Autoreferat (Załącznik nr 2)

Transkrypt

1 Dr inż. Anna Starzyńska-Janiszewska Katedra Biotechnologii Żywności Wydział Technologii Żywności Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w Krakowie Autoreferat (Załącznik nr 2) Kraków 2017

2 1. Imię i nazwisko: Anna Starzyńska-Janiszewska Miejsce Katedra Biotechnologii Żywności pracy: Wydział Technologii Żywności Uniwersytet Rolniczy w Krakowie ul. Balicka 122, Kraków 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe - z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytuł rozprawy doktorskiej studia magisterskie, kierunek Ogrodnictwo, Wydział Ogrodniczy, Akademia Rolnicza, Kraków 30 czerwca 1998 r. dyplom magistra inżyniera, Wydział Ogrodniczy, Akademia Rolnicza, Kraków. Praca magisterska pt. Ocena zawartości cukrów, barwników betalainowych i azotanów w korzeniach segregujących populacji buraków, promotor: dr Rafał Barański studia doktoranckie, Wydział Ogrodniczy, Akademia Rolnicza, Kraków 2 grudnia 2002 r. dyplom doktora nauk rolniczych w zakresie ogrodnictwa, Wydział Ogrodniczy, Akademia Rolnicza, Kraków. Rozprawa doktorska pt. Biochemiczne i fizjologiczne zmiany zachodzące w różach brokułu w trakcie krótkotrwałego przechowywania, promotor: dr hab. Maria Leja, prof. AR w Krakowie 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych asystent naukowo- dydaktyczny, Katedra Biotechnologii Żywności, Wydział Technologii Żywności, Akademia Rolnicza im. Hugona Kołłątaja, Kraków obecnie adiunkt naukowo- dydaktyczny, Katedra Biotechnologii Żywności, Wydział Technologii Żywności, Akademia Rolnicza (aktualnie Uniwersytet Rolniczy) im. Hugona Kołłątaja, Kraków - 2 -

3 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): a) tytuł osiągnięcia naukowego Osiągnięciem naukowym, będącym podstawą złożonego przeze mnie wniosku o wszczęcie postępowania habilitacyjnego jest cykl powiązanych tematycznie publikacji pod zbiorczym tytułem: Roślinne produkty spożywcze otrzymywane poprzez modyfikacje inokulum i substratów tradycyjnych indonezyjskich fermentacji pleśniowych b) publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego 1. Starzyńska-Janiszewska A. (58%), Stodolak B., Duliński R., Mickowska B The influence of inoculum composition on selected bioactive and nutritional parameters of grass pea tempeh obtained by mixed-culture fermentation with Rhizopus oligosporus and Aspergillus oryzae strains. Food Science and Technology International, 18(2): IF: 0,907 MNiSW =25 pkt 2. Starzyńska-Janiszewska A. (87%), Stodolak B., Wikiera A Proteolysis in tempeh-type products obtained with Rhizopus and Aspergillus strains from grass pea (Lathyrus sativus) seeds. Acta Scientiarum Polonorum: Technologia Alimentaria, 14(2): IF: 0 MNiSW =15 pkt 3. Starzyńska-Janiszewska A. (73%), Stodolak B., Mickowska B Effect of controlled lactic acid fermentation on selected bioactive and nutritional parameters of tempeh obtained from unhulled common bean (Phaseolus vulgaris) seeds. Journal of the Science of Food and Agriculture, 94: ; Errata: : 3068 IF: 1,714 MNiSW =35 pkt 4. Starzyńska-Janiszewska A. (67%), Stodolak B., Wikiera A Antioxidant potential and α-galactosides content of unhulled seeds of dark common beans subjected to tempe-type fermentation with Rhizopus microsporus var. chinensis and Lactobacillus plantarum. Food Science and Technology Research, 21(6): IF: 0,357 MNiSW =15 pkt 5. Starzyńska-Janiszewska A. (60%), Bączkowicz M., Sabat R., Stodolak B., Witkowicz R Quinoa tempe as value-added food sensory, nutritional and bioactive parameters of products from white, red and black seeds. Cereal Chemistry. DOI: CCHEM R. IF:1,036 MNiSW= 25 pkt a 6. Starzyńska-Janiszewska A. (60%), Duliński R., Stodolak B., Mickowska B., Wikiera A Prolonged tempe-type fermentation in order to improve bioactive potential and nutritional parameters of quinoa seeds. Journal of Cereal Science. 71: IF: 2,402 MNiSW= 35 pkt 7. Starzyńska-Janiszewska A. (58%), Stodolak B., Duliński R., Mickowska B., Sabat R Fermentation of coloured quinoa seeds with Neurospora intermedia to obtain oncom-type product of favourable nutritional and bioactive characteristics. Cereal Chemistry. DOI: CCHEM R. IF: 1,036 MNiSW=25 pkt a a dane dla 2016 r

4 Liczba punktów za cykl publikacji (dane z roku publikacji, z wyjątkiem a ) MNiSW: 175 wartość IF (dane z roku publikacji, z wyjątkiem a ): 7,452 Oświadczenia współautorów prac określające indywidualny wkład każdego z nich w powstanie publikacji znajdują się w załączniku nr 5. c) omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania Wprowadzenie i cele badawcze Fermentacja w podłożu stałym, jako metoda produkcji i obróbki żywności pochodzenia roślinnego, jest powszechnie stosowana w krajach Azji Wschodniej (Chiny, Japonia) i Południowo-Wschodniej (Wietnam, Indonezja). W procesie tym wykorzystuje się przede wszystkim grzyby strzępkowe, ze względu na sprzyjające fizykochemiczne parametry środowiska, zbliżone do naturalnych warunków wzrostu pleśni. Jednym z produktów spożywczych otrzymywanych w wyniku fermentacji w podłożu stałym jest tempe (synonim: tempeh), pochodzący z wyspy Jawa i rozpowszechniony w Indonezji; obecnie znany również w USA, Kanadzie, Japonii i krajach Europy Zachodniej. Produkt ten otrzymywany jest w wyniku fermentacji wstępnie ugotowanych, namoczonych i obłuskanych nasion soi przy udziale kultur Rhizopus, najczęściej R. oligosporus lub R. microsporus var. chinensis. Pleśnie te, ze względu na charakter wzrostu (wytwarzają nadziemne rozłogi które pozwalają na bardzo szybką kolonizację substratu, produkują wysoką i gęstą grzybnię powietrzną), umożliwiają otrzymanie w niedługim czasie (zazwyczaj godzin inkubacji w temperaturze o C) produktu spożywczego o zwartej strukturze i delikatnym smaku. Charakterystyka i zalety sojowego tempe zostały omówione w wielu pozycjach naukowych. W literaturze przedmiotu opisano również przykłady produktów typu tempe otrzymanych z nasion innych gatunków roślin strączkowych oraz mieszanek roślin strączkowych i zbóż, a także odpadów przemysłu rolno-spożywczego 1,2,3. Stosunkowo prosty przebieg i krótki czas fermentacji typu tempe stwarzają pole dla modyfikacji, które przy zachowaniu istoty tradycyjnej procedury umożliwiłyby otrzymanie nowych produktów o korzystnych cechach. W badaniach, które złożyły się na cykl publikacji stanowiących opisywane osiągnięcie naukowe skoncentrowałam się na dwóch podstawowych elementach procesu fermentacji: składzie inokulum i rodzaju substratu. W tradycyjnym procesie fermentacji typu tempe w warunkach Indonezji materiał szczepienny stanowią mieszane kultury, uzyskiwane z otrzymanego wcześniej produktu, ryżu przerośniętego kulturami pleśni (ragi) lub wysuszonych liści hibiskusa (Hibiscus tiliaceus) (usar), stanowiących naturalne miejsce występowania pleśni Rhizopus 1. W przypadku produkcji tempe na skalę przemysłową lub laboratoryjną stosuje się natomiast zarodniki konkretnego szczepu Rhizopus lub startery otrzymane z monoszczepowych produktów. Dzięki temu zapewniona zostaje kontrola przebiegu procesu i 1 Nout M.J.R., Kiers J.L A review. Tempe fermentation, innovation and functionality: update into the third millennium. J. App. Microbiol., 98: Kuswanto K.R Industrialization of tempe fermentation. W: Industrialization of indigenous fermented foods, revised and expanded. 2nd Edition. K.H. Steinkraus (ed.), CRC Press 3 Steinkraus K.H. (ed.) Handbook of indigenous fermented foods, second edition, revised and expanded, CRC Press - 4 -

