PL B1. System mikroprzepływowy do hodowli trójwymiarowych struktur komórkowych i badania cytotoksyczności związków chemicznych

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. G01N 31/00 ( ) C12M 3/00 ( ) G01N 21/63 ( ) C12M 1/34 ( ) (54) System mikroprzepływowy do hodowli trójwymiarowych struktur komórkowych i badania cytotoksyczności związków chemicznych (73) Uprawniony z patentu: POLITECHNIKA WARSZAWSKA, Warszawa, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 25/13 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 06/15 (72) Twórca(y) wynalazku: KARINA ZIÓŁKOWSKA, Ostrowiec Świętokrzyski, PL RADOSŁAW KWAPISZEWSKI, Radom, PL ZBIGNIEW BRZÓZKA, Warszawa, PL ARTUR DYBKO, Warszawa, PL MICHAŁ CHUDY, Żyrardów, PL KAMIL ŻUKOWSKI, Reszel, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Joanna Bocheńska

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest system mikroprzepływowy do hodowli trójwymiarowych struktur komórkowych i badania cytotoksyczności związków chemicznych. Hodowle komórkowe in vitro są popularnym narzędziem dla badań podstawowych oraz testów toksykologicznych czy farmakologicznych. Szczególne znaczenie dla wdrażania nowych leków mają systemy HTS (High Throughput Screening) umożliwiające szybką i powtarzalną analizę wielu próbek jednocześnie. Większość rozwiązań dążących do automatyzacji oznaczeń bazuje na wykorzystaniu płytek wielodołkowych (96-cio, 384-ro lub 1536-cio dołkowych), co wiąże się z rozbudowanym zapleczem aparaturowym. Poszukuje się wysokosprawnych metod umożliwiających otrzymywanie wyników pozwalających przewidzieć działanie związku na żywy organizm. Metody takie doprowadziłyby do zmniejszenia liczby zwierząt wykorzystywanych w badaniach. Modelem komórkowym najczęściej wykorzystywanym w systemach HTS jest monowarstwa komórek adherentnych. Jest to model wygodny w użyciu i stosunkowo prosty do analizy, jednak niewystarczający z punktu widzenia poszukiwania metod alternatywnych do testów na zwierzętach. Komórki wyizolowane z organizmu i hodowane w postaci monowarstwy na dnie naczynia hodowlanego tracą funkcje specyficzne dla danej tkanki. Otoczenie komórek w środowiskach in vivo oraz in vitro jest rozbieżne ze względu na brak bezpośrednich połączeń międzykomórkowych, różnice w topologii macierzy międzykomórkowej oraz brak sygnalingu parakrynnego i endokrynnego. W efekcie obserwuje znaczące rozbieżności w fizjologii komórek in vitro i in vivo od budowy cytoszkieletu po zmiany w ekspresji genów. Znany jest z publikacji Ziółkowska K. i in., marzec 2010, Sensors and Actuators B: Chemical, 145(1), mikroukład do hodowli komórkowej. W szklanej płytce znajduje się macierz mikrokomór hodowlanych w układzie liniowym, przeznaczonych do prowadzenia hodowli komórek. Mikrokanały, korzystnie meandryczne, utworzone w płytce polimerowej, tworzą generator gradientu stężeń, zawierający dwa kanały wlotowe służące do wprowadzenia dwóch stężeń badanych substancji i kanały wylotowe połączone z mikrokomorami hodowlanymi i łączące mikrokomory hodowlane ze sobą wzdłuż mikroukładu. Od strony dwóch kanałów wlotowych znajdują się trzy mikrokanały, każdy następny etap generatora gradientu stężeń utworzony przez mikrokanały zawiera o jeden mikrokanał więcej. W ostatnim etapie generatora stężeń utworzonym przez mikrokanały znajduje się taka ilość mikrokanałów, która odpowiada ilości linii mikrokomór hodowlanych. W trakcie przepływu substancji przez generator gradientu stężeń następuje wymieszanie badanych substancji i tworzenie różnych stężeń. Pozwala to na otrzymanie macierzy mikrokomór z tyloma stężeniami badanej