Dorota Uchman - Rzeżnik

Transkrypt

1 Klinika Neurologii II Wydział Lekarski Warszawskiego Uniwersytetu Lekarskiego Dorota Uchman - Rzeżnik OCENA ZMIAN STĘŻEŃ WYBRANYCH NEUROPEPTYDÓW I NIESWOISTYCH MARKERÓW STANU ZAPALNEGO U PACJENTÓW Z NOWO ROZPOZNANYM STWARDNIENIEM ROZSIANYM Praca na stopień doktora nauk medycznych STRESZCZENIE Promotor pracy: Dr hab. n. med. Wojciech Bik; prof. CMKP Promotor pomocniczy: Dr n. wet. Anna Litwiniuk Warszawa 2018

2 1 Streszczenie Wstęp Stwardnienie rozsiane jest nieuleczalną, zapalno-demielinizacyjną i zwyrodnieniową chorobą OUN, o postępującym przebiegu i nadal niewyjaśnionej etiologii. MS charakteryzuje się występowaniem wieloogniskowego procesu zapalnego w OUN, który prowadzi do demielinizacji włókien nerwowych i niszczenia aksonów, z nieodwracalną utratą komórek istoty białej i szarej mózgu. Hipoteza, która aktualnie tłumaczy genezę choroby, łączy genetycznie uwarunkowany defekt układu immunologicznego z czynnikami środowiskowymi tj. niedoborem witaminy 25(OH) D, nikotynizmem, otyłością, nadmiarem soli w diecie i czynnikami zakaźnymi. Wśród czynników zakaźnych, największe znaczenie przypisuje się obecnie zakażeniu wirusem Epsteina-Barr. W patogenezie MS istotne znaczenie ma układ immunologiczny i nieprawidłowe działanie limfocytów T i B. Limfocyty T, które odgrywają kluczową rolę w patologii choroby to limfocyty pomocnicze Th1, Th17, Th2 oraz Treg. VIP i PACAP 38 są peptydami o udowodnionych właściwościach przeciwzapalnych, immunomodulujących i neuroprotekcyjnych. Receptory dla tych peptydów występują w ośrodkowym układzie nerwowym. Neuroprotekcyjny efekt działania PACAP został wykazany w eksperymentalnych modelach uszkodzenia mózgu w MS, udarze niedokrwiennym, chorobie Parkinsona i chorobie Alzheimera. Natomiast VIP, może pośrednio hamować procesy neurodegeneracyjne, wpływając na syntezę czynników neurotropowych, a także modulować reakcję zapalną. ADNP jest peptydem o właściwościach immunomodulacyjnych i ochronnych wobec neuronów. Jest konieczny do prawidłowego przebiegu organogenezy w okresie embrionalnym i właściwego rozwoju układu nerwowego wraz z zamknięciem cewy nerwowej. Bierze udział w mechanizmach naprawczych w pourazowym, ciężkim uszkodzeniu mózgu. BDNF występuje przede wszystkim w OUN. Najważniejszą jego biologiczną funkcją jest ochrona neuronów. Białko to odpowiada za ich dojrzewanie i przeżycie. BDNF stymuluje i kontroluje rozwój nowych neuronów z komórek macierzystych, uczestniczy w procesach ich różnicowania oraz moduluje przekaźnictwo synaptyczne. 2

3 Uzasadnienie podjęcia tematu Przedstawiane w literaturze wyniki badań naukowych nie wyjaśniają w sposób wyczerpujący i wszechstronny roli i znaczenia VIP, PACAP, BDNF, ADNP oraz markerów stanu zapalnego w MS. Stwardnienie rozsiane jest chorobą zapalno-degeneracyjną wynikającą z autoagresji, o nadal niepoznanych szczegółowo mechanizmach jej rozwoju i przebiegu. W związku z tym w prezentowanej pracy przeprowadzono badania mające na celu ocenę stężenia VIP, PACAP, BDNF, ADNP oraz wybranych markerów stanu zapalnego u pacjentów z nowo rozpoznanym MS. Cel pracy Celem niniejszej dysertacji było określenie, czy u pacjentów z nowo rozpoznanym stwardnieniem rozsianym i nieleczonych do tego momentu steroidami i/lub lekami immunomodulującymi, mogą wystąpić zmiany stężeń w osoczu krwi obwodowej i w płynie mózgowo-rdzeniowym VIP, PACAP, BDNF i ADNP oraz wybranych markerów stanu zapalnego. Zadania badawcze 1. Porównanie stężeń peptydów VIP, PACAP, BDNF, ADNP w osoczu krwi obwodowej u pacjentów z nowo rozpoznanym stwardnieniem rozsianym i w grupie kontrolnej. 2. Porównanie stężeń markerów stanu zapalnego: w surowicy - CRP, w osoczu -cytokin prozapalnych: TNF-alfa, IL-6 oraz cytokiny przeciwzapalnej IL-10 u pacjentów z nowo rozpoznanym stwardnieniem rozsianym i w grupie kontrolnej. 3. Porównanie stężeń peptydów VIP i PACAP w płynie mózgowo-rdzeniowym u pacjentów z nowo rozpoznanym stwardnieniem rozsianym i w grupie kontrolnej. 4. Ocena korelacji pomiędzy stężeniami badanych peptydów i markerów stanu zapalnego u pacjentów z nowo rozpoznanym stwardnieniem rozsianym Materiał i metody W projekcie badawczym brali udział pacjenci, którzy byli hospitalizowani w Klinice Neurologii II Wydziału Lekarskiego Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, po wyrażeniu pisemnej, świadomej zgody na udział w badaniu. Wszystkie, zakwalifikowane osoby, były ochotnikami. Uczestnikom przekazano wyczerpujące informacje dotyczące założeń, przebiegu 3

4 i celu badania. Protokół projektu badawczego został zaakceptowany przez Komisję Bioetyczną Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego w Warszawie (uchwała z dnia r.). Charakterystyka grupy badanej Do badania włączeni zostali pacjenci z nowo postawionym rozpoznaniem MS na podstawie kryteriów diagnostycznych według McDonalda zrewidowanych przez Polmana i wsp. w 2010 r. Grupę badaną stanowiło 20 osób, 13 kobiet i 7 mężczyzn w wieku od 23 do 53 lat. Średni wiek badanych osób wyniósł 36 lat (36,55 ± 7,98). Wśród badanych było 65% kobiet i 35% mężczyzn. Kryteria wyłączenia z grupy badanej Wiek poniżej 18 lat i powyżej 55 lat Kolejny rzut MS Wtórnie postępująca lub pierwotnie postępująca postać MS Choroby ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego np. choroby infekcyjne, naczyniowe, zwyrodnieniowe, nowotwory Cukrzyca Niewydolność nerek Niewydolność wątroby Niewydolność krążenia Choroby psychiczne Choroby skóry Choroby tarczycy Choroby autoimmunologiczne Choroby nowotworowe Choroby infekcyjne Charakterystyka grupy kontrolnej Do badania włączeni zostali pacjenci hospitalizowani w Klinice z powodu diagnostyki pierwotnych bólów głowy. Rozpoznanie ustalane było na podstawie The International Classification of Headache Disordes ICHD II i III. Grupę kontrolną stanowiło 27 osób, 23 4

5 kobiety i 4 mężczyzn, w wieku od 18 do 51 lat. Średni wiek w badanej grupie wyniósł 33 lata (33,41 ± 7,09). Wśród badanych było 80,5% kobiet oraz 19,5% mężczyzn. Kryteria wyłączenia z grupy kontrolnej Wiek poniżej 18 lat i powyżej 55 lat Choroby ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego np.: choroby infekcyjne, naczyniowe, zwyrodnieniowe, nowotwory Cukrzyca Niewydolność nerek Niewydolność wątroby Niewydolność krążenia Choroby psychiczne Choroby skóry Choroby tarczycy Choroby autoimmunologiczne Choroby nowotworowe Choroby infekcyjne U wszystkich uczestników badania przeprowadzono badanie podmiotowe i przedmiotowe z oceną stanu neurologicznego. U pacjentów z rozpoznaniem MS wykonano rezonans magnetyczny mózgu i odcinka szyjnego rdzenia kręgowego z podaniem środka kontrastowego, wzrokowe i somatosensoryczne potencjały wywołane z kończyn górnych i dolnych, badanie płynu mózgowo-rdzeniowego w kierunku obecności prążków oligoklonalnych i określenia wartości indexu IgG, panel badań laboratoryjnych. U pacjentów z grupy kontrolnej wykonano tomografię komputerową lub rezonans magnetyczny z podaniem środka kontrastowego, badanie ogólne płynu mózgowo-rdzeniowego, panel badań laboratoryjnych. Metodologia przeprowadzenia badań W pierwszej dobie hospitalizacji od wszystkich uczestników badania pobierano 15ml krwi i wykonywano punkcję lędźwiową. Krew pobierana była do wcześniej schłodzonych probówek, odwirowywana w temperaturze 4ºC z szybkością obrotów 3000/min. Otrzymane w ten sposób osocze rozdzielano po 0,5ml do probówek typu Eppendorf i zamrażano w 5

6 temperaturze -70ºC do momentu wykonywania oznaczeń. Płyn mózgowo-rdzeniowy pobierano do typowych probówek laboratoryjnych i natychmiast zamrażano w -70ºC. W obu grupach pacjentów określano w osoczu stężenie IL-6, IL-10, TNF-alfa, BDNF, ADNP VIP i PACAP 38 oraz określano w płynie mózgowo-rdzeniowym stężenie VIP i PACAP 38. Stężenie VIP, PACAP 38 w osoczu oznaczano metodą RIA a IL-6, IL-10, TNF-alfa, BDNF, ADNP oznaczano w osoczu krwi uczestników badania metodą ELISA. Stężenie VIP i PACAP 38 w płynie mózgowo-rdzeniowym oceniano przy pomocy testu RIA. Przed wykonaniem analizy radioimmunologicznej (VIP i PACAP 38) próbki osocza krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego pobrane od pacjentów z nowo rozpoznanym MS i grupy kontrolnej poddane zostały procesowi oczyszczenia i zatężenia z wykorzystaniem metody ekstrakcji do fazy stałej (Solid Phase Extraction; SPE). Analiza statystyczna Analizę statystyczną wykonano przy użyciu programu STATISTICA v Normalność rozkładu wartości w grupach była analizowana przy pomocy testów: Shapiro-Wilka oraz Kołmogorowa-Smirnowa z poprawką Lillieforsa. Nieparametryczne dane były porównywalne między grupami przy użyciu testu Mann-Whitney U Test. Do badania związku pomiędzy analizowanymi zmiennymi stosowano korelację Spearmana. Poziom istotności statystycznej w przeprowadzonej analizie ustalono na poziomie 0,05. Wyniki 1. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic pomiędzy stężeniem VIP w PMR w grupie MS i kontrolnej. Zaobserwowano jednak tendencję do niższych stężeń VIP w PMR w grupie badanej w stosunku do stężeń w grupie kontrolnej 2. Stężenie PACAP 38 w PMR pacjentów z MS było istotnie statystycznie niższe niż stężenie w PMR z grupy kontrolnej 3. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic pomiędzy stężeniem VIP / PACAP w osoczu w grupie MS i kontrolnej 4. Stężenie IL-6 w osoczu krwi i CRP w surowicy u pacjentów z MS było istotnie statystycznie niższe niż stężenie w osoczu krwi z grupy kontrolnej 6

7 5. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic pomiędzy stężeniem TNF-alfa i IL 10 w osoczu krwi w grupie MS i kontrolnej 6. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic pomiędzy stężeniem ADNP i BDNF w osoczu krwi w grupie MS i kontrolnej Wnioski: 1. Obniżone stężenie PACAP 38 w płynie mózgowo-rdzeniowym może sugerować zaburzenia syntezy peptydów o działaniu neuroprotekcyjnym u pacjentów z nowo rozpoznanym stwardnieniem rozsianym 2. Brak istotnych korelacji pomiędzy stężeniem PACAP 38 a markerami stanu zapalnego wskazuje, że zaburzenie wydzielania tego neuropeptydu w nowo rozpoznanym stwardnieniu rozsianym nie jest bezpośrednio zależne od nasilenia reakcji zapalnej 3. Uzyskane wyniki dotyczące stężeń VIP, PACAP 38, ADNP, BDNF wskazują, że badane neuropeptydy nie są wykładnikami zaawansowania choroby w momemencie jej rozpoznania 7

8 2 Summary Introduction Multiple sclerosis is an incurable, inflammatory demyelinating and degenerative disease of the CNS with progressive course and still unexplained etiology. MS is characterized by occurrence of multifocal inflammatory process in the CNS, which leads to demyelination of the nerve fibers and damaging axons, with irreversible loss of the cells in the white matter and in the grey matter of the brain. The hypothesis, which currently explains origin of the disease, combines genetically determined defect of the immunological system with environmental factors, i.e., deficit in vitamin 25(OH) D, nicotinism, obesity, excessive amount of salt in the diet and infectious factors. Among infectious factors, the greatest significance is currently assigned to Epstein-Barr virus infection. The immune system and abnormal action of T-cells and B-cells are important in pathogenesis of MS. T-cells, which play the key role in pathology of the disease, are helper cells: Th1, Th17, Th2 and Treg. VIP and PACAP 38 are peptides with proven anti-inflammatory, immunomodulatory and neuroprotective properties. Receptors for these peptides are located in the central nervous system. Neuroprotective effect of PACAP action was established in experimental models of brain damage in MS, ischemic stroke, Parkinson s disease and Alzheimer s disease. VIP may indirectly inhibit neurodegenerative processes affecting synthesis of the neurotrophic factors and inhibiting inflammatory mediators. ADNP is a peptide with immunomodulatory and protective properties towards neurons. It is necessary for normal course of organogenesis within the embryonic period and suitable development of the nervous system together with the neural tube closure. It participates in repair mechanisms in posttraumatic, severe brain damage. BDNF mainly occurs in the CNS. Its most important biological function includes protection of neurons. This protein is responsible for their maturation and survival. BDNF stimulates and controls development of the new neurons from the stem cells, participates in the processes of their differentiation and modulates their synaptic neurotransmission. 8

9 Rationale for conducting the study Results of scientific studies presented in the literature do not explain the role and significance of VIP, PACAP, BDNF, ADNP, and inflammatory markers in MS in exhaustive and comprehensive manner. Multiple sclerosis is inflammatory and degenerative autoimmune disease, which mechanisms of its development and course are unknown in details. Therefore, presented paper included studies in order to evaluate concentration of VIP, PACAP, BDNF, ADNP and selected inflammatory markers in patients with newly diagnosed MS. Aim of the study The aim of this dissertation was to determine whether changes in concentrations of VIP, PACAP, BDNF and ADNP may occur in plasma of the peripheral blood and in the cerebrospinal fluid in patients with newly diagnosed multiple sclerosis, who are naïve to treatment with steroids and/or with immunomodulatory factors. Research tasks 1. Comparing concentrations of selected peptides VIP, PACAP, BDNF, and ADNP in plasma of peripheral blood in patients with newly diagnosed multiple sclerosis and in the control group 2. Comparing concentrations of inflammatory markers: in serum - CRP, in plasma proinflammatory cytokines: TNF-alpha, IL-6 and anti-inflammatory cytokine IL-10 in patients with newly diagnosed multiple sclerosis and in the control group 3. Comparing concentrations of peptides VIP and PACAP in the cerebrospinal fluid in patients with newly diagnosed multiple sclerosis and in the control group 4. Evaluation of correlation between concentrations of studied peptides and inflammatory markers in patients with newly diagnosed multiple sclerosis Material and methods Patients, who were hospitalized in the Clinic of Neurology of the Second Faculty of Medicine of the Medical University of Warsaw, and provided written informed consent for participation in the study, took part in the research project. All enrolled individuals were volunteers. Participants obtained comprehensive information regarding assumptions, course 9

10 and purpose of the study. The protocol of the research project was approved by the Bioethics Committee of the Centre of Postgraduate Medical Education in Warsaw (resolution of ). Studied group characteristics Patients with newly diagnosed MS based on diagnostic criteria according to McDonald revised by Polman et al. in 2010 were enrolled in the study. The studied group included 20 individuals, 13 females and 7 males, in the age ranged from 23 to 53 years. Mean age in the studied group was 36 years (36.55 ± 7.98). Subjects included 65% of females and 35% of males. Studied group exclusion criteria Age below 18 years and above 55 years Another relapse of MS Secondary progressive MS or primary progressive MS Diseases of the central and the peripheral nervous system, e.g.: infectious, vascular, degenerative diseases, and neoplasms Diabetes mellitus Renal insufficiency Hepatic insufficiency Circulatory insufficiency Mental diseases Skin diseases Thyroid gland diseases Autoimmune diseases Neoplastic diseases Infectious diseases Control group characteristics Patients hospitalized in the Clinic due to diagnostics of primary headaches were enrolled in the study. Diagnosis was established based on the International Classification of Headache Disordes ICHD II and III. The control group included 27 individuals, 23 females and 4 males, 10

11 in the age ranged from 18 to 51 years. Mean age in the studied group was 33 years (33.41 ± 7.09). Subjects included 80.5% of females and 19.5% of males. Control group exclusion criteria Age below 18 years and above 55 years Diseases of the central and the peripheral nervous system, e.g.: infectious, vascular, degenerative diseases, and neoplasms Diabetes mellitus Renal insufficiency Hepatic insufficiency Circulatory insufficiency Mental diseases Skin diseases Thyroid gland diseases Autoimmune diseases Neoplastic diseases Infectious diseases All study participants were subject to medical interview and physical examination with evaluation of neurological condition. Patients with diagnosed MS underwent magnetic resonance imaging of the brain and the cervical segment of the spinal cord with administration of the contrast medium, visual and somatosensory evoked potentials for upper and lower limbs, cerebrospinal fluid evaluation for presence of oligoclonal bands and determination of IgG index level, and laboratory evaluation panel. Patient from the control group underwent CT-scan or MRI with administration of the contrast medium, routine cerebrospinal fluid analysis, and laboratory evaluation panel. Methodology of conducting evaluations Within the first day of hospitalization, 15ml of blood was collected from all study participants and all of them underwent lumbar puncture. Blood was collected to previously cooled tubes, centrifuged in the temperature 4ºC at 3000 RPM. Plasma obtained in this manner was divided into volumes of 0.5ml, placed into Eppendorf tubes and frozen in temperature - 70ºC until the further labarotary assessment. The cerebrospinal fluid was collected to the typical laboratory test tubes and instantly frozen in -70ºC. 11

12 In both groups of patients, concentration of IL-6, IL-10, TNF-alpha, BDNF, ADNP VIP and PACAP 38 was determined in plasma, and concentration of VIP and PACAP 38 was determined in the cerebrospinal fluid. Concentration of VIP and PACAP 38 in plasma was determined with RIA method, and concentration of IL-6, IL-10, TNF-alpha, BDNF, and ADNP was determined with ELISA method in plasma of the study participants. Concentration of VIP and PACAP 38 in the cerebrospinal fluid was evaluated with RIA test. Before performing radioimmunological analysis (VIP and PACAP 38), plasma samples and cerebrospinal samples collected from the patients with newly diagnosed MS and from the control group underwent process of purification and concentration using Solid Phase Extraction (SPE) method. Statistical analysis Statistical analysis was performed with STATISTICA v software. Normality of distribution in values in the groups was analyzed with the following tests: the Shapiro-Wilk and Kolmogorov-Smirnov Statistic with Lilliefors' Significance. Non-parametric data were compared between the groups using the Mann-Whitney U Test. For the study of relationship between analyzed variables, Spearman's rank correlation was used. The level of statistical significance in conducted analysis was established at 0,05. Results 1. No statistically significant differences were determined between VIP concentration in CSF in MS group and control group. However, tendency to lower VIP concentration in CSF was observed in the studied group comparing to concentrations in the control group. 2. Concentration of PACAP 38 in CSF of the patients with MS was statistically significantly lower than concentration in CSF in the controls. 3. No statistically significant differences were determined between plasma concentration of VIP / PACAP in the MS group and in the control group. 4. Plasma concentration of IL-6 and serum concentration of CRP in patients with MS was statistically significantly lower than plasma concentration in the control group. 12

13 5. No statistically significant differences were determined between plasma concentration of TNF-alpha and IL 10 in the MS group and in the control group. 6. No statistically significant differences were determined between plasma concentration of ADNP and BDNF in the MS group and in the control group. Conclusions: 1. Reduced PACAP 38 concentration in the cerebrospinal fluid may suggest synthesis disturbances of neuroprotective action peptide in patients with newly diagnosed multiple sclerosis. 2. Lack of significant correlations between concentration of PACAP 38 and inflammatory markers indicates that disturbances secretion of this neuropeptid in newly diagnosed multiple sclerosis is not directly dependant on intensity of the inflammatory reaction. 3. Obtained results regarding concentrations of VIP, PACAP 38, ADNP and BDNF indicate that studied neuropeptides do not serve as indicators of the disease advancement in the moment of diagnosis. 13