. Wykazano wysoką skuteczność oczyszczalni hydrofitowych wykorzystywanych do oczyszczania ścieków bytowo gospodarczych, przemysłowych czy ścieków z przemysłu rolniczego [57-62]. Na usunięcie mikrozanieczyszczeń w oczyszczalniach hydrofitowych mają wpływ różne czynniki, takie jak: konfiguracja systemu, rodzaj zastosowanego wypełnienia, gatunki roślin stosowane w systemie, tryb pracy (okresowy lub ciągły) czy hydrauliczny czas zatrzymania [63]. Oczyszczalnie hydrofitowe mogą być klasyfikowane zgodnie z: (i) hydrologią (przepływ powierzchniowy i podpowierzchniowy), (ii) rodzajem roślinności (zakorzeniona, pływająca, zanurzona oraz wynurzająca), (iii) kierunek przepływu (poziomy lub pionowy). Rozróżnia się zatem oczyszczalnie hydrofitowe o przepływie 9

powierzchniowym (SF-CWs, z ang. surface flow constructed wetlands), oczyszczalnie hydrofitowe o przepływie podpowierzchniowym poziomym (HSSF-CWs, z ang. horizontal subsurface flow constructed wetlands) oraz oczyszczalnie hydrofitowe o przepływie podpowierzchniowym pionowym (VSSF-CWs, z ang. vertical subsurface flow constructed wetlands) [64, 65]. Różne typy systemów hydrofitowych mogą także być łączone w tak zwane systemy hybrydowe, tak by osiągnąć wyższą skuteczność usuwania zanieczyszczeń. Oczyszczalnie hydrofitowe z przepływem podpowierzchniowym pionowym ze względu na większą dostępność tlenu uważa się za systemy bardziej sprzyjające procesom nitryfikacji (czyli procesom utleniania azotu amonowego do azotu azotanowego (III) oraz azotu azotanowego (V) prowadzonego przez bakterie nitryfikacyjne), w porównaniu z systemami o przepływie podpowierzchniowym poziomym [66]. Dostępność tlenu w systemie może być różna, w zależności od zastosowanego obciążenia hydraulicznego, można także zastosować dodatkowe źródło napowietrzania. Układy te mogą również pracować ze złożem zanurzonym dzięki czemu możliwe jest uzyskanie warunków beztlenowych. Odpowiednia konfiguracja stosowanego systemu powinna być zdefiniowana zgodnie z charakterystyką zanieczyszczeń dopływających do systemu. Przykładowo, systemy z powierzchniowym przepływem wykazują wyższą wydajność w przypadku zanieczyszczeń podatnych na fotodegradacje, ze względu na długi czas kontaktu z światłem słonecznym. Z kolei systemy o przepływie podpowierzchniowym mogą być stosowane w przypadku eliminacji związków ulegających biodegradacji, ponieważ bezpośredni kontakt zanieczyszczeń z wypełnieniem systemu sprzyja procesom adsorpcji, jak również zwiększa sposobność interakcji pomiędzy doprowadzanymi ściekami, wypełnieniem, roślinami i mikroorganizmami. Systemy z pionowym przepływem podpowierzchniowym wykazują zwiększoną biodegradację zanieczyszczeń w porównaniu z systemem o poziomym przepływie podpowierzchniowym, ze względu na lepsze natlenienie wypełnienia wynikające z drenażu dopływających ścieków w różnych warstwach systemu [63]. Stosowane w systemach hydrofitowych wypełnienie odgrywa istotną rolę, ponieważ nie tylko wspomaga wzrost roślin i mikroorganizmów, ale także sprzyja różnym procesom chemicznym i fizycznym. Przykładowo, sorpcja na wypełnieniu może sprzyjać 10

eliminacji zanieczyszczeń, w związku z tym dobór odpowiedniego materiału o dużej pojemności sorpcyjnej sprzyja większej efektywności pracy systemu. Równie istotny jest dobór odpowiednich roślin. Rośliny w systemach hydrofitowych mogą wykazywać zdolność do akumulacji zanieczyszczeń jak również związków azotu, węgla czy fosforu. Obecność roślin sprzyja także lepszemu dotlenieniu wypełnienia jak również rozwojowi odpowiedniej biocenozy bakteryjnej w strefie korzeniowej [63]. Co więcej, eksudat (czyli wydzieliny korzeni roślin) wraz z obumarłym materiałem roślinnym może stanowić dodatkowy donor elektronów w procesach beztlenowych, takich jak denitryfikacja czy redukcja siarczanów. Dodatkowo, rośliny uwalniające w strefie korzeniowej tlen sprzyjają mikrobiologicznej degradacji tlenowej [67, 68]. Poza roślinami i wypełnieniem, istotnym czynnikiem wpływającym na usuwanie i transformację zanieczyszczeń są mikroorganizmy [61, 69-72]. Biodegradacja substancji farmaceutycznych w systemach hydrofitowych może zachodzić zarówno w warunkach tlenowych jak i beztlenowych przy udziale bakterii heterotroficznych, autotroficznych, grzybów czy pierwotniaków. W przypadku sulfametoksazolu (SMX) zaobserwowano skuteczną biodegradację tego związku w warunkach tlenowych [72]. Z kolei w przypadku diklofenaku (DCF) uzyskane jak dotąd wyniki nie są jednoznaczne. Niektóre badania wskazują na wyższe usunięcie DCF w warunkach charakteryzujących się wysokim potencjałem redox [73-75]. Z kolei lepszą skuteczność usuwania DCF w warunkach beztlenowych wykazano w badaniach przeprowadzonych przez Avila i in., 2010. Rozbieżność uzyskanych jak dotąd wyników wskazuje na dalszą konieczność prowadzenia w tym zakresie badań dążących do lepszego poznania mechanizmów usuwania tych substancji [76]. Zgodnie z bazą Scopus, w latach od 2006 do pierwszej połowy 2018 roku w Europie opublikowano 51 artykułów naukowych poświęconych tematyce oczyszczalni hydrofitowych, gdzie badano efektywność usunięcia między innymi DCF, natomiast wyniki związane z efektywnością usunięcia SMX są opisane w 28 pracach (okres od 2008 do 2018 roku). Uzyskane dotychczas efektywności usunięcia SMX oraz DCF były zmienne, podstawowy mechanizm usuwania tych substancji nadal nie jest dokładnie poznany. Przykładowo, uzyskane efektywności usunięcia SMX w oczyszczalniach hydrofitowych wahały się od wartości ujemnych [77], aż do praktycznie 100% efektywności 11

usunięcia [72]. Intensyfikacja efektywności usunięcia SMX miała miejsce w przypadku zastosowania systemu, gdzie panowały warunki częściowo beztlenowe [77, 78]. Z kolei w przypadku DCF, uzyskiwane efektywności usunięcia były bardzo skrajne, mieściły się w zakresie od 0 do 96% [12], a najwyższa skuteczność usuwania tego związku została uzyskana w przypadku zastosowania kombinację warunków tlenowych i beztlenowych [79-82]. Zastosowanie oczyszczalni hydrofitowych do usuwania substancji farmaceutycznych jest tematem nadal stosunkowo nowym. Uzyskane jak dotąd wyniki często osiągają skrajne wartości, stąd nadal należy poszukiwać optymalnego systemu, którego zastosowanie pozwoli na wyeliminowanie tych związków ze środowiska. II Teza badawcza, cel i zakres pracy Oczyszczalnie hydrofitowe mogą stanowić alternatywną, efektywną i tanią metodę usuwania substancji farmaceutycznych ze środowiska wodnego. Wynikający z postawionej tezy główny cel pracy to ocena efektywności usuwania i biotransformacji DCF oraz SM) w systemach hydrofitowych. Cel główny pracy realizowano w oparciu o następujące cele cząstkowe określenie wpływu konfiguracji systemu (oczyszczalni hydrofitowej) na usunięcie i (bio)transformację SMX i DCF, określenie wpływu SMX oraz DCF na pracę oczyszczalni hydrofitowej w zależności od stosowanej konfiguracji systemu, określenie wpływu SMX DCF na strukturę i bioróżnorodność biocenozy bakteryjnej obecnej w górnej warstwie (strefie ryzosfery) wypełnienia oczyszczalni hydrofitowej oraz genów związanych z opornością na antybiotyki, a także porównanie toksyczności ścieków surowych i oczyszczonych zwierających SMX i DCF względem ścieków nie zawierających tych substancji. III Metodyka badań Metodyka badań i stosowane materiały dostosowane były do poszczególnych celów szczegółowych pracy. Ich skrótowe przedstawienie zawarte jest w pięciu publikacjach wchodzących w skład pracy doktorskiej. Były to następujące publikacje 12

Publikacja 1 Removal of diclofenac and sulfamethoxazole from synthetic municipal waste water in microcosm downflow constructed wetlands: start-up results, gdzie określono efektywność usuwania SMX oraz DCF w oczyszczalni hydrofitowej o pionowym przepływie podpowierzchniowym zstępującym. Dokładną konfigurację systemu przedstawiono w artykule. Nadawę stanowiły syntetyczne ścieki bytowogospodarcze, a zastosowane stężenie DCF oraz SMX wynosiło 5 mg/l każdy. Okres badawczy wynosił 86 dni, a zastosowane obciążenie hydrauliczne systemu wynosiło 32 mm/dobę. Dodatkowo, określono wpływ dozowanych farmaceutyków na efektywność usunięcia związków azotu, węgla oraz fosforu. Publikacja 2 The treatment of wastewater containing pharmaceuticals in microcosm constructed wetlands: the occurrence of integrons (inti1-2) and associated resistance genes (sul1-3, qaceδ1), gdzie przedstawiono analizę występowania genów związanymi z opornością na sulfonamidy (sul1-3) oraz innych elementów genetycznych (qaceδ1 oraz inti1-2) w górnej warstwie wypełnienia oczyszczalni hydrofitowej o pionowym przepływie podpowierzchniowym, zstępującym zasilanej ściekami zawierającymi SMX oraz DCF. Próbki wypełnienia pochodziły z systemu omawianego w publikacji 1, a okres badawczy obejmował ten sam okres co przedstawiony