5 mikrobiologiczne bezpieczeństwo produktu, z drugiej jednak strony zakres możliwości modyfikacji składu i cech sensorycznych, a w konsekwencji - uzyskania interesujących cech produktów - jest w pewnym stopniu ograniczony. Propozycje rozwiązania tego problemu można spotkać w literaturze przedmiotu, przykładowo Wiesel i wsp. 4 z powodzeniem zastosowali mieszaninę szczepów R. oligosporus i R. oryzae (odpowiednio MS5 i EN w stosunku 4:1) dla uzyskania sojowego tempe o zbilansowanym składzie odżywczym. Fermentację nasion jęczmienia mieszanym inokulum, zawierającym oprócz R. oligosporus szczepy drożdży i bakterii mlekowych, opisano natomiast w pracach Fenga i wsp. 5,6 Celem doświadczeń przedstawionych w publikacjach 1-4 było zbadanie parametrów produktów typu tempe uzyskanych z nasion roślin strączkowych z wykorzystaniem mieszanego inokulum grzybowego oraz grzybowo-bakteryjnego. W doborze gatunków drobnoustrojów kierowałam się nadrzędną zasadą, aby nie wprowadzać mikroorganizmów zupełnie obcych dla tradycyjnej fermentacji typu tempe, co umożliwiło zachowanie typowego charakteru otrzymanych produktów. Ponadto, wybrane gatunki drobnoustrojów musiały być dopuszczone do stosowania w żywności, najlepiej stosowane rutynowo w tradycyjnych procesach fermentacji substratów roślinnych. Inspirację do wyboru szczepu pleśniowego stanowiły dane dotyczące składu usar pochodzących z wyspy Bali, w których oprócz kultur Rhizopus stwierdzono obecność pleśni Aspergillus (aż 60% próbek) 7. Gatunki aspergilli izolowano również z tradycyjnego tempe z Malezji 8. Spośród tego rodzaju, gatunek A. oryzae, pleśń jadalna, genetycznie niezdolna do syntezy mikotoksyn 9, jest na szeroką skalę stosowany do otrzymywania koji, stanowiącego źródło enzymów (proteolitycznych, amylolitycznych, lipolitycznych i innych) w procesach produkcji pasty sojowej, sosu sojowego czy sake. Badania opisane w publikacjach 1 i 2 przedstawiają charakterystykę wartości odżywczej i potencjału bioaktywnego produktów otrzymanych z udziałem Rhizopus microsporus var. chinensis i Aspergillus oryzae, przy zachowaniu jednoetapowej procedury fermentacji nasion lędźwianu siewnego. Zbadano ponadto proteolityczną aktywność ww. szczepów podczas wzrostu na tym substracie w warunkach fermentacji typu tempe. Bakteryjna fermentacja mlekowa jest częścią tradycyjnej procedury otrzymywania tempe, ponieważ drobnoustroje ją prowadzące stanowią składnik naturalnej mikroflory nasion soi. Ich aktywność w trakcie moczenia nasion warunkuje zapewnienie ph substratu właściwego dla rozwoju pleśni oraz zapobiega zdominowaniu procesu przez niepożądaną mikroflorę. Wiadomo ponadto, że bakterie te mogą rosnąć razem z Rhizopus w trakcie właściwej fermentacji w podłożu stałym 10. W doświadczeniach postanowiłam wykorzystać szczep Lactobacillus plantarum, który zastosowany wcześniej w procesie fermentacji wgłębnej mączki z nasion lędźwianu siewnego, umożliwił akumulację rozpuszczalnych polifenoli i wzrost aktywności antyrodnikowej, a także częściową 4 Wiesel I., Rehm H.J., Bisping B Improvement of tempe fermentations by application of mixed cultures consisting of Rhizopus sp. and bacterial strains. Appl. Microbiol. Biotechnol., 47: Feng X.M., Eriksson A.R.B., Schnürer J Growth of lactic acid bacteria and Rhizopus oligosporus during barley tempeh fermentation. Int. J. Food Microbiol., 104: Feng X.M., Larsen T.O., Schnürer J Production of volatile compounds by Rhizopus oligosporus during soybean and barley tempeh fermentation. Int. J. Food Microbiol., 113: Kozaki M Tempe production in Japan. W: Industrialization of indigenous fermented foods, revised and expanded. 2nd Edition. K.H. Steinkraus (ed.), CRC Press 8 Arora D.K. (ed.) Fungal biotechnology in agricultural, food, and environmental applications, Marcel Dekker, New York 9 Barbesgaard P., Heldt-Hansen H.P., Diderichsen B On the safety of Aspergillus oryzae: a review. Appl. Microbiol. Biotechnol., 36: Patrz bibliografia w przyp. 5 powyżej - 5 -