substancji w jednym kroku ile jest linii mikrokomór hodowlanych. Ponadto mikrosystem zawiera wywiercony w płytce polimerowej otwór do wprowadzenia komórek do mikroukładu oraz pożywek hodowlanych. Mikrokomory mają płaskie dno i uzyskane w nich hodowle komórkowe mają postać monowarstwy. Wyniki najnowszych badań na temat różnic między środowiskami in vivo a in vitro są przesłanką do poszukiwania nowych modeli in vitro. Obiecujące jest stosowanie w badaniach trójwymiarowych struktur komórkowych sferoidów. Komórki adherentne hodowane w naczyniach o odpowiednim, hydrofobowym charakterze powierzchni, zamiast monowarstwy tworzą kuliste agregaty zwane sferoidami. Trójwymiarowa struktura, obecność macierzy międzykomórkowej, przestrzenne połączenia międzykomórkowe oraz warstwowa budowa tkanki powodująca opory dyfuzyjne sprawiają, że steroidy są modelem in vitro znacznie przybliżającym warunki in vivo. Jest to model szczególnie atrakcyjny dla badań nad nowotworami, gdyż wykazano, że sferoidy zbudowane z komórek nowotworowych wykazują szereg cech identycznych z guzami in vivo. Jednak brak wygodnych i powtarzalnych metod hodowli sferoidów w znacznym stopniu ogranicza ich szerokie wykorzystanie w badaniach. Istnieje potrzeba poszukiwania nowych metod, pozwalających na włączenie sferoidów do badań nad lekami przeciwnowotworowymi. Dotychczas opisano w literaturze kilka rozwiązań dotyczących hodowli sferoidów w układach mikroprzepływowych, jednak żadne z nich nie było kompatybilne z metodami analizy instrumentalnej. W ogromnej większości są to układy wymagające wieloetapowego wytwarzania, skomplikowanej obsługi oraz żmudnych metod detekcji (manualna obróbka obrazu mikroskopowego). Układy mikroprzepływowe do hodowli sferoidów złożone są z dwóch polimerowych płytek z których jedna, lub obie zawierają mikrostrukturę. Układy takie zawierają matrycę komór hodowlanych odpowiadających wielkościom pojedynczych sferoidów (poniżej 200 µm), z doprowadzeniem medium do każdej komory w postaci pojedynczego, wąskiego mikrokanału. Takie rozwiązanie powoduje wysokie wartości stresu

3 PL B1 3 hydrodynamicznego działającego na pojedynczy sferoid. W przypadku układów zawierających mikrostrukturę w obu warstwach polimeru, precyzja dopasowania wzorów znacznie wpływa na funkcjonalność, a im dokładniejsze dopasowanie jest konieczne, tym koszt urządzenia wyższy. Ze względów technologicznych komory hodowlane są odseparowane od siebie i położone na dość znacznej powierzchni, dlatego też żadne z opisanych w literaturze rozwiązań nie było kompatybilne z metodami analizy instrumentalnej (czytnikami płytek wielodołkowych). Znane jest również rozwiązanie zawierające wiele nisz hodowlanych w jednej mikrokomorze, jednak są to nisze małe, mieszczące do kilkunastu komórek, co nie w pełni odzwierciedla warunki in vivo. Jako alternatywa, opublikowany został system kompatybilny z czytnikami płytek wielodołkowych wykorzystujący hodowlę sferoidów w wiszącej kropli, jednak ten sposób hodowli w znaczący sposób ogranicza możliwość wymiany medium hodowlanego (dostarczanie związków pokarmowych, odprowadzanie produktów metabolizmu), przez co zgodność otrzymanych wyników może być poddana w wątpliwość. System mikroprzepływowy do hodowli trójwymiarowych struktur komórkowych i badania cytotoksyczności związków chemicznych składa się z modułu mikroprzepływowego oraz płytki pozycjonującej, przy czym moduł mikroprzepływowy składa się z dwóch warstw wykonanych z poli- (dimetylosiloksanu) (PDMS) warstwy górnej z wykonanymi portami wlotowymi i portem wylotowym i warstwy dolnej. W warstwie dolnej wykonana jest