w publikacji 1. Dodatkowo, w publikacji 2 przedstawiono produkty transformacji SMX w próbkach odpływu z kolumn obsadzonych roślinami (Phalaris arundinacea Picta ). W publikacji 3 The effect of loading frequency and plants on the degradation of sulfamethoxazole and diclofenac in vertical-flow constructed wetlands przedstawiono wpływ częstotliwości zasilania na efektywność usuwania SMX I DCF. w oczyszczalni hydrofitowej o pionowym przepływie podpowierzchniowym, obsadzonej mozgą trzcinowatą (Phalaris arundinacea Picta ). W tym eksperymencie zmniejszono stosowane stężenie SMX i DCF do 0,5 mg/l. Wykonano także test toksyczności Microtox ścieków surowych i oczyszczonych zawierających DCF i SMX względem ścieków pobranych z systemu stanowiącego kontrolę. Przeprowadzono także analizę struktury mikroorganizmów znajdujących się w wierzchniej warstwie wypełnienia i w strefie ryzosfery oraz zaproponowano struktury produktów transformacji SMX i DCF w zależności od stosowanej częstotliwości zasilania układu. 13

Publikacja 4 Removal and transformations of diclofenac and sulfamethoxazole in a two-stage constructed wetland system, gdzie oceniono efektywność usuwania SMX oraz DCF w dwustopniowym układzie hydrofitowym, składającym się z dwóch stopni: pierwszy stopień stanowiła oczyszczalnia hydrofitowa o przepływie podpowierzchniowym pionowym, drugi stopień stanowił system o przepływie powierzchniowym. Dodatkowo, zidentyfikowano produkty transformacji DCF oraz SMX po każdym z wymienionych części. Badania obejmowały okres 442 dni, a system był zasilany syntetycznymi ściekami bytowo-gospodarczymi, zawierającymi SMX oraz DCF w stężeniu 2 mg/l. Ponadto, w ramach przeprowadzonych badań stosowano dodatkowe napowietrzanie systemu. Część pierwszą układu obsadzono miskantem olbrzymim (Miscanthus giganteus), natomiast w drugiej części systemu występowały rośliny zakorzenione na pływającej wyspie (kosaciec żółty, tatarak zwyczajny, krwawnica pospolita), rośliny pływające i wynurzone (rzęsa pospolita, wywłócznik brazylijski, hiacynt wodny, limnobium gąbczaste, pistia rozetkowa). Publikacja 5 Usuwanie i transformacja wybranych mikrozanieczyszczeń antropogenicznych w sztucznych mokradłach skojarzonych z procesami indukowanymi światłem słonecznym w której przedstawiono wyniki związane z efektywnością usuwania SMX i DCF w skojarzonym procesie wykorzystującym oczyszczalnię hydrofitową o pionowym przepływie podpowierzchniowym, częściowo obsadzoną miskantem olbrzymim (Miscanthus giganteus) oraz światło słoneczne wspomagane TiO 2. Dodatkowo, w pracy podjęto próbę określenia głównych produktów transformacji DCF oraz SMX. IV Wyniki i ich podsumowanie Główny celem pracy była ocena efektywności oczyszczalni hydrofitowej do usuwania i biotransformacji modelowych substancji farmaceutycznych, czyli diklofenaku (DCF) oraz sulfametoksazolu (SMX). W ramach badań przedstawionych w publikacji 1 usunięcie DCF wynosiło średnio 50%, natomiast usunięcie SMX było stosunkowo niskie, mieściło się w granicach od 24 do 30%. W tym etapie badań zastosowano oczyszczalnię hydrofitową o pionowym przepływie podpowierzchniowym, zstępującym. Dozowanie substancji farmaceutycznych nie miało wpływu na stężenie azotu amonowego (N-NH 4 ) oraz zawartości węgla organicznego (ChZT) w ściekach oczyszczonych, wykazano 14

natomiast istotny wpływ DCF oraz SMX na stężenie azotu azotanowego V (N-NO 3 ). Generalnie, zastosowana w tym etapie badań konfiguracja systemu nie sprzyja efektywnemu usunięciu SMX oraz DCF. Wpływ stosowanych w tym okresie badawczym substancji farmaceutycznych na mikroorganizmy bytujące w górnej strefie wypełnienia, bądź strefie ryzosfery przedstawiono w publikacji 2. W próbkach piasku, będącego stosowanym wypełnieniem układu badawczego, analizowano obecność determinantów genetycznych związanych z opornością na sulfonamidy (sul1-3) oraz innych elementów genetycznych takich jak inti1-2, qaceδ1. W tym etapie badań zaproponowano również struktury pośrednich produktów transformacji SMX w ściekach oczyszczonych pobranych z tej części układu badawczego, gdzie występowały rośliny (Phalaris arundinacea Picta ). W przeprowadzonych analizach zaobserwowano zmianę jakościową wymienionych determinantów genetycznych w trakcie trwania etapu badawczego. W badaniach wykazano głównie obecność genów sul1-2, inti1 oraz qaceδ1. Wymienione determinanty genetyczne były również obecne