6 eliminację fitynianów z materiału 11. W doświadczeniu opisanym w publikacji 3 porównano efektywność bakterii mlekowych w procesie typu tempe na etapie moczenia substratu oraz fermentacji w podłożu stałym (mieszane inokulum grzybowo-bakteryjne) w odniesieniu do monoszczepowej fermentacji z udziałem R. microsporus var. chinensis. Celem było zbadanie wpływu wymienionych modyfikacji procedury fermentacji na poziom oligosacharydów i związków bioaktywnych, a także wartość odżywczą produktów. Jako substrat fermentacji wykorzystano odmianę kolorowej fasoli zwyczajnej Małopolanka, opierając się na wcześniejszych badaniach prowadzonych w Uniwersytecie Rolniczym w Krakowie przez Bieżanowską i wsp. 12, w których wykazano, że nasiona te są bogate w związki fenolowe oraz mogą być poddane procesowi obróbki biologicznej z wykorzystaniem R. microsporus var. chinensis. Cechy tempe otrzymanego w wyniku fermentacji mieszanym inokulum porównano następnie z parametrami ugotowanych do miękkości nasion fasoli, by ocenić efekt obróbki w ujęciu praktycznym (publikacja 4). Jak wspomniano powyżej, w procesie fermentacji typu tempe można wykorzystać różne materiały roślinne. Nasiona roślin strączkowych poddawane są procesowi obłuskania w trakcie obróbki wstępnej, co ułatwia penetrację strzępek grzybni do ich wnętrza. Jednak w praktyce, podczas produkcji tempe w Indonezji, część łusek sojowych może być celowo pozostawiana w materiale, aby obniżyć koszt składników 13. Dlatego też interesujące pod względem możliwości uproszczenia obróbki substratu oraz wzbogacenia produktu w polifenole obecne w okrywach nasion wydało mi się wykorzystanie niełuskanych nasion kolorowej fasoli zwyczajnej (publikacje 3 i 4). Kolejny typ testowanego substratu stanowiły pseudozboża, atrakcyjne ze względu na skład (nasiona bezglutenowe, zawierające polifenole) i aspekt praktyczny, gdyż nie wymagają moczenia ani długotrwałego gotowania. Substraty wysokoskrobiowe mogą być przetwarzane w procesie fermentacji typu tempe pod warunkiem, że zastosuje się szczepy Rhizopus o znikomej aktywności amylolitycznej. W przeciwnym wypadku, powstające w dużej ilości produkty hydrolizy skrobi będą dalej metabolizowane przez pleśń do kwasów organicznych (winowego, jabłkowego), o działaniu silnie zakwaszającym 14,15. Ponieważ szczep R. microsporus var. chinensis nie spełnia tego kryterium, w dalszych badaniach wykorzystałam szczep R. oligosporus ATCC Spośród substratów z grupy pseudozbóż wybrałam komosę ryżową, ze względu na duży zasięg uprawy i znaczenie ekonomiczne tej rośliny w skali światowej 16. Prace dotyczące fermentacji tempe z komosy można znaleźć w literaturze przedmiotu, jednak skupiały się one przede wszystkim na badaniu fizycznych i fizjologicznych parametrów procesu 17,18 lub tylko wybranych cech produktów 19,20. Celem prowadzonych przeze mnie badań było sprawdzenie, czy procedurę 11 Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B Effect of inoculated lactic acid fermentation on antinutritional and antiradical properties of grass pea (Lathyrus sativus Krab ) flour. Pol. J. Food. Nutr. Sci. 61: Bieżanowska-Kopeć R., Franczyk M Wpływ fermentacji przez Rhizopus microsporus, oligosporus sp-t3 oraz kiełkowania na zmiany zawartości nasion fasoli (Phaseolus vulgaris L.). Ż.N.T.J., 2: Patrz bibliografia w przyp. 3 powyżej 14 Berg S., Olsson J., Swanberg J., Schnürer M., Eriksson A Method for the production of fermented whole grain barley with Rhizopus, and products thereof B1 European Patent 15 Wang H.L., Hesseltine C.W Wheat tempeh. Cereal Chem., 43: Vega-Galvez A., Miranda M., Vergara J., Uribe E., Puente L., Martinez, E.A Nutrition facts and functional potential of quinoa (Chenopodium quinoa Willd.), an ancient Andean grain: A review. J. Sci. Food Agric., 90: Peñaloza W., Hedger J.N., Thomas B.J Low-temperature scanning electron microscopy of hyphal colonisation of Chenopodium quinoa during fermentation with Rhizopus oligosporus. Ann. Appl. Biol., 121: Peñaloza W., Davey C.L., Hedger J.N., Kell D.B Physiological studies on the solid-state quinoa tempe fermentation, using on-line measurements of fungal biomass production. J. Sci. Food Agric., 59: Matsuo M Antioxidant activity of quinoa-tempe, the seeds of Chenopodium quinoa fermented with Rhizopus oligosporus. J. Jap. Soc. Nutr. Food Sci., 56:

7 tę można zastosować uniwersalnie do różnych odmian komosy ryżowej (komosa biała, czerwona i czarna) dla uzyskania produktów typu tempe o korzystnych cechach sensorycznych, które byłyby konkurencyjne pod względem wartości odżywczej i potencjału antyoksydacyjnego w stosunku do nasion poddanych tradycyjnej obróbce kulinarnej (gotowanych). Przeanalizowałam także, w jaki sposób wydłużenie procesu fermentacji wpływa na aktywność antyoksydacyjną otrzymanych produktów typu tempe. Wyniki tych doświadczeń we wstępnej postaci przedstawiłam w formie referatu na międzynarodowej konferencji 21, a następnie zebrałam w publikacjach 5-6. Ostatnia praca, która wchodzi w skład prezentowanego cyklu publikacji, dotyczy fermentacji nasion komosy z udziałem zmodyfikowanej procedury typu oncom (synonim: ontjom), w której wykorzystano szczep Neurospora intermedia (publikacja 7). Wymieniony gatunek jest wykorzystywany w części Indonezji (Zachodnia Jawa) do fermentacji odpadów po tłoczeniu oleju (wytłoki z orzeszków ziemnych czy orzechów kokosowych) lub produkcji tofu (okara), w wyniku czego otrzymywany jest czerwony oncom (oncom mera). N. intermedia czasem może być stosowana wymiennie z Rhizopus - tak zwany czarny oncom powstaje lokalnie w Indonezji z udziałem kultur Rhizopus; w literaturze przedmiotu napotkałam także wzmiankę o wykorzystaniu pleśni Neurospora do obróbki nasion roślin strączkowych według procedury typu tempe 22,23. Celem doświadczenia z udziałem szczepu N. intermedia była charakterystyka składu oraz potencjału antyoksydacyjnego produktów typu oncom uzyskanych z kolorowych odmian komosy. Według mojej wiedzy, jest to pierwsza praca, w której opisano tego typu produkt spożywczy z nasion komosy ryżowej. Metody analityczne W badanym materiale wykonano następujące oznaczenia: - białka całkowitego według metody Nesslera 24, po mineralizacji próbek (publikacje 1-3, 5-7) - tłuszczu całkowitego 25 (publikacje 5-7) - popiołu całkowitego 26 (publikacje 5-7) - profilu aminokwasów (publikacje 1, 3, 6, 7) - sumy wolnych aminokwasów 27 (publikacje 2, 5, 6) - biodostępności białek i węglowodanów po trawieniu in vitro według metody opisanej przez Żyłę i wsp., po modyfikacji dostosowującej warunki trawienia do układu pokarmowego człowieka 28 (publikacje 1, 3, 6) - biodostępności białka 29 (publikacja 2) 20 Matsuo M In vivo antioxidant activity of methanol extract from quinoa fermented with Rhizopus oligosporus. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 51: Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Bączkowicz M., Wikiera A. Tempe-type fermentation to enhance nutritional and bioactive parameters of quinoa seeds. 7th International conference on quality and safety in food production chain, Wrocław, Owens J.D., Astuti M., Kuswanto K Tempe and related products. W: Indigenous fermented foods of Southweast Asia. J.D. Owens (ed.), CRC Press 23 Shurtleff W., Aoyagi A History of soybeans and soyfoods in Southeast Asia (13th century to 2010): Bibliography and Sourcebook. Soyinfo Center 24 Marczenko Z., Balcerzak M Spektrofotometryczne metody w analizie nieorganicznej. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, str AOAC No. 920, Official Methods of Analysis. AOAC International, Arlington 26 ICC-Standard No.104/ Korenman S Analiza fotometryczna. WNT: Warszawa 28 Żyła K., Wikiera A., Korelewski J., Świątkiewicz S., Pironen D.R., Ledoux D.R Comparison of the efficiencies of a novel Aspergillus niger mycellium with separate and combined effectiveness of phytase, acid phosphatase and pectinase in dephosphorylation of wheat-based feeds fed to growing broilers. Poultry Sci., 79:

