Mgr Sailaja Antharvedi Goda. Streszczenie

Transkrypt

1 Mgr Sailaja Antharvedi Goda Dziedzina: Nauki biologiczne Dyscyplina: Biologia Otwarcie: r. Temat: Abnormal high frequency oscillations in the rat nucleus accumbens in the serotonin and developmental model of schizophrenia Promotor: : prof. dr hab. Stefan Kasicki (promotor), prof. Rene Garcia (ko-promotor) i dr Mark J. Hunt (promotor pomocniczy). Recenzenci: prof. dr hab. Adam Płaźnik, prof. dr hab. Grzegorz Hess Streszczenie Istnieje szereg hipotez dotyczących mechanizmów odpowiedzialnych za patofizjologię schizofrenii. Wiele z nich łączy je ze zmianami aktywności w jądrze półleżącym, jak również z zaburzoną aktywnością jego struktur aferentnych. Do weryfikacji tych hipotez przyjęto stosować rozmaite, doświadczalne modele zwierzęce schizofrenii, u których występują zaburzenia zachowania lub zmiany anatomiczne obserwowane również u chorych na schizofrenię. Przedstawiona rozprawa dotyczy zmian w czynności elektrycznej jądra półleżącego u czuwającego szczura w dwóch modelach doświadczalnych schizofrenii. Za model służący za punkt odniesienia dla badanych modeli przyjęto intensywnie badany w naszej pracowni model wykorzystujący antagonistów receptora NMDA (głównie ketaminę i MK801), tzw. model obniżonej aktywności receptora NMDA. Farmakologiczne modele schizofrenii są szeroko stosowane w badaniu schizofrenii. Ostre modele dotyczą zmian krótkotrwałych wywołanych bezpośrednio podaniem środków farmakologicznych. W niniejszej pracy zastosowano dwa modele zwierzęce: w farmakologicznym modelu (ostrym) objawy podobne do występujących w schizofrenii wywoływano podaniem środków psychoaktywnych (LSD i DOI, agonistów receptora serotoninowego). Drugi model (neurorozwojowy) wykorzystuje zmiany w strukturze mózgu potomstwa samicy szczura, wywołane przez podanie jej w trakcie ciąży (E17, siedemnasty dzień życia płodu) środka farmakologicznego Metylazoksymetanol (MAM) (w związku z tym model ten nazywa się również modelem MAM). Metylazoksymetanol zaburza prawidłowy rozwój mózgu płodu, co skutkuje zaburzeniami anatomicznymi mózgu, podobnymi do obserwowanych u pacjentów chorych na schizofrenię, jak również zaburzeniami zachowania.