w osadzie czynnym, który wprowadzono do systemu przed rozpoczęciem badań oraz w glebie pochodzącej z sadzonek stosowanej rośliny. Większą częstotliwość występowania wymienionych genów zaobserwowano w części systemu obsadzonego roślinami. Dodatkowo, zaobserwowano również obecność analizowanych determinantów genetycznych w próbkach pobranych z kontrolnej części systemu. Wśród zidentyfikowanych pośrednich produktów transformacji SMX pojawiły się koniugaty SMX z glutationem, który w komórkach bakteryjnych pełni funkcje ochronne przed stresem oksydacyjnym. Ocenę efektywności usunięcia SMX oraz DCF w zależności od częstotliwości zasilania systemu oraz wpływu roślin (Phalaris arundinacea Picta ) na ten proces przedstawiono w publikacji 3. Określono także produkty transformacji SMX oraz DCF, jak również wykonano testy toksyczności (Microtox) oraz opisano strukturę biocenozy bakteryjnej w górnej warstwie wypełnienia. Zastosowanie mniejszej częstotliwości dozowania ścieków zawierających SMX oraz DCF korzystnie wpłynęło na usunięcie tych związków w części systemu, gdzie występowała roślinność. Nie zaobserwowano wpływu częstotliwości zasilania na usunięcie SMX oraz DCF w systemie, gdzie nie występowała roślinność. Usunięcie DCF oraz SMX w tej części eksperymentu mieściło się w zakresie 15

52,8 91,2% oraz 47,3 74,2%. Obecność substancji farmaceutycznych nie wpłynęła na efektywność usunięcia związków węgla oraz azotu. Zaobserwowano jednak zmniejszenie różnorodności mikroorganizmów w strefie ryzosfery w systemie, gdzie dozowano ścieki zawierające SMX oraz DCF. Zidentyfikowane w tym etapie badawczym produkty transformacji SMX to głównie hydroksylowane pochodne (mono-, di-, tri-) hydroksy- SMX, pozostałe produkty transformacji powstały w wyniki demetylacji, deaminacji, zidentyfikowano również koniugaty SMX z glutationem. W przypadku DCF, zidentyfikowano jeden produkt trihydroksy-dcf. Toksyczność ścieków dopływających do systemu oraz oczyszczonych zarówno w przypadku układu zasilanego ściekami zawierającymi DCF i SMX oraz układu kontrolnego była na porównywalnym poziomie. Kolejny etap badań (publikacja 4) obejmował ocenę efektywności usunięcia SMX oraz DCF w systemie dwustopniowym (hybrydowym). W tym etapie wykorzystano połączenie oczyszczalni hydrofitowej o pionowym przepływie podpowierzchniowym obsadzoną miskantem olbrzymim (Miscanthus x giganteus) oraz oczyszczalni hydrofitowej o przepływie powierzchniowym, gdzie występowały mieszane gatunki roślin. W systemie stosowano także dodatkowe napowietrzanie. Usunięcie SMX oraz DCF było znacznie wyższe, wynosiło odpowiednio 78% dla DCF oraz 96% dla SMX. Usunięcie SMX było zdecydowanie wyższe w pierwszej części systemu (oczyszczalni hydrofitowej o pionowym przepływie podpowierzchniowym), kiedy nie stosowano dodatkowego napowietrzania, natomiast nie zaobserwowano wpływu napowietrzania na usunięcie DCF. W drugiej części systemu (oczyszczalni hydrofitowej o przepływie powierzchniowym) zastosowanie dodatkowego napowietrzania pozytywnie wpłynęło na usunięcie DCF, jednak w przypadku SMX nie zaobserwowano takiego wpływu. W tych doświadczeniach zaobserwowano znacznie większy udział pierwszej części systemu w procesie usuwania DCF oraz SMX w porównaniu z drugą częścią systemu. Zidentyfikowane w tym etapie badawczym produkty transformacji DCF oraz SMX mogą wskazywać na transformację tych związków zachodzącą zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych. Niektóre spośród zidentyfikowanych produktów transformacji po pierwszej części układu hybrydowego, podlegały dalszym procesom transformacji w części drugiej, występowały również takie produkty transformacji, które były obecne zarówno po pierwszej jak i drugiej części układu. Stwierdzono również 16