8 - stopnia hydrolizy białek 30 (publikacja 2) - zawartości witaminy B1 i B2 według metody opisanej przez Arella i wsp. 31, z modyfikacjami (publikacje 1, 6, 7) - zawartości karotenoidów 32 (publikacja 7) - poziomu błonnika całkowitego, rozpuszczalnego i nierozpuszczalnego 33 (publikacje 5 i 7) - profilu oligosacharydów z rodziny rafinozy - rafinozy, stachiozy i werbaskozy 34 (publikacje 3 i 4) - poziomu fitynianów 35 (publikacja 7) - profilu fitynianów 36 (publikacja 7) - poziomu tanin skondensowanych 37 (publikacje 3 i 4) - poziomu kwasu N-oksalil-diaminopropionowego (ODAP) 38 (publikacja 1) - poziomu inhibitorów trypsyny 39 (publikacje 1 i 3) - aktywności proteaz 40 przy ph 3, 5 i 7 (publikacja 2) - poziomu glukozaminy 41 po hydrolizie chityny 42 (publikacje 2 i 7). Dla oceny potencjału antyoksydacyjnego materiału stosowano różne mieszaniny ekstrakcyjne i metody ekstrakcji materiału w zależności od typu substratu, opierając się na danych literaturowych, weryfikowanych następnie w porównawczych doświadczeniach wstępnych (dane nie publikowane): mieszanina gliceryny, 96% alkoholu etylowego i wody destylowanej w stosunku 1:1:1 (V/V/V); 3 godz. wytrząsanie w temperaturze 60 o C 43 - dla nasion lędźwianu siewnego (publikacja 1) mieszanina acetonu i wody destylowanej w stosunku 4:1 (V/V) dla nasion fasoli zwyczajnej (publikacje 3-4) oraz mieszanina acetonu i wody destylowanej w stosunku 1:1 (V/V) dla komosy ryżowej (publikacje 5-7); 3 godz. wytrząsanie w 29 Monsoor M.A., Yusuf H.K.M In vitro protein digestibility of lathyrus pea (Lathyrus sativus), lentil (Lens culinaris) and chickpea (Cicer arietinum). Int. J. Food Sci. Tech., 37: De Reu J.C., ten Wolde R.M., de Groot J., Nout M.J.R., Rombouts F.M., Gruppen H Protein hydrolysis during soybean tempe fermentation with Rhizopus oligosporus. J. Agric. Food Chem., 43: Arella F., Lahely S., Bourguingon J.B., Hasselman C Liquid chromatographic determination of vitamins B1 and B2 in foods. A collaborative study. Food Chem., 56: Singgih M., Andriatna W., Damayanti S., Priatni S Carotenogenesis. Study of Neurospora intermedia N-1 in liquid substrate fermentation. J. Chem. Pharm. Res., 7: AOAC Official Methods of Analysis Cereal foods. Total, soluble, and insoluble dietary fiber in foods. 32: 7 34 Muzquiz M., Rey C., Cuadrado C., Fenwick G.R Effect of germination on the oligosaccharide content of lupine species. J. Chromatogr. A, 607: Gambuś H., Matusz-Mirlak A., Duliński R., Ziobro R., Golachowski A The influence of extrusion process on myoinositol phosphate content and profile in snacks containing rye bran. Int. J. Food Sci. Nutr., 63: Blaabjerg K., Hansen-Møller J., Poulsen H.D., High-performance ion chromatography method for separation and quantification of inositol phosphates in diets and digesta. J. Chromatogr B., 878: Price M.L., Scoyoc S.V., Butler L.G A critical evaluation of the vanillin reaction as an assay for tannin in sorghum grain. J. Agr. Food Chem., 26: Briggs C.J., Parreno N., Campbell C.G Phytochemical assessment of Lathyrus species for the neurotoxic agent, β-noxalyl-l-α,β-diaminopropionic acid. Planta Med., 47: Kakade F.L., Rackis J.J., McGhee J.E., Puski G Determination of trypsin inhibitor activity of soy products: a collaborative analysis of an improved procedure. Cereal Chem., 51: Rick W., Fritsch W.P Pepsin (Pepsin, Gastricsin, Pepsinogen, Uropepsinogen). W: H. U. Bergmeyer (ed.), Methods of Enzymatic Analysis (Vol. 2, str ). San Francisco: Academic Press 41 Tsuji A., Kinoshita T., Hoshino M Analyitical chemical studies on amino sugars. II. Determination of hexosamines using 3-methyl-2-benzothizolone hydrazone hydrochloride. Chem. Pharm. Bull., 17: Desgranges C., Vergoignan C., Georges M., Durand A Biomass estimation in solid state fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol., 35: Tyczkowska K Metoda oznaczania kwasu taninowego w ziarnach sorga. Biuletyn Informacyjny Przemysłu Paszowego, 4:

9 temperaturze pokojowej i 18 godz. inkubacja w ciemności w temperaturze pokojowej 44 w odniesieniu do warunków fizjologicznego ph - 0,1 M bufor fosforanowy o ph 7,4; 3 godz. wytrząsanie w temperaturze pokojowej (publikacje 6 i 7). W ekstraktach oznaczano: - poziom fenoli rozpuszczalnych metodą z odczynnikiem Folina-Ciocalteu 45 (publikacje 1, 3-7) - sumę flawonoidów 46 (publikacja 4) - zawartość wybranych związków fenolowych 47 - kwasu protokatechowego, wanilinowego i rutyny (publikacja 6) - aktywność antyrodnikową metodą z DPPH 48 (publikacje 1, 3, 4, 6, 7) - aktywność antyrodnikową metodą z ABTS + 49 (publikacje 3-7) - aktywność neutralizacji OH 50 (publikacje 4, 6) - zdolność przeciwutleniającą (AC) 51 (publikacja 3) - siłę redukującą 52 (publikacje 4-7) Aktywność antyrodnikową zmierzono także metodą Quencher - ABTS + 53 (publikacja 7). Otrzymane produkty typu tempe poddano analizie sensorycznej z udziałem trenowanego panelu i oceniano za pomocą 7-punktowej interwałowej skali intensywności 54 oraz metodą profilowania tekstury 55 i smakowitości 56 (publikacja 5). Publikacje 1 i 2 Materiał Substrat stanowiły nasiona polskiej odmiany lędźwianu siewnego (Lathyrus sativus) o nazwie Krab (Spójnia, Nochowo). Jako szczep tempe wykorzystano Rhizopus microsporus var. chinensis z Institute for Microbial Resources w Taichung Industrial Park na Tajwanie (występuje w literaturze naukowej również pod nazwą R. oligosporus spt3, taka nazwa została też użyta w publikacji 1). Wymieniony szczep został wytypowany we wstępnym eksperymencie (publikacja 1), który wykazał, że lędźwianowy tempe otrzymany z udziałem tej pleśni miał korzystniejsze cechy (niższa aktywność inhibitorów trypsyny, wyższy poziom fenoli 44 Xu B.J., Chang S.K.C A comparative study on phenolic profiles and antioxidant activities of legumes as affected by extraction solvents. J. Food Sci., 72: S159 S Swain T., Hillis W.E Phenolic constituents of Prunus domestica L. Quantitative analysis of phenolic constituents. J. Sci. Food Agric., 10: Papoti V.T., Xystouris S., Papagianni G., Tsimidou M.Z Total flavonoid content assessment via aluminum [Al(III)] complexation reactions. What we really measure? Ital. J. Food Sci., 23: Anesini C., Turner S., Cogoi L., Filip R Study of the participation of caffeine and polyphenols on the overall antioxidant activity of mate (Ilex paraguariensis). LWT Food Sci. Technol., 45: Pekkarinen S.S., Stockmann H., Schwarz K., Heinonen M., Hopia A.I Antioxidant activity and partitioning of phenolic acids in bulk and emulsified methyl linoleate. J. Agric. Food Chem., 47: Cano A., Acosta M., Arnao M.B Hydrophilic and lipophilic antioxidant activity changes during on-vine ripening of tomatoes (Lycopersicon esculentum Mill.). Postharvest Biol. Technol., 28: Marambe P.W.M.L.H.K., Shand P.J., Wanasundara J.P.D An in-vitro investigation of selected biological activities of hydrolysed flaxseed (Linum usitatissimum L.) proteins. J. Am. Oil Chem. Soc., 85: Udenigwe C.C., Aluko R.E Antioxidant and angiotensin converting enzyme-inhibitory properties of a flaxseed protein-derived high Fisher ratio peptide mixture. J. Agric. Food Chem., 58: Ardestani A., Yazdanparast R Antioxidant and free radical scavenging potential of Achillea santolina extracts. Food Chem., 104: Serpen A., Gökmen V., Pellegrini N., Fogliano V Direct measurement of the total antioxidant capacity of cereal products. J. Cereal Sci., 48: PN-EN ISO 4121: Sensory analysis - Guidelines for the use of quantitative response scales 55 PN-EN ISO 11036: Sensory analysis - Methodology - Texture profile 56 PN-EN ISO 6564: Sensory analysis - Methodology - Flavour profile methods - 9 -

10 rozpuszczalnych i aktywność antyrodnikowa) niż nasiona przerośnięte R. oligosporus DSM 1964 (stosowany we wcześniejszych badaniach z moim udziałem 57 ). Szczepem wprowadzanym jako dodatkowy składnik inokulum była pleśń koji Aspergillus oryzae DSM 1861 (z kolekcji DSMZ). Materiał szczepienny stanowiły zawiesiny zarodników R. microsporus var. chinensis i A. oryzae uzyskane z 12-dniowych hodowli na skosach agarowych przez wymycie zarodników roztworem soli fizjologicznej z dodatkiem peptonu bakteryjnego (0,1% m/v) i Tweenu 80 (0,00001% V/V). Zawiesina była trzykrotnie filtrowana (filtry Millipore, ø 11 µm) w celu usunięcia fragmentów grzybni (efektywność metody została potwierdzona doświadczalnie). Procedura fermentacji Zastosowany model fermentacji, oparty na tradycyjnym procesie otrzymywania sojowego tempe 58, został dopracowany przez nasz zespół w Katedrze Biotechnologii Żywności WTŻ dla lędźwianu siewnego 59. Nasiona, po odrzuceniu nietypowych i uszkodzonych, podzielono na 60 g porcje, umyto i wstępnie ugotowano (30 min) celem sterylizacji, a następnie moczono przez 18 godz. w nowej porcji wody. Spęczniałe nasiona obłuskano ręcznie, podzielono na połówki i ugotowano (15 min) w świeżej porcji wody o z dodatkiem kwasu mlekowego (w celu zapewnienia optymalnego dla pleśni ph substratu - w granicach 4,5 5,0). Powierzchniowo osuszone i schłodzone do temperatury poniżej 35 o C nasiona dokładnie wymieszano z zawiesiną zarodników Rhizopus (monoszczepowy tempe) lub Rhizopus i Aspergillus w różnych dawkach (kultura mieszana), a następnie umieszczano w perforowanych woreczkach foliowych (formowano zwarte pakiety o grubości 2-3 cm). Inkubację prowadzono w temperaturze 30 o C przez 25 godzin (gdy pełna dawka zarodników aplikowana na gram nasion wynosiła zarodników - publikacja 1) lub 30 godzin (odpowiednio, 10 4 zarodników na gram nasion - publikacja 2). Różnica w ilości zarodników Rhizopus uznanej za podstawową dawkę wynikała z około dwukrotnie niższej żywotności, oznaczonej dla partii skosów wykorzystanych w doświadczeniu opisanym w publikacji 1 (w celu oceny żywotności stosowano metodę posiewu redukcyjnego na płytkach agarowych). Moment zakończenia procesu fermentacji wyznaczano na podstawie oceny wizualnej, gdy produkty uznane za punkt odniesienia, czyli monoszczepowe tempe uzyskane przy pełnej dawce zarodników R. microsporus var. chinensis, były równomiernie porośnięte grzybnią i miały zwartą konsystencję. Aktywność grzybni przerywano, gotując produkty na parze przez 10 minut. Omówienie wyników Wykorzystanie lędźwianu siewnego w żywieniu ludzi jest ograniczone obecnością neurotoksycznego aminokwasu β-odap 60, dlatego procesy obróbki powinny gwarantować zmniejszenie poziomu tego związku w nasionach. Wcześniejsze badania prowadzone z moim udziałem wykazały, że proces fermentacji nasion lędźwianu szczepem R. oligosporus DSM 1964 skutkował znaczną eliminacją ODAP 61. Analogiczną tendencję stwierdzono dla 57 Stodolak B., Starzyńska-Janiszewska A The influence of tempeh fermentation and conventional cooking on antinutrient level and protein bioavailability (in vitro test) of grass pea seeds. J. Sci. Food Agric., 88: Patrz bibliografia w przyp. 2 powyżej 59 Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Jamróz M., Antioxidant properties of extracts from fermented and cooked seeds of polish cultivars of Lathyrus sativus. Food Chem., 109: Campbell C.G Grass pea Lathyrus sativus L., IPGRI, Rome 61 Patrz bibliografia w przyp. 57 powyżej

11 R. microsporus var. chinensis (publikacja 1, tabela 2). Wprowadzenie pleśni A. oryzae do procesu fermentacji umożliwiło bardziej zaawansowaną detoksykację nasion lędźwianu, która dodatkowo była dodatnio skorelowana z ilością zarodników tego szczepu w inokulum (publikacja 1, tabela 2). Przy pełnej dawce zarodników Aspergillus poziom ODAP w produkcie był o 63% niższy niż w monoszczepowym tempe. Wynik ten jest nieco gorszy niż efekt uzyskany przez Kuo i wsp. 62 po sekwencyjnej fermentacji nasion lędźwianu szczepem R. oligosporus i A. oryzae (ok. 78%). Jednak proces zastosowany przez cytowanych autorów składał się z dwóch faz inkubacji trwających 48 lub 68 godzin, przedzielonych sterylizacją - był więc bardziej skomplikowany i czasochłonny, a ponadto odbiegał od tradycyjnej procedury. Zastosowanie mieszanego inokulum, w porównaniu z monoszczepowym, umożliwiło otrzymanie produktów o korzystniejszych parametrach odżywczych. Takie tempe charakteryzowały się lepszym profilem aminokwasów egzogennych (publikacja 1, tabela 5), wyższą biodostępnością in vitro białka (publikacja 1, tabela 6) i większą zawartością witamin B 1 i B 2 (publikacja 1, tabela 3). Jedynie poziom ryboflawiny oznaczony w tempe uzyskanym przy pełnej dawce zarodników obu szczepów uległ niewielkiemu obniżeniu. Dodatek konidiów A. oryzae do inokulum skutkował ponadto wzrostem aktywności antyrodnikowej oznaczonej metodą z DPPH w ekstraktach etanolowo-glicerynowowodnych (publikacja 1, tabela 2). Potwierdza to obserwacje innych autorów, że fermentacja szczepami Aspergillus może wzbogacić substrat w związki o aktywności antyoksydacyjnej 63,64. Porównując produkty otrzymane w wyniku fermentacji mieszanym inokulum można jednak zauważyć, że zwiększenie dawki A. oryzae w obrębie konkretnej ilości zarodników R. microsporus var. chinensis nie zawsze wiązało się z korzystnymi zmianami składu tempe (publikacja 1, tabele 2-4 i 6 oraz publikacja 2, tabela 4). Spośród wariantów produktów omówionych w publikacji 1, najlepsze parametry uzyskano przy zastosowaniu dawki konidiów Aspergillus stanowiącej połowę pełnej dawki zarodników Rhizopus. W stosunku do monoszczepowego tempe, produkt ten charakteryzował się lepszym profilem aminokwasów egzogennych w białku (publikacja 1, tabela 5), wyższym poziomem tiaminy i ryboflawiny (ponad trzy- i dwukrotnie) (publikacja 1, tabela 3) oraz fenoli rozpuszczalnych (o 70 %), a także większą skutecznością neutralizacji DPPH (45%, w stosunku do 26%) (publikacja 1, tabela 2). Poziom rozpuszczalnych białek uwolnionych z tego tempe w wyniku trawienia prowadzonego w warunkach in vitro zwiększył się o 25% w porównaniu z produktem uzyskanym z wyłącznym udziałem Rhizopus, a biodostępność in vitro białka istotnie wzrosła, z 49% do 65%, czyli do wartości takiej jak oznaczona dla namoczonych i wstępnie ugotowanych nasion lędźwianu (publikacja 1, tabela 6). Biodostępność białka produktów tempe z nasion roślin strączkowych stanowi istotny aspekt tego typu obróbki 65,66. Dla precyzyjnego określenia wpływu zmodyfikowanego 62 Kuo Y.-H., Bau H.-M., Quemener B., Khan J.K., Lambein F Solid-state fermentation of Lathyrus sativus seeds using Aspergillus oryzae and Rhizopus oligosporus spt3 to eliminate the neurotoxin β-odap without loss of nutritional value. J. Sci. Food Agric., 69: Matsuo M., In vivo antioxidant activity of okara koji, a fermented okara, by Aspergillus oryzae. Biosci. Biotechnol. Biochem., 61: Lin C.H., Wei Y.T., Yu R.C., Chou C.C Cultivation temperature and length affect the antioxidant activity and total phenolic content of soybean koji prepared with Aspergillus awamori. J. Food Drug Anal., 14: Kiers J.L., Nout R.M.J., Rombouts F.M In vitro digestibility of processed and fermented soya bean, cowpea and maize. J. Sci. Food Agric., 80: Angulo-Bejarano P.I., Verdugo-Montoya N.M., Cuevas-Rodríguez E.O., Milán-Carrillo J., Mora-Escobedo R., Lopez- Valenzuela J.A. i wsp Tempeh flour from chickpea (Cicer arietinum L.) nutritional and physicochemical properties. Food Chem., 106:

12 inokulum na poziom białka w produkcie i jego podatność na trawienie in vitro, przeprowadzono doświadczenie, w którym do stałego poziomu zarodników R. microsporus var. chinensis w inokulum (pełna dawka) dodawano konidia A. oryzae w ilości równej 50%, 100% i 150% dawki szczepu tempe. Jako kontrolę wykorzystano monoszczepowy produkt uzyskany po zaszczepieniu pełną dawką spor Rhizopus. Okazało się, że dodatek oraz wzrost ilości zarodników Aspergillus w inokulum skutkował zwiększeniem zawartości białka i wolnych aminokwasów w tempe (publikacja 2, tabela 4). Ponadto, podobnie jak w poprzednim doświadczeniu (publikacja 1, tabela 6), biodostępność in vitro białka produktów wzrastała w pewnym zakresie dawek zarodników A.oryzae, jednak w tym przypadku negatywny efekt obserwowano dopiero przy przewadze konidiów w inokulum (publikacja 2, tabela 4). Najprawdopodobniej miał tutaj miejsce negatywny wpływ wzrostu i/lub aktywności pleśni koji, współzawodniczącej z Rhizopus o dostęp do substratu. Ilość zarodników A. oryzae powyżej 10 4 na gram nasion (1,5 lub 2 razy wyższa) nie gwarantowała zapewnienia odpowiedniej, możliwie wysokiej biodostępności białka produktu, zarówno gdy poziom zarodników Rhizopus w inokulum wynosił 10 4 (publikacja 2) jak i wtedy gdy było ich dwukrotnie więcej (publikacja 1). Jest to spójne z wynikami badań Fenga 67, który wykazał, że zbyt duża ilość komórek pewnych gatunków drożdży i bakterii mlekowych (dawki > 10 4 jtk na gram wilgotnego substratu) wywierała negatywny wpływ na wzrost Rhizopus w procesie fermentacji jęczmienia. Na podstawie wyników opisanych w publikacjach 1 i 2 można wnioskować, że zastosowanie A. oryzae jako dodatkowego składnika inokulum w fermentacji nasion lędźwianu siewnego umożliwia otrzymanie produktów typu tempe o korzystniejszej wartości odżywczej i wyższym potencjale antyoksydacyjnym, pod warunkiem, że aktywność tej pleśni nie zdominuje procesu. Na podstawie moich badań można rekomendować dawkę 10 4 konidiów A. oryzae przy zarodników Rhizopus microsporus var. chinensis na gram substratu (suche nasiona). Tempe otrzymany z udziałem tak skomponowanego inokulum, w stosunku do nasion poddanych obróbce hydrotermicznej (moczenie i gotowanie), charakteryzował się lepszym potencjałem antyoksydacyjnym (piętnastokrotnie wyższym poziomem fenoli rozpuszczalnych i prawie trzydziestokrotnie wyższą aktywnością antyrodnikową), był istotnie bogatszy w witaminę B 1 i B 2 (odpowiednio, cztero- i aż pięćdziesięciokrotnie), stanowił też źródło białka o korzystniejszym profilu aminokwasów egzogennych i zbliżonym poziomie biodostępności, szacowanej metodą in vitro (publikacja 1, tabele 2, 3, 5 i 6). Trzeba jednak zaznaczyć, że arbitralne wyznaczenie optymalnej ilości zarodników A. oryzae w mieszanym inokulum może być technicznie trudne, ze względu na zmienną żywotność zarodników obu szczepów w różnych partiach skosów (3-10% dla A. oryzae i 13-20% dla Rhizopus wyniki rutynowych testów prowadzonych w latach ). Zdolność produkcji zewnątrzkomórkowych proteaz jest podstawową cechą kultur pleśni tempe i koji, przy czym jest ona specyficzna nie tyle dla konkretnego gatunku, co szczepu 68,69. W celu zbadania (publikacja 2) aktywności proteolitycznej szczepów R. microsporus var. chinensis i A. oryzae wykorzystanych w opisanych powyżej doświadczeniach, przeprowadzono trzydziestodwugodzinną inkubację nasion lędźwianu 67 Feng, X.M Microbial dynamics during barley tempeh fermentation. Doctoral dissertation. ISSN , IBSN Baumann U., Bisping B Proteolysis during tempe fermentation. Food Microbiol., 12: Fukushima D Industrialization of fermented soy sauce production centering around Japanese shoyu. W: Industrialization of indigenous fermented foods, revised and expanded. 2nd Edition. K.H. Steinkraus (ed.), CRC Press

13 osobno z każdą kulturą (przy dawce zarodników równej 10 4 na gram nasion). Szczepy wykazały zbliżoną dynamikę produkcji enzymów proteolitycznych w warunkach fermentacji typu tempe. Znaczący wzrost aktywności proteaz w badanym materiale obserwowano po 24 i 32 godzinach procesu, co korespondowało z ilością biomasy pleśni (oznaczonej jako zawartość glukozaminy, publikacja 2, tabela 1 i 2). Najwyższą aktywność proteolityczną oznaczono w ph 3,0; w następnej kolejności ph 5,0 i 7,0. Jest to korzystne dla praktycznego zastosowania tych pleśni, ponieważ synteza kwaśnych proteaz jest uważana za kluczową dla otrzymania dobrej jakości tempe 70. Fermentacja R. microsporus var. chinensis skutkowała wyższym poziomem produkcji enzymów proteolitycznych, bardziej zaawansowanym stopniem hydrolizy białek i większą zawartością glukozaminy w produkcie - o 56% po 32 godzinach inkubacji, niż proces z udziałem A. oryzae (publikacja 2, tabela 1 i 3). Jak podano powyżej, szczep Aspergillus charakteryzował się generalnie niższą żywotnością zarodników. Obserwowane różnice można ponadto tłumaczyć morfologią A. oryzae (niska, niezbyt obfita grzybnia powietrzna) i nieoptymalnymi warunkami jej wzrostu (inkubacja szczepów w procesie koji prowadzona jest dłużej, w nieco niższej temperaturze, z okresowym mieszaniem substratu i przy większym dostępie tlenu). Publikacje 3 i 4 Materiał Substrat stanowiły nasiona polskiej odmiany fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris) Małopolanka o kolorowych nasionach (Krakowska Hodowla i Nasiennictwo Ogrodnicze POLAN Sp. z o.o). Hodowlę Rhizopus microsporus var. chinensis oraz zawiesinę zarodników tego szczepu przygotowano według procedury opisanej dla publikacji 1-2. Jako szczep bakterii mlekowych zastosowano Lactobacillus plantarum DSM (z kolekcji DSMZ, wyizolowany z kwaśnej kapusty). Inukulum uzyskano z hodowli wgłębnej (podłoże: de Man, Rogosa and Sharpe (MRS) broth (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)) prowadzonej w 30 o C przez 24 godz. Zawiesinę odwirowano i zawieszono w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Gęstość zawiesiny oceniano turbidymetrycznie przy wykorzystaniu metody standardów McFarlanda. Procedura fermentacji Tempe monoszczepowy: Nasiona wysuszono w celu inaktywacji mikroflory (24 h w 55 o C) i podzielono na połówki przy zastosowaniu młynka (Porkert, Markovice-Sližany, Czechy). 60 g próbki zalano sterylną wodą destylowaną (1:5 V/V) zakwaszoną do ph kwasem mlekowym i moczono w 30 o C przez 18 godz., a następnie płukano sterylną wodą i autoklawowano (40 min, 121 o C). Kolejno, schłodzone poniżej 35 o C porcje nasion inokulowano mieszaniną zarodników pleśni (10 4 zarodników na gram suchych nasion), pakowano w perforowane woreczki foliowe (zwarta warstwa 2-3 cm grubości) i inkubowano w temperaturze 30 o C. 70 Miszkiewicz H., Bizukojc M., Rozwandowicz A., Bielecki S Physiological properties and enzymatic activities of Rhizopus oligosporus in solid-state fermentations EJPAU 7(1), #03. ww.ejpau.media.pl

14 Tempe z udziałem bakteryjnej fermentacji wgłębnej: Modyfikacja dotyczyła etapu moczenia nasion i polegała na wprowadzeniu zawiesiny komórek L. plantarum w ilości komórek na ml wody. Gęstość zawiesiny bakterii ustalono na podstawie doświadczeń wstępnych tak, aby ph nasion po procesie fermentacji wgłębnej wynosiło Tempe z udziałem grzybowo-bakteryjnego inokulum: Nasiona traktowano tak jak w przypadku monoszczepowego tempe, modyfikacja polegała na dodaniu do inokulum grzybowego zawiesiny bakterii w ilości 10 4 komórek na gram suchych nasion. Proces fermentacji w podłożu stałym prowadzono przez 31 godz., otrzymując przerośnięte grzybnią i zwarte produkty, z pewną ilością widocznych zarodników (publikacja 3). Zarodnikowanie nie dyskwalifikuje produktu, ale nie jest pożądane w procesie fermentacji typu tempe 71. Dlatego w doświadczeniu opisanym w publikacji 4 czas inkubacji skrócono do 24 godz. Fermentację przerywano stosując 10 min. gotowanie produktów na parze. Omówienie wyników Wykorzystanie szczepu L. plantarum w fermentacji typu tempe niełuskanych nasion fasoli prowadziło do uzyskania produktów o zróżnicowanym potencjale bioaktywnym, w porównaniu z procesem monoszczepowym (fermentacja wyłącznie R. microsporus var. chinensis) (publikacja 3, tabela 1). Przykładowo, po zastosowaniu pleśniowo-bakteryjnego inokulum obserwowano niewielki wzrost zdolności neutralizacji DPPH (o 6%) i zdolności przeciwutleniającej (o 11%), ale niższą efektywność zmiatania ABTS + (o 12%). Tempe uzyskany z udziałem bakteryjnej fermentacji wgłębnej miał natomiast największą zdolność przeciwutleniającą spośród badanych produktów, ale mniejszą efektywność neutralizacji syntetycznych wolnych rodników. Wpływ aktywności L. plantarum na zawartość związków antyżywieniowych w tempe również nie był jednoznaczny. Produkt otrzymany z udziałem inokulum pleśniowobakteryjnego miał o około 20% mniej tanin skondensowanych, ale aż o 85% więcej inhibitorów trypsyny niż tempe monoszczepowy (publikacja 3, tabela 2). W porównaniu do nasion przygotowanych do inokulacji, tempe uzyskane w obecności Rhizopus, jak i Lactobacillus zawierały więcej związków antyżywieniowych. Zapewne było to wynikiem metabolizowania przez drobnoustroje innych, przyswajalnych składników nasion fasoli. Obserwowana tendencja nie do końca musi być uznana za niekorzystną. Coraz częściej podkreśla się, że niektóre składniki antyodżwycze, takie jak fenole rozpuszczalne, taniny skondensowane czy inhibitory trypsyny, mogą działać również jako antyoksydanty. W przypadku inhibitorów trypsyny wskazywana jest nawet korzystna rola tych związków jako potencjalnego czynnika prewencji chorób cywilizacyjnych 72,73. Warto przy tym podkreślić, że wzrost ilości tanin skondensowanych i inhibitorów trypsyny nie ograniczył biodostępności białka tempe z fasoli, szacowanej metodą trawienia in vitro (publikacja 3 errata, tabela 2). Moczone niełuskane nasiona charakteryzowały się bardzo niską biodostępnością białka, na poziomie 26%. Wprowadzenie L. plantarum, zarówno na etapie 71 Hedger J.N Production of tempe, an Indonesian fermented food. W: Sourcebook of experiments for the teaching of microbiology. S.B. Primrose, A.C. Wardlaw (ed.), Academic Press, New York, US, str Xu B., Chang S.K.C Total phenolic, phenolic acid, Anthocyanin, flavan-3-ol, and flavonol profiles and antioxidant properties of pinto and black beans (Phaseolus vulgaris L.) as affected by thermal processing. J. Agric. Food Chem., 57: Huang G., Chang H., Chen H., Lu T., Chang Y., Sheu M. i wsp Effects of trypsin inhibitor on plasma antioxidant activity and lipid levels in mice from sweet potato roots. J. Sci. Food Agric. 88:

15 moczenia, jak i fermentacji w podłożu stałym, skutkowało poprawą tego parametru w produktach, do wartości 40%, zaś w przypadku standardowego tempe biodostępność białka wzrosła do 34%. Tempe otrzymane z udziałem bakterii mlekowych miały też wyższy poziom białka w suchej masie, średnio o 18%, a co za tym idzie, większą zawartość poszczególnych aminokwasów, niż produkt monoszczepowy (publikacja 3, tabela 2 i 3). Tempe uzyskane w obecności L. plantarum charakteryzowały się zbliżonym profilem aminokwasów egzogennych w białku, z wyjątkiem sumy Cys+Met, która była zgodna z wzorcem FAO tylko w przypadku monoszczepowego produktu (publikacja 3, tabela 4). Obecność w nasionach roślin strączkowych oligosacharydów z rodziny rafinozy, pomimo ich prebiotycznych właściwości 74, jest z praktycznego punktu widzenia niekorzystna, jako że wywołują one efekt wzdymający. Zastosowany w doświadczeniu szczep Rhizopus spowodował częściowe usunięcie galaktooligosacharydów z substratu, co potwierdza jego właściwości enzymatyczne opisane w pracy Schwertz i wsp. 75 Aktywność bakterii mlekowych nie wywarła pozytywnego wpływu na etapie fermentacji wgłębnej, natomiast przyczyniła się do zaawansowanej redukcji poziomu rafinozy, stachiozy i werbaskozy podczas fermentacji w podłożu stałym (publikacja 3, tabela 2). Wiadomo, że szczepy L. plantarum mogą wykazywać zdolność produkcji α-galaktozydazy 76. Jednak, jak się wydaje, wyniki uzyskane w prezentowanym doświadczeniu można raczej tłumaczyć pozytywnym wpływem aktywności tych bakterii mlekowych na warunki wzrostu R. microsporus var. chinensis w trakcie jednoczesnej inkubacji. Z uwagi na najniższy poziom oligosacharydów wzdęciogennych, tempe otrzymany z udziałem pleśniowo-bakteryjnego inokulum został wytypowany do kolejnego doświadczenia (publikacja 4), w którym przeprowadzono porównanie z nasionami poddanymi konwencjonalnej obróbce hydrotermicznej (namoczonymi i ugotowanymi do miękkości). Tempe zawierał średnio o 60% mniej galaktooligosacharydów (stachioza, werbaskoza, rafinoza) w suchej masie (publikacja 4, tabela 3). Ponadto, był znacząco wzbogacony w ekstrahowalne związki fenolowe: taniny skondensowane (o 140%), fenole rozpuszczalne (o 29% w ekstraktach acetonowo-wodnych 1:1, v/v ) i flawonoidy (o 30%). Niezależnie od typu ekstrakcji (wodna, acetonowo-wodna), potencjał antyoksydacyjny produktu uzyskanego w wyniku fermentacji był istotnie wyższy niż nasion standardowo przygotowanych do spożycia. Tempe charakteryzował się wyższą aktywnością antyrodnikową (o 31% w metodzie z ABTS +, o 46% w metodzie z DPPH oraz prawie dwukrotnie większą zdolnością neutralizacji OH) oraz siłą redukującą (publikacja 4, tabela 1). Na podstawie wyników przedstawionych w publikacjach 3 i 4 niełuskane nasiona fasoli zwyczajnej można polecić jako substrat dla fermentacji typu tempe z udziałem szczepu R. microsporus var. chinensis. Wprowadzenie do inokulum komponentu bakteryjnego, czyli L. plantarum, skutkuje poprawą biodostępności białka, obniżeniem poziomu galaktooligoscharydów oraz zwiększeniem potencjału bioaktywnego produktu. Tempe może więc stanowić korzystną alternatywę dla ugotowanych do miękkości nasion fasoli. Jako produkt zaliczany do kategorii żywności wygodnej będzie ponadto znacznie 74 Ruiz-Terán F., Owens J.D Fate of oligosaccharides during production of soya bean tempe. J. Sci. Food Agric., 79: Schwertz A., Villaume C., Mejean L., Decaris B., Percebois G New identification of the strain Rhizopus microsporus var. oligosporus spt3 as Rhizopus microsporus var. chinensis. Can. J. Microbiol., 43: Silvestroni A., Connes C., Sesma F., Savoy de Giori G., Piard J.Ch Characterization of the mela locus for α- galactosidase in Lactobacillus plantarum. Appl. Environ. Microbiol., 68: