AUTOREFERAT. 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/artystyczne - z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej

Transkrypt

1 AUTOREFERAT 1. Imię i nazwisko: Magdalena Dziembowska 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/artystyczne - z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej 2002 stopień doktora nauk biologicznych, specjalność: biologia molekularna Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN w Warszawie tytuł rozprawy: Molekularny mechanizm działania TGF-beta1 na komórki ludzkiego glejaka T98G, regulacja i znaczenie w patogenezie glejaków ; dyplom z wyróżnieniem 2002 dyplom ukończenia Studium Medycyny Molekularnej w Warszawie 1998 tytuł magistra biologii, zakres: biologia molekularna Wydział Biologii oraz Wydział Indywidualnych Studiów Matematyczno-Przyrodniczych (MISMaP), Uniwersytet Warszawski 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych od 2013 kierownik laboratorium Molekularnych Podstaw Pastyczności Synaptycznej w Centrum Nowych Technologii Uniwersytetu Warszawskiego (CeNT) adiunkt w Pracowni Neurobiologii Instytutu Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN w Warszawie staż podoktorski w Instytucie Curie, Orsay, Francja staż podoktorski w Instytucie Pasteura, Paryż, Francja doktorat w Instytucie Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN w Warszawie 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.) a) (autorzy, rok wydania, tytuły publikacji, nazwa wydawnictwa); impact factor (IF) roku wydania i 5-letni wg bazy Journal Citation Reports, punkty wg MNiSW, liczba cytowań wg bazy Web of Science 1. Dziembowska M, Milek J, Janusz A, Rejmak E, Romanowska E, Gorkiewicz T, Tiron A, Bramham CR, Kaczmarek L. (2012) Activity-dependent local translation of matrix metalloproteinase-9. Journal of Neuroscience, 32, IF 2012: 6,908; 5-letni IF: 7,869; MNiSW: 45; liczba cytowań: Dziembowska M, Wlodarczyk J. (2012) MMP9: a novel function in synaptic plasticity. Int J Biochem Cell Biol, 44, IF 2013: 4,24; 5-letni IF: 4,37; MNiSW: 35; liczba cytowań: Janusz A, Miłek J, Perycz M, Pacini L, Bagni C, Kaczmarek K and Dziembowska M. (2013) Matrix metalloproteinase 9 mrna is translationally regulated by the Fragile X Mental Retardation Protein Journal of Neuroscience, 33, IF 2013: 6,747; 5-letni IF: 7,35; MNiSW: 45; liczba cytowań: Dziembowska M, Pretto DI, Janusz A, Kaczmarek L, Leigh MJ, Gabriel N, Durbin-Johnson B, Hagerman RJ, Tassone F. (2013) High activity levels of MMP-9 in Fragile X syndrome are lowered by minocycline. American Journal of Medical Genetics, 161A, IF 2013: 2,048; 5-letni IF 2,305; MNiSW: 15; liczba cytowań: Jasińska M, Miłek J, Cymerman IA, Łęski S, Kaczmarek L, Dziembowska M. (2015) mir- 132 Regulates Dendritic Spine Structure by Direct Targeting of Matrix Metalloproteinase 9 mrna. Molecular Neurobiology IF 2014: 5,137; 5-letni IF: 5,46; MNiSW: 40; liczba cytowań: 0 1

2 b) Opis indywidualnego wkładu habilitanta w powstanie każdej z powyższych wieloautorskich publikacji. 1. Dziembowska M, Milek J, Janusz A, Rejmak E, Romanowska E, Gorkiewicz T, Tiron A, Bramham CR, Kaczmarek L. (2012) Activity-dependent local translation of matrix metalloproteinase-9. Journal of Neuroscience, 32, IF 2013: 6,908; 5-letni IF: 7,87; MNiSW: 45; liczba cytowań: 31. Procentowy udział habilitantki 75% Habilitantka zaplanowała i przeprowadziła samodzielnie 75% doświadczeń prezentowanych w pracy: 1. Zoptymalizowała metodę in situ hybrydyzacji na skrawkach mózgu szczura oraz na utrwalonych komórkach z pierwotnej hodowli neuronalnej z wykorzystaniem sondy RNA rozpoznającej endogenne mrna MMP-9 i Arc. 2. Przeprowadziła pomiary intensywności fluorescencji w różnych obszarach hipokampa po hybrydyzacji z sondą MMP-9 oraz Arc (Fig. 1I,J), a także liczenie granul zawierających mrna MMP-9 w dendrytach komórek nerwowych (Fig. 2 E). 3. Nawiązała współpracę z laboratorium prof. C. Bramhama w Bergen (Norwegia), gdzie były przeprowadzone doświadczenia indukcji LTP na żywych szczurach. 4. Zoptymalizowała metodę transfekcji komórek hipokampa plazmidami zawierającymi elementy systemu MS2 do śledzenia transportu RNA w żywych komórkach. Skonstruowała wektor zawierający sekwencję kodującą wraz z 3 UTR MMP-9 połączone ze szpilkami MS2 pod kontrolą promotora Synapsyny 1. Przeprowadziła obrazowanie komórek nerwowych w czasie rzeczywistym i przeanalizowała uzyskane wyniki (Fig. 3). 5. Zoptymalizowała metodę izolacji synaptoneurosomów z mózgu myszy z wykorzystaniem filtracji przez szereg filtrów PVDF. Uzyskane preparaty synaptoneurosomów przetestowała pod względem odpowiedzi na stymulację vitro. Z pomocą doktorantki Aleksandry Janusz przeprowadziła pomiar aktywności MMP-9 w supernatancie uzyskanym po wirowaniu stymulowanych synaptoneurosomów z wykorzystaniem techniki pomiaru fluorescencji DQ żelatyny. 6. Przeanalizowała sekwencję 3 UTR mrna MMP-9 pod kątem obecności potencjalnych miejsc wiązania białka CPEB regulującego lokalną poliadenylację transkryptów w neuronach. Zoptymalizowała metodę PAT assay (ang. Poly(A) Tail-Lenght Assay), służącą do badania długości ogonów poli(a) mrna znajdujących się w synaptoneurosomach przed i po stymulacji i przeprowadziła wszystkie doświadczenia zawarte w pracy. Opracowała uzyskane wyniki w formie wykresów. 7. Zoptymalizowała metodę frakcjonowania polirybosomów z synaptoneurosomów (izolowanych na świeżo z mózgu myszy) poprzez wirowanie w gradiencie sacharozy, a następnie z pomocą doktoranta Jacka Miłka przeprowadziła badanie poziomu mrna MMP-9 obecnego we wszystkich frakcjach za pomocą metody radioaktywnego RT-PCR. 8. Zoptymalizowała metodę znakowania nowo powstających w synaptoneurosomach białek z wykorzystaniem inkorporacji analogu aminokwasu i reakcji click chemistry. 9. Zoptymalizowała metodę stymulacji pierwotnej hodowli hipokampalnej bikukuliną po wcześniejszym wyciszeniu neuronów. Przeprowadziła analizę wpływu stymulacji hodowli neuronalnej na wydzielanie endogennego MMP-9, co było badane poprzez cięcie jego naturalnego substratu - beta-dystroglikanu metodą western blot. Doświadczenia były prowadzone w obecności inhibitora MMP-9 oraz inhibitora poliadenylacji (cordycepiny). 10. Przeprowadziła analizę statystyczną wszystkich wyników. 11. Przygotowała wszystkie ryciny zamieszczone w pracy. 12. Napisała pierwszą wersję manuskryptu oraz współpracowała z prof. Leszkiem Kaczmarkiem, prof. Clivem Bramhamem i pozostałymi współautorami nad ostateczną wersją publikacji. 2

