Prof. dr hab. inż. Marek Lankosz Wydział Fizyki i Informatyki Stosowanej Akademia Górniczo-Hutnicza w Krakowie

Transkrypt

1 Prof. dr hab. inż. Marek Lankosz Wydział Fizyki i Informatyki Stosowanej Akademia Górniczo-Hutnicza w Krakowie Recenzja pracy doktorskiej mgr Justyny Bobrowskiej pt. Characterization of cell surface structure and its relation to cytoskeleton elasticity in cancer cells Zmiany obserwowane w komórkach nowotworowych w relacji do komórek nie objętych procesem nowotworzenia związane są z licznymi procesami zaburzającymi ich obraz morfologiczny, strukturę oraz wzrost. Aktualny stan wiedzy na temat tych procesów jest ciągle niekompletny i wymaga dalszych badań. Skłoniło to autorkę rozprawy do podjęcia się realizacji ambitnych badań, których celem było poznanie i pogłębienie wiedzy o własnościach biochemicznych i biomechanicznych pojedynczych komórek podczas rozwoju choroby nowotworowej. Głównym celem recenzowanej rozprawy było zbadanie w jaki sposób elastyczność komórki jest związana z budową biochemiczną jej powierzchni i czy zmiany te są skorelowane ze wzrostem nowotworu. Do badania elastyczności komórek czerniaka oraz raka pęcherza moczowego autorka rozprawy wykorzystała nowoczesną metodę badawczą - mikroskopię sił atomowych (AFM). Badaniami objęto trzy grupy komórek w tym linie komórkowe wywodzące się z pierwotnego ogniska czerniaka to znaczy z radialnej i wertykalnej fazy wzrostu, linie pochodzące z przerzutu czerniaka do skóry i płuc, jak również grupę referencyjną obejmującą prawidłowe melanocyty. Ponadto, doktorantka badała linie komórkowe raka pęcherza moczowego. Budowa biochemiczna powierzchni komórek zbadana została metodą spektrometrii mas jonów wtórnych z analizatorem czasu przelotu (ToF SIMS). Do badania składu molekularnego błon komórkowych w nanoskali autorka rozprawy wykorzystała unikatową metodę opartą o efekt foto-termiczny (PTMS). Technika ta znana jest też pod nazwą mikroskopii obrazowania foto-termicznego (PTIM, Photo-Thermal Imaging Microscopy). Wspomniana technika umożliwia obrazowanie w nanoskali obiektów molekularnych, bazując na wydzielanym przez nie cieple w czasie naświetlania fotonami. Interpretację swoich wyników badań doktorantka oparła na nowoczesnych metodach statystycznych w tym na analizie głównych składowych (PCA). Kształt komórek określiła metodą fluorescencji.

2 Licząca 114 stron praca ma typowy układ dysertacji doktorskiej, przy czym zasadniczy tekst podzielony jest na dziesięć rozdziałów i jest poprzedzony streszczeniem. Do pracy dołączono spis treści, listę i znaczenie użytych skrótów, listę tytułów rysunków oraz listę publikacji autorki rozprawy. W rozdziale drugim swojej rozprawy doktorantka przedstawiła podstawowe informacje dotyczące rozwoju czerniaka oraz terminologię stosowaną w opisie własności biomechanicznych komórki. Następnie, omówiła oparty o literaturę przegląd metod fizycznych stosowanych do badania deformacji i własności biochemicznych powierzchni komórek w przypadku różnych procesów patologicznych. Szczególną uwagę zwróciła na metody oparte na mikroskopii sił atomowych oraz spektroskopii masowej jonów wtórnych z analizatorem czasu przeloty. Ponadto, przedstawiła i omówiła metody zastosowane do statystycznej oceny uzyskanych wyników badań w tym metodę analizy głównych składowych. Na końcu rozdziału opisała cele pracy. Z uwagi na fakt, że proces przekształceń zdrowych melanocytów w inwazyjne komórki czerniaka przejawia się zmianami w składzie molekularnym powierzchni komórek, strukturze włókien aktynowych cytoszkieletu jak również w deformacji komórek doktorantka zaproponowała, że własności mechaniczne komórek nowotworowych oraz skład molekularny błon komórkowych można wykorzystać do rozróżnienia typu nowotworu oraz stopnia jego zaawansowania. Ponadto, starała się wykazać, że istnieją korelacje pomiędzy własnościami mechanicznymi komórek a chemicznym składem powierzchni komórek. Tego rodzaju badania wymagały opracowania optymalnych procedur przygotowania próbek komórek nowotworowych do badań SIMS, AFM oraz spektroskopii PTMS. Kolejne rozdziały pracy stanowią właściwe wprowadzenie w przedmiot rozprawy. W tej części pracy, autorka opisała linie komórek nowotworowych stosowane w swoich badaniach (raka pęcherza moczowego oraz czerniaka). Ponadto, opisała opracowane przez siebie procedury przygotowania próbek do badań AFM, PTMS, ToF-SIMS oraz barwienie komórek dla potrzeb ich obrazowania metodą fluorescencji. Ważnym osiągnięciem tego etapu badań była nowatorska procedura przygotowania komórek do pomiarów ToF-SIMS. Procedura ta umożliwia badanie komórek w wysokiej próżni. Zaletą tej metody jest eliminacja procesu dehydratyzacji i suszenia próbek w niskich temperaturach bez ich deformacji. Szkoda, że doktorantka nie zasygnalizowała, czy oprócz procedury opisanej w swojej pracy doktorskiej, badała też inne sposoby utrwalania próbek do badań. W wielu publikacjach sugeruje się, że optymalną metodą przygotowania próbek tkanek czy też 2

3 pojedynczych komórek jest tzw shock freezing w schłodzonym izopentanie. Metoda ta nie niszczy struktury komórek. W rozdziale czwartym przedstawiono podstawy fizyczne oraz opis stosowanych metod eksperymentalnych. Autorka rozprawy podkreśliła, że do identyfikacji wizytówek rozróżniających komórki różnego typu nowotworów pęcherza moczowego lub czerniaka w oparciu o badanie składu biomolekularnego powierzchni komórek nowotworowych metodami ToF-SIMS i PTMS zastosowała metodą analizy PCA. Ważnym osiągnięciem tego etapu badań jest zastosowanie pełnych zakresów zarejestrowanych widm rozpylonych mas i widm fototermicznych do analizy PCA, bez wstępnej selekcji mas lub liczb falowych. Jest to ważne z uwagi na bardzo skomplikowany charakter widm. W dalszych rozdziałach przedstawiła opis badań różnego typu komórek nowotworowych i ich własności fizykochemicznych z zastosowaniem wybranych technik pomiarowych. Każdy z rozdziałów poświęcony jest określonemu rodzajowi nowotworu i oprócz opisu zrealizowanych badań zawiera opis celu ich realizacji oraz wnioski jakie wynikają z ich wykonania. W rozdziale piątym autorka zaprezentowała przydatność metody ToF-SIMS do badania pojedynczych komórek raka pęcherza moczowego na potrzeby ich identyfikacji. Badała elastyczność szkieletu oraz skład molekularny ich powierzchni Wyniki badań wykazały, że własności mechaniczne komórek wysoce inwazyjnych nowotworów pęcherza moczowego są skorelowane ze zmianami składu molekularnego ich powierzchni. Wspomożenie tego rodzaju analiz metodą PCA umożliwiło rozróżnienie nowotworu pęcherza moczowego od komórek zdrowych. Ważnym osiągnięciem tego etapu badań jest wykazanie, że całe widmo rozpylonych mas z powodzeniem może być wykorzystane do rozpoznania typu nowotworu i ich odróżnienia od komórek nie objętych procesem nowotworzenia. Niestety, ze sposobu przedstawiania wyników pomiarów czytelnikowi trudno jest wywnioskować w jaki sposób badano linie komórkowe tzn. wiadomo że analizowano powierzchnie 150x150 μm 2 ale brak jest informacji jaki był czas akwizycji widm i w jaki sposób skanowano próbki. Rozdział szósty i siódmy dotyczy badania własności morfologicznych, mechanicznych oraz składu molekularnego komórek dwóch typów czerniaka, pierwotnego oraz jego przerzutu do skóry, wywodzących się od tego samego pacjenta. Do rozróżnienia obu typów komórek wykorzystano pomiar powierzchni całych komórek oraz ich jąder komórkowych. Do badania topografii komórek i ich elastyczności stosowano technikę AFM. Przeprowadzone badania wykazały, że metoda AFM i mikroskopia fluorescencyjna umożliwiają rozróżnienie komórek pod względem stadium rozwoju nowotworu. tzn. nowotworu pierwotnego jak i jego przerzutów do skóry. W rozprawie doktorantka udokumentowała, że oba typy komórek różnią 3

4 się zarówno własnościami morfologicznymi, uporządkowaniem cytoszkieletu aktynowego oraz elastycznością. Nasuwa się jednak pytanie dlaczego własności morfologiczne zostały jedynie ograniczone do badania pola powierzchni komórek i ich jąder. Można też analizować ich obwód, średnicę czy też kształt linii brzegowej. Podobnie, jak w przypadku nowotworów pęcherza moczowego, synergia dwóch metod mikro-spektroskopowych tzn. ToF-SIMS oraz PTMS z metodą PCA pozwala na dywersyfikację komórek dwóch typów czerniaka z ogniska pierwotnego i przerzutowego na poziomie prawdopodobieństwa dochodzącego do 99%. W rozdziale ósmym doktorantka przedstawiła wyniki badań komórek czerniaka o różnym stopniu zaawansowania. Obejmowały one komórki z ogniska pierwotnego, przerzutów do skóry oraz przerzutów do płuc. Jako próbki kontrolne zastosowała melanocyty pochodzenia ludzkiego. Badała elastyczność komórek oraz masy rozpylonych fragmentów molekuł z błony komórkowej. Zaobserwowała istotne różnice w elastyczności komórek. Największą odkształcalność posiadały komórki czerniaka przerzutowego do płuc, mniejszą do skóry a najmniejszą z ogniska pierwotnego. Również widma mas fragmentów molekuł wykazują istotne różnice. Metoda PCA nie pozwoliła jednak na pełne zróżnicowanie badanych komórek w relacji do ich stopnia ekspansji. Takie zróżnicowanie było możliwe jedynie dla wyselekcjonowanych par badanych linii komórkowych. Recenzowaną pracę kończy omówienie własności biomechanicznych i biochemicznych badanych nowotworów wraz z wnioskami wynikającymi z przeprowadzonych badań. Do najważniejszych wniosków należy zaliczyć fakt, że komórki czerniaka niezależnie od stopnia zaawansowania są bardziej elastyczne niż melanocyty. Badania spektralne rozpylonych mas oraz widm IR wskazały na możliwość wykorzystania pełnego zakresu widm do rozróżnienia badanych komórek nowotworowych. W pracy autorka zacytowała 144 pozycji literatury naukowej, w tym pięć własnych publikacji, w których jest wiodącą autorką lub współautorką. Świadczy to o tym, że wyniki badań autorki rozprawy znalazły uznanie w międzynarodowym środowisku naukowym. Przechodząc do oceny pracy trzeba przede wszystkim zgodzić się z wnioskami autorki, że postawione cele badań zostały osiągnięte. Przedstawiona do recenzji praca stanowi istotny krok w badaniach nad własnościami mechanicznymi i molekularnymi wybranych nowotworów na poziomie pojedynczych komórek. Autorka rozprawy zasługuje przede wszystkim na uznanie z racji opanowania warsztatu pomiarowego dla potrzeb wykorzystania różnorodnych metod fizycznych w skali nano w badaniach procesu kancerogenezy. Pracę można uznać za napisaną w sposób poprawny pod względem stylistycznym i językowym. Autor niniejszej recenzji zauważył tylko dwa błędy drukarskie. Praca została 4

5 zredagowana w sposób bardzo staranny. Tylko w niektórych miejscach wymiary wielkości fizycznych zostały zapisane drukiem pochyłym, zamiast prostym, co jest niezgodnie z obowiązującymi normami. Zastrzeżenia budzi brak istotnych informacji utrudniających czytelnikowi ocenę przeprowadzanych procedur PCA. Poniżej przedstawiono ważniejsze uwagi krytyczne dotyczące ocenianej pracy. W przypadku stosowania metody analizy głównych składowych autorka nie podaje, jaką liczbę zmiennych (kanałów) użyła do analizy, ile widm analizowała w każdym z badanych przypadków oraz jakie wielkości fizyczne z widm były wykorzystane jako dane wejściowe. Czy dokonano selekcji zmiennych wejściowych bądź redukcji ich liczby? Jakie kryteria zastosowano do wyznaczenia liczby głównych składowych wykorzystanych do interpretacji pomiarów? Czy ładunki czynnikowe były poddane rotacji? Wymaga to wyjaśnienia przez doktorantkę. Podsumowując należy stwierdzić, że podjęta przez autorkę tematyka badań jest bardzo ważna z punktu widzenia naukowego oraz może mieć duże znaczenie dla potrzeb wspomagania diagnostyki histopatologicznej tkanek objętych procesem nowotworzenia. Przeprowadzone badania świadczą o dużych umiejętnościach doktorantki. Reasumują, pragnę stwierdzić, że przedstawiona praca pt. Characterization of cell surface structure and its relation to cytoskeleton elasticity in cancer cells spełnia wszystkie ustawowe i zwyczajowe wymogi stawiane pracom doktorskim i może być dopuszczona do publicznej obrony w celu uzyskania stopnia naukowego doktora nauk fizycznych. Istotnym osiągnieciem doktorantki jest potwierdzenie możliwości wykorzystania metod ToF-SIMS, PTMF oraz AFM do badań własności fizykochemicznych komórek nowotworowych. Badania te należy uznać za nowatorskie. Synergia metod fizycznych ze statystyczną ewaluacja PCA może być wykorzystana w niektórych przypadkach do rozróżnienia typu komórek nowotworowych oraz stopnia zaawansowania nowotworu. Tego typu badania mogą wspomóc diagnostykę histopatologiczną, szczególnie w przypadkach wątpliwych oceny typu nowotworu czy stopnia jego złośliwości przy diagnostyce tkanek biopsyjnych i pooperacyjnych. Wyniki badań zostały opublikowane przez doktorantkę w czterech artykułach w prestiżowych czasopismach o zasięgu międzynarodowym. Biorąc pod uwagę przedstawione powyżej osiągnięcia, wnioskuję o wyróżnienie pracy doktorskiej mgr Justyny. Bobrowskiej. Kraków, Marek Lankosz 5