Chrom w hydroksyapatytach kamieni ó³ciowych u kobiet pal¹cych aktywnie i biernie oraz niepal¹cych tytoñ

Transkrypt

1 PRACE ORYGINALNE Mariusz BOGUNIA Bo ena AHNERT Jerzy KWAPULIÑSKI Barbara BRODZIAK-DOPIERA A Jolanta KOWOL Ewa NOGAJ Edyta BOGUNIA Urszula OLEŒKÓW Chrom w hydroksyapatytach kamieni ó³ciowych u kobiet pal¹cych aktywnie i biernie oraz niepal¹cych tytoñ Chromium in hydroxiapatites of gallstones from active and passive smoking and non smoking women Katedra i Zak³ad Toksykologii, Œl¹ski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Kierownik Katedry i Zak³adu Toksykologii: Prof. dr hab. Jerzy Kwapuliñski Dodatkowe s³owa kluczowe: chrom aktywne i bierne palenie tytoniu kobiety kamienie ó³ciowe Additional keywords: chromium active and passive tobacco smoking women gallstones Przeprowadzono badania nad zmianami wystêpowania chromu w kamieniach ó³ciowych pobranych od 93 kobiet, w tym 24 kobiety stanowi³y grupê aktywnie pal¹cych, 18 kobiet stanowi³o grupê pal¹cych biernie, a 51 niepal¹cych tytoñ. Sk³ad pierwiastkowy kamieni ó³ciowych okreœlono metod¹ ICP-AES (Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spektroskopy atomowa spektroskopia emisyjna z plazm¹ wzbudzon¹ indukcyjnie). Badania nad wystêpowaniem chromu w z³ogach kamieni ó³ciowych wykaza³y obecnoœæ wiêkszych jego stê eñ u kobiet biernie pal¹cych (3,15 µg/g), w porównaniu do kobiet pal¹cych (1,20 µg/g) i niepal¹cych tytoñ (0,89 µg/ g). Wykazano odrêbny sposób kszta³towania siê podobieñstwa zmian zawartoœci chromu w nawi¹zaniu do innych pierwiastków w z³ogach pêcherzyka ó³ciowego u kobiet biernie pal¹cych tytoñ w porównaniu do kobiet pal¹cych i niepal¹cych tytoñ. The studies were carried out on the changes in chromium content in concretions of gallstones taken from 93 women (24 active smoking, 18 passive smoking, 51 non smoking women), respectively. Chromium content was determined with ICP-AES method (Inductively Coupled Plasma - Atomic Emission Spectroscopy). Studies on chromium occurrence in concretions of gallstones showed the presence of its higher concentrations in passive smoking women (3.15 µg/g) in comparison with active smoking (1.20 µg/g) and non smoking women (0.89 µg/g). Separate patterns of changes in chromium in active, passive and no smoking women gallstones were demonstrated. Adres do korespondencji: Dr Mariusz Bogunia Katedra i Zak³ad Toksykologii, Œl¹ski Uniwersytet Medyczny ul. Jagielloñska Sosnowiec Tel.: (+32) mbogunia@sum.edu.pl Wstêp Nikotynizm, pomimo prowadzonych przeciwnikotynowych programów edukacyjnych oraz wzrostu œwiadomoœci spo³ecznej o szkodliwoœci palenia tytoniu, pozostaje nadal powszechnym problemem spo³ecznym. Powszechnoœæ czynnego palenia tytoniu dotyczy szczególnie ludzi m³odych oraz w œrednim wieku czêsto rodziców ma³ych dzieci [2]. Skutkiem czynnego palenia tytoniu jest bierne palenie otoczenia (ETS Environmental Tobacco Smoke, dym tytoniowy w œrodowisku), które wywiera szczególnie negatywny wp³yw na ma³e dzieci, niemowlêta, a równie na p³ód i noworodki [8,10]. Liczne badania potwierdzaj¹ wystêpowanie istotnego zwi¹zku pomiêdzy biernym nara eniem na dym tytoniowy a zachorowalnoœci¹ na wiele chorób, inwalidztwa, a tak e œmierci [7,15]. Ocenia siê, e z powodu biernego palenia rocznie umiera w Polsce 1000 osób, natomiast w Stanach Zjednoczonych [12]. Bierne palenie tytoniu powoduje te same problemy, jak palenie bezpoœrednie zwiêkszaj¹c ryzyko zachorowania na raka p³uc, chorób uk³adu kr¹ enia, infekcje ucha oraz schorzeñ p³uc takich, jak: zapalenie oskrzeli, przewlek³a obturacyjna choroba p³uc, astma i alergia u dzieci i doros³ych [1,3,4,5, 7,9,11,13]. Bierne nara enie na dym tytoniowy zwiêksza ryzyko poronienia i wad wrodzonych, przyczynia siê do niskiej masy urodzeniowej z obni eniem ywotnoœci noworodków w skali Apgar oraz mo e wywo³aæ zespó³ œmierci ³ó eczkowej [6]. Efektem d³ugotrwa³ego biernego palenia tytoniu jest przyspieszony rozwój mia d ycy, pozakrzepowe zaburzenia metabolizmu p³ytek krwi, odp³ywy o³¹dkowoprze³ykowe u dzieci i doros³ych [8]. Badania nad wp³ywem nara enia dzieci na dym tytoniowy wykaza³y gorszy rozwój psychofizyczny, depresje oraz k³opoty wychowawcze oraz edukacyjne zwi¹zane z niedojrza³ym zachowaniem dzieci [6]. Miêdzynarodowa Agencja Badañ nad Rakiem dosz³a do wniosku, e bierne palenie jest czynnikiem rakotwórczym z grupy 1 [15]. Czynnikiem rakotwórczym s¹ równie zwi¹zki chromu, które poza uszkodzeniem uk³adu oddechowego, przewodu pokarmowego i zmianami skórnymi, wykazuj¹ dzia- ³anie mutagenne, embriotoksyczne i teratogenne. 524 M. Bogunia i wsp.

2 Tabela I Charakterystyka statystyczna wystêpowania chromu w z³ogach kamieni ó³ciowych kobiet [µg/g]. Statistical characteristics of occurrence chromium in women gallstones [µg/g]. M etal Najbardziej Zaw arto ci odpow iadaj¹ce perceny low i: Wspó³czy nniki Odchy lenie Zakres zm ian praw dopodobny ary tm ety czna geom etry czna standardow e sko no ci kurtozy Zm ienno ci [%] staty sty cznie zakres zm ian rednia Kobiety Pal¹ce 1,20 0,64 2,67 0,13 17,32 0,25 3,15 1,09 5,90 0,18 20,03 0,25 0,57 1,60 2,54 5,56 33, ,38 2,03 20,03 2,56 5, ,21 6,09 2,61 4,21 20, ,55 1,23 Kobiety Biernie Pal¹ce 0,80 18,13 Kobiety Niepal¹ce 0,89 0,56 1,34 0,12 8,70 0,22 0,50 1,36 Rycina 1 Wspó³wystêpowanie chromu z innymi pierwiastkami w z³ogach pêcherzyka ó³ciowego kobiet. Co-occurrence of chromium in relationships to other elements in gallstones in the women. Utleniaj¹ce w³a ciwo ci chromu sze ciowarto ciowego s¹ odpowiedzialne za jego toksyczne dzia³anie. Chrom trójwarto ciowy, który wchodzi w sk³ad czynnika tolerancji glukozy (GTF, Glucose Tolerance Factor), jest niezbêdny do zachowania prawid³owego metabolizmu glukozy u ludzi i zwierz¹t. Chrom odgrywa tak e istotn¹ rolê w metabolizmie niektórych bia³ek i lipidów, a zw³aszcza cholesterolu [10]. Celem pracy by³a po rednia ocena nara enia chromu w nawi¹zaniu do zawarto ci wybranych metali w dymie tytoniowym, dokonana na przyk³adzie ludzkich kamieni ó³ciowych, pochodz¹cych od kobiet pal¹cych aktywnie i biernie oraz niepal¹cych tytoñ. Materia³ i metody Przedmiotem badañ by³y kamienie ó³ciowe w przebiegu kamicy ó³ciowej, pozyskane ródoperacyjnie od 93 kobiet, w tym 24 kobiety stanowi³y grupê aktywnie pal¹cych, 18 kobiet stanowi³o grupê pal¹cych biernie, a 51 niepal¹cych tytoñ, zamieszkuj¹cych tereny Polski po³udniowej. Pozyskane kamienie ó³ciowe suszono w suszarce laboratoryjnej, w temperaturze 105 C±1 C, do sta³ej masy (±0,001 g), a nastêpnie rozdrabniano. Z rozdrobnionego materia³u odwa ano 0,5 g i zadawano 5 ml spektralnie czystego 65% HNO3 (Supra pure Merck), pozostawiono pod przykryciem i po 24 godzinach odparowywano do sucha na ³a ni piaskowej, a nastêpnie zalewano 3 ml spektralnie czystego 65% HNO3 i 2 ml 70% HClO4. Zmineralizowane próby (klarowny roztwór) przenoszono ilo ciowo do kolby miarowej o pojemno ci 25 ml i uzupe³niano wod¹ redestylowan¹ do kreski. W tak przygotowanych roztworach zawarto æ chromu oznaczano metod¹ ICP-AES. Precyzja pomiaru dla chromu wynosi³a 1,3%, natomiast wykrywalno æ tego pierwiastka wynosi³a 0,01 µg/g. Wyniki i ich omówienie Zagadnienie wystêpowania chromu w kamieniach ó³ciowych analizowano na przyk³adzie kobiet aktywnie i biernie pal¹cych oraz niepal¹cych tytoñ, zamieszkuj¹cych rejony Polski po³udniowej (tabela I). Jedn¹ z istotnych struktur, z punktu widzenia toksykologii, s¹ z³ogi pêcherzyka ó³ciowego, które spe³niaj¹ postulat d³ugie- go okresu pó³trwania pierwiastków wchodz¹cych w ich sk³ad. Z³ogi kamieni ó³ciowych s¹ materia³em patogennym, powsta³ym w wyniku eliminacji wybranych pierwiastków z organizmu. Czêsto æ wystêpowania, pochodz¹cych od kobiet zamieszkuj¹cych rejony Polski po³udniowej, posiada³a na ogó³ charakter normalny. Istotno æ ró nic zawarto ci chromu w z³ogach pêcherzyka ó³ciowego wykazano metod¹ Kruskala-Walisa (p=0,005). Przeprowadzona charakterystyka statystyczna wystêpowania chromu w z³ogach pêcherzyka ó³ciowego kobiet, w odniesieniu do roli na³ogu palenia tytoniu, wykaza³a du ¹ zmienno æ wystêpowania chromu u kobiet pal¹cych tytoñ rzêdu 418% i u niepal¹cych 241%, a u biernie pal¹cych tytoñ 187% (tabela I). Bardzo du ¹ zmienno æ wystêpowania kobiet, w odniesieniu do roli na³ogu palenia tytoniu, t³umaczy siê du ym rozstêpem za525

3 Rycina 2 Zale no æ stê enia chromu w z³ogach pêcherzyka ó³ciowego od czynników socjalnych. The effect of social factors on chromium occurrence in women gallbladder concretions. Rycina 3 Podobieñstwo wystêpowania chromu w z³ogach kamieni ó³ciowych kobiet niepal¹cych. Similarity of chromium and other elements co-occurrence in gallstones in the females non smoking. warto ci chromu w dymie tytoniowym. Analiza wystêpowania wykaza³a statystycznie istotnie wy sz¹ zawarto æ chromu ( rednia arytmetyczna) u kobiet biernie pal¹cych tytoñ (3,15 µg/g), w porównaniu do kobiet niepal¹cych (0,89 µg/g) oraz aktywnie pal¹cych tytoñ (1,20 µg/g). Wyniki te potwierdzaj¹ tak e zakresy zawarto ci u kobiet biernie pal¹cych tytoñ (od 0,18 do 20,03 µg/g), u kobiet niepal¹cych (od 0,12 do 8,70 µg/g) oraz u kobiet pal¹cych tytoñ (od 0,18 do 20,03 µg/g) (tabela I). Uzyskane wyniki sugeruj¹, e proces eliminacji chromu z organizmu do z³ogów pêcherzyka ó³ciowego mo e byæ tak e determinowany na³ogiem palenia tytoniu. Uzyskane rezultaty badañ wskazuj¹ tak e na ró ne pochodzenie chromu w z³ogach pê526 cherzyka ó³ciowego oraz na znaczenie procesów kontaminacji i interakcji chromu z innymi pierwiastkami w konkurencji o miejsce w hydroksyapatytach kamieni ó³ciowych. Najbardziej prawdopodobny statystycznie zakres zmian zawarto ci kobiet aktywnie pal¹cych tytoñ wynosi³ od 0,38 µg/g do 2,03 µg/g, u kobiet biernie pal¹cych tytoñ od 0,21 µg/g do 6,09 µg/g, natomiast u kobiet niepal¹cych tytoñ od 0,55 µg/g do 1,23 µg/g (tabela I). Zaobserwowane zakresy zmian zawarto ci kobiet stanowi¹ niezwykle istotny argument o jego obecno ci i kierunku migracji do wybranych czê ci organizmu, poniewa zawarto æ tego pierwiastka w wybranych narz¹dach, czy tworach patogennych odzwierciedla nie tylko jego metabolizm, lecz tak e przeciêtn¹, permanentn¹ jego poda. Porównanie zawarto ci chromu odpowiadaj¹cej 10 percentylowi wykaza³o podobn¹ tendencjê zmian zawarto ci chromu w z³ogach pêcherzyka ó³ciowego kobiet nara onych na dym tytoniowy. Wed³ug interpretacji pojêcia 10 percentyla zawarto æ chromu wynosz¹ca 0,25 µg/g w z³ogach kamieni ó³ciowych kobiet aktywnie i biernie pal¹cych tytoñ oraz 0,22 µg/g u kobiet niepal¹cych tytoñ, mo na przyj¹æ jako ilo æ tego pierwiastka, eliminowan¹ z organizmu do z³ogów pêcherzyka ó³ciowego, która jest charakterystyczna dla przeciêtnych zawarto ci rodowiskowych chromu oraz ilo ci tego pierwiastka w codziennej diecie. Warto æ stê enia 0,22 µg/g w z³ogach pêcherzyka ó³ciowego kobiet niepal¹cych tytoñ mo na uznaæ jako warto æ odniesiem. Bogunia i wsp.

4 Rycina 4 Podobieñstwo wystêpowania chromu w z³ogach kamieni ó³ciowych kobiet biernie pal¹cych. Similarity of chromium and other elements co-occurrence in gallstonesin the females passive smoking. Rycina 5 Podobieñstwo wystêpowania chromu w z³ogach kamieni ó³ciowych kobiet pal¹cych. Similarity of chromium and other elements co-occurrence in gallstones in the females active smoking. nia, zarówno w ocenach prognozowania zmian zawarto ci chromu w rodowisku przyrodniczym, jak i monitorowania roli na³ogu palenia tytoniu ze wzglêdu na czas trwania na³ogu, jak i wiek kobiet. Natomiast wysoka zawarto æ chromu (20,03 µg/g) odpowiadaj¹ca 95 percentylowi wiadczy o udziale tego pierwiastka w intoksykacji organizmu kobiet nara onych na dym tytoniowy w rodowisku (tabela I.). Kolejnym analizowanym zagadnieniem by³o okre lenie charakteru wspó³wystêpowania chromu z innymi pierwiastkami w z³ogach pêcherzyka ó³ciowego kobiet. W celu uzyskania istotnych warto ci wspó³czynników korelacji, okre laj¹cych wspó³zale no æ zmian zawarto ci chromu z zmianami zawarto ci wybranych pierwiastków, ilustruj¹ wspó³czynniki korelacji uzyskane metod¹ analizy korelacyjnej (Pearson'a i Spermana; p<0,05). W kamieniach ó³ciowych kobiet biernie pal¹cych tytoñ zaobserwowano szereg silnych powi¹zañ we wspó³wystêpowaniu chromu z innymi pierwiastkami. W tej grupie kobiet zmiany o charakterze wprost proporcjonalnym dotyczy³y S, Fe, Cu, Ni, Pb, Zn, As, Se, Ti, Sr, Ca, Mg, Na, K. Natomiast zale no ci odwrotnie proporcjonalne wystêpowa³y w odniesieniu do zmian zawarto ci Si, Al, Ba (rycina 1). Chrom w z³ogach pêcherzyka ó³ciowego kobiet niepal¹cych tytoñ wykaza³ w³a ciwo ci synergistyczne w stosunku do Ni, Pb, Hg, Ti oraz antagonistyczne interakcje w odniesieniu do Si, As, Ba, Mg (rycina 1). Równie w grupie kobiet pal¹cych tytoñ pojawi³o siê niewiele istotnych powi¹zañ chromu z wybranymi pierwiastkami. Synergistyczne wspó³zale no ci dotyczy³y B, Pb, Zn, Ti, Bi, a antagonistyczne Mn, Ca, Na (rycina 1). 527

5 Obserwowane w kamieniach ó³ciowych kobiet niepal¹cych i pal¹cych tytoñ s³abe zale noœci korelacyjne sugeruj¹ wykorzystanie biodostêpnej puli chromu w innych procesach metabolicznych zachodz¹cych w organizmie kobiet. Porównanie wartoœci wspó³czynników korelacji opisuj¹cych zmiany zawartoœci chromu z poszczególnymi pierwiastkami u kobiet aktywnie i biernie pal¹cych oraz niepal¹cych tytoñ, wyraÿnie œwiadczy o roli na³ogu palenia tytoniu w procesie uporz¹dkowanego samooczyszczania siê organizmu z poszczególnych pierwiastków do z³ogów pêcherzyka ó³ciowego na drodze eliminacji. Analizowano tak e zale noœæ wystêpowania kobiet aktywnie i biernie pal¹cych oraz niepal¹cych tytoñ od czynników socjalnych (wiek, miejsce zamieszkania, wykszta³cenie, rodzaj diety, picie alkoholu, spo ywanie kawy, stopieñ oty³oœci) (rycina 2). W kamieniach ó³ciowych kobiet niepal¹cych tytoñ wprost proporcjonalne zale - noœci dotyczy³y miejsca zamieszkania, spo- ywania alkoholu, stopnia wykszta³cenia i oty³oœci, natomiast rola diety mia³a charakter odwrotnie proporcjonalny w stosunku do zawartoœci chromu (rycina 2). W grupie kobiet pal¹cych tytoñ zaobserwowano synergistyczne interakcje w odniesieniu do stopnia wykszta³cenia, rodzaju diety i stopnia oty³oœci, a antagonistyczne do miejsca zamieszkania, spo ywania kawy i alkoholu (rycina 2). Z kolei w kamieniach ó³ciowych kobiet biernie pal¹cych tytoñ charakterystyczne by³y odwrotnie proporcjonalne wp³ywy chromu w odniesieniu do wszystkich analizowanych parametrów (rycina 2). Zastosowana w badaniach metoda analizy korelacyjnej zosta³a potwierdzona wynikami analizy podobieñstwa grupowego. Celem tej analizy jest ³¹czenie obiektów w coraz to wiêksze zwi¹zki, z zastosowaniem miary odleg³oœci wi¹zania, tzw. odleg³oœci euklidesowych. W celu grupowania pierwiastków, wykorzystano metodê Ward'a, która jest najczêœciej stosowana dla oceny tworzenia skupieñ o ma³ej wielkoœci [14]. Dla okreœlenia odleg³oœci miêdzy skupieniami wykorzystano odleg³oœci euklidesowe. Wyniki analizy przedstawiono w postaci dendrogramów (rycina 3, 4, 5). W z³ogach pêcherzyka ó³ciowego kobiet niepal¹cych chrom najsilniej by³ zwi¹zany z zmianami stê enia Bi, Ni, nastêpnie z zawartoœci¹ Co, Hg, Ti (odleg³oœæ euklidesowa rzêdu 2,5). Najmniejsze podobieñstwo wystêpowania stwierdzono dla Ca, P, S, Na (odleg³oœæ euklidesowa rzêdu 3400,0) (rycina 3). W grupie kobiet biernie pal¹cych tytoñ bezpoœrednie zale noœci chromu zwi¹zane by³y z zmianami zawartoœci Bi, Pb, Ti, Li, Sb, As, Mo (odleg³oœæ euklidesowa rzêdu 5,0), poœrednio z zmianami zawartoœci Se, Ba, Sr, Mg, Fe (odleg³oœæ euklidesowa rzêdu 23,0). Najmniejsze podobieñstwo wystêpowania dotyczy³o S, Na, P, Ca (odleg³oœæ euklidesowa rzêdu 920,0) (rycina 4). Z kolei chrom w z³ogach pêcherzyka ó³ciowego kobiet pal¹cych tytoñ w najwiêkszym stopniu zale ny by³ od zawartoœci Bi, Ti, Li, Sb, As, (odleg³oœæ euklidesowa rzêdu 50,0) poœrednio z zmianami Zn, Al, Cu, Mn (odleg³oœæ euklidesowa rzêdu 50,0). Najmniejsze podobieñstwo wystêpowania dotyczy³o S, Na, P, Ca (odleg³oœæ euklidesowa rzêdu 4000,0) (rycina 5). Du e wartoœci odleg³oœci euklidesowych dla Ca, P, Na, S mog¹ byæ wyrazem ich du- ych zmian stê eñ w porównaniu do innych pierwiastków w z³ogach kamieni ó³ciowych badanej grupy kobiet i s¹ odzwierciedleniem patofizjologii uk³adu pokarmowego. Wnioski 1. Wykazano istotnie wy sze zawartoœci u kobiet nara onych na bierne palenie tytoniu w porównaniu do kobiet pal¹cych i niepal¹cych tytoñ. 2. Analiza podobieñstwa grupowego oraz analiza korelacyjna dotycz¹ca wspó³wystêpowania wybranych pierwiastków w kamieniach ó³ciowych kobiet aktywnie i biernie pal¹cych oraz niepal¹cych tytoñ potwierdzi- ³a charakter i tendencje zmian ich zawartoœci. 3. Wykazano odmienny sposób wystêpowania i charakter zmian zawartoœci chromu w z³ogach pêcherzyka ó³ciowego u kobiet nara onych na bierne palenie tytoniu, w porównaniu do kobiet pal¹cych i niepal¹cych tytoñ. 4. Na³óg palenia tytoniu jest wspólnym Ÿród³em obecnoœci wielu pierwiastków œladowych (, Be, Ti, Bi, Be, Ni), które posiadaj¹ pierwszorzêdne znaczenie w zmianach hydroksyapatytu kamieni ó³ciowych, przeciwnie, jak w przypadku S, Na, P, Ca, Si, Mg. Piœmiennictwo 1. Alberg A.J., Samet J.M.: Epidemiology of lung cancer. Chest. 2003, 123, Bielska D., O³dak E.: Ekspozycja na dym tytoniowy i jej wp³yw na choroby uk³adu oddechowego wœród bia³ostockich trzylatków. Przegl. Lek. 2004, 61, Boyle P., Autier P., Bartelink H. et al.: European Code Against Cancer and scientific justification: third version. Ann Oncol. 2003, 14, Cantani A., Micera M.: Epidemiology of passive smoke: a prospective study in 589 children. Eur. Rev. Med. Pharmacol Sci. 2005, 9, Janson C.: The effect of passive smoking on respiratory health in children and adults. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2004, 8, Ko³o³o H., Mazur J.: Czy bierne palenie tytoniu pogarsza jakoœæ ycia dzieci i m³odzie y? Przegl. Lek. 2006, 6, Mania M., Przybysz A., Kurylak A.: Bierne palenie tytoniu, a czêstoœæ wystêpowania objawów ze strony uk³adu oddechowego u dzieci od 0-7 lat. Przegl. Lek. 2006, 63, Pirogowicz I., Bujnowska-Fedak M., Piorek M. i wsp.: Wp³yw biernego palenia papierosów na czêstoœæ infekcji dróg oddechowych, alergii i astmy oskrzelowej u dzieci. Przegl. Lek. 2004, 61, Sasco A.J., Secretan M.B., Straif K.: Tobacco smoking and cancer: a brief review of recent epidemiological evidence. Lung Cancer. 2004, 45, Señczuk W.: Toksykologia wspó³czesna. PZWL, Warszawa Skorge T.D., Eagan T.M., Eide G.E. et al.: The adult incidence of asthma and respiratory symptoms by passive smoking in uterus or in childhood. Am. J. Respir. it. Care Med. 2005, 172, Stachura J., Domaga³a W.: Patologia, znaczy s³owo o chorobie. T. 1, patologia ogólna. PAU, Kraków Thomson N.C., Spears M.: The influence of smoking on the treatment response in patients with asthma. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2005, 5, Ward J.H.: Hierarchical grouping to optimize an objective function. J. Am. Stat. Associat. 1963, 58, WHO International Agency for Research on Cancer: Tobacco Smoke and Involuntary Smoking. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, 2002, M. Bogunia i wsp.