3 2. Dziembowska M, Wlodarczyk J. (2012) MMP9: a novel function in synaptic plasticity. Int Biochem Cell Biol, 44, IF 2013: 4,24; 5-letni IF: 4,37; MNiSW: 15; liczba cytowań: 30. Procentowy udział habilitantki: 50% Habilitantka dokonała przeglądu literatury fachowej, napisała połowę tekstu pracy i przygotowała rycinę Janusz A, Miłek J, Perycz M, Pacini L, Bagni C, Kaczmarek K and Dziembowska M (2013) Matrix metalloproteinase 9 mrna is translationally regulated by the Fragile X Mental Retardation Protein Journal of Neuroscience., 33, IF 2013: 6,747; 5-letni IF: 7,35; MNiSW: 45; liczba cytowań: 20. Procentowy udział habilitantki: 40% Habilitantka zaplanowała większość eksperymentów prezentowanych w pracy oraz nadzorowała pracę dwójki doktorantów, zaangażowanych w realizację projektu. Nawiązała współpracę z laboratorium prof. Claudii Bagni w Leuven, skąd otrzymała myszy Fmr1KO. Kierowała hodowlą myszy linii Fmr1KO. 1. Przeprowadziła pierwszą analizę poziomu białka MMP-9 w synaptoneurosomach izolowanych z mózgu myszy Fmr1KO i myszy o genotypie dzikim używając metody zymografii żelowej, analizy były następnie powtarzane przez doktorantkę Aleksandrę Janusz pod nadzorem habilitantki. 2. Nadzorowała wykonanie immunoprecypitacji RNA z przeciwciałem anty-fmrp na ekstraktach synaptoneurosomów izolowanych z mózgu myszy Fmr1KO i myszy o genotypie dzikim przez doktorantkę Aleksandrę Janusz. 3. Zoptymalizowała metodę kotransfekcji pierwotnych hodowli komórek hipokampa plazmidami zawierającymi elementy systemu MS2 oraz wektorem kodującym białko fuzyjne FMRP - mcherry, który służył do kolokalizacji mrna MMP-9 i białka FMRP w żywych komórkach. 4. Zoptymalizowała metodę in situ hybrydyzacji wraz z jednoczesnym barwieniem komórek przeciwciałem rozpoznającym endogenne białko FMRP i nadzorowała wykonanie doświadczeń przez doktorantkę Aleksandrę Janusz. 5. Nadzorowała wykonanie doświadczeń z oznaczaniem ilości mrna MMP-9 we frakcjach polisomalnych uzyskanych z synaptoneurosomów myszy Fmr1KO oraz myszy o genotypie dzikim stymulowanych lub nie DHPG. Wraz z doktorantami analizowała uzyskane wyniki. 6. Przeprowadziła analizę statystyczną wszystkich uzyskanych wyników wraz z doktorantami Aleksandrą Janusz i Jackiem Miłkiem. 7. Napisała pierwszą wersję manuskryptu oraz współpracowała z prof. Leszkiem Kaczmarkiem, prof. Claudią Bagni i pozostałymi współautorami nad ostateczną wersją publikacji. 8. Pełniła rolę autora korespondującego. 4. Dziembowska M, Pretto DI, Janusz A, Kaczmarek L, Leigh MJ, Gabriel N, Durbin- Johnson B, Hagerman RJ, Tassone F (2013) High activity levels of MMP-9 in Fragile X syndrome are lowered by minocycline. American Journal of Medical Genetics 161A, IF 2013: 2,048; 5-letni IF: 2,305; MNiSW:15; liczba cytowań: 31 Procentowy udział habilitantki: 30% Habilitantka nawiązała współpracę z prof. Florą Tassone z MIND Institute, Kalifornia, USA i była pomysłodawcą przeprowadzenia badań opisanych w publikacji. Habilitantka koordynowała przesyłanie materiału (surowica pacjentów) z Sakramento (USA) do Warszawy. Następnie wraz z doktorantką Aleksandrą Janusz przeprowadzała zymografie żelowe, analizowała uzyskane wyniki i przygotowała ostateczną wersję ryciny 1C. 3

4 Przygotowała schemat ilustrujący model aktywacji MMP-9 i działania minocykliny na synapsie zdrowej oraz fragile X syndrome (Ryc. 2). Napisała część manuskryptu dotyczącą bezpośrednio wykonywanych analiz oraz współpracowała z prof. Florą Tassone i pozostałymi współautorami nad ostateczną wersją publikacji. 5. Jasińska M, Miłek J, Cymerman IA, Łęski S, Kaczmarek L, Dziembowska M. (2015) mir- 132 Regulates Dendritic Spine Structure by Direct Targeting of Matrix Metalloproteinase 9 mrna. Molecular Neurobiology IF 2014: 5,137; 5-letni IF: 5,46; MNiSW: 40; liczba cytowań: 0. Procentowy udział habilitantki: 40% Habilitantka pełniła rolę autora korespondującego oraz nadzorowała pracę doktorantki Magdaleny Jasińskiej. 1. Habilitantka przeprowadziła analizę sekwencji cząsteczki mrna MMP-9 pod kątem odnalezienia potencjalnych miejsc wiązania mir-132, przy użyciu dostępnych baz danych. 2. Zaprojektowała klonowanie wszystkich wektorów użytych w pracy do transfekcji komórek w celu udowodnienia regulacji ekspresji mrna MMP9 przez mir-132 oraz nadzorowała konstrukcję plazmidów przez magistrantkę Magdalenę Jasińską. 3. Nadzorowała przeprowadzenie doświadczenia immunoprecypitacji RNA przez doktorantkę M. Jasińską a następnie analizę uzyskanych wyników. 4. Przeprowadzała transfekcję komórek nerwowych odpowiednimi wektorami, a następnie nadzorowała doświadczenia wykonywane przez M. Jasińską 5. Wykonała zymografię in situ na pożywce pochodzącej z hodowli neuronów korowych transferowanych mir-132 lub plazmidem kontrolnym, a następnie nadzorowała przeprowadzanie doświadczeń przez M. Jasińską 6. Przy użyciu metody western blot dokonała oznaczenia poziomu białka MMP-9 w ekstraktach pochodzących z hodowli neuronów korowych transferowanych mir-132 lub plazmidem kontrolnym 7. Nadzorowała analizę morfometryczną kolców dendrytycznych wykonaną przez M. Jasińską oraz Szymona Łęskiego 8. Przygotowała ostateczną wersją rycin zawartych w publikacji 9. Napisała pierwszą wersję manuskryptu a następnie współpracowała z pozostałymi współautorami nad ostateczną wersją publikacji. 4

