Prof. dr hab. inż. Andrzej Jarzębski Gliwice, Wydział Chemiczny Politechniki Śląskiej

Transkrypt

1 Prof. dr hab. inż. Andrzej Jarzębski Gliwice, Wydział Chemiczny Politechniki Śląskiej OCENA rozprawy doktorskiej mgr inż. Igi WASIAK Nanocząstki polisacharydowe, jako nośniki leków otrzymywanie separacja, właściwości fizykochemiczne i biologiczne Promotor prof. nzw. dr hab. Tomasz CIACH Podstawę formalną przedstawienia opinii stanowi decyzja Rady Wydziału Inżynierii Chemicznej i Procesowej Politechniki Warszawskiej przekazana recenzentowi pismem Dziekana z dnia 24 listopada 2016 r. 1. Przedmiot rozprawy Opracowanie efektywnych terapii leczniczych jest przedmiotem troski ludzkości od zarania dziejów. Wiadomo obecnie, że obok substancji aktywnej kapitalny wpływ na efektywność leku posiada jego postać i sposób wprowadzania oraz rodzaj, miejsce i kinetyka uwalniania substancji aktywnej i innych związków zawartych w leku. Niejednokrotnie konieczne jest minimalizowanie niekorzystnych, czy wręcz toksycznych oddziaływań substancji aktywnej na organizm lub zdrowe tkanki, zapewnienie ich ochrony, co dodatkowo komplikuję sprawę. Wyobraźnia naukowotechniczna, oparta na przesłankach fizykochemii i inżynierii chemicznej, nieomylnie podpowiada, że jednoczesne spełnienie wszystkich uwarunkowań może być niezwykle trudne. Konieczność poprawy skuteczności leczenia powszechnych chorób naszej cywilizacji: nowotworowych i układu krążenia, plasuje tę tematykę w grupie o najwyższej randze społecznej - eksponuje rangę chemii farmaceutycznej i inżynierii leków. W konsekwencji, kierunki wytyczane przez medycynę i biologię medyczną stanowią wyzwanie dla setek/tysięcy zespołów z środowisk akademickich i przemysłu na całym świecie. Oceniana rozprawa doktorska pani mgr inż. Igi Wasiak, poświęcona opracowaniu nowych, polisacharydowych nośników leków, o określonych właściwościach, szczególnie po inkluzji lub przyłączeniu modelowych związków cytotoksycznych, lokuje się w centrum tego nurtu. Doskonale wpisuje się także w ten kierunek

2 współczesnej inżynierii chemicznej i procesowej, który zorientowany jest na opracowanie efektywnych produktów, o ściśle zdefiniowanych właściwościach użytkowych. Rozwiązanie takich zagadnień wymaga szerokiej wiedzy i praktycznych umiejętności z zakresu kilku dyscyplin: syntezy i funkcjonalizacji, najczęściej hybrydowych materiałów chemicznych - w tym przypadku nośnika leku podlegającego stopniowej dezintegracji, zapewniającego kontrolowany transport/uwalnianie substancji aktywnej na zewnątrz. Wymaga to kompetencji z zakresu chemii materiałów i inżynierii chemicznej. Badania skuteczności wymagają kwalifikacji z zakresu biologii medycznej. Ostateczne powodzenie warunkowane jest znajomością właściwości i możliwości różnych technik i rozwiązań procesowych zapewniających otrzymanie materiałów, które cechuje pożądana relacja: struktura - skład efektywność (celowego) działania. Z reguły wymaga to wyobraźni i rozumienia podstaw inżynierii procesowej. Warto nadmienić, że rozwiązanie powinno być zrealizowane przy ostrych ograniczeniach: najniższych kosztach, możliwości skalowania procesu, wykorzystaniu łatwo dostępnych i przyjaznych związków, wykluczając angażowanie znanych i skutecznych, ale często również agresywnych substancji chemicznych. W tym aspekcie ukierunkowanie rozprawy na opracowanie nowych efektywnych nośników leków - polisacharydowych nanocząstek, odpowiada formalnym wymogom prac doktorskich. Przyjęta koncepcja nie jest całkiem oryginalna. Inżynieria farmaceutyczna od lat szeroko eksploatuje koncepcję glikokonjugatów jako związków zbudowanych z części (poli)cukrowej i domeny aktywnej. Od lat znane i stosowane jest też wiązanie dozowanej substancji leczniczej w kapsułkach alginianów. Ich wymiary zwykle znacznie przekraczają rozmiary nanocząstek. Wiele uwagi poświęcono także wykorzystaniu cząstek z chitosanu. W tym świetle, oceniana rozprawa stanowi kontynuację i rozwinięcie tych myśli. Warto także podkreślić, że tematyka rozprawy, zainicjowana przed laty przez pana prof. Leszka Gradonia i ugruntowana pracami jego zespołu, rozwijana jest bardzo pomyślnie na rodzimym Wydziale przez jego następców: profesorów Tomasza Ciacha i Tomasza Sosnowskiego, co powinno być przedmiotem dużej satysfakcji zarówno ich mistrza jak też władz Wydziału. 2

3 2. Ocena rozprawy Recenzowana rozprawa doktorska liczy 204 strony druku i jest najobszerniejszą jaką opiniował recenzent. Zasadniczo składa się ona z dwóch części merytorycznych: literaturowej (ca 70 stron) i eksperymentalnej (110 stron), a także spisu literatury (244 pozycje 18 stron) i dwóch załączników. Na początku poruszę kwestie technicznoredakcyjne: praca napisana jest zwięzłym, dość poprawnym językiem. Niekiedy napotkać można lapsusy w rodzaju: mieszając w mieszadle (str 92), zawarte w literaturze badania (str. 108), błędy stylistyczne - stosowanie niewłaściwych przypadków rzeczowników, braki spacji miedzy wyrazami, wynikające, jak się domyślam, ze stosowania różnych wersji Worda (doc i docx), wreszcie niespójność formy podawanej literatury. Wskazujące to na pewien pośpiech w jej redagowaniu. Pomocne byłoby dołączenie odrębnego opisu licznych stosowanych skrótów literowych. Błędne wymiarowo jest równanie podane na str. 48. wymiar lewej strony nie odpowiada wymiarowi prawej. Swoją drogą podanie tego równania nie było niezbędne; tendencja o której mowa jest dość oczywista dla każdego rozumiejącego podstawy transportu masy. Wspominam o tych usterkach, nie dlatego by podkreślić ich (w istocie drugorzędne) znaczenie, ale by podzielić się z Doktorantką myślą, że istnienie drobnych usterek w raporcie z badań może, często niesłusznie, podkopać zaufanie do rzetelności uzyskanych wyników. Myślę, że warto by Doktorantka pamiętała o tym w przyszłości. Zakres i ocena badań W pierwszej części Kandydatka omówiła obszernie zagadnienia budowy, właściwości i fizjologii guzów nowotworowych, rodzajów stosowanych terapii, ułomności i wymagań względem nośników leków i metod ich dozowania, specyfikę nanocząstek i hydrożeli. Na tym tle określiła rodzaj materiału proponowanego nośnika (policukry), jego postać (hydrożel) oraz przeciętną wielkość/średnicę cząstek (ok. 100nm). Wytypowała także modelowe substancje aktywne/leki, z grupy rubicyn, podlegające przyłączeniu/inkapsulacji. Determinowały one badania skuteczności biologicznej nanocząstek, wybór linii komórkowych, badania In vitro oraz In vivo, dopuszczalnej dawki, itp. Uznając wagę tego ostatniego fragmentu badań, jako specjalista z zakresu inżynierii chemicznej, posiadający także wiedzę nt. materiałów 3

4 chemicznych nie czuję się bezwarunkowo kompetentnym do wydawania sądów o bezwzględnej poprawności tego fragmentu pracy. Zakres zaplanowanych i wykonanych badań był niezwykle szeroki; obejmował on: Analizę możliwości syntezy nanocząstek polisacharydowych, z wykorzystaniem naturalnego substratu, typowych polisacharydów: dekstranu, karboksylocelulozy i alginianu, oraz zjawiska spontanicznej samoorganizacji związków amfifilowych. Opracowanie metody syntezy modyfikowanych nanocząstek z dekstranu oraz ich modyfikacji, w pierwszej fazie wymagało określenia korzystnego typu dekstranu (odpowiednie okazały się cząstki o masie 70kDa). Następnie przeprowadzono zmianę jego właściwości powierzchniowych - wytworzono grupy karbonylowe i przyłączono do nich stosownie dobrany czynnik zwijający. Ten ostatni wytypowano testując trzy aminy o 6, 8 i 10 atomach węgla w łańcuchu alifatycznym. Procedury syntezy i analizy materiałów zaczerpnięto ze obszernego zbioru chemicznych metod funkcjonalizacji i badań powierzchni materiałów. Grupy karbonylowe generowano na powierzchni policukrów stosując chemiczne utleniacze (nadtlenek wodoru i nadjodan), następnie łączono je, zachowują ilościową kontrolę stopnia podstawienia, z grupami aminowymi czynnika zwijającego. W ten sam sposób wiązano także określone ilości substancji aktywnej. Podjęto także próby dodatkowej modyfikacji ich powierzchni (także potencjału dzeta) poprzez wprowadzenie grup karboksylowych, oraz grup kwasu foliowego (potencjalnie) kierujących nanocząstki do powierzchni guzów nowotworowych, zgodnie z zasadami mechanizmu aktywnego kierowania. Na podkreślenie i uznanie zasługuje bardzo duża staranność prowadzenia wszystkich etapów preparatyki cząstek, w tym także oczyszczania produktów pośrednich otrzymywanych na różnych etapach syntezy. Przeprowadzone badania właściwości nanocząstek obejmowały analizę cząstek przed i po przyłączeniu substancji aktywnej (daunorubicyna, doksorubicyna), ich morfologii, składu, ładunku powierzchni (dzeta) oraz kinetyki uwalniania substancji aktywnej, Przebadano też ich stabilność, możliwość przechowywania w postaci zliofilizowanej - w tym celu opracowano 4

5 także procedurę liofilizacji - a także właściwości po ponownym uwodnieniu. Końcowe wyniki tych prac były jednoznacznie pozytywne. Odrębne miejsce zajmują badania skuteczności biologicznej otrzymanych nanocząstek zawierających modelowe leki przeciwnowotworowe (w ilości średnio 5% wag.) w układzie In vitro (na wytypowanej linii komórkowej MES SA/Dx5) oraz In vivo. Te ostatnie prowadzono według procedury podobnej do stosowanej w terapii nowotworowej na grupie 25 myszy z wszczepionym ludzkim nowotworem mięsaka macicy z odpornością wielolekową. Opracowany preparat (NanoDox 1-5) wykazywał średnią 42% cytotoksyczność wobec wspomnianej linii opornej na doksorubicyną, przy 29% cytotoksyczności preparatu doksorubicyny o tym samym stężeniu. W grupie myszy otrzymującej ten sam preparat w wytypowanej dawce i schemacie dozowania nie obserwowano znaczących spadków masy ciała, ani objawów toksyczności preparatu. Co ciekawe, wyniki te uzyskano w preparacie zawierającym grupy kierujące (FA), co dowodnie świadczy o ich efektywności Dla niespecjalisty są to wyniki więcej niż budujące. Jak wspomniałem, wszystkie badania wykonywane były nie tylko poprawnie, ale też niezwykle starannie, a wnioski wyciągano po przeprowadzeniu niezbędnych analiz. Stanowiły one punkt wyjścia do dalszych etapów pracy. Opisy stosowanych procedur syntezy i badań analitycznych umożliwiają ich pełne odtworzenie i weryfikację, co świadczy o jakości prowadzonych badań. Kilka uwag do rozważenia Pewien niedosyt budzi niewielki stopień wykorzystania analizy instrumentalnej, w szczególności spektrometrii FTIR, powszechniej we współczesnej chemii analitycznej i chemii materiałów. Czy Doktorantka nie zastanawiała się nad celowością określeniu wielkości cmc1, ewentualnie także cmc2 dla dodecyloaminy (stosowany czynnik zwijający).na tej podstawie można by spekulować czy zachodziło tworzenie miceli tego związku po jego szybkim (a nie powolnym) wprowadzeniu do układu reakcyjnego, dodatkowo ułatwione obecnością sterycznej zawady dla reakcji grupy aminowej z grupami aldehydowymi wielkich cząstek utlenionego dekstranu. Tłumaczyłoby to słabe związanie czynnika zwijającego 5

6 z nośnikiem, oraz obecność licznych niezwiązanych molekuł tej substancji wewnątrz utworzonej nanacząstki, o czym wspomina Autorka. Nieco podobny mechanizm mógł także mieć miejsce w odniesieniu do stosowanych substancji aktywnych. Czy rozważano stosowanie ultradźwięków (tzw. sonifikacji) do rozbijania agregatów nanocząstek w przypadku stwierdzenia ich obecności, co kilkakrotnie stwierdzono? Czy rozważano utleniania dekstranu metodą elektrochemiczną, eliminując tym samym konieczność stosowania nadjodanu, którego nadmiar i pozostałości usuwane były w uciążliwym/kosztownym procesie dializy? Przedstawione omówienie wzmocnienia czułości detekcji wykazywanej przez wybrane nanocząstki (złota, ale nie tylko) prezentuje, w najlepszym przypadku poziom popularnonaukowy, a nie naukowy brak wspomnienia o podstawach fizycznych tego zjawiska efekcie plazmonowym. Konkludując - bardzo wysoko oceniam wysyłek badawczy i wiedzę pani Igi Wasiak, a także Jej praktyczne umiejętności obejmujące zarówno syntezę i bardzo szeroki zakres prowadzonych badań fizykochemicznych i biologicznych. Niepodważalna jest także wysoka wartość poznawczą uzyskanych wyników. Wniosek końcowy Analiza rozprawy pani mgr inż. Igi WASIAK upoważnia mnie do stwierdzenia, że spełnia ona wszystkie wymagania stawiane rozprawom doktorskim przez obowiązujące przepisy. Doktorantka posiadła dużą wiedzę teoretyczną, zademonstrowała bardzo szerokie umiejętności realizacji złożonych badań z zakresu kilku dyscyplin, oraz właściwej interpretacji wyników. Przedstawione wyniki badań wskazują oryginalną drogę otrzymywania cząstek polisacharydowych o wielkościach nm, posiadające wszelkie cechy efektywnych nośników leków, co zademonstrowano na konkretnym przykładzie. Z pełnym przekonaniem stawiam wniosek o przyjęcie przedstawionej rozprawy przez Radę Wydziału Inżynierii Chemicznej i Procesowej Politechniki Warszawskiej i dopuszczenie mgr inż. Igi WASIAK do jej publicznej obrony. 6

7 7