AUTOREFERAT ROZPRAWY DOKTORSKIEJ NA TEMAT:

Transkrypt

1 Wydział Elektroniki Mikrosystemów i Fotoniki AUTOREFERAT ROZPRAWY DOKTORSKIEJ NA TEMAT: Metrologia i sterowanie kamertonów piezoelektrycznych w roli czujników mikrobiologicznych i biochemicznych AUTOR Karol Waszczuk PROMOTOR prof. dr hab. inż. Teodor Gotszalk obszar nauk technicznych, dziedzina nauk technicznych, dyscyplina: elektronika Wrocław r.

2 I. WSTĘP I CEL PRACY Tytułowe kamertony kwarcowe (QTF, ang. Quartz Tuning Fork) stanowiące jedną z grup przetworników piezoelektrycznych, mimo dużej atrakcyjności charakteryzujących je parametrów, rzadko znajdowały zastosowanie w czujnikowych układach biologicznych i biochemicznych. Klasyczne aplikacje rezonatorów kwarcowych obejmują zastosowanie przede wszystkim jako aktuatory, czujniki wielkości fizycznych (rys. 1), czy wzorce częstotliwości. Rys. 1 Kamerton QTF jako czujnik różnych zjawisk fizycznych. Cechą charakterystyczną typowych aplikacji czujników QTF jest fakt, że rezonator najczęściej pracuje w powietrzu lub atmosferze gazu obojętnego pod obniżonym ciśnieniem, czyli warunkach odmiennych od panujących w układach bioczujnikowych. Nieliczne prace opisujące zastosowanie czujników QTF w cieczy zawierały wyniki uzyskanie w środowisku o znikomej lepkości i doskonałych właściwościach izolacyjnych (w zakresie przewodnictwa elektrycznego) [1], ex situ po wyciągnięciu czujnika ze środowiska pomiaru i wysuszeniu [2] lub z wykorzystaniem struktur QTF z dodatkowym elementem sensorycznym skonstruowanych tak, że jedynie ów dodatkowy element pracuje w cieczy [3]. Przywołane rozwiązania są obarczone wieloma istotnymi ograniczeniami, na które autor zwraca uwagę w rozprawie. Brak jest natomiast w literaturze przedmiotu propozycji technik i metod pomiarowych odpowiednich do pracy czujników QTF w cieczach nawet w niewielkim stopniu przewodzących lub o znacznej lepkości. Podstawowa trudność w konstrukcji układu pomiarowego pozwalającego na zastosowanie kamertonu QTF jako bioczujnika wynika z tego, że typowe środowisko pracy czujników QTF w aplikacjach biologicznych i biochemicznych stanowią silnie przewodzące roztwory wodne różnych soli. Tak zdefiniowane środowisko pracy czujnika wydaje się nie do uniknięcia, ponieważ istnienie żywych komórek, czy też istnienie cząsteczek takich jak peptydy z zachowaniem ich struktury wyższego rzędu, jest możliwe jedynie w środowisku ciekłym o określonych parametrach (ciśnieniu osmotycznym, ph etc.). W opisanych wyżej warunkach drgania kamertonu są silnie tłumione przez ciekły ośrodek drgań, natomiast sygnał pomiarowy jest zwierany przez przewodzące medium. Dlatego warunkiem efektywnego zastosowania struktur QTF jako bioczujników jest opracowanie metod i technik pomiarowych odpowiednich do wzbudzania i pomiaru parametrów rezonatora QTF pracującego w ciekłym środowisku o znacznej lepkości i przewodności. Mając na uwadze opisane wyżej uwarunkowania autor postawił za podstawowy cel rozprawy: Opracowanie metod pomiaru parametrów czujników QTF, odpowiednich dla zastosowań, w których drgania czujników QTF są silnie tłumione oraz przetestowanie tych technik w wybranych czujnikowych aplikacjach biologicznych i biochemicznych

3 II. OPIS ETAPÓW BADAŃ Autor przystępując do badań dokonał przeglądu znanych z literatury technik pomiaru parametrów drgań czujników QTF zwracając uwagę na zalety oraz niedostatki tych metod. Ocenie zostały poddane następujące techniki: a) Pomiar w układzie generatora Pierce a. b) Pomiar w układzie obcowzbudnym. c) Pomiar technikami spektroskopii impedancyjnej. Spośród wyżej wymienionych za najbardziej przydatną w swoich badaniach autor uznał uproszczoną wersję spektroskopii impedancyjnej technikę pomiaru modułu admitancji. Wiarygodność wyników uzyskiwanych tą metodą potwierdzono wykazując, że w środowisku gazowym wyniki uzyskiwane metodą pomiaru modułu admitancji charakteryzuje doskonała zgodność z rzeczywistą amplitudą drgań czujnika QTF [4]. Z wykorzystaniem techniki pomiaru modułu admitancji, w ramach projektu Czujniki i Sensory do Pomiaru Czynników Stanowiących Zagrożenia w Środowisku (POIG /08), został zbudowany wielokanałowy system CIS-SMA pozwalający na jednoczesny pomiar zmian masy 8 czujników QTF. W ramach prowadzonych badań autor przeprowadził kalibrację struktur QTF w roli czujnika zmiany masy (rys. 2). Rys. 2 Kamerton QTF jako czujnik zmian masy zmiana masy skutkuje spadkiem częstotliwości rezonansu. Autor, opierając się na tzw. metodzie Clevelanda przeprowadził analizę wpływu zmian masy cząstek równomiernie zaadsorbowanych na powierzchni czujnika na parametry jego drgań [4]. Dzięki temu autor mógł określić czułość struktury QTF zastosowanej jako czujnik cienkich warstw cząsteczek lub komórek bazujący na pomiarach zmian masy.

4 Dysponując systemem pomiarowym oraz skalibrowanymi czujnikami masy w postaci struktur QTF autor rozprawy mógł, wraz ze współpracownikami z Instytutu Genetyki i Mikrobiologii Uniwersytetu Wrocławskiego, przeprowadzić próbę zastosowania systemu CIS-SMA oraz czujników QTF w aplikacji mikrobiologicznej. Wykorzystano kamerton QTF jako sensor przyrostu masy biofilmu bakteryjnego Pseudomonas aeruginosa (Pałeczka ropy błękitnej). Potencjał formowania biofilmu bakteryjnego jest jednym z istotnych parametrów opisujących właściwości poszczególnych gatunków i szczepów bakterii (zdolność ta wpływa na przykład na oporność bakterii na działanie antybiotyków [5]). Została wykazana przydatność takiej metody monitorowania stanu biofilmu bakteryjnego, przeprowadzono szereg testów kontrolnych z użyciem techniki kolorymetrycznej bazującej na adsorpcji barwnika (fioletu krystalicznego) przez matrycę biofilmu. Prowadzono również pomiary AFM (ang. Atomic Force Mikroscopy celem jednoznacznego potwierdzenia obecności biofilmu bakteryjnego na powierzchni czujników oraz oceny jego struktury (rys. 3). Rys. 3 Pomiar topografii biofilmu w różnych fazach wzrostu na powierzchni czujnika QTF. Wykazano przydatność systemu pomiarowego CIS-SMA nie tylko do obserwacji szybkości przyrostu biofilmu formowanego przez różne szczepy Pseudomonas aeruginosa, ale również do oceny skuteczności działania antybiotyków w zakresie hamowania wzrostu biofilmu bakteryjnego. Trzeba tutaj zaznaczyć, że pomiary były prowadzone ex situ po wyciągnięciu czujników z hodowli bakteryjnych i przeprowadzeniu odpowiedniej preparatyki, co autor uznał za największą wadę opracowanej techniki. Powyższy wniosek skłonił autora do prac nad metodą pozwalającą na pomiar parametrów drgań kamertonu QTF w ciekłym, przewodzącym środowisku,co zaowocowało opracowaniem tzw. Metody Drgań Gasnących - MDG [6]. Technika MDG bazuje na zastosowaniu modulowanego sygnału pobudzającego i odpowiedniej obróbki sygnału pomiarowego QTF. O ile w klasycznych technikach pomiarowych wzbudzanie drgań i pomiar odbywają się w tym samym czasie, to w MDG, dzięki zastosowaniu modulowanego sygnału wzbudzającego oraz właściwości rezonatora do magazynowania energii, możliwe jest prowadzenie pomiaru drgań po zaprzestaniu pobudzenia (rys. 4). W momencie zaprzestania pobudzenia prądy pasożytnicze, których przepływ w typowych technikach pomiarowych wymuszany jest przez

5 obecność napięcia wzbudzającego, zanikają, dzięki czemu możliwy staje się pomiar prądu piezoelektrycznego I m, który towarzyszy gasnącym drganiom czujnika. Wykorzystanie metody MDG w konstrukcji elektroniki pomiarowej pozwoliło na stworzenie kompaktowego, przenośnego oraz niedrogiego urządzenia pomiarowego. Rys. 4 Schemat ideowy układu realizującego technikę MDG oraz przebiegi prądu użytecznego I m oraz pasożytniczego I p w czasie trwania cyklu pomiarowego. Opracowanie narzędzia odpowiedniego prowadzenia pomiarów parametrów drgań kamertonu QTF w cieczy nie wystarczy do skutecznego zastosowania tego przyrządu jako czujnika w ciekłym środowisku. Jest to spowodowane tym, ze fizyka drgań rezonatora umieszczonego w środowisku silnie tłumiącym drgania znacząco różni się od zachowania takiego przyrządu w środowisku gazowym. Parametry fizykochemiczne cieczy takie jak lepkość i gęstość bardzo mocno wpływają zarówno na amplitudę jak i częstotliwość drgań rezonansowych czujnika. Autor bazując na modelu zaproponowanym dla dźwigni drgających jednostronnie podpartych przez K. Kokuban z zespołem [7] przeprowadził analizę teoretyczną wpływu lepkości i gęstości cieczy na parametry rezonansowe czujnika QTF. Autor przeprowadził kalibrację czujnika QTF w zastosowaniu do pomiaru wyżej wymienionych właściwości cieczy [8]. Dynamiczne zmiany lepkości ośrodka towarzyszą wielu procesom biochemicznym, których podstawą jest mechanizm polimeryzacji białek. Najbardziej charakterystycznym według autora

6 przykładem takiego procesu jest krzepnięcie krwi. Dochodzi w tym wypadku do reakcji enzymatycznej w ramach której białko fibrynogen polimeryzuje, co skutkuje powstaniem innego białka fibryny, mającej kluczowe znaczenie w procesie powstawania skrzepu. Autor ze współpracownikami z Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk badał możliwość wykorzystania techniki MDG do pomiarów zmian lepkości towarzyszących procesom podobnym, do opisanej wyżej reakcji enzymatycznej będącej elementem krzepnięcia krwi. Zespół pracował nad możliwością wykorzystania czujników QTF dla usprawnienia i automatyzacji testów biochemicznych służących do detekcji endotoksyn bakteryjnych. Detekcja tych cząsteczek w środowisku stanowi poważny problem kliniczny i przemysłowy [9, 10]. Obecność tych cząsteczek w lekach może wywołać bardzo ostrą reakcję ludzkiego organizmu, stąd w przemyśle farmaceutycznym obowiązują restrykcyjne normy określające np. dopuszczalny poziom endotoksyn w wodzie używanej w produkcji leków. W badaniach został wykorzystany preparat przygotowywany z limfy skrzypłocza, bezkręgowca, którego mechanizmem obronnym w walce z bakteriami wytwarzającymi endotoksyny jest żelowanie limfy spowodowane kaskadą reakcji enzymatycznych. Z użyciem jednej z najprostszych odmian komercyjnego testu endotoksyn (test Gel Clot) bazującego na wykorzystaniu lizatu z limfy skrzypłocza - LAL (ang. Limulus Amebocyte Lysate), udało się uzyskać ilościową detekcję endotoksyn przy wykorzystaniu jakościowego w założeniu testu (rys. 5). Rys. 5 Wynik pomiaru stężenia endotoksyn w próbkach zawierających komórki bakterii E. coli O157:H19. Zdołano jednocześnie znacznie zredukować koszt próby 10-krotnie zmniejszając objętość lizatu potrzebną do wykonania pojedynczego testu eliminując czynnik ludzki w ocenie wyniku. Potwierdzono tym samym możliwość skutecznego zastosowania czujników QTF w aplikacji biochemicznej.

7 III. PODSUMOWANIE Autor rozprawy wprowadził czytelnika w zagadnienia związane z metrologią parametrów drgań struktur QTF wykazując, że spośród metod opisanych w literaturze przedmiotu najciekawszymi możliwościami w zakresie prostoty układu pomiarowego i oferowanych parametrów charakteryzuje się technika pomiaru modułu admitancji czujnika QTF. Wykazano, że w środowisku gazowym wyniki uzyskiwane metodą pomiaru modułu admitancji wykazują doskonałą zgodność z rzeczywistą amplitudą drgań czujnika QTF. Dlatego, na bazie tej metody pomiaru został zbudowany system CIS-SMA, który posłużył do kalibracji czujników QTF w zastosowaniu do pomiaru niewielkich zmian masy. Dysponując systemem pomiarowym oraz skalibrowanymi czujnikami masy w postaci struktur QTF autor rozprawy mógł, wraz ze współpracownikami z UWr przeprowadzić próbę zastosowania systemu CIS- SMA oraz czujników QTF w aplikacji mikrobiologicznej związanej z obserwacją wzrostu biofilmu bakteryjnego. Została wykazana przydatność takiej metody oceny dynamiki powstawania biofilmu bakteryjnego, przeprowadzono szereg testów kontrolnych z użyciem techniki kolorymetrycznej, jak również wykazano przydatność metody do oceny skuteczności działania antybiotyków w zakresie hamowania wzrostu biofilmu. Jednocześnie, jako główne ograniczenie możliwości badawczych systemu CIS-SMA wskazano brak możliwości przeprowadzania obserwacji w środowisku cieczowym. Autor rozprawy obszernie omówił problemy metrologiczne pojawiające się w sytuacji, gdy czujniki piezoelektryczne takie jak kamertony QTF są stosowane w środowisku ciekłym o dużej przewodności elektrycznej i znacznej lepkości, zwracając jednocześnie uwagę, że jest środowisko typowe dla zdecydowanej większości potencjalnych zastosowań mikrobiologicznych i biochemicznych. Omówiony został również wpływ parametrów środowiska ciekłego takich jak lepkość oraz gęstość cieczy na odpowiedź czujnika. Analizie poddano możliwość stosowania kamertonu jako bioczujnika reagującego na zmiany zachodzące w ośrodku drgań (takie jak np. żelowanie) wywołane reakcjami chemicznymi o podłożu biologicznym i biochemicznym. Autor zaproponował odpowiednią do pomiarów w cieczy Metodę Drgań Gasnących (MDG) bazującą na zastosowaniu modulowanego sygnału pobudzającego i odpowiedniej obróbki sygnału pomiarowego QTF. Mając do dyspozycji system pomiarowy pozwalający na pomiary w przewodzącym środowisku cieczowym oraz struktury QTF na tyle niedrogie, że można je stosować jako czujniki jednorazowego użytku, autor, wraz ze współpracownikami z IITD PAN podjął próbę zastosowania czujników QTF do detekcji endotoksyn bakteryjnych, których obecność w środowisku stanowi poważny problem przemysłowy i kliniczny. Z użyciem jednej z najprostszych odmian komercyjnego testu endotoksyn bazującego na wykorzystaniu LAL (ang. Limulus Amebocyte Lysate), udało się uzyskać ilościową detekcję endotoksyn przy wykorzystaniu jakościowego w założeniu testu redukując jednocześnie koszt jednostkowy testu. Tym samym, autor zdołał zastosować struktury QTF w wybranej aplikacji zarówno mikrobiologicznej oraz biochemicznej. Warto podkreślić, że ze względu na brak (do czasu opracowania MDG) technik pozwalających na pomiary z użyciem komercyjnych QTF w lepkim, przewodzącym środowisku cieczowym, badania nad zastosowaniem QTF i LAL do detekcji endotoksyn bakteryjnych, stanowią pierwszy opublikowany w literaturze eksperyment, w ramach którego struktury QTF pracowały in situ jako czujniki w tego typu środowisku. IV. LITERATURA [1] Y. Liu, R. DiFoggio, K. Sanderlin, L. Perez, J. Zhao, Measurement of density and viscosity of dodecane and decane with a piezoelectric tuning fork over K and MPa, Sensors and Actuators A Physical 2011, 167, [2] X. Su, C. Dai, J. Zhang, S.J. O Shea, Quartz tuning fork biosensor, Biosensors and Bioelectronics 2002, 17,

8 [3] S. Vlassova, O. Schelerb, M. Plaadoa, R. Lõhmusa, A. Kurgb, K. Saala, I. Kinka, Integrated carbon nanotube fibre quartz tuning fork biosensor, Proceedings of the Estonian Academy of Sciences 2012, 61, [4] K. Waszczuk, G. Gula, M. Swiatkowski, J. Olszewski, W. Herwich,Z. Drulis-Kawa, J. Gutowicz, T. Gotszalk, Evaluation of pseudomonas aeruginosa biofilm formation using piezoelectric tuning fork mass sensors, Sensors and Actuators B: Chemical 2012, 170, 7-12 [5] G. Gula, K. Waszczuk, T. Olszak, J. Majewska, J. Sarowska, T. Gotszalk, J. Gutowicz, Z. Drulis-Kawa, Piezoelectric tuning fork based mass measurement method as a novel tool for determination of antibiotic activity on bacterial biofilm, Sensors and Actuators B: Chemical 2012, 175, [6] K. Waszczuk, T. Piasecki, K. Nitsch, T. Gotszalk, Modulation of excitation signal as a method for measurement of the mechanical properties of miniature piezoelectric resonant devices in a viscous and conductive environment, Measurement Science and Technology 2013, 24, [7] K. Kokubun, M. Hirata, H. Murakami, Y. Toda, M. Ono, A bending and stretching mode crystal oscillator as a friction vacuum gauge, Vacuum 1984, 34, [8] K. Waszczuk, T. Piasecki, K. Nitsch, T. Gotszalk, Application of piezoelectric tuning forks in liquid viscosity and density measurements, Sensors and Actuators B: Chemical 2011, 160, [9] T.J. Novitsky, Biomedical Applications of Limulus Amebocyte Lysate, Biol. Conserv. Horseshoe Crabs 2009, [10] S.C.P.L. Shiramizo, A.R. Marra, M.S. Durão, Â.T. Paes, M.B. Edmond, O.F.P. d. Santos, Decreasing Mortality in Severe Sepsis and Septic Shock Patients by Implementing a Sepsis Bundle in a Hospital Setting, 2011, V. DOROBEK NAUKOWY [1] K. Waszczuk, G. Gula, M. Swiatkowski, J. Olszewski, W. Herwich,Z. Drulis-Kawa, J. Gutowicz, T. Gotszalk, Evaluation of pseudomonas aeruginosa biofilm formation using piezoelectric tuning fork mass sensors, Sensors and Actuators B: Chemical 2012, 170, 7-12 [2] T. Piasecki, G. Guła, K. Waszczuk, Z. Drulis-Kawa, T. Gotszalk, Quartz Tuning Fork as in-situ sensor of bacterial biofilm, Eurosensors XXVIII Conference, 2014 [3] K. Waszczuk, T. Piasecki, K. Nitsch, T. Gotszalk, Application of piezoelectric tuning forks in liquid viscosity and density measurements, Sensors and Actuators B: Chemical 2011, 160, [4] K. Sozanski, A. Wisniewska, T. Piasecki, K. Waszczuk, A. Ochab-Marcinek, T. Gotszalk, R. Holyst, A depletion layer in polymer solutions at an interface oscillating at the subnano-to submicrometer scale, Soft matter 2014, 10, [5] A. Chałupniak, K. Waszczuk, K. Hałubek-Głuchowska, T. Piasecki, T. Gotszalk, J. Rybka, Application of quartz tuning forks for detection of endotoxins and Gram-negative bacterial

9 cells by monitoring of Limulus Amebocyte Lysate coagulation, Biosensors and Bioelectronics 2014, 58, [6] T. Piasecki, G. Guła, K. Nitsch, K. Waszczuk, Z. Drulis-Kawa, T. Gotszalk, Evaluation of Pseudomonas aeruginosa biofilm formation using Quartz Tuning Forks as impedance sensors, Sensors and Actuators B: Chemical 2013, 189, [7] G. Gula, K. Waszczuk, T. Olszak, J. Majewska, J. Sarowska, T. Gotszalk, J. Gutowicz, Z. Drulis-Kawa, Piezoelectric tuning fork based mass measurement method as a novel tool for determination of antibiotic activity on bacterial biofilm, Sensors and Actuators B: Chemical 2012, 175, [8] K. Waszczuk, T. Piasecki, K. Nitsch, T. Gotszalk, Modulation of excitation signal as a method for measurement of the mechanical properties of miniature piezoelectric resonant devices in a viscous and conductive environment, Measurement Science and Technology 2013, 24, [9] T. Piasecki, G. Guła, K. Waszczuk, Z. Drulis-Kawa, T. Gotszalk, Quartz tuning fork as in situ sensor of bacterial biofilm, Sensors and Actuators B: Chemical 2015, 210,