możliwy abiotyczny rozkład SMX. Nie zaobserwowano negatywnego wpływu SMX i DCF na rośliny w pierwszej części systemu. Jednakże wraz z upływem czasu trwania eksperymentu, zaobserwowano negatywny wpływ DCF i SMX (oraz produktów transformacji tych związków) na rośliny występujące w drugiej części systemu. Propozycję skojarzenia systemu hydrofitowego z innymi metodami przedstawiono w publikacji 5. W tym etapie badań w układzie zastosowano miskant olbrzymi (Miscanthus x giganteus). Usunięcie DCF w systemie obsadzonym roślinami wynosiło 82,3%, zaś w nieobsadzonej części 68,1. W przypadku SMX, usunięcie w obsadzonej części systemu wynosiło 85,2%, a w nieobsadzonej 57,6%. Ścieki oczyszczone w części układu obsadzonego roślinami poddano naświetlaniu w fotoreaktorze w obecności fotokatalizatora, którym był TiO 2. Dzięki zastosowaniu doczyszczania ścieków oczyszczonych osiągnięto wysokie usunięcie SMX oraz DCF, po 60 minutach procesu usunięcie DCF było niemalże całkowite, a SMX około 96%. Zidentyfikowane pośrednie produkty transformacji ścieków oczyszczonych przed procesem fotokatalizy indukowanej światłem słonecznym) to ponownie koniugaty SMX z glutationem (podobnie jak w publikacji 2) oraz połączenia SMX z nieznanym aminokwasem. Te produkty zostały zidentyfikowane w układach obsadzonych oraz nieobsadzonych roślinami. W przypadku DCF, zidentyfikowano cztery potencjalne produkty transformacji tego związku, które wskazują na symultaniczność procesów metylacji i hydroksylacji zachodzące w jednym układzie. Zintensyfikowanie procesu hydroksylacji zachodziło w systemie obsadzonym roślinami. Metylowana pochodna DCF wystąpiła natomiast jedynie w przypadku układu nieobsadzonego roślinami. V Wnioski Na podstawie przeprowadzonych badań można wyciągnąć poniższe wnioski, świadczące o tym, że cele pracy zostały zrealizowane: konfiguracja oczyszczalni hydrofitowej ma istotne znaczenie w przypadku usunięcia sulfametoksazolu (SMX) i diklofenaku (DCF). Stosowanie zmiennej częstotliwości zasilania układu wskazuje na wyższe usunięcie SMX i DCF w układzie o niższej częstotliwości zasilania. Zastosowanie systemu dwustopniowego (hybrydowego) może znacząco wpłynąć na zwiększenie 17

efektywności usunięcia DCF oraz SMX. Obecność dodatkowego napowietrzania w systemie hydrofitowym o przepływie podpowierzchniowym pionowym nie skutkuje zwiększeniem efektywności usunięcia DCF i SMX, natomiast zastosowanie dodatkowego napowietrzania w oczyszczalni hydrofitowej o przepływie powierzchniowym może wpłynąć na lepsze usunięcie DCF obniżając jednocześnie usunięcie SMX. Właściwości opisanych produktów transformacji SMX oraz DCF mogą świadczyć o procesach beztlenowych i tlenowych, które biorą udział w przemianie tych związków, jak również biodegradacji, czy udziału procesów abiotycznych, które mogą zachodzić we wnętrzu systemu. Opisane produkty transformacji występujące niezależnie od stosowanej konfiguracji systemu to hydroksylowane pochodne DCF oraz hydroksylowane i metylowane pochodne SMX. Ciekawą alternatywą okazuje się połączenie systemu hydrofitowego z procesami fotokatalitycznymi indukowanymi światłem słonecznym w obecności fotokatalizatora (TiO 2 ). Zastosowanie dodatkowego etapu doczyszczania skutkuje niemalże całkowitym usunięciem SMX oraz DCF ze ścieków oczyszczonych, jednak stosowanie takich procesów w skali technicznej wiąże się ze znacznymi kosztami, co może wykluczać takie rozwiązanie. obecność SMX oraz DCF może wpływać na podstawowe parametry pracy systemu takie jak zawartość azotu azotanowego (V) w ściekach oczyszczonych, nie wpływa natomiast na zawartość azotu amonowego czy związków węgla, długotrwały czas ekspozycji systemu hydrofitowego na SMX dozowany w ściekach wpływa na zmianę jakościową obecnych w górnej warstwie wypełnienia determinantów genetycznych. Wykonane analizy wskazują na zmniejszenie różnorodności struktury mikroorganizmów w oczyszczalni hydrofitowej zasilanej ściekami zawierającymi SMX i DCF. Nie zaobserwowano także wzrostu toksyczności ścieków surowych i oczyszczonych zawierających SMX i DCF względem kontroli. 18

Najogólniej można stwierdzić, że usuwanie farmaceutyków w sztucznych mokradłach jest procesem efektywnym (w określonych stężeniach i konfiguracjach systemu), jednak nie jest możliwe całkowite usunięcie badanych związków ze ścieków stosując wyłącznie ten proces. Jednakże skojarzenie oczyszczania hydrofitowego w sztucznych mokradłach z procesami indukowanymi światłem słonecznym (fotokataliza) pozwala na całkowitą eliminację diklofenaku (DCF) ze ścieków oraz ponad 90 procentowe usuniecie sulfametaksazolu (SMX). Została więc potwierdzona główna teza pracy. 19

VII Literatura [1] L. F. Escher B., Introduction to Bioanalytical Tools in Water Quality assessment., Bioanalytical Tools in Water Quality Assessment, IWA Publishing, London, UK, 2012. [2] J. Corcoran, M. J. Winter, and C. R. Tyler, Pharmaceuticals in the aquatic environment: A critical review of the evidence for health effects in fish, Critical Reviews in Toxicology, vol. 40, no. 4, pp. 287-304, 2010. [3] M. l. Farré, S. Pérez, L. Kantiani, and D. Barceló, Fate and toxicity of emerging pollutants, their metabolites and transformation products in the aquatic environment, TrAC Trends in Analytical Chemistry, vol. 27, no. 11, pp. 991-1007, 2008. [4] K. Fent, A. A. Weston, and D. Caminada, Ecotoxicology of human pharmaceuticals, Aquatic Toxicology, vol. 76, no. 2, pp. 122-159, 2006. [5] F. Gagné, C. Blaise, and C. André, Occurrence of pharmaceutical products in a municipal effluent and toxicity to rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) hepatocytes, Ecotoxicology and Environmental Safety, vol. 64, no. 3, pp. 329-336, 2006. [6] F. Pomati, S. Castiglioni, E. Zuccato, R. Fanelli, D. Vigetti, C. Rossetti, and D. Calamari, Effects of a Complex Mixture of Therapeutic Drugs at Environmental Levels on Human Embryonic Cells, Environmental Science & Technology, vol. 40, no. 7, pp. 2442-2447, 2006. [7] E. Zuccato, S. Castiglioni, R. Fanelli, G. Reitano, R. Bagnati, C. Chiabrando, F. Pomati, C. Rossetti, and D. Calamari, Pharmaceuticals in the Environment in Italy: Causes, Occurrence, Effects and Control, Environmental Science and Pollution Research, vol. 13, no. 1, pp. 15-21, 2006. [8] C. Carlsson, A.-K. Johansson, G. Alvan, K. Bergman, and T. Kühler, Are pharmaceuticals potent environmental pollutants?: Part I: Environmental risk assessments of selected active pharmaceutical ingredients, Science of The Total Environment, vol. 364, no. 1, pp. 67-87, 2006. [9] B. Kasprzyk-Hordern, A. Dabrowska, N. Vieno, L. Kronberg, and J. Nawrocki, Occurrence of acidic pharmaceuticals in the Warta River in Poland, Chemia Analityczna, vol. 53, no. 2, pp. 289-303, 2008. [10] D. W. Kolpin, E. T. Furlong, M. T. Meyer, and E. M. Thruman, Pharmaceuticals, Hormones and Other Organic Wastewater Contaminations in U.S Streams 1999-2000, A National Reconnaissance, pp. 1202-1211, 2002. [11] A. Nikolaou, S. Meric, and D. Fatta, Occurrence patterns of pharmaceuticals in water and wastewater environments, Analytical and Bioanalytical Chemistry, vol. 387, no. 4, pp. 1225-1234, 2007. [12] A. M. Gorito, A. R. Ribeiro, C. M. R. Almeida, and A. M. T. Silva, A review on the application of constructed wetlands for the removal of priority substances and contaminants of emerging concern listed in recently launched EU legislation, Environ Pollut, vol. 227, pp. 428-443, 2017. [13] J. C. G. Sousa, A. R. Ribeiro, M. O. Barbosa, M. F. R. Pereira, and A. M. T. Silva, A review on environmental monitoring of water organic pollutants identified by EU guidelines, Journal of Hazardous Materials, vol. 344, pp. 146-162, 2018. [14] GWRC, Pharmaceuticals and personal care products in the water cycle. An international review, London, UK, 2004. [15] B. Halling-Sørensen, S. Nors Nielsen, P. F. Lanzky, F. Ingerslev, H. C. Holten Lützhøft, and S. E. Jørgensen, Occurrence, fate and effects of pharmaceutical substances in the environment- A review, Chemosphere, vol. 36, no. 2, pp. 357-393, 1998. [16] S. K. Khetan, and T. J. Collins, Human Pharmaceuticals in the Aquatic Environment: A Challenge to Green Chemistry, Chemical Reviews, vol. 107, no. 6, pp. 2319-2364, 2007. [17] P. McGettigan, and D. Henry, Use of Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs That Elevate Cardiovascular Risk: An Examination of Sales and Essential Medicines Lists in Low-, Middle-, and High-Income Countries, PLOS Medicine, vol. 10, no. 2, pp. e1001388, 2013. [18] Y. Zhang, S. U. Geissen, and C. Gal, Carbamazepine and diclofenac: removal in wastewater treatment plants and occurrence in water bodies, Chemosphere, vol. 73, no. 8, pp. 1151-61, 2008. [19] E. Palmer, Top 20 generic molecules worldwide www.fiercepharma.com., 2012. [20] V. Acuña, A. Ginebreda, J. R. Mor, M. Petrovic, S. Sabater, J. Sumpter, and D. Barceló, Balancing the health benefits and environmental risks of pharmaceuticals: Diclofenac as an example, Environment International, vol. 85, pp. 327-333, 2015. 20

[21] O. A. H. Jones, N. Voulvoulis, and J. N. Lester, Aquatic environmental assessment of the top 25 English prescription pharmaceuticals, Water Research, vol. 36, no. 20, pp. 5013-5022, 2002. [22] B. Strenn, M. Clara, O. Gans, and N. Kreuzinger, Carbamazepine, diclofenac, ibuprofen and bezafibrate--investigations on the behaviour of selected pharmaceuticals during wastewater treatment, Water Science and Technology, vol. 50, no. 5, pp. 269-276, 2004. [23] B. t. Ferrari, N. Paxéus, R. L. Giudice, A. Pollio, and J. Garric, Ecotoxicological impact of pharmaceuticals found in treated wastewaters: study of carbamazepine, clofibric acid, and diclofenac, Ecotoxicology and Environmental Safety, vol. 55, no. 3, pp. 359-370, 2003. [24] D. Henry, Widely Used Diclofenac Associated With Increased Risk for Cardiovascular Events. Heartwire, Toronto www.medscape.com., M., O..R. (Ed.), 2013. [25] Dyrektywa 2013/39/UE Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady nr 2013/39/UE z dnia 12 sierpnia 2013 r. zmieniająca dyrektywy 2000/60/WE i 2008/105/WE w zakresie substancji priorytetowych w dziedzinie polityki wodnej.. [26] Decyzja wykonawcza UE 2015/495 decyzja wykonawcza komisji EU nr 2015/495 z dnia 20 marca 2015 r. ustanawiająca listę obserwacyjną substancji do celów monitorowania obejmującego całą Unię w zakre-sie polityki wodnej na podstawie dyrektywy Parlamentu Europejskiego i Rady 2008/105/WE.. [27] K. Kümmerer, The presence of pharmaceuticals in the environment due to human use present knowledge and future challenges, Journal of Environmental Management, vol. 90, no. 8, pp. 2354-2366, 2009. [28] A. Göbel, A. Thomsen, C. S. McArdell, A. Joss, and W. Giger, Occurrence and Sorption Behavior of Sulfonamides, Macrolides, and Trimethoprim in Activated Sludge Treatment, Environmental Science & Technology, vol. 39, no. 11, pp. 3981-3989, 2005. [29] P. Drillia, S. N. Dokianakis, M. S. Fountoulakis, M. Kornaros, K. Stamatelatou, and G. Lyberatos, On the occasional biodegradation of pharmaceuticals in the activated sludge process: The example of the antibiotic sulfamethoxazole, Journal of Hazardous Materials, vol. 122, no. 3, pp. 259-265, 2005. [30] R. Zhang, J. Tang, J. Li, Q. Zheng, D. Liu, Y. Chen, Y. Zou, X. Chen, C. Luo, and G. Zhang, Antibiotics in the offshore waters of the Bohai Sea and the Yellow Sea in China: Occurrence, distribution and ecological risks, Environmental Pollution, vol. 174, pp. 71-77, 2013. [31] Q. Zhang, A. Jia, Y. Wan, H. Liu, K. Wang, H. Peng, Z. Dong, and J. Hu, Occurrences of Three Classes of Antibiotics in a Natural River Basin: Association with Antibiotic-Resistant Escherichia coli, Environmental Science & Technology, vol. 48, no. 24, pp. 14317-14325, 2014. [32] Z. Wang, X.-H. Zhang, Y. Huang, and H. Wang, Comprehensive evaluation of pharmaceuticals and personal care products (PPCPs) in typical highly urbanized regions across China, Environmental Pollution, vol. 204, pp. 223-232, 2015. [33] McEvoy, HFS Drug Information 2005, American Society of Health-System Pharmacists, Bethesda, MD, 2005. [34] N. Collado, G. Buttiglieri, E. Marti, L. Ferrando-Climent, S. Rodriguez-Mozaz, D. Barceló, J. Comas, and I. Rodriguez-Roda, Effects on activated sludge bacterial community exposed to sulfamethoxazole, Chemosphere, vol. 93, no. 1, pp. 99-106, 2013. [35] S. K. Haack, D. W. Metge, L. R. Fogarty, M. T. Meyer, L. B. Barber, R. W. Harvey, D. R. LeBlanc, and D. W. Kolpin, Effects on Groundwater Microbial Communities of an Engineered 30-Day In Situ Exposure to the Antibiotic Sulfamethoxazole, Environmental Science & Technology, vol. 46, no. 14, pp. 7478-7486, 2012. [36] G. Kor-Bicakci, I. Pala-Ozkok, A. Rehman, D. Jonas, E. Ubay-Cokgor, and D. Orhon, Chronic impact of sulfamethoxazole on acetate utilization kinetics and population dynamics of fast growing microbial culture, Bioresource Technology, vol. 166, pp. 219-228, 2014. [37] F. Liu, J. Wu, G.-G. Ying, Z. Luo, and H. Feng, Changes in functional diversity of soil microbial community with addition of antibiotics sulfamethoxazole and chlortetracycline, Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 95, no. 6, pp. 1615-1623, 2012. [38] X.-P. Nie, B.-Y. Liu, H.-J. Yu, W.-Q. Liu, and Y.-F. Yang, Toxic effects of erythromycin, ciprofloxacin and sulfamethoxazole exposure to the antioxidant system in Pseudokirchneriella subcapitata, Environmental Pollution, vol. 172, pp. 23-32, 2013. [39] J. Subirats, A. Sànchez-Melsió, C. M. Borrego, J. L. Balcázar, and P. Simonet, Metagenomic analysis reveals that bacteriophages are reservoirs of antibiotic resistance genes, International Journal of Antimicrobial Agents, vol. 48, no. 2, pp. 163-167, 2016. 21

[40] L. S. Frost, R. Leplae, A. O. Summers, and A. Toussaint, Mobile genetic elements: the agents of open source evolution, Nature Reviews Microbiology, vol. 3, pp. 722, 2005. [41] P. M. Bennett, Plasmid encoded antibiotic resistance: acquisition and transfer of antibiotic resistance genes in bacteria, British Journal of Pharmacology, vol. 153, no. Suppl 1, pp. S347- S357, 2008. [42] T. U. Berendonk, C. M. Manaia, C. Merlin, D. Fatta-Kassinos, E. Cytryn, F. Walsh, H. Burgmann, H. Sorum, M. Norstrom, M. N. Pons, N. Kreuzinger, P. Huovinen, S. Stefani, T. Schwartz, V. Kisand, F. Baquero, and J. L. Martinez, Tackling antibiotic resistance: the environmental framework, Nat Rev Microbiol, vol. 13, no. 5, pp. 310-7, 2015. [43] USTAWA z dnia 5 grudnia 2008 r. o zapobieganiu oraz zwalczaniu zakażeń i chorób zakaźnych u ludzi, tj, Dz.U.2018.151. [44] ROZPORZĄDZENIE MINISTRA ZDROWIA z dnia 23 grudnia 2011 r. w sprawie listy czynników alarmowych, rejestrów zakażeń szpitalnych i czynników alarmowych oraz raportów o bieżącej sytuacji epidemiologicznej szpitala, Dz.U.2011.294.1741. [45] USTAWA z dnia 11 września 2015 r. o zdrowiu publicznym, tj, Dz.U.2017.2237 2018.01.01 zm. Dz.U.2017.2371 art. 36. [46] L. Lonappan, S. K. Brar, R. K. Das, M. Verma, and R. Y. Surampalli, Diclofenac and its transformation products: Environmental occurrence and toxicity - A review, Environ Int, vol. 96, pp. 127-138, 2016. [47] M. Majewsky, D. Wagner, M. Delay, S. Brase, V. Yargeau, and H. Horn, Antibacterial activity of sulfamethoxazole transformation products (TPs): general relevance for sulfonamide TPs modified at the para position, Chem Res Toxicol, vol. 27, no. 10, pp. 1821-8, 2014. [48] I. Wiesenberg-Boettcher, J. Pfeilschifter, A. Schweizer, A. Sallmann, and P. Wenk, Pharmacological properties of five diclofenac metabolites identified in human plasma, Agents and Actions, vol. 34, no. 1, pp. 135-137, 1991. [49] H. Stierlin, J. W. Faigle, A. Sallmann, W. Kung, W. J. Richter, H. P. Kriemler, K. O. Alt, and T. Winkler, Biotransformation of diclofenac sodium (Voltaren ) in animals and in man, Xenobiotica, vol. 9, no. 10, pp. 601-610, 1979. [50] A. Agüera, L. A. Pérez Estrada, I. Ferrer, E. M. Thurman, S. Malato, and A. R. Fernández-Alba, Application of time-of-flight mass spectrometry to the analysis of phototransformation products of diclofenac in water under natural sunlight, Journal of Mass Spectrometry, vol. 40, no. 7, pp. 908-915, 2005. [51] D. E. Moore, S. Roberts-Thomson, D. Zhen, and C. C. Duke, PHOTOCHEMICAL STUDIES ON THE ANTIINFLAMMATORY DRUG DICLOFENAC, Photochemistry and Photobiology, vol. 52, no. 4, pp. 685-690, 1990. [52] M. Schmitt-Jansen, P. Bartels, N. Adler, and R. Altenburger, Phytotoxicity assessment of diclofenac and its phototransformation products, Analytical and Bioanalytical Chemistry, vol. 387, no. 4, pp. 1389-1396, 2007. [53] T. Schulze, S. Weiss, E. Schymanski, P. C. von der Ohe, M. Schmitt-Jansen, R. Altenburger, G. Streck, and W. Brack, Identification of a phytotoxic photo-transformation product of diclofenac using effect-directed analysis, Environmental Pollution, vol. 158, no. 5, pp. 1461-1466, 2010. [54] A. J. Ven, T. B. Vree, E. W. Ewijk-Beneken Kolmer, P. P. Koopmans, and J. W. Meer, Urinary recovery and kinetics of sulphamethoxazole and its metabolites in HIV-seropositive patients and healthy volunteers after a single oral dose of sulphamethoxazole, British Journal of Clinical Pharmacology, vol. 39, no. 6, pp. 621-625, 1995. [55] A. J. Ven, M. A. Mantel, T. B. Vree, P. P. Koopmans, and J. W. Meer, Formation and elimination of sulphamethoxazole hydroxylamine after oral administration of sulphamethoxazole, British Journal of Clinical Pharmacology, vol. 38, no. 2, pp. 147-150, 1994. [56] H. J. Gill, J. L. Maggs, S. Madden, M. Pirmohamed, and B. K. Park, The effect of fluconazole and ketoconazole on the metabolism of sulphamethoxazole, British Journal of Clinical Pharmacology, vol. 42, no. 3, pp. 347-353, 1996. [57] A. K. Choudhary, S. Kumar, and C. Sharma, Constructed wetlands: An option for pulp and paper mill wastewater treatment, Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry, vol. 10, no. 10, pp. 3023-3037, 2011. [58] L. C. Davies, I. S. Pedro, R. A. Ferreira, F. G. Freire, J. M. Novais, and S. Martins-Dias, Constructed wetland treatment system in textile industry and sustainable development, Water Science and Technology, vol. 58, no. 10, pp. 2017-2023, 2008. 22