2 Do badania aktywności mózgu stosuje się rozmaite metody. W niniejszej pracy postanowiono skorzystać z metody rejestracji lokalnych potencjałów polowych, które odzwierciedlają elektryczną aktywność struktur mózgu. W lokalnych potencjałach polowych wyróżnia się szereg pasm częstotliwościowych, między innymi pasmo delta (0,1-4 Hz), theta (5-12 Hz) czy gamma ( Hz). W naszej pracowni jednym z głównych obiektów badań jest pasmo oscylacji wysokoczęstotliwościowych ( Hz, HFO high frequency oscillations) w lokalnych potencjałach polowych rejestrowanych w jądrze półleżącym i innych strukturach mózgu. Jak wcześniej wykazano, podanie ketaminy lub MK801 powoduje w rejestrowanym w jądrze półleżącym paśmie HFO wzrost mocy i zwiększenie dominującej częstotliwości. Ze względu na to, że moc i dominująca częstotliwość tego pasma zmienia się również po podaniu środków przeciwpsychotycznych, uznaliśmy, że niezbędne jest zbadanie ewentualnych zmian w paśmie HFO również w innych modelach zwierzęcych schizofrenii. Doświadczenia przeprowadzono na szczurach stada Wistar, pochodzących z hodowli Instytutu Nenckiego (Warszawa) lub Centrum Medycyny Doświadczalnej (Białystok). I Lokalna Komisja Etyczna w Warszawie wyraziła zgodę na przeprowadzenie doświadczeń na zwierzętach. Doświadczenia na modelu serotoninowym wykonano na 33 szczurach samcach ( g). W modelu MAM wykorzystano 14 zwierząt, które były dostarczone przez hodowlę własną Instytutu Nenckiego. Uzyskano je od 4 ciężarnych samic, którym wstrzyknięto w 17 dniu ciąży 25 mg/kg MAM lub roztwór soli fizjologicznej. Uzyskano w ten sposób 7 zwierząt MAM i 7 zwierząt kontrolnych. U wszystkich zwierząt w znieczuleniu ogólnym (izofluran w tlenie, plus butomidor) wykonano implantację elektrod dwubiegunowych (110 μm, Science Products, Germany) do jądra półleżącego [AP (+1,6 mm) i LM (+1,2 mm) w stosunku do bregmy, DV (-7,1 mm) w stosunku do powierzchni kory, wg atlasu Paxinosa i Watsona, 1998]. Elektrody po umieszczeniu we właściwej pozycji mocowano za pomocą cementu dentystycznego Duracryl (Spofa Dental, Republika Czech). Następnie na głowie zwierzęcia mocowano złącze przylutowane do elektrod, umożliwiające podłączenie kabla w celu rejestracji lokalnych potencjałów polowych (LFP). Po operacji zwierzętom podawano środki przeciwbólowe i czekano z rozpoczęciem doświadczeń przez okres 7 dni. Po tym okresie przez dwa dni prowadzono procedurę oswajania zwierząt z eksperymentatorem (tzw. handling). Doświadczenia prowadzono w doświadczalnej klatce Faraday a. Sygnał LFP był wzmacniany 1000, filtrowany 0, Hz (A-M Systems, USA), cyfrowany z częstością 4 khz (Micro1401, CED, Cambridge, UK) i zapisywany na dysku komputera w celu wykonania dalszych analiz. Doświadczenia prowadzono zgodnie ze 2

3 schematem kwadratu łacińskiego, tak że każde zwierzę otrzymało każdą dawkę środka farmakologicznego w pseudolosowej kolejności. Doświadczenie zaczynało się od rejestracji LFP przez 20 min., następnie podawano zwierzętom dootrzewnowo środek farmakologiczny i prowadzono rejestrację przez co najmniej 60 min. W przypadku, gdy w trakcie doświadczenia podawano dwa środki farmakologiczne, stosowano między nimi odstęp czasowy około 30 min. Odstępy między kolejnymi doświadczeniami wynosiły co najmniej 3 dni. Wstępną analizę lokalnych potencjałów polowych wykonano za pomocą skryptów wykonanych w naszej pracowni (usuwanie artefaktów, obliczenie widm mocy, eksport wyników do plików tekstowych). Dane te były następnie analizowane za pomocą testów statystycznych programu GraphPad Prism. Badania modelu serotoninowego. Zwierzętom podawano 1) LSD (0,03, 0,1, 0,3 mg/kg), 2) chlorowodorek DOI (agonista receptora 5-HT 2, 0,5, 1,0, 2,0 mg/kg), 3) DOI (2 mg/kg) a po 30 min. dodatkowo MDL (selektywny antagonista receptora 5-HT 2, 1,0 mg/kg), TCB-2 (agonista receptora 5-HT 2A, 0.1, 0.5, 1.5 mg/kg) i CP (agonista receptora 5-HT 2C, 0.1, 1,0 i 3,0 mg/kg). Po zakończeniu doświadczeń zwierzętom podawano dootrzewnowo jako dodatkową kontrolę ketaminę (25 mg/kg). Stosując podane wyżej środki farmakologiczne zbadano wpływ środków halucynogennych na moc i częstotliwość w paśmie HFO w lokalnych potencjałach polowych rejestrowanych w jądrze półleżącym. Wyniki porównano ze zmianami HFO wywołanymi podaniem antagonistów receptora NMDA. Analiza uzyskanych danych wykazała, że podanie dootrzewnowe środków halucynogennych będących agonistami receptora 5-HT, tzn. LSD (0,03-0,3 mg/kg) i DOI (0,5-2,0 mg/kg) spowodowało zwiększenie mocy i zmniejszyło dominującą częstotliwość w paśmie HFO. Podanie MDL (1.0 mg/kg), antagonisty receptora 5HT 2A, ale nie SB (1.0 mg/kg), antagonisty receptora 5HT 2C spowodowało odwrócenie efektu DOI na moc i częstotliwość HFO. Z kolei podanie dosystemowe TCB-2 (środka halucynogennego i agonisty receptora 5HT 2A ( mg/kg) wywołało podobny wzrost mocy pasma HFO i zmniejszenie częstotliwości dominującej w tym paśmie, jak po podaniu LSD i DOI. Natomiast podanie CP , agonisty receptora 5H 2C (0.1-3 mg/kg), nie wywołało żadnych zmian w paśmie HFO. Badanie modelu MAM. W ramach doświadczeń na tym modelu sprawdzono moc i dominującą częstotliwość w paśmie HFO występującym spontanicznie, jak i po podaniu MK801 u zwierząt wystawionych na działanie MAM, jak i w grupie kontrolnej. 3

4 W wyniku przeprowadzonych doświadczeń stwierdzono, że u zwierząt MAM pasmo spontanicznych HFO ma większą moc, jak również dominująca częstotliwość ma wartość wyższą niż u zwierząt kontrolnych. Podanie MK801 wywołało zwiększenie mocy HFO zarówno u zwierząt doświadczalnych (MAM), jak i w grupie kontrolnej. Natomiast wzrost dominującej częstotliwości w sposób zależny od dawki MK801 wystąpił tylko w grupie kontrolnej, podobnie jak we wcześniejszych doświadczeniach, gdy MK801 podawano zwierzętom niepoddanym modyfikacjom. Wykazano więc, że zwierzęta MAM wykazują odmienną od kontrolnych odpowiedź na podanie antagonisty receptora NMDA. Podsumowując, w niniejszej pracy wykazano, że podanie środków psychoaktywnych (LSD i DOI) wywołuje wzrost mocy i spadek dominującej częstotliwości w paśmie HFO. Za zmiany te odpowiada przede wszystkim pobudzenie receptora 5-HT 2A, na co wskazują wyniki podania antagonisty i agonisty receptora 5-HT 2A oraz antagonisty i agonisty receptora 5-HT 2C. W modelu MAM stwierdzono, że spontaniczna aktywność HFO ma zwiększoną moc i podwyższoną częstość w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Podanie antagonistów receptora NMDA powołuje nasilenie mocy, natomiast nie zwiększa częstotliwości HFO. Na obecnym etapie nie można wyjaśnić mechanizmów odpowiedzialnych za stwierdzone zjawisko. Wydaje się jednak, że przynajmniej częściowym wytłumaczeniem mogą być zmiany w sygnałach aferentnych dochodzących do jądra półleżącego z hipokampa, ciała migdałowatego, a zwłaszcza kory przedczołowej. Na podstawie uzyskanych wyników i rezultatów wcześniejszych prac wykonanych w Pracowni Układu Limbicznego można przyjąć hipotezę, że pasmo HFO występujące w lokalnym potencjale czynnościowym rejestrowanym w jądrze półleżącycm może być przydatnym biomarkerem elektrofizjologicznym do badania nie tylko mechanizmów schizofrenii w modelach zwierzęcych, ale również potencjalnej skuteczności nowych środków farmakologicznych do wykorzystania ich w leczeniu schizofrenii. Abstract Schizophrenia is a complex psychiatric disorder that is studied extensively using animal models which exhibit behavioral abnormalities similar to those observed in schizophrenic patients. Acute animal models use single exposure of drugs-of-abuse such as; ketamine (NMDAR antagonist), d-amphetamine, LSD (lysergic acid diethyl amide) and DOI (2, 5- dimethoxy-4-iodoamphetamine hydrochloride) (5HT 2A R agonists). Chronic models can be obtained by (e.g.) exposure of rat embryos to a mitotoxin, methylazoxymethanol acetate (MAM) at embryonic day 17 (E17). 4

5 The nucleus accumbens (NAc) is a part of the limbic circuit that is implicated in the disturbed sensory experiences produced by drugs-of-abuse and also to some of the symptoms of psychiatric diseases. Considering the integral role of NAc based on its anatomical and functional connections, our laboratory was involved in the analysis of local field potential (LFP) oscillations recorded from the NAc in acute animal models of schizophrenia. Previous results from our group have shown that, spontaneous high frequency oscillations (HFO, Hz) occur in the NAc of freely moving rats. Moreover, systemic and local administration of NMDAR antagonists (MK801/ketamine) enhanced the power and frequency of the spontaneous HFO and systemic injection of d-amphetamine induced small but significant enhancement in the power of HFO. So the purpose of this thesis was to examine whether similar changes in the accumbal HFO activity can be observed in other rodent models of schizophrenia such as, serotonin model and MAM developmental disruption model of schizophrenia. Here, we examined in freely moving rats: 1) the effect of serotonergic hallucinogens (LSD and DOI) on the power and frequency of HFO in the LFPs recorded in the NAc, 2) the power and frequency of spontaneous and MK801 enhanced accumbal HFO in MAM rats (a developmental disruption model of schizophrenia) in comparison with its control/sham. Having obtained these data we compared the changes in the accumbal HFO seen in serotonin agonist and MAM models with that observed in the NMDA receptor hypo-function model of schizophrenia. We found that LSD (0.03, 0.1, 0.3 mg/kg) and DOI (0.5, 1.0, 2.0 mg/kg) increased the power and reduced the frequency of HFO. Application of MDL (1.0 mg/kg), a 5HT 2A receptor antagonist, but not SB (1.0 mg/kg), a 5HT 2C receptor antagonist reversed the power and frequency of DOI enhanced HFO. Systemic administration of TCB-2 (5HT 2A receptor agonist, 0.1, 0.5, 1.5 mg/kg) but not CP (5H 2C receptor agonist, 0.1, 1.0, 3.0 mg/kg) produced similar increase in HFO power and reduction in HFO frequency as observed after LSD and DOI. Together these results suggest the involvement of the 5HT 2A and not 5HT 2C receptor in modulating HFO in the NAc. Interestingly, we also found that the hallucinogen-induced increases in HFO power were much smaller than those produced by ketamine (25 mg/kg). In the MAM model rats we found enhanced power and increased frequency of spontaneous HFO in the NAc when compared to sham animals. While administration of MK801 produced equivalent increase in the HFO power in both MAM and sham groups, we observed a dose-dependent increase in the HFO frequency in sham rats only. There was no 5

6 change in the HFO frequency in MAM animals, showing that both groups of rats respond in a different way to application of NMDAR antagonist. To sum up, spontaneous HFO occur in the NAc and their power can be enhanced either by systemic administration of NMDAR antagonists, serotonin agonists (small but significant increase), or by exposure of fetus to MAM at E17. Spontaneous HFO frequency is elevated in rats treated with MAM, while the frequency of accumbal HFO is either increased or decreased in NMDAR hypofunction model and serotonin model of schizophrenia, respectively. Taken together, modulations of accumbal HFO in the rodent models of schizophrenia were distinct in each animal model tested here with different characteristic changes in the HFO power and frequency. However, the general conclusion is that in all models of schizophrenia investigated we observed the enhanced power of accumbal HFO activity. The frequency of the HFO in these models is not so straightforward parameter. But, if we assume that changes in frequency of HFO reflect also some pathology related to schizophrenia, then it seems justified to hypothesize that aberrant accumbal HFO seem to be a characteristic feature of rodent models of schizophrenia. Moreover, HFO may be used as an electrophysiological biomarker that can be investigated in animal models to provide better understanding into the pathophysiology of schizophrenia and new treatment methods. 6