część hodowlana oraz system mikrokanałów doprowadzających medium hodowlane/roztwór badanego związku. W części hodowlanej znajdują się mikrokomory a w każdej mikrokomorze znajdują się półsferyczne mikrodołki hodowlane. Mikrokomory ułożone są w serie a ilość serii odpowiada ilości wylotów generatora gradientu stężeń mikrokanałów. Korzystnie mikrokomory mają średnice 3 mm i głębokość 50 µm i ułożone są w matrycę 4x4: cztery serie po cztery mikrokomory. Korzystnie w każdej mikrokomorze znajduje się dwadzieścia półsferyczych mikrodołków hodowlanych o średnicach 200 µm i głębokościach 150 µm. Wielkość mikrokomór oraz ich wzajemne położenie są identyczne z wielkością i położeniem grupy dołków standardowej płytki 384-dołkowej natomiast płytka pozycjonująca moduł mikroprzepływowy w spektrofluorymetrycznym czytniku płytek wielodołkowych posiada wgłębienia pozycjonujące ściśle dopasowane do kształtu modułu mikroprzepływowego i ma wymiary zewnętrzne zgodne ze standardową płytką 384-dołkową. Medium oraz badane związki doprowadzane są do mikrokomór systemem mikrokanałów tworzących generator gradientu stężeń. Za pomocą dwóch portów wlotowych doprowadzane są dwa roztwory o różnych stężeniach, które mieszane są w precyzyjny sposób w systemie mikrokanałów, dzięki czemu w czterech kanałach wylotowych znajdują się roztwory o ściśle zdefiniowanych stężeniach pośrednich. Do każdej z serii czterech mikrokomór doprowadzony jest roztwór związku o innym stężeniu, dzięki czemu możliwe jest badanie działania różnych stężeń związku w jednym eksperymencie. Porty wlotowe i wylotowe służą do montażu wężyków doprowadzających płyny. Drugim elementem systemu będącego przedmiotem wynalazku jest płytka pozycjonująca moduł mikroprzepływowy w spektrofluorymetrycznym czytniku płytek wielodołkowych. Mikrokomory hodowlane modułu mikroprzepływowego położone są w miejscach odpowiadających położeniu dołków standardowej płytki 384-dołkowej, do której przystosowanych jest większość urządzeń sczytujących. Moduł mikroprzepływowy ma precyzyjnie określone wymiary, kształt i pozycję mikrokomór względem brzegu. Wgłębienia pozycjonujące w płytce pozycjonującej są ściśle dopasowane do kształtu modułu mikroprzepływowego. Ich położenie i wymiary zostały wytworzone z dużą dokładnością za pomocą techniki mikrofrezowania w materiale polimerowym. Płytka pozycjonująca ma wymiary zgodne ze standardową płytką wielodołkową. Montaż modułu mikroprzepływowego we wgłębieniu pozycjonującym prowadzi do uzyskania pozycji mikrokomór analogicznej z pozycją dołków w płytce 384-dołkowej. Materiał, z którego wykonany jest moduł mikroprzepływowy (PDMS) promuje agregację komórek i tworzenie sferoidów. W przypadku wyjątkowo wymagających typów komórek, dopuszcza się chemiczną modyfikację powierzchni PDMS. Wielkość mikrodołków jest dobrana tak, aby zapewnić formowanie pojedynczych sferoidów komórek ludzkich w każdym dołku. Komórki wprowadzone do mikrodołka opadają na półsferyczne dno i agregują w centralnym jego miejscu, co prowadzi do otrzymania pojedynczych sferoidów w każdym mikrodołku. Wielkością otrzymanych sferoidów można sterować poprzez dobór odpowiedniej gęstości zawiesiny komórkowej. Ponadto moduł umożliwia wymywanie komórek niezagregowanych w mikrodołkach, co zapewnia precyzyjną kontrolę ilości i umiejscowienia materiału biologicznego. Stosunkowo duża średnica mikrokomór powoduje redukcję prędkości liniowej płynu przepływającego w części hodowlanej, co wpływa bezpośrednio na obniżenie stresu hydrodynamicznego działającego na komórki. Dzięki temu możliwa jest wielotygodniowa hodowla stabilnych sferoidów.

4 4 PL B1 System będący przedmiotem wynalazku jest rozwiązaniem spełniającym wymagania stawiane nowoczesnym modelom in vitro: zapewnia wzrost komórek w postaci struktur trójwymiarowych (sferoidów), umożliwia ścisłą kontrolę nad warunkami hodowli, obserwację pojedynczych sferoidów oraz system detekcji kompatybilny z układami HTS. System będący przedmiotem wynalazku może służyć do monitorowania wzrostu sferoidów. Jest to cecha unikatowa proponowanego systemu, gdyż brak jest obecnie instrumentalnych metod przystosowanych do monitorowania wzrostu trójwymiarowych struktur komórkowych. Do określania aktywności metabolicznej hodowanych komórek może posłużyć np. odczynnik alamarblue, który jest fluorescencyjnym wskaźnikiem zmian potencjału utleniająco-redukującego medium hodowlanego. Aktywność metaboliczna komórek prowadzi do redukcji odczynnika, a w efekcie do powstania fluorescencyjnego produktu reakcji. Moduł mikroprzepływowy zawierający hodowlę komórkową należy wypełnić roztworem odczynnika i po okresie inkubacji umieścić w płytce pozycjonującej, a następnie w spektrofluorymetrycznym czytniku płytek wielodołkowych. Sygnał intensywności fluorescencji pochodzący z każdej mikrokomory jest wprostproporcjonalny do ilości oraz stopnia proliferacji komórek w sferoidach zawartych w mikrodołkach danej mikrokomory. Przepływowy charakter systemu umożliwia wymycie odczynnika wskaźnikowego i dalsze prowadzenie hodowli. W trakcie wielotygodniowej hodowli sferoidów w module mikroprzepływowym, istnieje możliwość wielokrotnego powtórzenia opisanego wyżej doświadczenia. System będący przedmiotem wynalazku może posłużyć również do oceny aktywności leków przeciwnowotworowych. W tym celu w module mikroprzepływowym prowadzi się hodowlę komórek nowotworowych w postaci sferoidów. W odpowiednio dobranym momencie hodowli (sugeruje się by była to faza logarytmicznego wzrostu komórek) podaje się lek w taki sposób, że jednym portem wlotowym wprowadzane jest medium hodowlane, natomiast drugim roztwór leku w medium hodowlanym o stężeniu C MAX. Po przeprowadzeniu strumieni przez generator gradientu stężeń, do poszczególnych serii mikrokomór wprowadzane są roztwory o kolejnych stężeniach: o C MAX (czyste medium hodowlane kontrola), 0,33 C MAX, 0,67 C MAX oraz C MAX. Po określonym czasie inkubacji z lekiem przeprowadza się test żywotności komórek analogicznie do sposobu opisanego powyżej. Możliwe jest również wykorzystanie innych testów żywotności opartych na detekcji spektrofluorymetrycznej. Przepływowy charakter systemu umożliwia wymycie leku oraz odczynnika wskaźnikowego i dalsze prowadzenie hodowli. W trakcie wielotygodniowej hodowli sferoidów w module mikroprzepływowym, istnieje możliwość wprowadzania powtórnych dawek leku, jak również powtarzanie testów żywotności. Prowadzi to do unikatowej możliwości testowania powtórzonych dawek leku w warunkach in vitro, jak również określania cytotoksyczności opóźnionej. Przedmiot wynalazku przedstawiono na rysunku, na którym Fig. 1 przedstawia rzut ukośny modułu mikroprzepływowego do hodowli pojedynczych sferoidów z zachowaniem proporcji rzeczywistych, Fig. 2 przedstawia schematyczny przekrój przez układ mikroprzepływowy w proporcjach nierzeczywistych, Fig. 3 przedstawia rzut ukośny przykładu płytki pozycjonującej moduł mikroprzepływowy w czytniku płytek wielodołkowych, Fig. 4 przedstawia przykładowe pozycjonowania modułów mikroprzepływowych w czytniku płytek wielodołkowych (linią przerywaną zaznaczono pola, w których zachodzi detekcja za pomocą czytnika płytek 384-dołkowych). P r z y k ł a d 1. Moduł mikroprzepływowy 10 do hodowli trójwymiarowych struktur komórkowych składa się z części hodowlanej 2a oraz systemu mikrokanałów 4 doprowadzających medium hodowlane/roztwór badanego związku. Elementy modułu wytworzone są z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS). Moduł mikroprzepływowy 10 składa się z dwóch warstw: warstwy dolnej 8 zawierającej wklęsły, trójwymiarowy wzór mikrostruktury oraz warstwy uszczelniającej 7 zawierającej otwory wlotowe 5 i wylotowe 6. Część hodowlana 2a jest skonstruowana tak, aby zapewnić wielodniową hodowlę trójwymiarowych agregatów komórkowych. W części hodowlanej 2a znajdują się mikrokomory 2 średnicy 3 mm i głębokości 50 µm ułożone w matrycę 4x4: cztery serie po cztery mikrokomory. W każdej mikrokomorze 2 znajduje się dwadzieścia półsferyczych mikrodołków hodowlanych 1 o średnicach 200 µm i głębokościach 150 µm. W sumie układ zawiera 320 mikrodołków 1 (po 20 w każdej mikrokomorze) do hodowli pojedynczych sferoidów. Wielkość mikrokomór 2 oraz ich wzajemne położenie są identyczne z wielkością i położeniem grupy 16 (4x4) dołków standardowej płytki 384-dołkowej. Medium oraz badane związki doprowadzane są do mikrokomór 2 systemem mikrokonałów 4 tworzących generator gradientu stężeń. Na końcu każdego mikrokanału znajduje się kanał wylotowy 3 łączący mikrokanały 4 z mikrokomorami 2. Za pomocą dwóch portów wlotowych 5 doprowadzane są dwa roztwory o różnych stężeniach, które mieszane są w precyzyjny sposób w mikrokanałach 4, dzięki

5 PL B1 5 czemu w czterech kanałach wylotowych 3 znajdują się roztwory o ściśle zdefiniowanych stężeniach pośrednich. Do każdej z serii czterech mikrokomór 2 doprowadzony jest roztwór związku o innym stężeniu, dzięki czemu możliwe jest badanie działania różnych stężeń związku w jednym eksperymencie. Porty wlotowe 5 i wylotowe 6 służą do montażu wężyków doprowadzających płyny. Materiał, z którego wykonany jest układ (PDMS) promuje agregację komórek i tworzenie sferoidów. W przypadku wyjątkowo wymagających typów komórek, dopuszcza się chemiczną modyfikację powierzchni PDMS. Wielkość mikrodołków 1 jest dobrana tak, aby zapewnić formowanie pojedynczych sferoidów komórek ludzkich w każdym dołku. Komórki wprowadzone do mikrodołka 1 opadają na półsferyczne dno i agregują w centralnym jego miejscu, co prowadzi do otrzymania pojedynczych sferoidów 9 w każdym mikrodołku 1. Wielkością otrzymanych sferoidów można sterować poprzez dobór odpowiedniej gęstości zawiesiny komórkowej. Ponadto wynalazek umożliwia wymywanie komórek niezagregowanych w mikrodołkach 1, co zapewnia precyzyjną kontrolę ilości umiejscowienia materiału biologicznego. Stosunkowo duża średnica mikrokomór 2 powoduje redukcję prędkości liniowej płynu przepływającego w części hodowlanej, co wpływa bezpośrednio na obniżenie stresu hydrodynamicznego działającego na komórki. Dzięki temu możliwa jest wielotygodniowa hodowla stabilnych sferoidów. Istotnym elementem systemu będącego przedmiotem wynalazku jest sposób pozycjonowania modułu mikroprzepływowego w spektrofluorymetrycznym czytniku płytek wielodołkowych. Urządzenia kompatybilne z czytnikami płytek wielodołkowych wpisują się w powszechne dążenia do opracowywania systemów HTS (High Throughput Screening). Mikrokomory hodowlane 2 modułu mikroprzepływowego 10 położone są w miejscach odpowiadających położeniu dołków standardowej płytki 384-dołkowej, do której przystosowanych jest większość urządzeń sczytujących. Moduł mikroprzepływowy 10 ma precyzyjnie określone wymiary, kształt i pozycję mikrokomór 2 względem brzegu. Wgłębienia pozycjonujące 11a i 11b wykonane w płytce pozycjonującej 11 są ściśle dopasowane do kształtu modułu mikroprzepływowego 10. Ich położenie i wymiary zostały wytworzone z dużą dokładnością za pomocą techniki mikrofrezowania w materiale polimerowym. Płytka pozycjonująca 11 ma wymiary zgodne ze standardową płytką wielodołkową. Montaż modułu mikroprzepływowego 10 we wgłębieniu pozycjonującym 11a prowadzi do uzyskania pozycji mikrokomór 4 analogicznej z pozycją dołków w płytce 384-dołkowej. Użytkowanie modułu rozpoczyna się od sterylizacji poprzez ekspozycję na promieniowanie UV oraz przepływ 70% wodnego roztworu alkoholu etylowego. Tak przygotowany system wypełnia się medium hodowlanym, a następnie zawiesiną ludzkich komórek określonego typu (lub mieszaniną komórek różnych typów w celu stworzenia kokultury lub multikultury). Uszczelniony moduł umieszcza się w inkubatorze CO 2 do hodowli komórkowych. Poli(dimetylosiloksan), z którego zbudowany jest moduł, zapewnia wymianę gazową z atmosferą inkubatora, dzięki czemu możliwa jest efektywna hodowla. Ze względu na hydrofobowy charakter powierzchni poli(dimetylosiloksanu) uniemożliwiona jest adhezja komórek i w ciągu pierwszych kilkunastu godzin hodowli następuje agregacja komórek w mikrodołkach, a następnie tworzenie sferoidów. Przepływ medium zastosowany po 24 godzinach od wprowadzenia komórek, wymywa niezagregowane komórki z wężyków i mikrokanałów, pozostawiając trójwymiarowe agregaty jedynie w mikrodołkach hodowlanych. Hodowlę sferoidów prowadzi się przy okresowej wymianie medium w układzie. Reżim wymiany medium oraz jego skład należy dobrać stosownie do typu hodowanych komórek. System będący przedmiotem wynalazku może służyć do monitorowania wzrostu sferoidów. Do określania aktywności metabolicznej hodowanych komórek może posłużyć np. odczynnik alamarblue, który jest fluorescencyjnym wskaźnikiem zmian potencjału utleniająco-redukującego medium hodowlanego. Aktywność metaboliczna komórek prowadzi do redukcji odczynnika, a w efekcie do powstania fluorescencyjnego produktu reakcji. Moduł mikroprzepływowy zawierający hodowlę komórkową należy wypełnić roztworem odczynnika i po okresie inkubacji umieścić w płytce pozycjonującej, a następnie w spektrofluorymetrycznym czytniku płytek wielodołkowych. Sygnał intensywności fluorescencji pochodzący z każdej mikrokomory jest wprostproporcjonalny do ilości oraz stopnia proliferacji komórek w sferoidach zawartych w mikrodołkach danej mikrokomory. Przepływowy charakter systemu umożliwia wymycie odczynnika wskaźnikowego i dalsze prowadzenie hodowli. W trakcie wielotygodniowej hodowli sferoidów w module mikroprzepływowym, istnieje możliwość wielokrotnego powtórzenia opisanego wyżej doświadczenia. P r z y k ł a d 2. System będący przedmiotem wynalazku może posłużyć również do oceny aktywności leków przeciwnowotworowych. W tym celu w module mikroprzepływowym prowadzi się ho-

6 6 PL B1 dowlę komórek nowotworowych w postaci sferoidów. W odpowiednio dobranym momencie hodowli (sugeruje się by była to faza logarytmicznego wzrostu komórek) podaje się lek w taki sposób, że jednym portem wlotowym wprowadzane jest medium hodowlane, natomiast drugim roztwór leku w medium hodowlanym o stężeniu C MAX. Po przeprowadzeniu strumieni przez generator gradientu stężeń, do poszczególnych serii mikrokomór wprowadzane są roztwory o kolejnych stężeniach: 0 C MAX (czyste medium hodowlane kontrola), 0,33 C MAX, 0,67 C MAX oraz C MAX. Po określonym czasie inkubacji z lekiem przeprowadza się test żywotności komórek analogicznie do sposobu opisanego w przykładzie 1. Możliwe jest również wykorzystanie innych testów żywotności opartych na detekcji spektrofluorymetrycznej. Przepływowy charakter systemu umożliwia wymycie leku oraz odczynnika wskaźnikowego i dalsze prowadzenie hodowli. W trakcie wielotygodniowej hodowli sferoidów w module mikroprzepływowym, istnieje możliwość wprowadzania powtórnych dawek leku, jak również powtarzanie testów żywotności. Prowadzi to do unikatowej możliwości testowania powtórzonych dawek leku w warunkach in vitro, jak również określania cytotoksyczności opóźnionej. Zastrzeżenia patentowe 1. System mikroprzepływowy do hodowli trójwymiarowych struktur komórkowych i badania cytotoksyczności związków chemicznych, zawierający moduł mikroprzepływowy (10) składający się z dwóch warstw wykonanych z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) warstwy górnej (7) z wykonanymi portami wlotowymi (5) i portem wylotowym (6) i warstwy dolnej (8), w której wykonana jest część hodowlana (2a) oraz system mikrokanałów (4) doprowadzających medium hodowlane/roztwór badanego związku, przy czym mikrokomory (2) ułożone są w serie a ilość serii odpowiada ilości wylotów mikrokanałów (3), znamienny tym, że w części hodowlanej (2a) w każdej mikrokomorze (2) znajdują się półsferyczne mikrodołki hodowlane (1) a ponadto posiada płytkę pozycjonującą (11) moduł mikroprzepływowy (10) w spektrofluorymetrycznym czytniku płytek wielodołkowych posiadającą wgłębienia pozycjonujące (11a) i (11b) ściśle dopasowane do kształtu modułu mikroprzepływowego (10) i płytka ta ma wymiary zgodne ze standardową płytką 384-dołkową a równocześnie wielkość mikrokomór (2) oraz ich wzajemne położenie są identyczne z wielkością i położeniem grupy dołków standardowej płytki 384-dołkowej. 2. System według zastrz. 1, znamienny tym, że mikrokomory (2) mają średnice 3 mm i głębokość 50 µm. 3. System według zastrz. 1, znamienny tym, że mikrokomory (2) ułożone są w matrycę 4x4: cztery serie po cztery mikrokomory. 4. System według zastrz. 1, znamienny tym, że w każdej mikrokomorze (2) znajduje się dwadzieścia półsferyczych mikrodołków hodowlanych (1). 5. System według zastrz. 1, znamienny tym, że półsferyczne mikrodołki hodowlane (1) mają średnice 200 µm i głębokość 150 µm.

7 PL B1 7 Rysunki

8 8 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)