5 c) omówienie celu naukowego/artystycznego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania Tytuł osiągnięcia: Charakterystyka molekularnego mechanizmu regulującego synaptyczną syntezę białka - metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej 9 (MMP-9) w neuronach. Wstęp - Rola lokalnej translacji białek w plastyczności synaptycznej Plastyczność neuronalna to zdolność komórek nerwowych do trwałych zmian w odpowiedzi na działanie bodźców ze środowiska. Ta niezwykła właściwość układu nerwowego zapewnia organizmowi zdolność do adaptacji a przede wszystkim leży u podstaw procesów uczenia się i pamięci. Zrozumienie mechanizmów plastyczności układu nerwowego jest jednym z podstawowych wyzwań współczesnej neurobiologii. Na poziomie pojedynczej komórki nerwowej plastyczność wyraża się poprzez aktywność poszczególnych synaps, a ta z kolei zależy od rodzaju białek syntetyzowanych w synapsie w odpowiedzi na pobudzenie. Część białek obecnych w dendrytach i na synapsach jest syntetyzowana lokalnie na matrycy mrna specjalnie transportowanych z ciała komórki. mrna, które mają być transportowane do dendrytów są syntetyzowane w jądrze komórkowym na matrycy DNA, a następnie pakowane w struktury nazywane granulami RNA (mrnps), w skład których wchodzą RNA i białka je wiążące (Tom Dieck i wsp., 2014). Po opuszczeniu jądra komórkowego granule zawierające mrna transportowane są wzdłuż mikrotubul do dystalnych części komórki nerwowej, dendrytów i aksonów (Kindler i Kreienkamp, 2012). Dla niektórych mrna transportowanych do dendrytów udowodniono ich lokalną poliadenylację, która poprzedzała przyłączenie rybosomów i syntezę białka (Darnell i Richter, 2012). Lokalna translacja synaptycznych mrna zapewnia możliwość szybkiej zmiany przewodnictwa synaptycznego i morfologii kolców dendrytycznych (wypustki pokrywające dendryt, na których znajdują się synapsy). Dzięki temu możliwa jest indywidualna reakcja poszczególnych synaps na stymulację, co gwarantuje ich plastyczność. Proces translacji synaptycznej okazał się niezwykle ważny dla fizjologii synapsy a jego zaburzenia prowadzą do wystąpienia zespołów chorobowych, takich jak zespół łamliwego chromosomu X (ang. Fragile X syndrom, FXS) czy autyzm i są związane z nieprawidłową morfologią synaps oraz upośledzonym przewodnictwem synaptycznym (Liu-Yesucevitz i wsp., 2011, Penzes i wsp., 2011, Richter i wsp., 2015). Wiadomo, że lokalna translacja zachodzi w odpowiedzi na pobudzenie receptorów synaptycznych pozwalając na bardzo szybką produkcję białek po stymulacji i pewną niezależność synapsy od procesu transkrypcji jądrowej. Prawdopodobnie w zależności od 5

6 rodzaju neuronów i typu stymulacji syntetyzowany jest różny zestaw białek synaptycznych. W ostatnich latach potwierdzono lokalną translację kilkudziesięciu transkryptów o kluczowych funkcjach dla plastyczności synaptycznej. Używając metody bezpośredniego sekwencjonowania Cajigas i współpracownicy scharakteryzowali wszystkie mrna obecne w warstwie hipokampu zawierającej głównie dendryty i aksony pola CA1 hipokampa (Cajigas i wsp., 2012). Autorzy scharakteryzowali w badanej części mózgu ponad 2500 specyficznych mrna, tworząc katalog transkryptów obecnych w dendrytach i aksonach neuronów hipokampa. Wyniki te wskazują na ogromny, wcześniej niedoceniany potencjał lokalnej translacji pozwalający na syntezę nowych białek w zależności od zapotrzebowania i modyfikację proteomu synaptycznego (Holt i Schuman, 2013). Jednym z białek odgrywających kluczową rolę w regulacji struktury i funkcji synaps, dla którego mrna zostało wykryte w dendrytach jest metaloproteinaza macierzy zewnątrzkomórkowej 9 (MMP-9). W 2002 roku Szklarczyk i wsp. wykazali wzrost poziomu mrna MMP-9 w warstwie molekularnej zakrętu zębatego hipokampa po 24 godzinach od wywołania stanu drgawkowego indukowanego podaniem kwasu kainowego (Szklarczyk i wsp., 2002). W podobnym modelu doświadczalnym wykazano obecność mrna MMP-9 w okolicy synaps przy użyciu in situ hybrydyzacji i mikroskopii elektronowej (Konopacki i wsp., 2007). Zaobserwowano również, że MMP-9 ulega ekspresji w neuronach w odpowiedzi na stymulację (Szklarczyk i wsp., 2002, Rivera i wsp., 2010) oraz wykazano jej kluczową rolę w procesach związanych z uczeniem się i pamięcią, jak np. utrzymanie długotrwałego wzmocnienia synaptycznego (ang. long term potentiation - LTP) (Nagy i wsp., 2006, Bozdagi i wsp., 2007, Wang i wsp., 2008, Gorkiewicz i wsp., 2015). MMP-9 jest enzymem o właściwościach proteolitycznych wydzielanym w formie nieaktywnego proenzymu na zewnątrz komórki, w przypadku komórek nerwowych na zewnątrz synapsy, gdzie po aktywacji przecina specyficzne substraty, do których należą np. białka adhezyjne, białka macierzy zewnątrzkomórkowej, czy receptory jak beta1 integryna (Ryc.1) (Wang i wsp., 2008, Michaluk i wsp., 2011, Peixoto i wsp., 2012, Bajor i Kaczmarek, 2013). Prawdopodobnie poprzez trawienie specyficznych substratów, białek synaptycznych o różnorodnych funkcjach, MMP-9 wpływa zarówno na zależną od aktywności synaptycznej reorganizację morfologii kolców dendrytycznych jak i na regulację przewodnictwa synaptycznego. W tym kontekście, MMP-9 jest mediatorem zarówno strukturalnej jak i funkcjonalnej plastyczności synaptycznej. W serii prac, które wchodzą w skład prezentowanej habilitacji udowadniamy, że mrna MMP-9 jest transportowane do synaps gdzie ulega lokalnej translacji i jest wydzielane w sposób zależny od aktywności. Lokalna synteza MMP-9 na synapsie jest kontrolowana przez białko FMRP (ang. fragile X mental retardation protein) oraz mir-132. Działając razem z innymi lokalnie syntetyzowanymi białkami MMP-9 koordynuje procesy strukturalnej i funkcjonalnej plastyczności w aktywowanych synapsach. 6

7 Ryc. 1. Schemat przedstawiający transport mrna kodującego białko MMP-9 w granulach zawierających RNA, jego lokalną translację na synapsie a następnie wydzielanie w odpowiedzi na stymulację w postaci nieaktywnego proenzymu (pro-mmp-9). Po aktywacji (odcięcie propeptydu przez tkankowy aktywator plazminogenu (tpa)) MMP-9 trawi specyficzne substraty jak np. białka macierzy zewnątrzkomórkowej czy receptory integryn, indukując w ten sposób zmiany morfologiczne oraz wewnątrzkomórkowe ścieżki przekazywania sygnału (Dziembowska i Wlodarczyk, 2012). 1. Synaptyczna translacja MMP-9 w odpowiedzi na pobudzenie neuronalne. (Dziembowska i wsp., Journal of Neuroscience, 2012) W pierwszej opublikowanej pracy wykazaliśmy, że MMP-9 ulega lokalnej translacji w neuronach w odpowiedzi na stymulację synaptyczną (Dziembowska i wsp., 2012). Udało nam się wykazać, że mrna kodujące białko MMP-9 jest zlokalizowane w wypustkach dendrytycznych, uwidocznione w okolicy synaps przy użyciu metody in situ hybrydyzacji oraz barwień immunocytochemicznych a także z wykorzystaniem techniki uwidaczniania fluorescencyjnie wyznakowanych mrna w żywej komórce (ang. MS2 system). Aby zaobserwować, czy po stymulacji komórek nerwowych dochodzi do przemieszczania się granul zawierających mrna MMP-9 z ciała komórki do dendrytów zaplanowaliśmy doświadczenia z wykorzystaniem hodowli neuronów hipokampalnych oraz obrazowanie struktur hipokampa szczura po wcześniejszej indukcji LTP (ang. long term potentiation). LTP 7

8 ścieżki przeszywającej (ang. medial perforant path LTP) powoduje bardzo silną stymulację neuronów zakrętu zębatego hipokampa, przy czym specyficzna budowa tej struktury umożliwia obserwację ciał komórek (warstwa ziarnista) oraz wypustek dendrytycznych (warstwa molekularna). Zaobserwowaliśmy, że po 2 godzinach od indukcji LTP dochodzi do zwiększenia ekspresji i przemieszczania się mrna MMP-9 z ciała komórki do dendrytów. Podobny efekt zaobserwowaliśmy w neuronach hipokampalnych w hodowli w 10, 15 i 20 minut po pobudzeniu glutaminianem. Uzyskane wyniki wskazywały na to, że mrna MMP-9 jest transportowane wzdłuż wypustek dendrytycznych do odległych synaps. Aby wizualizować ten proces w żywych komórkach transfekowaliśmy neurony dwoma plazmidami. Pierwszy z nich zawierał sekwencję kodującą oraz sekwencję 3 UTR mrna MMP-9 wraz z powtórzonymi sekwencjami MS2. Sekwencje MS2 tworzą charakterystyczną strukturę szpilki do włosów, do której wiąże się białko MS2-EGFP (Rook i wsp., 2000). Drugi plazmid kotransfekowany do komórek pozwalał na wyrażanie białka MS2-EGFP w neuronach. Dzięki wykorzystaniu systemu MS2 udało nam się pokazać dendrytyczny transport mrna MMP-9 w żywych neuronach. Po tym jak wykazaliśmy lokalizację mrna MMP-9 w dendrytach używając nowoczesnych technik mikroskopowych przeszliśmy do badań biochemicznych, które miały na celu scharakteryzowanie mechanizmów molekularnych i udowodnienie, że białko MMP-9 jest produkowane na synapsie na bazie transportowanego mrna. Podstawowym modelem doświadczalnym, jaki wykorzystaliśmy w badaniach lokalnej translacji białka MMP-9 były synaptoneurosomy, czyli oczyszczona frakcja połączonych ze sobą pęcherzyków pre- i postsynaptycznych izolowanych z mózgu szczura. Synaptoneurosomy stanowią model wyizolowanej synapsy i są z powodzeniem wykorzystywane w badaniach lokalnej translacji. Stosowana przez nas metoda izolacji synaptoneurosomów polega na filtracji homogenatu uzyskanego z mózgu szczura przez szereg filtrów o zmniejszającej się średnicy porów (Ryc. 2A,B). W przeciwieństwie do metod opartych o wirowanie w gradiencie gęstości, pozwala ona na szybką preparatykę, a zaletą uzyskiwanych przez nas preparatów synaptoneurosomów jest to, że zachowują one zdolność do odpowiedzi na stymulację synaptyczną in vitro, czyli uwalniania neurotransmiterów, aktywacji receptorów i w efekcie syntezy białka w odpowiedzi na stymulację. Wykazaliśmy to na przykładzie stymulacji receptorów NMDA udowadniając, że są one funkcjonalne w wyizolowanych synaptoneurosomach, bowiem w wyniku stymulacji NMDA i glutaminianem dochodziło do: 1) poliadenylacji synaptycznych mrna (MMP-9 i CaMKII), 2) związania się synaptycznych mrna z polirybosomami, 3) lokalnej syntezy białka MMP-9 de novo, 4) obserwowaliśmy również wzrost aktywności enzymatycznej białka MMP-9 wydzielanego na zewnątrz synapsy (Ryc. 2) (Dziembowska i wsp., 2012). 8

9 A B C Hippocampus or cortex HOMOGENIZATION Homogenate (H) FILTRATION (100, 60, 30, 10 μm) D Filtrate (F) CENTRIFUGATION Synaptoneurosomes (SN) Cytosol (C) Ryc. 2. A. Schemat przedstawiający metodę izolacji synaptoneurosomów, B. Poliadenylacja mrna MMP-9 i CaMKII w synaptoneurososmach po stymulacji glutaminianem. C. Przesuwanie się mrna MMP-9 i Arc do frakcji zawierającej polirybosomy (3 i 4) w odpowiedzi na stymulację. E. De novo synteza białka MMP-9 i Arc w synaptoneurosomach po stymulacji uwidoczniona dzięki inkorporacji HPG. Lokalna poliadenylacja synaptycznych mrna jest jednym z proponowanych mechanizmów inicjacji translacji (Bramham i Wells, 2007, Richter, 2010). Subpopulacja mrna transportowanych w wypustkach dendrytycznych posiada bardzo krótkie, kilkunukleotydowe ogony polia, a w obrębie ich 3 UTR występują sekwencje umożliwiające wiązanie się z białkiem CPEB (ang. cytoplasmic polyadenylation binding protein). Związanie CPEB prowadzi do powstania kompleksu mrna z opłaszczającymi je białkami, które jednocześnie chronią przed degradacją i zabezpieczają transport dendrytyczny do docelowego miejsca lokalnej syntezy. W wyniku stymulacji synaptycznej dochodzi do fosforylacji i dysocjacji elementów kompleksu białkowego opłaszczającego cząsteczkę mrna, co umożliwia poliadenylację i inicjację syntezy białka. Aby zbadać czy mrna kodujące białko MMP-9 podlega lokalnej poliadenylacji przeprowadziliśmy izolację RNA z synaptoneurosomów, a następnie zbadaliśmy długość ogonów polia przy użyciu tzw. metody PAT assay (ang. Poly(A) Tail-Lenght Assay). W metodzie tej, dzięki specyficznie zaprojektowanym starterom, w reakcji PCR amplifikowane są fragmenty zawierające ogon polia. W wyniku indukcji poliadenylacji uzyskuje się widoczny na żelu agarozowym charakterystyczny smear świadczący o wydłużaniu się łańcucha polia. W przypadku synaptoneurosomów stymulowanych glutaminianem w czasach 3, 6 i 12 minut udało nam się zaobserwować wzrost poliadenylacji mrna MMP-9 jak również CaMKII, która była pozytywną kontrolą eksperymentu (Ryc. 2B). 9

10 Po tym jak cząsteczka mrna ulega poliadenylacji możliwe jest przyłączenie podjednostek rybosomu i zapoczątkowanie syntezy białka. Aby sprawdzić obecność mrna MMP-9 we frakcji związanej z polisomami zastosowaliśmy metodę frakcjonowania polirybosomów poprzez wirowanie w gradiencie sacharozy. Synaptoneurosomy przed lub po stymulacji glutaminianem były poddawane lizie a następnie frakcjonowane. Zbieraliśmy następujące frakcje: 1. mrnps, 2. monosomy, 3. frakcja lekkich polisomów, 4. frakcja ciężkich polisomów oraz 5. granule RNA (Krichevsky i Kosik, 2001). Z każdej z nich izolowaliśmy RNA a następnie przy użyciu metody radioaktywnego RT-PCR badaliśmy poziom transkryptów dla MMP-9 i białka Arc, które było kontrolą pozytywną eksperymentu. Udało nam się zaobserwować, że po pobudzeniu neuronalnym, mrna kodujące białko MMP-9 przesuwa się do frakcji zawierającej wydajnie translujące polirybosomy, co jest bezpośrednim dowodem na lokalną translację synaptycznej puli mrna kodującego białko MMP-9 (Ryc. 2C). Dzięki wykorzystaniu metody inkorporacji analogu aminokwasu, L- homopropargylglicyny (HPG, analog glicyny) do nowo syntetyzowanych białek w stymulowanych synaptoneurosomach udało nam się bezpośrednio wykazać obecność powstającgo de novo MMP-9. Świeżo wyizolowane synaptoneurosomy były preinkubowane z HPG a następnie stymulowane NMDA i glutaminianem. W wyniku stymulacji do nowo powstających białek wbudowała się HPG, co umożliwiło chemiczne dołączenie biotyny w reakcji Click-iT. Po wzbogaceniu na złożu ze streptawidyną białka poddawano analizie western blot ze specyficznym przeciwciałem i obserwowano wzrost ilości nowopowstałych białek synaptycznych, MMP-9 i Arc (Ryc. 2E). W omówionej publikacji udowadniamy, że ważne dla fizjologicznych funkcji synapsy białko MMP-9 podlega lokalnej syntezie w odpowiedzi na stymulację. Do realizacji projektu konieczne było zoptymalizowanie szeregu metod z zakresu biologii komórki (jak np. transfekcja komórek nerwowych elementami systemu MS2) oraz biochemii (izolacja synaptoneurosomów, ich stymulacja in vitro, frakcjonowanie polirybosomów, chemia click, PAT assay). Stworzony warsztat metodyczny pozwalający na badanie mechanizmów lokalnej translacji z wykorzystaniem synaptoneurosomów został wykorzystany w kolejnych pracach stanowiących dalsze części habilitacji. 2. Lokalna translacja metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej-9 w neuronach jest regulowana przez białko FMRP. (Janusz i wsp., Journal of Neuroscience, 2013) Kontynuując nasze badania odkryliśmy, że mrna MMP-9 oddziałuje z białkiem FMRP (ang. fragile X mental retardation protein), które reguluje jego lokalną translację 10

11 w neuronach. Brak ekspresji FMRP jest odpowiedzialny za wystąpienie jednego z częstszych zespołów wad wrodzonych, zespołu łamliwego chromosomu X. Bezpośrednią przyczyną braku ekspresji białka FMRP jest mutacja dynamiczna - powielenie trójki nukleotydów CGG w genie FMR1 zlokalizowanym na chromosomie X. Zespół łamliwego chromosomu X to choroba genetyczna cechująca się obniżeniem poziomu rozwoju intelektualnego różnego stopnia, której niektóre objawy behawioralne pokrywają się z objawami charakterystycznymi dla autyzmu (Hagerman i wsp., 2005). Jest to najczęstsza dziedziczna przyczyna upośledzenia umysłowego u chłopców i druga, co do częstości wśród przyczyn genetycznych (po zespole Downa). FMRP jest inhibitorem lokalnej translacji w neuronach a jego brak prowadzi do zwiększonej lokalnej syntezy białek synaptycznych (Bassell i Warren, 2008). To z kolei powoduje brak zdolności komórki nerwowej do odpowiedzi na pobudzenie synaptyczne (Zalfa i wsp., 2003, Lu i wsp., 2004, Muddashetty i wsp., 2007). Brak białka FMRP powoduje podwyższenie poziomu translacji synaptycznej białek zależnych od FMRP, które ulegają lokalnej translacji i regulują fizjologię synapsy, co prowadzi do nieprawidłowości obserwowanych w zespole łamliwego chromosomu X, takich jak nieprawidłowa morfologia synaps i kolców dendrytycznych, a także upośledzenia przewodnictwa synaptycznego (Rudelli i wsp., 1985). Charakterystyczną cechą neuronów pozbawionych białka FMRP jest zmieniona morfologia kolców dendrytycznych, które są wydłużone, niedojrzałe i nie mogą tworzyć stabilnych połączeń synaptycznych (Comery i wsp., 1997). W prowadzonych przez nas badaniach wykorzystaliśmy myszy transgeniczne, pozbawione funkcjonalnego białka FMRP - Fmr1KO. Myszy te są modelem zespołu łamliwego chromosomu X, który rekapituluje symptomy zespołu występującego u ludzi i jest szeroko wykorzystywany do badań molekularnego podłoża choroby (Santos i wsp., 2014). W 2009 roku ukazała się praca, której autorzy obserwowali zwiększoną aktywność żelatynolityczną MMP-9 w ekstraktach białkowych uzyskanych z mózgu myszy Fmr1KO w porównaniu z myszami o genotypie dzikim (Bilousova i wsp., 2009). W tym samym czasie prowadzone przez nas badania wskazywały, że MMP-9 ulega translacji na synapsie w odpowiedzi na pobudzenie neuronalne (Dziembowska i wsp., 2012). Nasunęło to przypuszczenia, że podwyższony poziom aktywności MMP-9 w mózgu myszy Fmr1KO może być spowodowany zaburzeniami lokalnej syntezy tego białka. Aby zbadać poziom MMP-9 na synapsach ponownie użyliśmy synaptoneurosomów, tym razem izolowanych z mózgu myszy Fmr1KO oraz myszy o genotypie dzikim. W uzyskanych preparatach oznaczyliśmy aktywność białka MMP-9 przy użyciu metody zymografii żelowej. Wyniki uzyskane w tym eksperymencie wskazywały na znacznie podwyższony poziom białka MMP-9 w synaptoneurosomach izolowanych z mózgu myszy 11

12 Fmr1KO w porównaniau z myszami o genotypie dzikim. To nasunęło kolejne pytanie - czy lokalna translacja mrna MMP-9 jest regulowana przez białko FMRP? Analiza in silico sekwencji 3 UTR mrna MMP-9 wykazała obecność tzw. motywu G- kwartetu, lub kwadrupleksu, czyli sekwencji podwójnych zasad purynowych G, dzięki którym możliwe jest tworzenie wewnątrzcząsteczkowych oddziaływań, warunkujących strukturę RNA znaną jako G-kwartet. Wiadomo, że FMRP może oddziaływać ze strukturą G-kwartetu poprzez domenę RGG (Darnell i wsp., 2001, Schaeffer i wsp., 2001, Subramanian i wsp., 2011). W celu zbadania przypuszczalnego oddziaływania białka FMRP z mrna MMP-9 oraz potwierdzenia czy oddziaływanie ma bezpośredni charakter, przeprowadziliśmy coimmunoprecypitację RNA z przeciwciałem anty-fmrp 7G1-1 z wykorzystaniem ekstraktów wyizolowanych z mózgów myszy Fmr1KO i myszy o genotypie dzikim. Uzyskane wyniki jednoznacznie potwierdziły oddziaływanie białka FMRP z mrna MMP-9. Aby zlokalizować oddziaływanie mrna MMP-9 z FMRP w komórce ponownie wykorzystaliśmy system MS2 do wyznakowania mrna MMP-9 i dodatkowo transfekowaliśmy neurony plazmidem kodującym fluorescencyjne białko FMRP (FMRPmCherry) (Ryc. 3). Dzięki zastosowaniu tej metody stwierdziliśmy występowanie kompleksów mrna MMP-9 z białkiem FMRP w dendrytach. Wynik ten został następnie potwierdzony metodą in situ hybrydyzacji z wykorzystaniem sondy rozpoznającej mrna MMP-9 i barwienia immunocytochemicznego z użyciem przeciwciała rozpoznającego endogenne białko FMRP. Dodatkowo udało nam się wykazać, że w neuronach stymulowanych DHPG (agonista I grupy metabotropowych receptorów dla glutaminianu mglur) dochodzi do dysocjacji kompleksów mrna MMP-9-białko FMRP. A B Ryc. 3 A. Aktywność MMP-9 w synaptoneurosomach izolowanych z mózgu myszy o genotypie dzikim (WT) oraz myszy Fmr1KO mierzona przy użyciu zymografii żelowej. B. Kolokalizacja mrna kodującego MMP-9 - wyzankowany na zielono przy użyciu systemu MS2 oraz białka FMRP (transfekcja białka fuzyjnego FMRPmCherry) w neuronach. 12

13 Aby ocenić poziom translacji mrna MMP-9 w synaptoneurosomach izolowanych z mózgu myszy Fmr1KO i myszy o genotypie dzikim przeprowadziliśmy frakcjonowanie poprzez ultrawirowanie w liniowym gradiencie sacharozy, tak jak opisano powyżej. Synaptoneurosomy były stymulowane DHPG (agonista metabotropowych receptorów dla glutaminianu grupy I). Po lizie, ekstrakt synaptoneurosomów został poddany frakcjonowaniu. Z każdego gradientu zbierano dziesięć frakcji, które następnie zostały podzielone na 5 grup na podstawie profilu absorbancji: 1. mrnps, 2. monosomy, 3. frakcja lekkich polisomów, 4. frakcja ciężkich polisomów oraz 5. granule RNA (Krichevsky i Kosik, 2001). Ze wszystkich frakcji wyizolowano RNA, a następnie przy użyciu metody radioaktywnego RT-PCR, analizowano ilość mrna MMP-9 w poszczególnych frakcjach. Zaobserwowaliśmy wzrost poziomu mrna MMP-9 we frakcji 3 i 4 (aktywnie translujące polirybosomy) po stymulacji, natomiast myszy Fmr1KO wykazywały podwyższony poziom translacji mrna MMP-9 już w kontroli i brak odpowiedzi na stymulację (Janusz i wsp., 2013). Dotychczas zidentyfikowano wiele mrna regulowanych przez FMRP, ale funkcja większości z nich w plastyczności synaptycznej nie jest znana. W pracy z 2013 roku charakteryzujemy mrna MMP-9 jako substrat FMRP regulowany przez to białko na synapsie (Janusz i wsp., 2013). Dzięki opisanym doświadczeniom udało nam się jednoznacznie wykazać, że podwyższona aktywność MMP-9 obserwowana w preparatach synaptoneurosomów pozyskanych z mózgów myszy Fmr1 KO jest wynikiem podwyższonego poziomu lokalnej translacji mrna MMP-9, który prowadzi do nadmiernej ilości tego białka na synapsie i może być odpowiedzialny za nieprawidłową morfologię kolców dendrytycznych - charakterystyczną cechę neuronów zespołu łamliwego chromosomu X. W niedawno opublikowanej pracy Sidhu i współautorzy wykazali, że pozbawienie myszy Fmr1KO ekspresji MMP-9 (skrzyżowanie ze szczepem MMP-9 KO) prowadzi do odwrócenia fenotypu charakterystycznego dla zespołu łamliwego chromosomu X, a więc przywrócenia prawidłowego kształtu kolców dendrytycznych, naprawę zależnego od mglur5 LTD, a także poprawia wyniki zwierząt w testach behawioralnych (Sidhu i wsp., 2014). W innej pracy Gkogkas i współautorzy wykazali, że zmniejszenie poziomu MMP-9 w szczepie myszy Fmr1KO poprzez zahamowanie inicjacji translacji zależnej od eif4e, podobnie wpływa na przywrócenie morfologii kolców dendrytycznych, LTD i zachowania zwierząt do poziomu kontroli (Gkogkas i wsp., 2014). Podsumowując, w kolejnej pracy odkryliśmy, że lokalna translacja mrna MMP-9 jest kontrolowana przez białko FMRP, a w przypadku jego braku (myszy Fmr1KO) poziom MMP- 9 na synapsie jest podwyższony. Wyniki nasze oraz innych autorów wskazują na ważną rolę MMP-9 w regulacji plastyczności strukturalnej i funkcji synapsy oraz wskazują, że MMP-9 może być potencjalnym celem w terapii łamliwego chromosomu X. 13

14 3. Minocyklina obniża poziom MMP-9 u pacjentów cierpiących na zespół łamliwego chromosomu X. (Dziembowska i wsp., American Journal of Medical Genetics, 2013) Badania ostatnich lat wskazują, że przyczyną chorób neurokognitywnych, takich jak schizofrenia czy autyzm jest nieprawidłowe funkcjonowanie synaps (Penzes i wsp., 2011). Jedną z najlepiej poznanych pod względem molekularnych mechanizmów chorób tego typu jest zespół łamliwego chromosomu X, gdzie poznanie i zrozumienie synaptycznych funkcji białka FMRP doprowadziło do zaproponowania strategii terapeutycznych (Saldarriaga i wsp., 2014). Zewnątrzkomórkowa lokalizacja enzymu MMP-9 czyni go szczególnie atrakcyjnym potencjalnym celem dla farmakologicznej interwencji terapeutycznej. Wykazano, że hamowanie aktywności MMP-9 przez zastosowanie minocykliny, antybiotyku z grupy tetracyklin, u myszy Fmr1KO może spowodować nie tylko poprawę morfologii kolców dendrytycznych, ale także zmianę zachowania myszy Fmr1KO, które po podaniu minocykliny wypadały lepiej w ogólnych testach poznawczych (Bilousova i wsp., 2009). Na podstawie badań własnych oraz wyników innych autorów zaproponowaliśmy mechanizm wpływu MMP- 9 na morfologię kolców dendrytycznych w zdrowych neuronach i w zespole łamliwego chromosomu X (Ryc. 4). Obecnie testuje się skuteczność inhibitora MMP-9, minocykliny jako potencjalnego leku stosowanego w zespole łamliwego chromosomu X. Ryc. 4. Schemat prezentujący wpływ wydzielanego pod wpływem stymulacji neuronalnej białka MMP-9 na strukturę kolców dendrytycznych w przypadku neuronów zdrowych oraz pochodzących od pacjentów z FXS. Nadprodukcja MMP-9 prowadzi do powstawania wydłużonych kolców dendrytycznych w FXS a jej zahamowanie przez minocyklinę przywraca prawidłową strukturę synapsy. 14

15 Pierwsze badania kliniczne, które przeprowadzono w celu przetestowania minocykliny w leczeniu pacjentów z zespolem łamliwego chromosomu X i pacjentów z autyzmem wskazują, że minocyklina jest stosunkowo dobrze tolerowana i przynosi pacjentom korzyści funkcjonalne (Paribello i wsp., 2010, Utari i wsp., 2010). Dzięki współpracy z prof. Florą Tassone z MIND Institute (Sacramento, USA), gdzie prowadzone są badanie kliniczne dotyczące wpływu minocykliny na pacjentów z FXS mogliśmy zbadać poziom MMP-9 w osoczu krwi pacjentów przyjmujących ten lek. W pierwszej kolejności udało nam się wykazać, że ogólny poziom aktywności MMP-9 jest podwyższony w osoczu chorych FXS, w porównaniu z osobami zdrowymi (odpowiednio dobraną pod względem wieku grupą kontrolną) (Dziembowska i wsp., 2013). Randomizowane badanie kliniczne, z podwójnie ślepą próbą, kontrolowane placebo przeprowadzono w Instytucie MIND. Grupa pacjentów z zespołem łamliwego chromosomu X przyjmowała minocyklinę przez trzy miesiące a następnie placebo przez kolejne trzy miesiące. Poziom MMP-9 był oznaczany w osoczu krwi przed i po trzymiesięcznym okresie przyjmowania minocykliny i placebo przy użyciu metody zymografii żelowej. Poziom MMP-9 korelowano z obserwacjami klinicznymi. Wyniki wskazują, że minocyklina powoduje obniżenie poziomu MMP-9 w osoczu krwi pacjentów i że w niektórych przypadkach zmiany poziomu MMP-9 korelują z poprawą stanu pacjentów prowadzoną w oparciu o ankietę i parametry kliniczne. Ogólny stan pacjentów oceniano w skali Clinical Global Impression Scale (CGI-I) oraz w 2 kategoriach skali VAS, gdzie znajdowały się między innymi takie parametry jak poprawa zdolności poznawczych i zachowania, ocena nastroju czy poprawa interakcji społecznych. Parametry te były oceniane przed i po podaniu minocykliny lub placebo. Tylko niewielka liczba pacjentów nie wykazała poprawy po leczeniu minocykliną a skutki uboczne leczenia nie różniły się od poprzednio opisywanych (Dziembowska i wsp., 2013). Prowadzone przez nas badania podstawowych mechanizmów molekularnych regulujących lokalną translację MMP-9 na synapsie przez białko FMRP nieoczekiwanie nabrały charakteru badań potencjalnie aplikacyjnych. Zrozumienie mechanizmu deregulacji poziomu MMP-9 na synapsie może stanowić podstawę do zaproponowania nowych terapii, w której MMP-9 stanowić będzie cel interwencji farmakologicznej w leczeniu zespołu łamliwego chromosomu X. 15

16 4. Rola mirna-132 w regulacji lokalnej translacji MMP-9 oraz plastyczności strukturalnej kolców dendrytycznych (Jasińska i wsp., Molecular Neurobiology, 2015) Nasze poprzednie badania wskazywały, że precyzyjna regulacja poziomu białka MMP-9 na synapsie w odpowiedzi na pobudzenie ma bezpośredni wpływ na morfologię kolców dendrytycznych i prawidłowe funkcje synapsy. W ostatnich latach ukazały się publikacje opisujące rolę mikrorna w regulacji translacji synaptycznej (Muddashetty i wsp., 2011). Ponieważ wykazano oddziaływanie białka FMRP z licznymi mikrorna w neuronach, a jednocześnie nasze badania wskazywały na oddziaływanie FMRP z mrna MMP-9 postanowiliśmy sprawdzić czy synaptyczna translacja MMP-9 jest regulowana przez mikrorna. MikroRNA (mirna) są główną klasą małych, niekodujących cząsteczek RNA, które działają posttranskrypcyjnie hamując ekspresję białek poprzez wiązanie się do specyficznej sekwencji w docelowych mrna (Bartel, 2004). MiRNA wiąże się do częściowo komplementarnej sekwencji znajdującej się najczęściej w rejonie 3'UTR regulowanego mrna wraz z kompleksem RISC, co prowadzi do represji translacji oraz, w większości przypadków, degradacji mrna (Filipowicz i wsp., 2008). Ludzki genom koduje ponad 1000 różnych mirna, które mają potencjał by regulować większość ludzkich genów (Berezikov i wsp., 2006, Kosik, 2009). Pojedyncza cząsteczka mikrorna może regulować wiele różnych mrna, co stanowi ogromny i na razie słabo poznany potencjał regulacyjny. Co ciekawe, niektóre z neuronalnych mirna są specyficznie wzbogacone w dendrytach i na synapsach (Kye i wsp., 2007, Pichardo-Casas i wsp., 2012). MikroRNA zlokalizowane w dendrytach wpływają na aktywność synapsy poprzez regulację lokalnej syntezy białek biorących udział w plastyczności kolców dendrytycznych (Schratt, 2009). Tak więc mikrorna stanowią dodatkowy poziom regulacji syntezy białek synaptycznych zapewniający ścisłą kontrolę translacji mrna w określonym miejscu (synapsa) i czasie (stymulacja synaptyczna), co może mieć fundamentalne znaczenie dla funkcjonowania synapsy (Bredy i wsp., 2011). Szereg opublikowanych danych wskazywało na to, że mir-132 może regulować synaptyczną ekspresję mrna MMP-9 w neuronach. W opublikowanej w 2012 pracy Edbauer i wsp., wykazali, że mir-132 współoczyszcza się z przeciwciałem anty-fmrp z ekstraktów uzyskiwanych z mózgu myszy, co wskazywało na istnienie kompleksu FMRP/mir-132, natomiast nasze wcześniejsze, omówione wyżej badania dowodzą oddziaływania FMRP z mrna MMP-9 (Edbauer i wsp., 2010, Janusz i wsp., 2013). Ponadto analiza sekwencji 3 UTR cząsteczki mrna MMP-9 wykazała, że miejsce wiązania mir-132 przewidziane in silico leży w bezpośredniej bliskości miejsca oddziaływania z FMRP (tzw. sekwencja G-kwartetu). Nadekspresja mir-132 w neuronach hipokampalnych prowadzi do 16

17 zwiększenia szerokości główki kolców dendrytycznych (Edbauer i wsp., 2010), efekt ten można wytłumaczyć zahamowaniem aktywności MMP-9 przez nadekspresję mir-132. Podanie aktywnej formy białka MMP-9 do hodowli neuronalnej powoduje wydłużanie się kolców dendrytycznych, a więc efekt odwrotny do mir-132 (Michaluk i wsp., 2011). Myszy pozbawione aktywności białka Dicer, enzymu odpowiedzialnego za powstawanie dojrzałego mirna w komórce, wykazują zwiększoną ekspresję MMP-9 w mózgu, co było kolejnym argumentem wskazującym na regulację MMP-9 przez mikrorna (Konopka i wsp., 2010). Zarówno mir-132 jak i metaloproteinaza macierzy zewnątrzkomórkowej - 9 (MMP-9) są zaangażowane w zmiany architektury i funkcji synaps, tzw. plastyczność strukturalną. Plastyczność strukturalna to zdolność kolców dendrytycznych do zmiany kształtu, która jest ściśle powiązana z funkcją synapsy (Bosch i Hayashi, 2012, Rochefort i Konnerth, 2012). Uważa się, że kształt kolca dendrytycznego odzwierciedla stabilność synapsy oraz siłę transmisji synaptycznej. Kolce dendrytyczne to struktury bardzo dynamiczne, dzięki szybkiej zmianie ich kształtu możliwa jest modulacja połączeń sieci neuronalnej (Yoshihara i wsp., 2009). Nieprawidłowości w ich morfologii stwierdzono w wielu zaburzeniach neurologicznych takich jak zespół łamliwego chromosomu X czy schizofrenia (Penzes i wsp., 2011). Badania ostatnich lat wskazują, że struktura kolców dendrytycznych jest zależna od ekspresji białek synaptycznych, a ta z kolei podlega regulacji przez synaptyczne mikrorna. Ekspresja mir-132 jest indukowana w neuronach w odpowiedzi na pobudzenie synaptyczne przez czynnik transkrypcyjny CREB (Remenyi i wsp., 2010). Zaobserwowano, że zwiększona ekspresja mir-132 kontroluje powiększanie się kolców dendrytycznych w odpowiedzi na stymulację i zwiększenie transmisji synaptycznej (Eacker i wsp., 2013). Do tej pory zidentyfikowano dwa transkrypty, których zahamowanie przez mir-132 może prowadzić do przebudowy cytoszkieletu aktynowego i zmiany kształtu kolców dendrytycznych - p250gap i MeCP2 (Klein i wsp., 2007, Impey i wsp., 2010). Wyniki opisane w naszej ostatniej pracy wskazują, że mir-132 wpływa na plastyczność strukturalną kolców dendrytycznych poprzez regulację synaptycznej translacji mrna MMP-9 (Jasinska i wsp., 2015). Analiza in silico sekwencji 3 UTR mrna MMP-9 wykazała obecność zachowanego w ewolucji miejsca wiązania mir-132 (Ryc. 5A). W celu sprawdzenia czy mir-132 reguluje ekspresję mrna MMP-9 przygotowaliśmy plazmid reporterowy (psyn-luc-3 UTR-MMP9), w którym ekspresja mrna lucyferazy świetlikowej wraz z sekwencją 3 UTR mrna MMP-9 jest regulowana promotorem synapsyny 1, zapewniającym wydajną ekspresję w neuronach. Nadekspresja mir-132 z wektorem reporterowym w neuronach powodowała obniżenie aktywności lucyferazy wskazując na regulację 3 UTR mrna MMP-9 przez mir-132. W celu identyfikacji dokładnego miejsca oddziaływania mir-132 w obrębie 3 UTR mrna MMP-9 wprowadziliśmy mutację (zamiana 4 nukleotydów) w przewidzianym in silico miejscu 17

18 wiązania mir-132. Zmiana sekwencji uniemożliwiła mir-132 wiązanie się do 3 UTR mrna MMP-9, o czym świadczył brak zmiany aktywności lucyferazy (Ryc. 5B). Uzyskany przez nas wynik dowodzi, że mir-132 wiąże się do 3 UTR mrna MMP-9 w przewidzianym miejscu i sugeruje, że mrna MMP-9 jest synaptycznym celem cząsteczki mir-132 poprzez regulację którego może ona wpływać na funkcje synapsy. A B C D Ryc. 5. mir-132 reguluje ekspresję 3 UTR mrna MMP-9 w neuronach. A. Schemat przedstawiający porównanie sekwencji nukleotydowej fragmentu 3 UTR mrna MMP-9 z zaznaczonymi miejscami oddziaływania mir-132 i sekwencją G-kwartetu. B. Wektor reporterowy z sekwencją lucyferazy i 3 UTR mrna MMP-9 oraz wektor zawierający zmienioną sekwencję wiązania mir-132. Aktywność lucyferazy w neuronach korowych transfekowanych wektorami reporterowymi i mir-132. C, D Wyciszenie aktywności MMP-9 w neuronach transfekowanych mir zymografia żelowa przedstawiająca aktywność MMP-9 wydzielanego do pożywki (C) oraz poziom białka MMP-9 w lizowanych komórkach badany metodą western blot (D). Dalsze badania miały na celu udowodnienie, że nadekspresja mir-132 w neuronach spowoduje obniżenie poziomu białka MMP-9. Dzięki temu, że MMP-9 jest enzymem proteolitycznym wydzielanym na zewnątrz komórki jego aktywność można badać w pożywce przy użyciu tzw. zymografii żelowej. Przy użyciu tej metody zmierzyliśmy poziom MMP-9 18

19 wydzielanej przez neurony transfekowane wektorem kontrolnym oraz wektorem umożliwiającym nadekspresję mir-132 (Ryc. 5C). Uzyskane wyniki wskazywały jednoznacznie, że nadekspresja mir-132 w neuronach obniża poziom endogennego białka MMP-9, wynik ten został dodatkowo potwierdzony metodą western blot (Ryc. 5D). Obecnie uważa się, że istnieją dwa podstawowe mechanizmy regulacji ekspresji genów przez mikrorna za pośrednictwem kompleksu RISC: inhibicja translacji oraz degradacja zależna od deadenylacji (Filipowicz i wsp., 2008). Mechanizm działania mikrorna może zależeć od rodzaju komórek. W neuronach, gdzie mrna są transportowane do dendrytów w granulach zawierających białka i RNA, łatwo wyobrazić sobie wykorzystanie mikrorna do czasowej represji transportowanych mrna, które po stymulacji mogłyby oddysocjować od mrna umożliwiając kontrolowaną translację białek synaptycznych. Taki typ regulacji, w którym następuje odwracalna represja translacji przez mirna, udowodniono np. dla mrna PSD-95, które jest regulowane przez mir-125a (Muddashetty i wsp., 2011). W omawianej pracy udało nam się wykazać, ze mir-132 wiąże się do sekwencji 3 UTR MMP-9 w sposób zależny od aktywności synaptycznej. Używając plazmidu reporterowego psyn-luc- 3 UTR-MMP9 wykazaliśmy, że aktywność lucyferazy zmienia się w transfekowanych neuronach po zahamowaniu ich aktywności. Ponadto wykazaliśmy, że niewielka ilość mir-132 jest związana z polirybosomami w synaptoneurosomach, co sugeruje bezpośredni wpływ mir- 132 na regulację translacji. Następnie zbadaliśmy wpływ nadekspresji mir-132 w neuronach na plastyczność strukturalną kolców dendrytycznych. Zwiększona aktywność MMP-9 na synapsie powoduje nieprawidłową morfologią kolców dendrytycznych charakterystyczną dla zespołu łamliwego chromosomu X, zahamowanie endogennej aktywności MMP-9 w neuronach Fmr1KO poprzez nadekspresję mir-132 prowadziło do zwiększania się szerokości kolców dendrytycznych przywracając ich poprawną morfologię (Ryc.6). Pomiarów morfometrycznych kolców dendrytycznych dokonano z wykorzystaniem programu SpineMagick! (Ruszczycki i wsp., 2012). Fmr1KO wild-type GFP mir-132 GFP mir-132 Ryc. 6. Morfologia kolców dendrytycznych w neuronach hipokampalnych uzyskanych z myszy Fmr1KO i myszy o genotypie dzikim. Neurony transfekowano plazmidem do nadekspresji mir-132 oraz plazmidem kontrolnym. 19

20 W omawianej pracy wykazaliśmy, że mikrorna-132 (mir-132) może regulować lokalną translację mrna metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej 9 (MMP-9) w neuronach, przez co wpływa na plastyczność strukturalną kolców dendrytycznych (Ryc. 7). Odkrycie dodatkowego mechanizmu regulacji lokalnej ekspresji MMP-9 na synapsie przez mikrorna dowodzi, że precyzyjna regulacja poziomu tego białka jest ważna dla prawidłowego funkcjonowania komórek nerwowych. Ryc. 7. Na podstawie omówionych wyżej wyników zaproponowaliśmy schemat przedstawiający działanie mir- 132 na synapsie. Po stymulacji synaptycznej dochodzi do dysocjacji kompleksu mrna/mikrorna/białko, a uwolnione z czasowej represji mrna MMP-9 może ulec translacji. Wydzielone na synapsie MMP-9 indukuje plastyczność strukturalną kolców dendrytycznych, poprzez chwilowe zerwanie połączeń części presynaptycznej z postsynaptyczną. Kolce dendrytyczne zmieniają kształt i strukturę w zależności od rodzaju pobudzenia. Podsumowanie Na osiągnięcie habilitacyjne składa się cykl omówionych powyżej prac eksperymentalnych, w których identyfikujemy molekularny mechanizm regulujący lokalną syntezę białka MMP-9 na synapsie w odpowiedzi na pobudzenie neuronalne. Dokładne zrozumienie mechanizmu regulacji lokalnej translacji MMP-9 przez mir-132 i FMRP, którego brak prowadzi do zespołu łamliwego chromosomu X, najczęstszej dziedzicznej przyczyny upośledzenia umysłowego u chłopców, przyczyni się do zrozumienia molekularnych mechanizmów tej a także innych chorób, w których obserwuje się zaburzenia w rozwoju synaps. Piśmiennictwo Bajor M, Kaczmarek L (2013) Proteolytic remodeling of the synaptic cell adhesion molecules (CAMs) by metzincins in synaptic plasticity. Neurochem Res 38: Bartel DP (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116: