Biofizyczne podstawy oddziaływao analogów kooca 5 mrna z triadą białek regulującą eukariotyczną ekspresję genów

Transkrypt

1 Załącznik 2a. Biofizyczne podstawy oddziaływao analogów kooca 5 mrna z triadą białek regulującą eukariotyczną ekspresję genów AUTOREFERAT związany z ubieganiem się o stopieo doktora habilitowanego dr Anna Niedźwiecka Środowiskowe Laboratorium Fizyki Biologicznej Instytut Fizyki Polskiej Akademii Nauk Warszawa, marzec 2016

2 2

3 Spis treści 1. Imię i Nazwisko Posiadane dyplomy, stopnie naukowe Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych Bibliometryczne podsumowanie dorobku naukowego Osiągnięcie wynikające z art. 16 ust. 2 ustawy z 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. 65, poz. 595 ze zm.) Wprowadzenie Omówienie osiągnięcia naukowego - celów szczegółowych i osiągniętych wyników Podsumowanie Omówienie pozostałych osiągnięd naukowo - badawczych Pozostała działalnośd naukowa Publikacje stanowiące dorobek naukowy po uzyskaniu stopnia doktora Publikacje z listy filadelfijskiej Artykuły w wydawnictwach spoza listy filadelfijskiej Publikacje stanowiące dorobek naukowy przed uzyskaniem stopnia doktora Publikacje z listy filadelfijskiej Artykuły w materiałach pokonferencyjnych spoza listy filadelfijskiej Udział w projektach naukowych Udział w konferencjach Działalnośd na rzecz środowiska akademickiego Dydaktyka Działalnośd recenzencka Działalnośd popularyzatorska Członkostwo w towarzystwach naukowych Osiągnięcia organizacyjne Środowiskowe Laboratorium Fizyki Biologicznej w Instytucie Fizyki PAN Nowa infrastruktura naukowo-badawcza NanoFun Literatura

4 Motto Characterisation of structural and functional properties of biological molecules requires the concerted application of an arsenal of complementary techniques....tackling a biological problem with a multidisciplinary approach, in which molecular biophysics play a dominant role. The aim of this approach is to define as finely as possible the functional, structural and dynamic properties of the molecules implicated in the physiological process as well as their interactions. Pierre Joliot, słowo wstępne do podręcznika Methods in Molecular Biophysics I. N. Serdyuka, N. R. Zaccai ego i J. Zaccai ego 4

5 1. Imię i Nazwisko Anna Niedźwiecka 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe doktor nauk fizycznych w zakresie fizyki (z wyróżnieniem); Zakład Biofizyki, Instytut Fizyki Doświadczalnej, Wydział Fizyki Uniwersytetu Warszawskiego; rozprawa pt. Thermodynamic Analysis of Interaction of eif4e Protein with mrna 5' Cap Structure and 4E-BP1 or eif4g Protein Fragments, promotor dr hab. Ryszard Stolarski, prof. UW magister fizyki, specjalnośd: biofizyka (z wyróżnieniem); Zakład Biofizyki, Instytut Fizyki Doświadczalnej, Wydział Fizyki Uniwersytetu Warszawskiego; praca pt. Badanie tautomerii i konformacji N 4 -hydroksy pochodnych metylowanych analogów cytozyny metodami spektroskopii molekularnej, promotor prof. dr David Shugar 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych obecnie Instytut Fizyki Polskiej Akademii Nauk, asystent Koordynator merytoryczny projektu POIG 2.2. NanoFun realizowanego przez konsorcjum naukowo-przemysłowe NanoBioGeo na terenie ośmiu jednostek akademickich w Polsce (budżet ponad 54 mln zł) oraz kierownik projektu w IF PAN (budżet ponad 12 mln zł) Instytut Fizyki Polskiej Akademii Nauk, adiunkt obecnie Zakład Biofizyki IFD Wydziału Fizyki Uniwersytetu Warszawskiego, etat inżynieryjno-techniczny (50% od 2004) Studia Doktoranckie w Zakładzie Biofizyki IFD Wydziału Fizyki Uniwersytetu Warszawskiego, w tym zajęcia dydaktyczne prowadzenie zajęd dydaktycznych (umowa-zlecenie) na Wydziale Fizyki Uniwersytetu Warszawskiego dla studentów I. - III. roku Wydziałów Fizyki, Biologii i Nauczycielskiego Kolegium Fizyki W latach i przebywałam na urlopach macierzyoskich i wychowawczych (łącznie 22 miesiące). 4. Bibliometryczne podsumowanie dorobku naukowego z dnia wg JCR/ISI Web of Science (w nawiasie: po uzyskaniu stopnia doktora): Indeks Hirscha 15 Sumaryczna liczba cytowao / bez autocytowao 1231 / 1116 Sumaryczny Impact Factor wg roku opublikowania 122 (75) Sumaryczna liczba punktów MNiSW (620) Liczba oryginalnych publikacji eksperymentalnych 39 (22) Liczba abstraktów konferencyjnych 95 (63) w tym m. in.: 5

6 praca cytowana 470 razy: Gingras AC, Raught B, Gygi SP, Niedzwiecka A, Miron M, Burley SK, Polakiewicz RD, Wyslouch-Cieszynska A, Aebersold R, Sonenberg N. Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1. Genes Dev. 2001; 15(21): praca cytowana 219 razy: Niedzwiecka A, Marcotrigiano J, Stepinski J, Jankowska-Anyszka M, Wyslouch- Cieszynska A, Dadlez M, Gingras AC, Mak P, Darzynkiewicz E, Sonenberg N, Burley SK, Stolarski R. Biophysical studies of eif4e cap-binding protein: recognition of mrna 5' cap structure and synthetic fragments of eif4g and 4E-BP1 proteins. J Mol Biol. 2002; 319(3): publikacje o wysokim IF (>5): Genes Dev (IF 21), Nucleic Acids Res (IF 8.0), RNA 2005 (IF 6.1), Structure 2009 (IF 5.9), J. Biol. Chem. 2007, 2009 (IF 5.6, 5.3), J. Mol. Biol (IF 5.4) 5. Osiągnięcie wynikające z art. 16 ust. 2 ustawy z 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. 65, poz. 595 ze zm.) a) tytuł osiągnięcia naukowego: Biofizyczne podstawy oddziaływao analogów kooca 5 mrna z triadą białek regulującą eukariotyczną ekspresję genów Jednotematyczny cykl ośmiu publikacji z listy filadelfijskiej, o sumarycznym IF 34 (wg roku opublikowania) i liczbie punktów MNiSW 250 (wg komunikatu z grudnia 2015 r.), cytowanych 131 razy, przedstawiony w kolejności chronologicznej. Gwiazdką oznaczono autorstwo korespondencyjne habilitantki. Kursywą oznaczono pierwszych autorów, którzy wykonywali badania pod bezpośrednią opieką naukową habilitantki (H1. RW - magistrant, H3. IRW, H6. KKM - doktorantki): b) autorzy, tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa: H1. Worch R, Niedzwiecka A, Stepinski J, Mazza C, Jankowska-Anyszka M, Darzynkiewicz E, Cusack S, Stolarski R. Specificity of recognition of mrna 5' cap by human nuclear capbinding complex. RNA 2005; 11(9): IF / pkt MNiSW 35 / cyt. 37 H2. Nilsson P, Henriksson N, Niedzwiecka A, Balatsos NA, Kokkoris K, Eriksson J, Virtanen A. A multifunctional RNA recognition motif in poly(a)-specific ribonuclease with cap and poly(a) binding properties. Journal of Biological Chemistry 2007; 282(45): IF / pkt MNiSW 35 / cyt. 20 H3. Rutkowska-Wlodarczyk I, Stepinski J, Dadlez M, Darzynkiewicz E, Stolarski R, Niedzwiecka A.* Structural changes of eif4e upon binding to the mrna 5' monomethylguanosine and trimethylguanosine cap. Biochemistry 2008; 47(9): IF / pkt MNiSW 25 / cyt. 16 H4. Worch R, Jankowska-Anyszka M, Niedzwiecka A, Stepinski J, Mazza C, Darzynkiewicz E, Cusack S, Stolarski R. Diverse role of three tyrosines in binding of the RNA 5' cap to the 6

7 human nuclear cap binding complex. Journal of Molecular Biology 2009; 385(2): IF / pkt MNiSW 30 / cyt. 12 H5. Wu M, Nilsson P, Henriksson N, Niedzwiecka A, Lim MK, Cheng Z, Kokkoris K, Virtanen A, Song H. Structural basis of m(7)gpppg binding to poly(a)-specific ribonuclease. Structure 2009; 17(2): IF / pkt MNiSW 40 / cyt. 35 H6. Kiraga-Motoszko K, Niedzwiecka A*, Modrak-Wojcik A, Stepinski J, Darzynkiewicz E, Stolarski R. Thermodynamics of molecular recognition of mrna 5' cap by yeast eukaryotic initiation factor 4E. Journal of Physical Chemistry B 2011; 115(27): IF / pkt MNiSW 30 / cyt. 2 H7. Niedzwiecka A*, Lekka M, Nilsson P, Virtanen A. Global architecture of human poly(a)- specific ribonuclease by atomic force microscopy in liquid and dynamic light scattering. Biophysical Chemistry 2011; 158(2-3): IF / pkt MNiSW 20 / cyt. 9 H8. Niedzwiecka A*, Nilsson P, Worch R, Stepinski J, Darzynkiewicz E, Virtanen A. Molecular recognition of mrna 5 Cap by 3 poly(a)-specific ribonuclease (PARN) differs from interactions known for other cap-binding proteins, Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 2016; 1864(4): IF 5-letni / pkt MNiSW 30 c) omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania: Numery publikacji H. dotyczą jednotematycznego cyklu zgłoszonego jako osiągnięcie naukowe, D. odnoszą się do pozostałego dorobku naukowego po uzyskaniu stopnia doktora, a M. przed doktoratem (po uzyskaniu stopnia magistra) Wprowadzenie Tematyka moich badao dotyczy biofizycznych podstaw oddziaływao białko-ligand, pozwalających interpretowad wyniki biologiczne i lepiej zrozumied jak działa Natura. Badania oddziaływao w roztworze dostarczają komplementarnej wiedzy, dzięki której statyczne struktury krystalograficzne nabierają życia, a eksperymenty biologiczne przestają byd czarną skrzynką. Z drugiej strony, charakterystyka związków chemicznych pod kątem ich powinowactwa do białek odgrywających istotną rolę w wielopoziomowej regulacji ekspresji genów sprawia, że synteza chemiczna nie jest już tylko sztuką dla sztuki. Jako osiągnięcie naukowe przedstawiam jednotematyczny cykl publikacji dotyczący charakterystyki właściwości biofizycznych (podobieostw i różnic) związanych z oddziaływaniami triady białek, a mianowicie (i) homodimerycznej rybonukleazy specyficznej względem poli(a) (ang. poly(a)-specific ribonuclease, PARN, 150 kda), (ii) monomerycznego eukariotycznego czynnika inicjującego translację 4E (ang. eukaryotic initiation factor 4E, eif4e, 25 kda) i (iii) heterodimerycznego kompleksu wiążącego kap (ang. cap-binding complex, CBC, 110 kda) ze strukturą chemiczną tzw. kapu (ang. cap) na koocu 5 transkryptów polimerazy II: mrna i U snrna organizmów eukariotycznych (1). 7

8 Kap Kap 5 mrna składa się z zwitterionowo-kationowej 7-metyloguanozyny połączonej mostkiem trifosforanowym 5-5 z pierwszym transkrybowanym nukleozydem (m 7 GpppN gdzie N - dowolny nukleotyd, Rys. 1.). Struktura ta jest dodawana do kooca 5 kotranskrypcyjnie. Kap odgrywa kluczową rolę w koordynacji inicjacji translacji (1), nadzoru nad poprawnością mrna (ang. surveillance) i jego degradacji (2), które są wysoce regulowanymi procesami, dzięki czemu możliwa jest szybka odpowiedź na bodźce pochodzące ze środowiska, hormony, czynniki wzrostu itp. Kap bierze udział w całym spektrum procesów: składaniu genów (ang. splicing) i transporcie nukleocytoplazmatycznym, jak również pełni rolę głównej kotwicy molekularnej mrna do kompleksu inicjującego translację, eif4f i zabezpiecza mrna przeciwko degradacji egzonukleolitycznej od strony 5. Co ciekawe, kap 5' jest także uwikłany w regulację degradacji od strony 3' przez PARN. Kap występuje naturalnie w różnych formach: głównie jako 7-monometyloguanozynokap (MMG) oraz jako 2,2,7-trimetyloguanozynokap (TMG) w snrna i w prymitywnych organizmach eukariotycznych na skutek składania mrna typu trans. Dla lepszego zrozumienia eukariotycznej ekspresji genów konieczna jest biofizyczna charakteryzacja mechanizmów leżących u podstaw molekularnego rozpoznawania kapu 5 przez białka zaangażowane na różnych etapach regulacji ( ) 3 - mrna chain (or H for cap analogs) R2 Rys. 1. Struktura chemiczna analogu kapu 5 mrna. Gwiazdką zaznaczono proton o pk a 7.35 (3). R1 = CH 3 lub inny podstawnik; R2, R3 = H w analogach MMG kapu, CH 3 lub większa grupa w analogach TMG. Triada CBC-eIF4E-PARN W komórce eukariotycznej te trzy białka są ze sobą ściśle powiązane przez wzajemne zależności funkcjonalne. CBC bierze udział w składaniu genów (ang. splicing) w jądrze komórkowym, w eksporcie dojrzałego mrna i U snrna do cytoplazmy oraz w usuwaniu mrna zawierającego przedwczesny kodon STOP (ang. nonsense-mediated decay, NMD) podczas postulowanej tzw. pierwszej rundy translacji. W cytoplazmie koniec 5' poprawnego mrna rozpoznawany jest przez monomeryczny czynnik translacyjny eif4e. Białko to jest kluczowym elementem kompleksu eif4f, zawierającego również wielofunkcyjny czynnik eif4g i helikazę eif4a. eif4f inicjuje regularną translację zależną od kapu 5' poprzez przyłączenie małej podjednostki rybosomalnej do mrna. Pierwszym krokiem w procesie rekrutacji rybosomu do mrna, decydującym o wydajności całego etapu inicjacji translacji, jest właśnie stabilne związanie eif4e z kapem. Eksperymenty biochemiczne sugerują, że rybosomy przeprowadzające biosyntezę białka zależną od kapu przechodzą w sposób ciągły w kolejne rundy translacji, bez konieczności dysocjacji z mrna i ponownej inicjacji (4), jak gdyby mrna tworzyło zamkniętą strukturę cykliczną. Istotnie, obrazy uzyskane metodami mikroskopii sił atomowych (ang. atomic force microscopy, AFM) potwierdziły, że mrna ulega cyrkularyzacji za pośrednictwem kompleksu utworzonego przez czynniki inicjacyjne eif4e i eif4g oraz białko wiążące łaocuch poliadenylowy (ang. poly(a)-binding protein, PABP) znajdujący się na koocu 3' mrna (5). Kiedy natomiast z łaocucha poliadenylowego 8

9 oddysocjowują cząsteczki PABP, może on stad się substratem homodimerycznej deadenylazy PARN (6 10). Co ciekawe, PARN jest enzymem degradującym koniec 3' mrna, którego aktywnośd jest zależna od obecności struktury kapu na koocu 5' (11 13). Procesywnośd i szybkośd deadenylacji przeprowadzanej przez PARN wzrastają znacznie dla substratów posiadających kap. Dodanie analogu kapu do mieszaniny reakcyjnej powoduje niekompetycyjną inhibicję deadenylacji. Inhibitorem PARN-u jest również m. in. większa podjednostka CBC, CBP80 (14). Inhibitorowe oddziaływanie CBC na PARN może mied związek z regulacją zaangażowania PARN-u w NMD podczas pierwszej rundy translacji. Z drugiej strony stwierdzono, że istnieje zależnośd pomiędzy stopniem zasocjowania kooca 5' mrna z PARN-em lub eif4e a uwarunkowaniami środowiskowymi: w warunkach głodu komórkowego równowaga obsadzenia 5' kooca przez te białka przesuwa się na korzyśd PARN-u stymulując procesy degradacji mrna. Ta konkurencja pomiędzy eif4e a PARN-em o dostęp do 5' kooca może wpływad na los danego mrna - czy zostanie ono użyte jako matryca do translacji, czy przeznaczone do degradacji. W pierwszej kolejności chciałabym wyeksponowad częśd poświęconą PARN-owi, gdyż wiąże się ona z podjęciem nowej tematyki. Jednakże mechanizm molekularnego rozpoznawania kapu 5 mrna przez ten enzym należy rozpatrywad w kontekście rezultatów otrzymanych dla innych białek, eif4e oraz CBC, wiążących 7-monometyloguanozynokap (MMG) w procesach regulacji eukariotycznej ekspresji genów, gdyż triada ta stanowi zespół molekularnych partnerów - stąd tytuł osiągnięcia przedstawionego ocenie. Dopiero bowiem takie tło porównawcze daje pełniejszy ogląd zjawiska jedności w różnorodności, polegającego na tym, że podobne strukturalne elementy składowe dają zupełnie inny biofizyczny obraz oddziaływania, w zależności od uwarunkowao submolekularnych. Co ciekawe, efekty te są ściśle i logicznie powiązane z funkcjami biologicznymi każdego z tych trzech białek. Eukariotyczny czynnik inicjujący translację 4E (eif4e) Badania własności eif4e od początku były immanentnie związane z potencjalnym projektowaniem leków przeciwnowotworowych ze względu na protoonkogenny charakter tego białka. Podwyższona aktywnośd eif4e wywołuje złośliwą transformację nowotworową i vice versa: w komórkach nowotworowych, które weszły na drogę złośliwienia z innych przyczyn, pojawia się podwyższony poziom eif4e. Jest tak, ponieważ indukowana przez eif4e inicjacja translacji zależna od kapu dotyczy mrna regulatorowych, ważnych dla wzrostu i podziału komórki, a niekoniecznie dla genów konstytutywnych (ang. housekeeping genes), co czyni z eif4e obiecujący cel terapeutyczny. Nadzieje na terapię genową opartą o antysensowne oligonukleotydy hamujące ekspresję samego eif4e zawiodły w próbach klinicznych, więc kwestia poszukiwania małych cząsteczek blokujących aktywnośd eif4e na poziomie białka w komórce jest wciąż aktualna. Białko eif4e jest stosunkowo małym monomerem (217 aminokwasów, 25 kda, Rys. 2A.) o wybitnie zakonserwowanej sekwencji (98% identyczności u ssaków, 88% u kręgowców; 44% podobieostwa pomiędzy białkiem człowieka i drożdży) i bardzo wysokiej zawartości tryptofanów (8 Trp). Pierwsza struktura krystalograficzna eif4e w kompleksie z m 7 GDP została rozwiązana w 1997 r. (15) (pdb: 1EJ1). Był to ciekawy przykład sytuacji, gdzie struktura krystalograficzna nie wyjaśnia selektywności biologicznej eif4e względem 7- monometylowanej formy kapu, gdyż identyczny układ trzech wiązao wodorowych z udziałem 9

10 7-metyloguanozyny, jaki jest widoczny w krysztale (Rys. 2B.), mógłby powstad również dla niemetylowanej formy G, a jednak niemetylowana forma kapu jest całkowicie nieaktywna biologicznie w testach translacyjnych. Dopiero badania oddziaływao w roztworze wykazały (M8.), że utworzenie tych trzech wiązao wodorowych jest uwarunkowane stabilizacją kanapkowego układu warstwowego, osiąganą dzięki oddziaływaniu warstwowemu (stackingowi) typu kation-, które jest energetycznie efektywniejsze niż stacking -. Forma kationowa pierścienia guanozyny pojawia się bowiem dzięki obecności (jakiegokolwiek) podstawnika w pozycji N7, wprowadzającego nadmiarowy ładunek dodatni. Badania te (M8.) pokazały również, że niemetylowane formy kapu 5 mrna oddziałują z eif4e wyłącznie za pośrednictwem łaocucha trifosforanowego. (A) (B) Rys. 2. Struktura krystalograficzna eif4e(28-217) myszy z m 7 GTP (pdb 1L8B, M8.). (A) Ogólny pokrój cząsteczki z zaznaczonymi kluczowymi aminokwasami wiążącymi kap (patyczki CPK) i m7gtp (kulki CPK, atomy węgla zielone), (B) Struktura krystalograficzna miejsca wiążącego kap. Kompleks wiążący kap (CBC) CBC jest najbardziej enigmatyczne z tych trzech białek pod względem funkcji biologicznej. Wykazano jego istotną rolę w alternatywnym składaniu genów, w transporcie, biogenezie niektórych mirna, NMD i w pierwszej rundzie translacji (16). CBC wiąże kap transkryptów eukariotycznej polimerazy II, takich jak pre-mrna, bogate w urydynę małe jądrowe RNA (U snrna) lub małe jąderkowe RNA (snorna). W niektórych przypadkach nowotworów znaleziono podwyższony poziom ekspresji małej podjednostki CBC, CBP20, natomiast brak jest danych na temat skutków niedoboru aktywności CBC w organizmie człowieka. Co ciekawe, w przypadku roślin mutanty pozbawione prawidłowego CBC stają się odporne na suszę (17, 18). Pod względem budowy molekularnej CBC jest dużym heterodimerem ( aminokwasów, 110 kda, Rys. 3B.), którego mniejsza podjednostka CBP20 jest domeną RRM oddziałującą z kapem 5 mrna (Rys. 3A.), która wymaga obecności większej podjednostki CBP80 dla ustabilizowania własnej struktury i utworzenia trwałego kompleksu z kapem (pdb: 1H2T). 10

11 (A) (B) Rys. 3. Struktura krystalograficzna (A) centrum wiążącego kap domeny RRM CBC, (B) heterodimeru CBC. Kolory aminokwasów i analogu kapu m 7 GpppG jak na Rys. 1. Rybonukleaza specyficzna względem poli(a) (PARN) Enzym PARN jest obecny głównie u kręgowców; może występowad również u roślin. Na początku mojego zaangażowania w prace badawcze nad tym enzymem, PARN był jeszcze obiektem słabo poznanym zarówno od strony pełnionych funkcji fizjologicznych, jak i charakterystyki własności biofizycznych. Ostatnie doniesienia pokazały, iż białko to ma ogromne znaczenie biomedyczne (19 23). Z jednej strony - PARN jest niezbywalnym elementem układu regulującego metabolizm telomerów, gdyż jego niedobór powoduje ciężką chorobą genetyczną polegającą na nagłym ich skracaniu i przedwczesnym starzeniu się, a z drugiej strony jego nadmiar zidentyfikowano w rozwoju nowotworu żołądka i ostrych białaczek. Mutacje homologu PARN-u u rzodkiewnika prowadzą do wytworzenia obumarłych nasion (24). Dla prawidłowego funkcjonowania organizmu człowieka konieczna jest zatem precyzyjna równowaga aktywności PARN-u, który kontroluje poziom mrna innych białek regulatorowych. Wykazano, że PARN jest zaangażowany w następujące procesy molekularne związane z metabolizmem RNA: i) usuwanie matczynego mrna podczas embriogenezy i wczesnego rozwoju (25), ii) Nonsense Mediated Decay (2), iii) selekcję mrna do degradacji podczas regulacji ruchów komórkowych (26), iv) przycinanie nowo zsyntetyzowanych cząsteczek mrna (27) i małych jąderkowych RNA (28), jak również v) dojrzewanie mirna (29). Pod względem budowy PARN jest homodimerem (2 639 aminokwasów, 150 kda) połączonym kowalencyjnie mostkiem dwusiarczkowym pośrodku rozległej powierzchni hydrofobowej pomiędzy monomerami. Każdy monomer składa się z trzech domen globularnych: nukleazy, R3H i RRM (ang. RNA Recognizing Motif) oraz ok aminokwasowego nieustrukturyzowanego odcinka na koocu C. Od 2005 r. znane były struktury krystalograficzne fragmentów zawierających domenę nukleazy w kompleksie z trinukleotydem AAA (pdb: 2A1S (30)) oraz domeny nukleazy i R3H bez ligandu (pdb: 2A1S 11

12 (30)) W pierwszym przypadku konstrukt zawierał również domenę R3H, lecz jej pozycja w strukturze krystalograficznej była nieuporządkowana. Inne białka wiążące kap Wspólnym motywem strukturalnym białek wiążących 7-mono lub 2,2,7-trimetylowany kap 5 mrna lub U snrna (Tabela 1.) jest utworzenie układu trójwarstwowego (kanapkowego stackingu), w którym pierścieo 7-metyloguanozyny jest wsunięty pomiędzy dwa pierścienie aromatyczne lub ich zamienniki oraz z sieci międzyatomowych wiązao niekowalencyjnych pomiędzy kapem a białkiem (mostków solnych i wiązao wodorowych utworzonych bezpośrednio lub za pośrednictwem cząsteczek wody). eif4e, CBC i dwufunkcyjne białko wirusa krowianki VP39 (2 O-metylotransferaza i czynnik procesywności poliadenylazy) stanowią przykłady idealnego, równoległego układu potrójnego z 7- metyloguanozyną pomiędzy pierścieniami aromatycznymi grup bocznych (Trp, Tyr lub Phe). W snurportynie trzecią warstwę zapewnia zasada pierwszego transkrybowanego nukleozydu (31). W przypadku enzymu degradującego kap DcpS trzeci pierścieo aromatyczny jest zastąpiony przez Leu206 (32, 33), a w syntazie trimetyloguanozynokapu TGS1 jest to Ser671. Podjednostka PB2 polimerazy wirusa grypy wykorzystuje His357 i nie całkiem równoległą resztę Phe404, natomiast w 2 O-metylotransferazie człowieka CMTr1 występuje układ daleki od idealnego ze stackingiem z udziałem Glu373 i Phe206 pod dużym kątem względem płaszczyzny MMG. Udział reszt zasadowych w wiązaniu łaocucha trifosforanowego jest bardzo różny, podobnie jak specyficzna stabilizacja (lub jej brak) pierwszego transkrybowanego nukleozydu. Skutkiem tego wypadkowe powinowactwo i selektywnośd są bardzo zróżnicowane (prace M8., H1,2,6., D3,4,6. (34)). W trakcie badao opisanych w części dotyczących osiągnięcia (H5.) okazało się, że PARN jest jedynym wyjątkiem, który rozpoznaje strukturę kapu poprzez stacking z tylko jednym aminokwasem aromatycznym, bez trzeciego partnera lub jego substytutu. Tabela 1. Białka o znanej strukturze miejsca wiążącego 7-monometyloguanozynokap (MMG) lub 2,2,7- trimetyloguanozynokap (TMG) Białko Funkcja PDB ID eukariotyczne CMTr1 (2 O-ribose methyltransferase 1) synteza 2 O-MMG kapu 4N48 (35) DcpS (decapping scavenger) degradacja MMG kapu 1ST0 (33) TGS1 (2,2,7-trimethylguanosine synthase 1) synteza TMG kapu 3GDH (36) Snurportyna (snurportin 1) import dojądrowy U snrnp 1XK5 (31) CBC (cap-binding complex) składanie genów, eksport, NMD 1H2T (37) eif4e (eukaryotic initiation factor 4E) inicjacja translacji 1L8B M8. PARN (poly(a)-specific ribonuclease) deadenylacja 3D45 H5. wirusowe VP39 (2 O-ribose methyltransferase) synteza 2 O-MMG kapu/poliadenylacja 1AV6 (38) PB2 (influenza virus polymerase subunit) transkrypcja wirusowego mrna 2VQZ (39) 12

13 Główne zainteresowania badawcze W projektowaniu swoich badao koncentrowałam się głównie na pozyskaniu informacji komplementarnej do statycznego obrazu wynikającego ze struktur krystalograficznych. Moje publikacje są często wynikiem bliskiej współpracy z krystalografami mającej na celu dostarczenie jak najbardziej wyczerpującego opisu obiektu biologicznego, zjawiska lub procesu. Zrozumienie opisie mechanizmu molekularnego oddziaływania między cząsteczkowego wymaga bowiem znajomości parametrów termodynamicznych determinujących stany równowagowe oraz parametrów kinetycznych, związanych z procesami prowadzącymi do tych równowag. Typowo, w literaturze biofizycznej obiekty naładowane elektrostatycznie analizowane są pod kątem charakterystyki kinetycznej ich oddziaływao (np. (40)), a obiekty hydrofobowe pod kątem termodynamicznym (np. (41)). Kapy 5 mrna i U snrna (Rys. 1) mają zarówno znaczny ładunek ujemny na grupach fosforanowych, jak i ładunek dodatni (forma kationowa) lub dodatni i ujemny (forma zwitterionowa) na 7-metylowanym pierścieniu guanozyny, a jednocześnie ze względu na pierścieo heteroaromatyczny zasady zachowuje pewne cechy hydrofobowe. Obecne badania stanowią rozszerzenie wcześniejszych prac termodynamicznych (M8,9., D2,9.) na białka eif4e z innych organizmów: drożdży jako eukariotycznego organizmu modelowego i ortologów eif4e z organizmów pasożytów (nicienie, przywry) w kontekście potencjalnego projektowania leków przeciwpasożytniczych w oparciu o TMG kap oraz na inne białka wiążące kooce 5 transkryptów polimerazy II (mrna, U snrna): CBC, PARN i snurportynę. Współpraca międzynarodowa i krajowa Moja działalnośd naukowa jest związana z międzynarodową i krajową współpracą w interdyscyplinarnych zespołach badawczych złożonych również z krystalografów, chemików i biologów molekularnych. Współprace te wynikają stąd, że do prawidłowej interpretacji i zrozumienia, a czasem wręcz do poprawnego rozwiązania struktur krystalograficznych (np. w pracy H5.) i innych własności obiektów i procesów biologicznie istotnych konieczne jest zbadanie dynamiki oddziaływao makrocząsteczek biologicznych w roztworze. Skutkiem takich współprac są kompleksowe artykuły, prezentujące spektrum zastosowanych podejśd metodologicznych, mające w mojej opinii wartośd dodaną względem większej liczby możliwych publikacji (w tym np. potencjalnie jednoautorskich) zawężonych do zakresu badao biofizycznych w czasopismach bardziej specjalistycznych o ograniczonym zasięgu. W szczególności cenna jest dla mnie współpraca z prof. Andersem Virtanenem z Uniwersytetu w Uppsali (Szwecja), odkrywcą rybonukleazy specyficznej względem poli(a) (PARN) (6). Efektem tej współpracy są m. in. publikacje H2., H5., w których jako jedyny niebiolog (i jedyna osoba z Polski) odpowiadam całościowo za stronę spektroskopową oraz molekularną interpretację biofizyczną uzyskanych wyników, oraz prace H7. i H8. Na podkreślenie zasługuje również długoletnia współpraca z grupą chemików prof. dr. hab. Edwarda Darżynkiewicza z Zakładu Biofizyki na Wydziale Fizyki Uniwersytetu Warszawskiego, która zajmuje się syntezą licznych, komercyjnie niedostępnych, chemicznie modyfikowanych analogów kapu 5 mrna, koniecznych do wszechstronnych badao biofizycznych. Z innych kontaktów krajowych, dzięki którym wzbogaciłam swój repertuar metodologiczny, chciałabym wymienid współpracę z prof. dr. hab. Michałem Dadlezem z Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN (spektrometria mas) oraz z prof. nadzw. Małgorzatą Lekką z Instytutu Fizyki Jądrowej PAN (mikroskopia AFM). 13

14 Podejście metodologiczne Stosowane i rozwijane przeze mnie metody badawcze obejmują szerokie spektrum technik i stanowią wybór adekwatny do bieżącego pytania naukowego w zakresie opracowania metodyki pracy z danym układem biomolekuł, planowania doświadczeo, wdrażania praktyki pomiarowej, analizy numerycznej i biofizycznej interpretacji wyników. Obejmują one spektroskopię emisyjną i absorpcyjną UV, dichroizm kołowy (CD), dynamiczne rozpraszanie światła (DLS), spektrometrię mas z wymianą wodór/deuter (HDX MS), mikroskopię sił atomowych (AFM), powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), izotermiczną mikrokalorymetrię miareczkującą (ITC), spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego 1 H i 13 C, techniki krystalizacji białek, chromatografię HPLC/FPLC i mikrodializę równowagową. W pracy naukowej ważne dla mnie jest to, aby uzyskiwane wyniki umożliwiały formułowanie ogólniejszych wniosków lub hipotez w kontekście funkcji biologicznej badanych obiektów oraz na tle innych zjawisk biofizycznych opisanych w literaturze. Badania strukturalne układów makrocząsteczek o wysokiej dynamice strukturalnej potrzebują wielu komplementarnych metod analizy doświadczalnej. Tam, gdzie kanoniczne metody badao strukturalnych takie jak krystalografia i wielowymiarowy magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) mają ograniczone zastosowanie ze względu na rozmiary, własności i ograniczenia stężeniowe badanego obiektu, trzeba sięgad po metody alternatywne, np. HDX MS lub AFM w warunkach roztworu. Natomiast aby właściwie zinterpretowad obraz strukturalny, konieczna jest ścisła analiza oddziaływao białek z ligandami w roztworze w języku parametrów termodynamicznych, która uzupełnia informacje niemożliwe do wyczytania z samej struktury kompleksu. W badaniach oddziaływao międzycząsteczkowych spektroskopia emisyjna oparta o naturalną fluorescencję białek pozostaje moją metodą pierwszego wyboru ze względu na możliwośd bezpośredniego obserwowania właściwego procesu asocjacji bez jego zaburzania przez znakowanie i pomiary sygnałów pośrednich. Mierzona intensywnośd promieniowania jest sumą sygnałów pochodzących od wszystkich obecnych w próbce fluoroforów. Własności spektralne poszczególnych białek, a także ich mutantów mogą się istotnie różnid ze względu na inną zawartośd aminokwasów o grupach bocznych wykazujących naturalna fluorescencję w bliskim ultrafiolecie (głównie tryptofanów i tyrozyn, w niewielkim stopniu także fenyloalanin) oraz ich rozlokowanie w miejscach, w których mogą doświadczad albo wygaszania statycznego albo zmian konformacyjnych i wygaszania dynamicznego. Ma to wpływ zarówno na kształt widma, jak i na profil wygaszania naturalnej fluorescencji białek podczas tworzenia kompleksów międzycząsteczkowych. Wygaszanie fluorescencji może zachodzid w następstwie procesów dynamicznych (transfer energii, reakcje w stanie wzbudzonym, zderzenia grup chemicznych i jonów) lub statycznych (m. in. tworzenie ciemnego kompleksu). W białkach różne procesy wygaszania z udziałem tyrozyny i tryptofanu mogą zachodzid jednocześnie. Mogą to byd procesy bezpośrednio związane z asocjacją, czyli statyczne wygaszanie fluoroforu przez ligand tworzący z nim ciemny kompleks poprzez oddziaływania warstwowe ich pierścieni aromatycznych (stacking) i/lub oddziaływania kation-, czy też zderzeniowe wygaszanie fluoroforu znajdującego się pobliżu miejsca wiążącego ligand, jak również procesy wygaszania lub wzmocnienia fluorescencji wraz ze zmianą kształtu widma, wynikające z odległych od miejsca wiążącego zmian konformacyjnych sprzężonych termodynamicznie z tworzeniem kompleksu. Wypadkowe, obserwowane zmiany sygnału fluorescencyjnego białka na skutek zmian konformacyjnych 14

15 mogą pochodzid od: (i) zmiany wydajności kwantowej i przesunięcia maksimum widma pierścienia indolowego tryptofanu w funkcji stałej dielektrycznej lokalnego mikrootoczenia na skutek niewielkich przesunięd grup bocznych aminokwasów sąsiadujących z indolem lub zmiany dostępności dla wody, (ii) zmiany stopnia wygaszania dynamicznego indolu przez sąsiadujące grupy chemiczne lub jony roztworu, (iii) jonizacja tyrozyny; (iv) zmiana wydajności rezonansowego przeniesienia energii z tyrozyn na tryptofany (FRET) na skutek zmiany geometrii donor-akceptor lub selektywnego wygaszania donora albo akceptora. W opracowanej przeze mnie wcześniej procedurze pomiarowej (D8.) nie stosuje się żadnych uproszczających założeo. Równanie analityczne opisujące w sposób ścisły równowagę tworzenia kompleksu białko-ligand w funkcji całkowitego stężenia ligandu jest niezależne od mechanizmu obserwowanego wygaszania fluorescencji białka. Emisja pochodząca od swobodnego ligandu jest również explicite uwzględniona. Kształt izoterm wiązania wyznaczonych w ten sposób zależy więc od wielu czynników. Dlatego też różne układy białko-ligand o zbliżonych stałych asocjacji mogą mied różny kształt krzywych miareczkowania. W pracy (D8.) wykazałam, że wprowadzanie nieuzasadnionych przybliżeo i linearyzacja danych prowadząca do zmiany względnej niepewności pomiarowej punktów leżących w różnych zakresach skali, a co za tym idzie przypisywanie nierównomiernych wag różnym zakresom, doprowadzało w literaturze do uzyskiwania błędnych rezultatów. Skutkiem tego była m. in. kontrowersja wokół 7-monometyloguanozynokapu (MMG) i 2,2,7- trimetyloguanozynokapu (TMG) dla izoform eif4e, która stała się przedmiotem badao w pracach H3. oraz D3. i D4. Perspektywy dalszych badao Dotychczasowe wyniki pozwalają na rozszerzenie badao na układy, których mechanizmy molekularne oddziaływania zależą od kapu 5, a są nadal słabo poznane. Do takich pytao należą m. in. (i) zagadnienie akompetycyjnej lub niekompetycyjnej kinetyki inhibicji PARN-u przez domenę CBP80 heterodimerycznego białka CBC w zależności od obecności kapu na substracie, (ii) poszukiwania ligandów o nanomolarnej stałej dysocjacji względem snurportyny, czy (iii) mechanizm oddziaływania enzymów degradujących kap 5, takich jak np. hnudt16. Inne nowe kierunki badao, to białka natywnie nieustrukturyzowane i ich oddziaływania biorące udział w regulacji ekspresji genów przez mirna oraz w procesach biomineralizacji Omówienie osiągnięcia naukowego - celów szczegółowych i osiągniętych wyników Eksperymenty biologiczne znane z wcześniejszej literatury sugerowały, że procesywnośd deadenylacji mrna przeprowadzanej przez egzorybonukleazę specyficzną względem 3 poli(a) (PARN) jest wyższa dla substratów posiadających strukturę 7- metyloguanozynokapu na koocu 5, jak gdyby enzym ten zyskiwał dodatkową możliwośd stabilizacji kompleksu z substratem poprzez cyrkularyzację mrna. Celem publikacji: H2. Nilsson P, Henriksson N, Niedzwiecka A, Balatsos NA, Kokkoris K, Eriksson J, Virtanen A. A multifunctional RNA recognition motif in poly(a)-specific ribonuclease with cap and poly(a) binding properties. J Biol Chem. 2007; 282(45): IF / pkt MNiSW 35 / cyt

16 było sprawdzenie, czy istnieje bezpośredni kontakt pomiędzy koocem 5 a PARN-em człowieka oraz odkrycie tego potencjalnego miejsca wiążącego kap. Ponieważ najczęstszym partnerem 7-metyloguanozynokapu w kompleksach z białkami jest tryptofan, przygotowano serię mutantów punktowych, obejmujących m. in. wszystkie tryptofany występujące w sekwencji: Trp219 w domenie R3H, Trp456 i Trp475 w domenie RRM, Trp526 i Trp531 w części nieustrukturyzowanej tuż za domeną RRM i Trp639 jako ostatni aminokwas na koocu C. Wykonane przeze mnie pomiary izoterm wiązania dla monoi dinukleotydowego analogu kapu 5 za pomocą metody miareczkowania fluorescencyjnego zoptymalizowanej pod kątem własności spektralnych tego białka wykazały, że: (1) istnieje bezpośrednie oddziaływanie pomiędzy PARN-em a kapem 5 mrna o mikromolarnej równowagowej stałej dysocjacji, (2) oddziaływanie to jest zapewnione przez domenę RRM (118 aminokwasów), która wiąże kap ze stałą K D zaledwie 7-8 razy wyższą niż pełny dimer PARN-u (2 639 aminokwasów), (3) pierwszy transkrybowany nukleozyd przyczynia się do stabilizacji oddziaływania z PARN-em, (4) mutant W475A całkowicie utracił zdolnośd oddziaływania z PARN-em, a więc Trp475 konstytuuje miejsce wiążące kap, (5) Trp456 pełni rolę pomocniczą, a pozostałe tryptofany nie mają znaczenia. Powstało zatem pytanie, czy utrata powinowactwa do kapu nie jest wynikiem zaburzenia struktury spowodowanego mutacją, gdyż tryptofany często pełnią w białkach rolę rusztowania molekularnego. Za pomocą pomiarów dichroizmu kołowego wykazałam, że struktura drugorzędowa domeny RRM z mutacjami W456A, W475A jest identyczna ze strukturą wyjściową, a więc obserwowany efekt całkowitego zaniku powinowactwa PARN-u W475A do kapu 5 ma charakter czysto funkcjonalny. Co ciekawe, z wyników tych płynie wniosek, iż jednostronne oddziaływanie warstwowe (ang. stacking, pl. również staking) pomiędzy Trp475 a 7-metyloguanozynokapem jest warunkiem wystarczającym dla utworzenia kompleksu kapu z białkiem o powinowactwie w zakresie 1 M, co jest wyjątkiem wśród białek wiążących kap, ponieważ w każdym innym przypadku takiemu układowi warstwowemu towarzyszy trzeci partner aromatyczny lub hydrofobowy, podtrzymujący kap z drugiej strony. Było to pierwsze w literaturze doniesienie o nietypowej domenie RRM, która oddziałuje z kapem RNA poprzez Trp475 leżący na zewnętrznej powierzchni molekularnej domeny RRM zamiast przez swoje miejsce kanoniczne, któremu odpowiada His449 w tym białku. Nasze odkrycie dokonane na bazie spektroskopowych pomiarów oddziaływao w roztworze zostało wkrótce potwierdzone przez struktury wyizolowanych domen RRM z analogiem kapu, otrzymane metodami NMR (42) i rentgenograficznie (43). Okazało się również, że domena RRM PARN-u ma bardzo interesujące własności funkcjonalne. Pomimo swoich małych rozmiarów wiąże ona również w sposób selektywny poli(a) z powinowactwem silnie zależnym od długości oligonukleotydu, co sugeruje możliwośd dimeryzacji RRM. Miejsce wiążące poli(a) w ramach tej domeny jest rozłączne z miejscem wiążącym kap. Podsumowując - wykazaliśmy, że aktywnośd PARN-u jest kolejnym przykładem komunikacji molekularnej pomiędzy kraocami 5' i 3' eukariotycznego mrna, która 16

17 odgrywa tak kluczową rolę również w innych procesach regulacji ekspresji genów, np. poprzez mirna. Kontynuacją tych badao były poszukiwania pozostałych aminokwasów tworzących miejsce wiążące kap i udział w rozwiązaniu struktury krystalograficznej PARN-u z analogiem kapu, czego owocem jest następna publikacja: H5. Wu M, Nilsson P, Henriksson N, Niedzwiecka A, Lim MK, Cheng Z, Kokkoris K, Virtanen A, Song H. Structural basis of m(7)gpppg binding to poly(a)-specific ribonuclease. Structure. 2009; 17(2): IF / pkt MNiSW 40 / cyt. 35 Praca ta poświęcona jest strukturze krystalograficznej PARN-u myszy oraz budowie i własnościom miejsca wiążącego kap 5 mrna PARN-u człowieka. Sama struktura krystalograficzna tego trudnego dla krystalografii obiektu miała dośd słabą zdolnośd rozdzielczą (> 3.0 Å) ze względu na dużą masę (150 kda) i fragmenty niestabilne strukturalnie. Wstępna analiza napotkała trudności w identyfikacji miejsca związania dinukleotydowego analogu kapu, m 7 GpppG, użytego do krystalizacji. Zostaliśmy więc wraz z prof. Andersem Virtanenem zaproszeni do współpracy przez krystalografa, prof. Haiweia Songa, aby pomóc zlokalizowad miejsce i prawidłowy sposób związania ligandu poprzez badania z udziałem licznych mutantów, co było etapem koniecznym do ostatecznego rozwiązania struktury (Rys. 4.). (A) domena RRM (B) domena nukleazy Numeracja w strukturze krystalograficznej PARN-u myszy odpowiada +7 w białku człowieka Rys. 4. Struktura krystalograficzna (A) fragmentu dimeru PARN-u myszy obejmującego domeny nukleazy i RRM (domena R3H niewidoczna) w kompleksie z analogiem kapu m7gpppg (pdb 3D45), rozwiązana w prac H5; (B) centrum wiążące kap na pograniczu domeny RRM (aminokwasy > 423) i nukleazy (aminokwasy < 423) w konformacji zamkniętej. Wyniki pomiarów oddziaływao wykonanych przeze mnie metodą miareczkowania fluorescencyjnego dla serii mutantów punktowych PARN-u człowieka z mono- 17

18 i dinukleotydowym analogiem kapu wykazały, że w przeciwieostwie do eif4e (M8.) energia swobodna Gibbsa stabilizacji dinukleotydowego kapu w miejscu wiążącym nie separuje się na wkłady pochodzące od oddziaływao poszczególnych aminokwasów z elementami struktury kapu, np. 7-metyloguanozyny, łaocucha trifosforanowego, niemetylowanej guanozyny. Oddziaływanie to jest zapewnione przez całą serię residuów o charakterze głównie hydrofobowym, a w mniejszym stopniu przez łaocuchy boczne aminokwasów naładowanych dodatnio. Okazało się również, że niektóre mutacje mają większe znaczenie dla stabilizacji miejsca wiążącego jako całości mogącej zaadaptowad kap, niż dla utworzenia poszczególnych wiązao niekowalencyjnych. Np. stwierdzono paradoksalnie nieco silniejszy efekt mutacji w obrębie powierzchni hydrofobowej w pobliżu miejsca oddziaływania zasady pierwszego transkrybowanego nukleozydu (I34A, L291A, Rys. 4B.) na mononukleotydowy analog kapu, m 7 GTP, niż na analog dinukleotydowy, m 7 GpppG, co świadczy o tym, że destabilizacja miejsca wiążącego jest dla analogu mononukleotydowego bardziej istotna, a obecnośd drugiego nukleotydu pomaga związad kap pomimo tej mutacji. Ten efekt kolejny raz potwierdza znaczenie pierwszego transkrybowanego nukleotydu dla wzmocnienia oddziaływania z PARN-em, podobnie jak to ma miejsce dla CBC, a przeciwnie niż dla eif4e. Mutacja N288A całkowicie uniemożliwiła utworzenie kompleksu z analogami kapu, podobnie jak mutacja W475A zbadana wcześniej w pracy H2. Przyczyną tak silnego efektu może byd, poza utratą stabilizacji łaocucha fosforanowego, zniekształcenie miejsca wiążącego w obrębie pętli na granicy z α-helisą, gdzie Ala jako aminokwas o jednej z najsilniejszych tendencji -helikalnych może wymuszad zmianę konformacji łaocucha peptydowego na helikalną. Co ciekawe, w obszarze domeny nukleazy miejsce wiązania kapu pokrywa się częściowo z miejscem wiązania poli(a), znanym z wcześniejszej pracy (30), w przeciwieostwie do tej części miejsca wiążącego kap, która jest zlokalizowana w domenie RRM i odpowiada za stacking 7-metyloguanozyny kapu z Trp475. Aby sprawdzid, czy to przestrzenne nakładanie się miejsc wiążących ma również znaczenie funkcjonalne, przeprowadziliśmy pomiary izotermicznego miareczkowania kalorymetrycznego (ang. Isothermal Titration Calorimetry, ITC). Zinterpretowane przeze mnie eksperymenty kompetycyjne, w których zmierzono wypadkowe parametry termodynamiczne m. in. oddziaływania A 10 z PARN-em po uprzednim dodaniu 2.5-krotnego nadmiaru m 7 GpppG oraz oddziaływania m 7 GpppG z PARNem po uprzednim dodaniu 2.5-krotnego nadmiaru A 10 wykazały, że proces wypierania ligandu o wyższej stałej dysocjacji (m 7 GpppG) przez ligand o niższej stałej asocjacji (A 10 ) z potencjalnie wspólnego miejsca wiążącego rzeczywiście zachodzi, co znajduje swoje odbicie w zmianach wartości H i T S na znacznie bardziej dodatnie w porównaniu z analogicznymi wartościami dla oddziaływao w układach dwuskładnikowych. Metodami enzymatycznymi pokazano również, że niektóre aminokwasy domeny nukleazy zaangażowane w wiązanie kapu są konieczne dla prawidłowego procesu deadenylacji. Rozwiązana struktura krystalograficzna wykazała, że PARN jest jedynym wyjątkiem pośród znanych dotąd białek wiążących kap 5, który rozpoznaje strukturę kapu poprzez oddziaływanie warstwowe z tylko jednym aminokwasem (Trp), bez trzeciego partnera aromatycznego lub jego substytutu. W strukturze krystalograficznej poszczególne monomery dimeru PARN-u mają domeny RRM w konformacjach nierównoważnych względem domeny nukleazy, przesuniętych o ok. 30. Konformacja zamknięta RRM wiąże kap a taki sposób, że widoczna jest gęstośd elektronowa wokół pierwszego transkrybowanego nukleozydu cząsteczki m 7 GpppG, 18

19 związanego przez domeną nukleazy. Natomiast w konformacji otwartej ten niemetylowany nukleozyd jest niewidoczny. Struktura ta rodzi zatem pytanie, czy te dwie konformacje występują również w roztworze i oddziaływanie obu miejsc wiążących kap dimeru PARN-u z ligandem jest również zróżnicowane, czy jednakowe. W pierwszym przybliżeniu oba podejścia metodologiczne zastosowane w tej pracy, miareczkowania fluorescencyjne i ITC, wykazywały uśrednione, zgodne wartości, co sugerowało, że jeśli takie różnice powinowactwa istnieją, to w zakresie tego samego rzędu wielkości. Pytanie to stało się przedmiotem dalszych szczegółowych badao opisanych w pracy H8. Mimo obecności trzech domen globularnych w konstrukcie białka użytym do krystalizacji, w strukturze ujawniły się tylko dwie z nich: nukleaza i RRM, a pozycja domeny R3H pozostała nieokreślona. Struktura PARN-u arbitralnie złożona z wykrystalizowanych osobno fragmentów pozostawiła więc nadal otwarte pytanie o globalny kształt (parametry geometryczne) cząsteczki białka o pełnej długości. Ze względu na ograniczenia standardowych metod biologii strukturalnej, tj. krystalografii rentgenowskiej i wielowymiarowej spektroskopii NMR, w zastosowaniu do obiektów o takiej wielkości (ok. 150 kda) zawierających długie sekwencje nieuporządkowane potrzebne było alternatywne podejście, którego rezultaty przedstawia praca: H7. Niedzwiecka A*, Lekka M, Nilsson P, Virtanen A. Global architecture of human poly(a)- specific ribonuclease by atomic force microscopy in liquid and dynamic light scattering. Biophys Chem. 2011; 158(2-3): IF / pkt MNiSW 20 / cyt. 9 W publikacji tej zastosowałam mikroskopię sił atomowych (ang. atomic force microscopy, AFM), gdyż jest to jedyna metoda umożliwiająca analizę kształtu biomolekuł tej wielkości z rozdzielczością nanometrową, przy użyciu niskich stężeo, zapewniających warunki monodyspersyjnej rozpuszczalności tego białka (nm- M) w warunkach buforowanych. Obrazowanie AFM w buforze ma te przewagę nad obrazowaniem w powietrzu, że optymalnie odtwarza rozmiar i kształt cząsteczki uwodnionej oraz usuwa ryzyko zniekształcenia pomiarów wysokości ze względu na siły kapilarne. Pomiary AFM zostały wykonane metodą kontaktową na funkcjonalizowanej mice, przy użyciu dźwigni o najniższych dostępnych stałych siłowych i zachowaniu najsłabszej możliwej siły nacisku, za pomocą dwóch typów ostrz o promieniu krzywizny 2-3 nm i 20 nm, aby uniknąd możliwych artefaktów. Otrzymane wyniki były zgodne w zakresie 95% przedziału ufności. Ze zmierzonych eksperymentalnie pozornych wartości rozmiarów poziomych wyliczyłam parametry geometryczne cząsteczki PARN-u, biorąc po uwagę poszerzenie obrazu wynikające z rozmiarów ostrza. Analiza statystyczna gaussowskiego rozkładu parametrów geometrycznych pojedynczych cząsteczek wykazała, że molekuła pełnej długości PARN-u człowieka jest elipsoidą o wymiarach nm x nm x nm i objętości nm 3, co odpowiada składowi dimerycznemu. Dimeryczny skład cząsteczki PARN-u potwierdziłam w niezależnych eksperymentach w roztworze metodą dynamicznego rozpraszania światła (ang. Dynamic Light Scattering, DLS), z uwzględnieniem wpływu składników buforu na lepkośd i współczynnik załamania światła. Wyznaczona średnia wartośd średnicy hydrodynamicznej nm odpowiada masie molekularnej kda. W pracy tej pokazano również, że sama domena RRM występuje w formie dimeru. Podobne wyniki wskazujące na dimeryzację RRM otrzymaliśmy również w innych warunkach metodą sączenia molekularnego. 19

20 Podsumowując - obrazowanie PARN-u metodą AFM w warunkach buforowanych pokazało elipsoidalny kształt kompletnej cząsteczki tego białka i pozwoliło na wyznaczenie jej parametrów geometrycznych z dobrą dokładnością, dostarczając na poziomie mezoskopowym informację komplementarną do fragmentarycznych struktur krystalograficznych poszczególnych domen. Ostatnia seria zagadnieo związanych z biofizycznymi własnościami PARN-u została opisana w publikacji: H8. Niedzwiecka A*, Nilsson P, Worch R, Stepinski J, Darzynkiewicz E, Virtanen A. Molecular recognition of mrna 5 Cap by 3 poly(a)-specific ribonuclease (PARN) differs from interactions known for other cap-binding proteins, Biochimica et Biophysica Acta 2016; 1864(4): IF 5-letni / pkt MNiSW 30 Praca ta dotyczy mechanizmu molekularnego rozpoznawania struktury 7- metyloguanozyno kapu 5 mrna przez PARN człowieka. Za pomocą metod biofizyki molekularnej, tj. powierzchniowego rezonansu plazmonowego (ang. surface plasmon resonance, SPR), ilościowego równowagowego miareczkowania fluorescencyjnego i spektroskopii dichroizmu kołowego (ang. circular dichroism, CD) pokazaliśmy, że selektywnośd, sposób tworzenia kompleksu z kapem i źródło jego stabilności są inne niż dla pozostałych białek wiążących kap, w szczególności różne od własności eif4e opisanych w pracach H3,7., a wcześniej w M6,8,9,10. i D2,3,4. oraz charakterystyki oddziaływao CBC z analogami kapu przeanalizowanych w pracach H1. i H4., a także od powinowactwa snurportyny do hipermetylowanej struktury kooca 5 U snrna (prace D6. i D7.). Zaplanowane i przeanalizowane przeze mnie eksperymenty kinetyki oddziaływania PARN-u jako analitu w roztworze z analogiem kapu unieruchomionym na podłożu za pomocą SPR wykazały, że model zakładający dwuwartościowy analit (stechiometria 1:2) daje najlepsze dopasowanie do danych doświadczalnych. Wyniki te świadczą o tym, że oba miejsca wiążące dimeru PARN-u mogą jednocześnie związad cząsteczki kapu, a przesunięcia konformacyjne domen cząsteczki białka są również możliwe. Co więcej, po zastosowaniu odpowiedniej kalibracji wyznaczyłam wartości kinetycznych stałych asocjacji i dysocjacji również dla oddziaływania drugiego miejsca wiążącego. Ogólnie, oddziaływanie PARN-u z 7- monometyloguanozynokapem jest powolne, w zakresie niskich wartości kinetycznych stałych asocjacji typowych dla procesów kontrolowane jedynie dyfuzyjnie i bardzo niskich wartości kinetycznych stałych dysocjacji, typowych dla oddziaływao hydrofobowych. Wynikająca z nich efektywna energia swobodna Gibbsa daje dobrą stabilnośd kompleksu na poziomie ok. -8 kcal/mol. Oznacza to, że kompleks raz ustanowiony może trwad dłużej, niż w przypadku szybkiej kinetyki, np. dla eif4e, gdzie oddziaływania kulombowskie dają większy wkład. Kinetyczna stabilnośd kompleksu PARN-u z kapem 5 odpowiada funkcji biologicznej tego oddziaływania, które podnosi procesywnośd deadenylacji 3, czyli powinno właśnie zabezpieczad stabilniejszy kontakt z substratem. Wartości równowagowych stałych dysocjacji na poziomie mikromolarnym otrzymane przeze mnie na podstawie parametrów kinetycznych są zgodne z wynikami uzyskanymi w pracach H2. i H5. innymi metodami, tj. poprzez miareczkowanie fluorescencyjne i ITC. Wyniki dla pierwszego i drugiego miejsca PARN-u wiążącego kap różnią się ok. czterokrotnie, co może wyjaśniad występowanie w strukturze krystalograficznej dwóch cząsteczek kapu związanych silniej i słabiej przez różne konformery domeny RRM dimeru. Druga stała dysocjacji jest wyższa (ponad 3 ), więc mamy do czynienia z niewielką negatywną 20

21 kooperatywnością miejsc wiążących kap. To bardzo ciekawy wynik w kontekście funkcji biologicznej PARN-u, ponieważ w świetle wyników pracy H5., które pokazały przestrzenne i funkcjonalne nakrywanie się miejsc wiążących kap i poli(a) w obszarze domeny nukleazy, dla zapewnienia procesywnej deadenylacji mrna tylko jedno z miejsc wiążących kap powinno byd zaangażowane w kompleks z koocem 5, a drugie z koocem 3 poli(a), który jest substratem. Wyniki SPR zrodziły dwa pytania: (1) skoro kinetyka tworzenia i rozpadu kompleksu PARN-u z kapem jest powolna, to jaki jest wkład oddziaływao elektrostatycznych? (2) czy tak niewielkie w sensie energetycznym ( G ~ RT) różnice powinowactwa pomiędzy dwoma miejscami wiążącymi kap dimeru PARN-u można zweryfikowad inną metodą w roztworze? Wykonałam zatem serię badao oddziaływania PARN-kap w funkcji mocy jonowej, która wykazała, że równowagowe stałe dysocjacji są prawie jednakowe w całym zakresie mocy jonowej. Oznacza to, że efekt elektrostatycznego ekranowania oddziaływao przez jony soli jest słabe. Wyznaczony efektywny ładunek powierzchniowy białka odczuwany przez analog kapu, m 7 GpppG, jest prawie trzykrotnie mniejszy niż analogiczny ładunek na eif4e. Wyniki te pokazują zatem mniejszościowy udział oddziaływao elektrostatycznych, a dominujący efektów hydrofobowych w tworzeniu kompleksu PARN-u z kapem, w zgodności z powolną kinetyką asocjacji i dysocjacji wyznaczoną metodami SPR oraz z równowagowymi stałymi wiązania wyznaczonymi w pracy H5. dla serii mutantów punktowych. Poszukując drugorzędowych zmian konformacyjnych przeanalizowałam różnice pomiędzy widmami dichroizmu kołowego (far-uv CD) PARN-u w formie apo oraz w kompleksach z m 7 GTP i m 7 GpppG. W kompleksach z ligandami udział helis nieznacznie spada na korzyśd kartek (i pozostałych elementów strukturalnych). W świetle struktury krystalograficznej miejsca wiążącego kap, gdzie kluczowy Trp475 jest ulokowany właśnie na granicy -kartki i pętli, wskazuje to na stabilizację tych lokalnych struktur w kompleksie z kapem. Co ciekawe, białko to okazało się termodynamicznie bardzo stabilne, gdyż ulega ono denaturacji dopiero w stosunkowo wysokiej temperaturze ok. 60 C (332 K), co pokazałam analizując sigmoidalny wzrost sygnału CD. Biorąc pod uwagę wyznaczone mikrokalorymetrycznie parametry termodynamiczne oddziaływania z m 7 GpppG, w tej wysokiej temperaturze udział białka skompleksowanego z wynosił zaledwie ok. 14 % (i nieco mniej dla m 7 GTP), mimo, że proporcja użytych stężeo zapewniała w temperaturze 20 C stan bliski wysyceniu (96% i 92%), toteż charakterystyczne temperatury topnienia (denaturacji) nie różniły się dla poszczególnych form białka. Natomiast zmiany molowej entalpii i entropii tego procesu, wynikające z szerokości tego przejścia w funkcji temperatury, były zależne od stanu białka, wzrastając dla próbek białka będącego w równowadze z ligandami. Oszacowane na tej podstawie energie swobodne Gibbsa stabilizacji cząsteczek PARN-u w temperaturze 20 C (293 K) sugerują stabilizację białka przez związanie ligandu. Na podstawie otrzymanych wyników można stwierdzid, że oddziaływanie tego dimerycznego białka (zawierającego w sumie sześd domen globularnych) ze strukturą kooca 5 mrna sprawia, że przejście z formy natywnej do zdenaturowanej odbywa się w bardziej skoordynowany sposób. 21

22 Kwestia, która pozostała do wyjaśnienia, to funkcjonalnośd PARN-u względem naturalnie występujących w komórkach form kapu 5 mrna. Przeprowadzone przeze mnie pomiary oddziaływao z analogami posiadającymi dodatkowe podstawniki metylowe na grupie N 2 i O2 wykazały, że miejsce wiążące kap PARN-u akceptuje różne formy kooca 5, przy czym zasadniczym wymaganiem jest obecnośd grupy metylowej w pozycji N7 guanozyny, chociaż selektywnośd ta (~1:50) jest dużo słabsza, niż w przypadku eif4e (~1:2000). Ponownie, wyniki wskazujące na szersze spektrum akceptowanych ligandów PARN-u idą w parze z funkcją biologiczną oddziaływania PARN-u z kapem w procesie deadenylacji. Dokładne miareczkowania fluorescencyjne pozwoliły mi na sprawdzenie, czy w izotermach wiązania można znaleźd oznaki negatywnej kooperatywności widocznej w eksperymentach SPR. Do porównania ścisłego analitycznego modelu zakładającego jednakowe miejsca wiązania w obu monomerach PARN-u z półempirycznym modelem Hilla zastosowałam test F-Snedecora oraz kryterium informacyjne Akaikego. Przeprowadzone analizy wykazały, że dla 7-monometyloguanozynowych analogów kapu współczynnik Hilla statystycznie istotnie niższy od jedynki, co wskazuje na negatywną kooperatywnośd. PARN traci jednak tę własnośd po mutacji His449Ala, aminokwasu odpowiadającego kanonicznemu residuum na środku -kartki domeny RRM, wiążącemu kwasy nukleinowe w innych białkach, lecz nie biorącego udziału w bezpośrednim oddziaływaniu PARN-u z kapem. His449 służy zatem jako czynnik stabilizujący i może uczestniczyd w negatywnej kooperatywności domen. W publikacji tej wykazałam także metodami bioinformatycznymi, że w PARN-ie rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) istnieje domena RRM, w której Trp475 odpowiada His565. Było to wcześniej niejasne i rodziło dotąd wątpliwości, czy ten homolog roślinny można nazywad białkiem PARN. Podsumowując: wyniki badao przeprowadzonych w ramach tej pracy pokazały, że mechanizm molekularnego rozpoznawania kapu 5 przez PARN jest istotnie różny od oddziaływao obserwowanych dla innych białek wiążących kap. W szczególności: i) pomocnicza funkcja biologiczna wiązania 7-metyloguanozynokapu 5 przez enzym degradujący koniec 3 mrna jest osiągana/dokonuje się/ jest uzyskiwana/ poprzez negatywną kooperatywnośd pomiędzy podjednostkami dimeru PARN-u; ii) oddziaływania kulombowskie mają mniejszościowy wkład w tworzenie kompleksu; iii) PARN ma dośd uniwersalne powinowactwo do różnych form kapu. Te cechy przyczyniają się do stabilizacji kompleksu mrna z PARN-em, potrzebnej dla podniesienia procesywności deadenylacji. Badania te dostarczyły spójny biofizyczny opis wyjaśniający procesywny mechanizm deadenylacji 3 mrna przez PARN i stworzyły nowe ramy interpretacyjne do zrozumienia roli kapu 5 w degradacji mrna. Celem badao było zyskanie głębszego wglądu w mechanizm molekularny rozpoznawania kapu 5 mrna przez PARN. Uzyskane wyniki pokazują, że PARN jest przykładem minimalnego, koniecznego i wystarczającego warunku nadającego białku specyficznośd względem struktury kapu 5. PARN i eif4e przejawiają różne biofizyczne własności oddziaływania z kapem, które korelują z ich odrębnymi funkcjami w degradacji poli(a) mrna i inicjacji translacji. Precyzyjna regulacja inicjacji translacji przez eif4e w odpowiedzi na sygnały komórkowe wymaga szybkiej kinetyki asocjacji i dysocjacji z wysokim powinowactwem i selektywnością, co jest zapewnione przez większy udział oddziaływao elektrostatycznych, podwójny stacking 22

23 i konformacyjną elastycznośd. Natomiast PARN zapewnia długotrwały, stabilny lecz łatwo odwracalny kontakt z kapem 5 mrna za pośrednictwem umiarkowanego powinowactwa, niskiej selektywności i małego wkładu od efektów elektrostatycznych, co skutkuje powolna kinetyka asocjacji i dysocjacji. Niewielka negatywna kooperatywnośd względem oddziaływania z kapem przez dimer odzwierciedla współdziałanie podjednostek PARN-u podczas jednoczesnego wiązania do substratu poli(a) 3 i kooca 5, gdyż miejsca wiążące te ligandy w marach jednego monomeru częściowo się pokrywają. Mechanizm molekularny pokazany tutaj odzwierciedla zatem pomocniczą rolę biologiczną wiązania kapu 5 przez PARN, co przyczynia się do procesywności tego enzymu. W kontraście do charakterystyki oddziaływania kooca 5 mrna z deadenylazą PARN jawi się dynamika strukturalna i termodynamika tworzenia kompleksów z białkowym czynnikiem inicjującym translację, eif4e. Obiektami badawczymi były białka eif4e myszy, które w badanej części globularnej (28-217) jest identyczne z eif4e człowieka (za wyjątkiem Glu174Asp), drożdży i robaków pasożytniczych: nicienia glisty świoskiej (Ascaris suum) jako obiektu modelowego oraz niebezpiecznego chorobotwórczego pasożyta człowieka, przywry Schistosoma mansoni. Celem szczegółowym tych badao było zrozumienie biofizycznych podstaw selektywności tych ortologów eif4e do różnych form strukturalnych kooca 5 mrna. W pracy: H3. Rutkowska-Wlodarczyk I, Stepinski J, Dadlez M, Darzynkiewicz E, Stolarski R, Niedzwiecka A.* Structural changes of eif4e upon binding to the mrna 5' monomethylguanosine and trimethylguanosine cap. Biochemistry 2008; 47(9): IF / pkt MNiSW 25 / cyt. 15 zbadaliśmy zmiany konformacyjne białka ssaczego eif4e zachodzące podczas tworzenia kompleksu z formami MMG i TMG kapu 5' mrna. Z moich wcześniejszych prac termodynamicznych M9. i D2. wynikało, że struktura ssaczego eif4e charakteryzuje się znacznymi fluktuacjami dopóki nie jest związana ze specyficznym ligandem MMG, natomiast kompleksy z analogami kapu słabo oddziałującymi z tym białkiem, w szczególności TMG, wykazują wzrost ciepła właściwego przy stałym ciśnieniu, C p, co sugeruje większy udział oddziaływao z wodą w takich kompleksach. Był to systematyczny, lecz dośd nietypowy wynik, który domagał się weryfikacji niezależną metodą. W celu zbadania dostępności dla wody w różnych rejonach białka zaplanowałam badania metodą opartą o wymianę protonów amidowych białka na deuterony (ang. H/D exchange, HDX) w ciężkiej wodzie, z trawieniem białka na fragmenty pepsyną i detekcją stopnia deuteracji za pomocą spektrometrii mas z elektrorozpylaniem (ang. electrospray ionization mass spectrometry, ESI MS), we współpracy z prof. dr. hab. Michałem Dadlezem z IBB PAN. Przeprowadzone pod moim kierunkiem i przeanalizowane przeze mnie badania pokazały, że stosunkowo niewielkie zmiany grup funkcyjnych kapu (MMG vs. TMG) prowadza do istotnych konsekwencji konformacyjnych, destabilizujących strukturę ssaczego białka eif4e, co jest przyczyna jego obniżonego powinowactwa do TMG, a przez to do wyraźnej specyficzności wiązania MMG przez ssacze eif4e (kilkusetkrotna różnica stałych wiązania, M8.). eif4e w kompleksie z MMG jest w stanie inkorporowad mniej deuteronów i wolniej niż forma apo białka, natomiast łaocuch główny eif4e w kompleksie z TMG jest bardziej dostępny dla solwentu niż forma apo. Co więcej, w kompleksie eif4e z TMG pojawiają się dodatkowe miejsca cięcia pepsyny, co również sugeruje, że zachodzą zmiany konformacyjne prowadzące do fluktuacji struktury. 23

24 Pokazaliśmy również, że dostępnośd dla wody w kompleksie z MMG zmniejsza się najbardziej (najsilniejsze ekranowanie od solwentu) nie tylko w bezpośrednim kontakcie z analogiem kapu 5', ale także w środkowej β-nici i w miejscu znajdującym się po przeciwnej stronie cząsteczki, oddziałującym z innym czynnikiem inicjującym translację, eif4g, i białkami inhibującymi translację, 4E-BP. Odkryliśmy zatem ścieżkę konformacyjnego sprzężenia pomiędzy tymi dwoma miejscami oddziaływania eif4e z dwoma molekularnymi partnerami. Pozwoliło to zrozumied różnice pomiędzy znanymi strukturami krystalograficznymi eif4e w kompleksie z kapem i strukturą apo wyznaczoną metodami wielowymiarowego NMR. Na tej podstawie mogłam zaproponowad hipotezę, że przyczyna obniżonego powinowactwa eif4e do TMG jest związana również z dynamiką konformacyjną całej cząsteczki białka, a nie wynika z samego tylko faktu, że niemożliwe jest utworzenie jednego z układu trzech wiązao wodorowych pomiędzy metylowaną zasadą kapu a grupą karboksylową Glu103. Hipoteza konformacyjnych przyczyn selektywności (białka ssacze) lub braku selektywności (białka S. mansoni i glisty świoskiej) względem TMG kapu znalazła potwierdzenie w dwóch innych pracach (D3,4.) dotyczących ortologów eif4e z organizmów robaków pasożytniczych. Oddziaływanie eif4e ze struktura kapu 5 mrna nie ogranicza się do rozpoznawania 7- metyloguanozyny przez szczelinę wiążącą kap, lecz obejmuje również przyciąganie elektrostatyczne pomiędzy ujemnie naładowanym łaocuchem trifosforanowym kapu a grupami bocznymi aminokwasów zasadowych białka u wlotu do tej szczeliny. Kolejnym krokiem było zbadanie, jak termodynamika oddziaływania kapu z białkiem eif4e drożdży, czyli eukariotycznego organizmu modelowego ewolucyjnie odległego od człowieka, różni się od eif4e ssaczego: H6. Kiraga-Motoszko K, Niedzwiecka A*, Modrak-Wojcik A, Stepinski J, Darzynkiewicz E, Stolarski R. Thermodynamics of molecular recognition of mrna 5' cap by yeast eukaryotic initiation factor 4E. J Phys Chem B. 2011; 115(27): IF / pkt MNiSW 30 / cyt. 1 W pracy tej wykorzystaliśmy analizę van t Hoffa stałych wiązania wyznaczonych metodą miareczkowania fluorescencyjnego oraz izotermiczne miareczkowania mikrokalorymetryczne. Obie metody dostarczyły spójny opis termodynamiczny procesu tworzenia kompleksu eif4e drożdży z serią chemicznych analogów kapu 5 mrna w roztworze. Wykonane przez doktorantkę pod moim kierunkiem pomiary pozwoliły mi wyznaczyd równowagowe stałe asocjacji oraz parametry termodynamiczne, które ujawniły podobieostwa i różnice pomiędzy eif4e drożdży i myszy/człowieka. Tworzenie kompleksu jest korzystne entalpowo i pociąga za sobą koszt entropowy dla każdego analogu kapu w 293 K. Nietrywialna kompensacja entalpowo-entropowa została znaleziona, podobnie jak w przypadku białka myszy (D2.). Dla analogu o niskim powinowactwie, m 7 GMP, stwierdzono dodatnią zmianę pojemności cieplnej, podobnie jak wcześniej dla białka ssaczego (M9. i D2.). Analiza termodynamiczna oddziaływao eif4e drożdży z analogami kapu 5 mrna wykonana za pomocą ITC i metody van t Hoffa wykazała elektrostatyczny mechanizm wzmocnienia powinowactwa dla białek ssaczych w porównaniu z drożdżowymi. Nietrywialna kompensacja entalpowo-entropowa wykazała, że ogólne zmiany konformacyjne są podobne jak w białku eif4e ssaczym. Natomiast oddziaływania kulombowskie pomiędzy mostkiem trójfosforanowym kapu i zasadowymi aminokwasami grup bocznych w miejscu wiążącym kap eif4e drożdży okazały się znacznie słabsze niż u ssaków. Pomimo zakonserwowanej 24

25 pozycji aminokwasów zasadowych w sekwencji eif4e, w trakcie ewolucji te grupy boczne uległy przemieszczeniu w strukturze trójwymiarowej w taki sposób, że w eif4e ssaczych tworzą zwartą powierzchnię, dzięki czemu ładunek dodatni nie jest rozproszony jak u drożdży i oddziaływania z łaocuchem fosforanowym znacznie silniej stabilizują kap w kompleksie. Różnice w przestrzennej stabilizacji łaocucha fosforanowego pokazałam porównując względne (względem średniej dla atomów pierścienia m 7 G) średnie przemieszczenie kwadratowe, u 2, policzone z czynników temperaturowych struktury krystalograficznej dla poszczególnych atomów rybozy i fosforanów kapu w kompleksie z białkiem myszy z ich względnym średnim standardowym odchyleniem kwadratowym, SD 2, dla atomów kapu w kompleksie z białkiem drożdży, na podstawie 20 struktur NMR. Na tle głównie elektrostatycznego mechanizmu molekularnego rozpoznawania kapu przez eif4e z nieistotnym udziałem pierwszego transkrybowanego nukleozydu (prace H3,6., D1-4,9., M6,8,10,12-14,16-18.) oraz głownie niekulombowskiego oddziaływania z istotnym udziałem tego nukleozydu dla PARN-u (prace H2,5,7,8.), zupełnie odmienny obraz rysuje się dla oddziaływania 7-monometyloguanozyno kapu 5 mrna (lub pre-mrna) z jądrowym heterodimerycznym kompleksem wiążącym kap, CBC. Kap jest dodawany do pre-mrna kotranskrypcyjnie i służy na tym etapie m. in. do rekrutacji białka CBC, które bierze udział w splicingu oraz eksporcie dojrzałych transkryptów mrna i U snrna z jądra do cytoplazmy. Przypuszcza się, że może byd ono zaangażowane w tzw. pierwszą rundę translacji i usuwanie mrna zawierających przedwczesny kodon STOP (ang. nonsense-mediated decay, NMD). H1. Worch R, Niedzwiecka A, Stepinski J, Mazza C, Jankowska-Anyszka M, Darzynkiewicz E, Cusack S, Stolarski R. Specificity of recognition of mrna 5' cap by human nuclear capbinding complex. RNA. 2005; 11(9): IF / pkt MNiSW 35 / cyt. 36 Celem tej pracy było znalezienie krytycznych wymogów CBC względem struktury i grup funkcyjnych kapu. Heterodimeryczny jądrowy kompleks wiążący kap (CBC) wiąże MMG kap eukariotycznych transkryptów polimerazy II, takich jak mrna i U snrna. W pracy tej analizujemy za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej rozpoznawanie kapu przez CBC człowieka. Wyznaczone przez magistranta pod moim kierunkiem stałe asocjacji kilkunastu analogów kapu oraz oligomeru m 7 GpppA m2 pu m2 pa m2 pokrywają zakres M -1. Wyższe powinowactwo do CBC jest widoczne dla dinukleotydów w porównaniu z mononukleotydami, a zwłaszcza dla tych zawierających zasadę purynową w pierwszym transkrybowanym nukleozydzie. Tetramer asocjuje z CBC tak samo silnie jak dinukleotydowe analogi. Mutacja Tyr138Ala w podjednostce CBP20 redukuje powinowactwo do analogów kapu, ale nie mononukleotydowych, w zgodności ze struktura krystalograficzną, gdzie druga zasada kapu oddziałuje warstwowo z Tyr 138. Nasze badania spektroskopowe i analiza energii swobodnych Gibbsa pokazały, że w przeciwieostwie do innych białek wiążących kap oba nukleotydy kapu są niezbywalne dla specyficznego rozpoznawania przez CBC. Mononukleotydowe analogi TMG kapu maja stała asocjacji tylko dwa razy niższą niż MMG kap, podczas gdy na poziomie dinukleotydów różnica ta jest ok. 80-krotna, co wskazuje, że drugi nukleotyd kapu (pierwszy transkrybowany nukleotyd mrna) zapewnia odpowiednia akomodację ligandu w kompleksie. Porównanie sposobów wiązania kapu przez CBC i eif4e może mied ważne biologiczne konsekwencje dla zrozumienia wymiany CBC na kompleks translacyjny eif4f na koocu 5 mrna. Powinowactwo CBC do dinukleotydowych analogów kapu i do tetranukleotydu jest dużo silniejsze niż eif4e. Podczas wymiany CBC na eif4e na koocu 5 mrna, transfer ten zachodzi zatem pozornie od mocniej do słabiej wiążącego białka. Ten proces byłby możliwy 25

26 do zrealizowania w obecności eif4g, które oddziałuje specyficznie z CBC i z eif4e (jest największym składnikiem kompleksu eif4f). Na podstawie uzyskanych wyników dzięki mojej interpretacji postawiliśmy hipotezę, że przejściowe oddziaływanie trzech białek eif4e eif4g CBP80 mogłoby obniżad powinowactwo CBC do kapu. Z drugiej strony wiadomo, że oddziaływanie eif4e z eif4g podnosi powinowactwo eif4e do kapu (44). W ten sposób modulacja zdolności obu białek do wiązania kapu przez eif4g mogłaby ułatwiad zastępowanie CBC przez eif4e. Dla uzupełnienia opisu tego oddziaływania przeprowadzono badania kinetyczne i równowagowe dla alaninowych i fenyloalaninowych mutantów trzech tyrozyn: Tyr20, Tyr43 i Tyr138 odpowiedzialnych za stabilizację nukleotydów kapu w kompleksie. Wyniki tych badao opisano w pracy: H4. Worch R, Jankowska-Anyszka M, Niedzwiecka A, Stepinski J, Mazza C, Darzynkiewicz E, Cusack S, Stolarski R. Diverse role of three tyrosines in binding of the RNA 5' cap to the human nuclear cap binding complex. J Mol Biol. 2009; 385(2): IF / pkt MNiSW 30 / cyt. 11 Zarówno z równowagowych pomiarów fluorescencyjnych, jak i z kinetycznych pomiarów metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR), wynika, że najważniejszą rolę w tworzenia kompleksu odgrywa Tyr20, która oddziałuje z kapem kooperatywnie z Tyr43. natomiast Tyr138 nie wpływa na kinetykę tworzenia kompleksu, lecz go stabilizuje zapobiegając jego rozpadowi, razem z Tyr43. Proces tworzenia stabilnego kompleksu jest wiec wyraźnie dwuetapowy, gdzie pierwszy krok można przypisad utworzeniu kanapkowego układu m7g pomiędzy Tyr20 i Tyr43, a drugi ustabilizowaniem pierwszego transkrybowanego nukleozydu przez Tyr138. Wyniki te wyjaśniły, że u podłoża tego, że równowagowe stałe asocjacji z kapem dla CBC są o dwa rzędy wielkości wyższe niż dla eif4e, leży całkowicie odmienna kinetyka: o cztery rzędy wielkości wolniejsza kinetyka dysocjacji, mimo iż kinetyka asocjacji eif4e pochodząca od odziaływao elektrostatycznych jest szybsza. Również kinetyka wewnętrznego przekształcenia kompleksu spotkaniowego (drugi etap asocjacji) jest dużo wolniejsza dla dużego heterodimeru CBC niż dla małego monomeru eif4e. W sumie, kompleks z CBC jest stabilizowany z dużo bardziej ujemną energią swobodną Gibbsa, co oznacza, że usunięcie CBC z kooca 5 mrna na rzecz eif4e wymaga aktywnego procesu, np. z udziałem eif4g jako najbardziej prawdopodobnego partnera molekularnego eif4e Podsumowanie Najważniejszymi osiągnięciami wynikającymi z moich badao przeprowadzonych w ramach jednotematycznej serii prac są rezultaty, które umożliwiają analizę porównawczą trzech eukariotycznych białek, dla których aktywności istotne jest rozpoznanie molekularne i utworzenie odpowiedniego kompleksu z koocem 5 mrna na etapie inicjacji translacji lub degradacji mrna. Otrzymane wyniki, ich biofizyczne interpretacje i zaproponowane na ich podstawie mechanizmy oddziaływania molekularnego pokazały, że: selektywnośd oddziaływania ssaczego białka eif4e z 7-monometyloguanozyno (MMG) kapem względem 2,2,7-trimetyloguanozyno (TMG) kapu 5 mrna wynika nie tylko z obecności lub braku konkretnej grupy funkcyjnej, lecz jest również mocno związana 26

27 z dynamiką zmian konformacyjnych białka, wpływającą na zmiany hydratacji i stabilnośd kompleksu (H3.); wyższe powinowactwo eif4e ssaków niż drożdży do 5 kooca mrna wynika ze składowej elektrostatycznej, gdyż przy zachowaniu tych samych pozycji aminokwasów zasadowych w sekwencji, ich bardziej skupione ułożenie przestrzenne pozwala na efektywniejsze oddziaływania kulombowskie z ujemnie naładowanym trójfosforanowym łaocuchem 5-5 kapu (H6.); w odróżnieniu od eif4e, gdzie znaczenie ma głównie obecnośd podstawnika na N7 guanozyny oraz ładunek ujemny grup fosforanowych, dla oddziaływania CBC z kapem ważny jest kooperatywny wkład od pierwszego transkrybowanego nukleozydu (H1.); skutkiem tego tworzenie i rozpad kompleksu CBC-kap są powolniejsze, ale kompleks ten jest wypadkowo dużo bardziej stabilny niż z eif4e (H4.). Adekwatnym kompleksem porównawczym dla heterodimeru CBC (CBP20/CBP80) w oddziaływaniu z kapem 5 mrna byłby raczej kompleks eif4e/eif4g; PARN, będąc enzymem aktywnym względem kooca 3 mrna, oddziałuje również bezpośrednio z kapem 5 mrna z mikromolarnym powinowactwem (H2.); oddziaływanie to zachodzi poprzez domenę RRM w nietypowy sposób, gdzie kluczowym aminokwasem jest tylko jedno residuum aromatyczne, Trp475, na zewnątrz tej domeny (H2.,H5.); PARN wiąże różne naturalne formy kapu; obie podjednostki dimeru PARN-u są w stanie związad MMG kap z słabą negatywną kooperatywnością; kinetyka tworzenia i rozpadu kompleksu jest powolna, co wynika ze niewielkiego wkładu oddziaływao elektrostatycznych (H8.); dimer pełnej długości PARN-u człowieka, zawierający w każdym monomerze po trzy domeny globularne oraz C-koniec, tworzy elipsoidę o wymiarach ~11x7.5x4.5 nm (H7.) Najciekawszym wnioskiem sumarycznym wynikającym z analizy biofizycznej jest obserwacja dotycząca funkcji biologicznej badanych białek. Ta sama struktura kapu 5 mrna oddziałuje z każdym z tych białek w zupełnie inny sposób - pod względem kinetyki oraz istotnych wkładów energetycznych stabilizujących kompleks i charakterystyka ta ściśle odpowiada funkcji biologicznej danego białka, a mianowicie: elastycznośd konformacyjna eif4e oraz szybka równowaga tworzenia i rozpadu kompleksu z koocem 5 mrna zapewniona przez oddziaływania elektrostatyczne są konieczne dla zapewnienia szybkiej odpowiedzi komórkowej na bodźce (regulacja inicjacji translacji); wysokie powinowactwo zapewnione dzięki utrudnionej dysocjacji CBC z kooca 5 jest konieczne dla skutecznego eksportu mrna do cytoplazmy i zainicjowania prawdopodobnej pierwszej rundy translacji; umiarkowane powinowactwo wynikające z powolnej kinetyki asocjacji kapu 5 z PARNem odpowiada pomocniczemu charakterowi tego oddziaływania dla funkcji biologicznej tego enzymu, dla której związanie kapu nie jest warunkiem koniecznym; z kolei powolna dysocjacja sprawia, że kompleks raz powstały może długo trwad przed 27

28 rozpadem, co ma sens w kontekście podniesienia procesywności deadenylacji przeprowadzanej przez PARN. W celu lepszego zobrazowania tych kontrastów, przybliżone charakterystyczne wartości wybranych stałych oddziaływania analogów kapu 5 mrna z białkami eif4e, CBC i PARN przedstawiono w Tabeli 2. Tabela 2. Charakterystyczne stałe dla oddziaływao białek eif4e, CBC i PARN z kapem 5 mrna eif4e CBC PARN Równowagowa stała asocjacji z miareczkowao fluorescencyjnych mononukleotyd K as *µm -1 ] 110 a 30 c 0.6 e dinukleotyd K as *µm -1 ] 7 a 250 c 1.1 e Kinetyczne stałe asocjacji i dysocjacji dla dinukleotydu (indeks 1 - kompleks spotkaniowy; 2 - zmiany konformacyjne) k 1 [M -1 s -1 ] b d f k -1 [s -1 ] b d f k 2 [s -1 ] b d - k -2 [s -1 ] 6 b d - Równowagowa stała asocjacji z pomiarów kinetycznych K as *µm -1 ] ~10 b 340 d 2 i 0.5 f wyniki z prac: a M8.; b M6.; c H1.; d H4.; e H2.; f H8. 6. Omówienie pozostałych osiągnięd naukowo - badawczych Pozostała działalnośd naukowa Moją ścieżkę naukową można podzielid na dwa etapy. (1) Przed uzyskaniem stopnia doktora początkowo prowadziłam badania własności fizykochemicznych małych, biologicznie aktywnych cząsteczek chemicznych (publikacje M1-4.). Badania takie są wciąż aktualnym nurtem biofizyki molekularnej związanym ściśle z selekcją związków spełniających kryteria podnoszące szanse praktycznego zastosowania w procesie projektowania leków. Pierwszą moją samodzielną pracą naukową wykonywaną w roku 1993/94 w ramach pracy magisterskiej na zakooczenie 5,5-letnich studiów była analiza równowag tautomerycznych, kwasowo-zasadowych i konformacyjnych metylowanych pochodnych N 4 -hydroksycytozyny (promutagenu indukującego mutacje punktowe w kwasach nukleinowych) metodami spektroskopii absorpcyjnej w bliskim UV oraz 1 H i 13 C NMR (M1.). W trakcie tych badao odkryłam, że w niektórych z tych analogów występuje podwójny proces jonizacji, czego wcześniej nie podejrzewano w literaturze. Okazało się również, że równowaga konformacyjna tych związków jest procesem 28

29 termodynamicznie sprzężonym z ich autoasocjacją (M1.). Ciekawe własności spektralne i konformacyjne wynikające z rozkładu ładunku zmienionego przez obecnośd mniej elektroujemnych atomów siarki miały 5'-S-tiosiarczany nukleozydów (tzw. sole Buntego) - grupa związków o własnościach antybiotykowych, będących inhibitorami niektórych enzymów (M4.). Wyznaczałam także szereg własności fizykochemicznych innych związków niskocząsteczkowych, takich jak dimer ftalimidu (M2.) i pochodna izatyny (M3.). (2) Poszukując tematyki, która złożyłaby się w ciąg wyników umożliwiających spójną interpretację mechanizmów oddziaływao międzycząsteczkowych, w 1998 r. podjęłam systematyczne badania nad poznaniem biofizycznych podstaw rozpoznawania kooca 5 mrna przez białkowy czynnik inicjujący translację eif4e (publikacje M6-18.), zapoczątkowane w Polsce przez prof. dr. hab. Edwarda Darżynkiewicza, dysponującego już wtedy pokaźnym zbiorem wariantów chemicznie modyfikowanych analogów kapu. Badania docelowe białka były poprzedzone pracami przyczynkarskimi na układach modelowych (prace M11,15). Po uzyskaniu stopnia doktora, poza zagadnieniami opisanymi w poprzedniej części, kontynuowałam badania nad własnościami izoform eif4e z różnych organizmów i nad nowymi analogami kapu (D1-5,8,9,12.), rozszerzając tematykę o inne białka wiążące kap, np. snurportynę (D6,7,14.), oraz w kierunku projektowania i charakterystyki sond molekularnych (D13.). Ze względu na to, że stosowane tradycyjnie w literaturze podejście metodologiczne w przypadku układu eif4e-analog kapu nie dawało satysfakcjonujących rezultatów (M5.), opracowałam własną nową, precyzyjną metodę zsynchronizowanego pomiaru fluorescencji, która uwzględniała explicite wszystkie zaniedbywane wcześniej, współistniejące procesy molekularne (np. dezaktywację białka) i zjawiska spektralne (np. emisja pochodząca od cząsteczek swobodnego ligandu o wzrastającym stężeniu) w postaci analitycznej. Takie podejście metodologiczne pozwala na wiarygodne i powtarzalne wyznaczanie równowagowych stałych asocjacji z krzywych miareczkowania otrzymywanych z pomiarów wygaszania wewnętrznej fluorescencji białkowej pod wpływem oddziaływania z ligandem, z dobrocią dopasowania dochodzącą do R 2 ~ Dzięki temu z krzywych miareczkowania można wyznaczad stężenie aktywnego białka nieenzymatycznego w badanej próbce i/lub stechiometrię kompleksów, jeśli stała asocjacji jest równa lub wyższa 10 6 M -1. Opracowana przeze mnie metoda została zastosowana w rozmaitych wariantach w pracach M6-10,12-14,17,18., D1-7,9-11,14. i H1,2,4-6,8., jak również w kilkudziesięciu innych publikacjach grup prof. E. Darżynkiewicza i dr. hab. J. Jemielitego z ISI WoS, które były cytowane w sumie ok razy, w szczególności w pracach omawiających własności nowych analogów kapu do zastosowao biotechnologicznych (np. D1.). Po przeprowadzeniu symulacji teoretycznych i krytycznych uzupełnieniach, to podejście metodologiczne zostało opublikowane w szczegółach w późniejszej pracy w Methods in Enzymology (D8.). Dysponując odpowiednim narzędziem pomiarowym wykazałam (praca M8.), że w warunkach roztworu: (1) charakterystyczna stała asocjacji eif4e koocem 5' mrna jest o trzy rzędy wielkości wyższa, niż podawana dotąd w literaturze, ta wyższa wartośd jest zgodna z wynikami biologicznymi oraz z wysoką zdolnością rozdzielczą struktury krystalograficznej eif4e w miejscu związania 7-metyloguanozyny; (2) dotychczasowa rozbieżnośd wyników pomiędzy różnymi zespołami miała swoje źródło m. in. w obecności śladowych ilości analogu kapu używanego w procesie oczyszczania; 29

30 (3) dla szeregu analogów kapu o różnych grupach funkcyjnych stałe asocjacji obejmują zakres sześciu rzędów wielkości oraz istnieje korelacja (r 2 ~ 0.8) pomiędzy stałymi asocjacji z eif4e a stałymi inhibicji w układzie translacyjnym in vitro; (4) eif4e wiąże kationową formę kapu; (5) niemetylowane analogi kapu oddziałują z eif4e tylko poprzez łaocuch fosforanowy; (6) warunkiem koniecznym utworzenia trzech wiązao wodorowych z udziałem m 7 G jest stabilizacja układu trójwarstwowego Trp/m 7 G/Trp dzięki oddziaływaniu kation-π, silniejszemu niż zwykły stacking -, gdyż każdy podstawnik w pozycji 7., wprowadzający ładunek dodatni, zapewnia skokowy wzrost powinowactwa do eif4e; w ten sposób wyjaśniona została biologiczna rola metylacji N7 guanozyny (struktura krystalograficzna dopuszcza utworzenie identycznego układu niekowalencyjnych wiązao międzycząsteczkowych dla G i m 7 G, natomiast testy biologiczne wykazują silną dyskryminację na rzecz m 7 G); (7) utworzeniu kompleksu eif4e z kapem 5' mrna towarzyszą zmiany konformacyjne i pobranie kilkudziesięciu cząsteczek wody do pierwszej warstwy hydratacyjnej; (8) oddziaływanie eif4e z mononukleotydowym analogiem kapu, m 7 GTP, jest sterowane entalpowo. (9) Pokazałam też, że oddziaływanie to ma wybitnie elektrostatyczny charakter (M8,13.), w zgodności ze stosunkowo wysokimi kinetycznymi stałymi asocjacji i dysocjacji w dwustopniowym procesie tworzenia kompleksu (M6.), którego parametry można było otrzymad dzięki wyznaczeniu aktualnego stężenia białka aktywnego w każdej mierzonej próbce indywidualnie, wspominaną wyżej metodą (D8). Dalszą konsekwencją elektrostatycznego charakteru oddziaływania eif4e z kapem jest jego osłabienie w przypadku fosforylacji białka na Ser209 (M10.). Jednocześnie z badaniami nad oddziaływaniami różnorodnych analogów kapu 5 mrna z białkiem eif4e wprowadziłam w Polsce we współpracy z grupami prof. Nahuma Sonenberga, prof. Stephena K. Burley a i z dr Aleksandrą Wysłouch-Cieszyoską z IBB PAN (synteza peptydów) nową tematykę badawczą dotyczącą regulacji aktywności tego białka przez centralny składnik kompleksu eif4f inicjującego translację, białko eif4g (eukaryotic initiation factor 4G), oraz przez inhibitor translacji, 4E-BP1 (eif4e-binding protein 1). Owocem tej współpracy była m. in. praca M7., fragment M8., publikacja D9. oraz szereg doniesieo konferencyjnych. Najważniejszym rezultatem tych badao było wykazanie za pomocą precyzyjnych miareczkowao fluorescencyjnych (D8.), że pojedynczo (P-Ser65) i podwójnie (P-Ser65/Thr70) ufosforylowany peptyd 4E-BP1 odpowiadający miejscu wiążącemu eif4e zachowuje wciąż stosunkowo wysokie, mikromolarne powinowactwo do eif4e. Było to potwierdzenie na poziomie molekularnym in vitro wyników biologicznych, wskazujących na to, że dopiero czterokrotna, zachodząca w określonej kolejności (Thr37/Thr46, Thr70, Ser65) fosforylacja 4E-BP1 doprowadza do jego dysocjacji z eif4e, umożliwiając w ten sposób inicjację translacji zależną od kapu. Wyniki te zostały opublikowane w Genes & Development (M7., była to pierwsza praca z polską afiliacją w tym czasopiśmie, IF ). Innymi ważnymi obserwacjami wynikającymi z tych badao było ustalenie, że: (1) na poziomie peptydów obejmujących miejsce wiązania eif4e powinowactwo nieufosforylowanego 4E-BP1 jest zbliżone do eif4g oraz: 30

31 (2) do wyraźnego podniesienia powinowactwa eif4e do kapu w kompleksie z eif4gi lub eif4gii są potrzebne pozostałe domeny 4G, gdyż w kompleksach z peptydami kooperatywnośd pomiędzy tymi miejscami wiążącymi jest słabo zaznaczona: stała asocjacji dla oddziaływania z kapem wzrasta zaledwie o 20-40% (M8.). Badania te są w obecnej chwili rozwijane w kierunku oddziaływao eif4e z białkami 4E- BP pełnej długości (D5.). Poszukując dalej pełnego opisu oddziaływao analogów kapu 5 mrna z eif4e w kontekście potencjalnych zastosowao terapeutycznych przeprowadziłam analizę termodynamiczną dla wybranego analogu za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkującej (M9.) oraz dla serii analogów kapu metodą van t Hoffa (D2.), w celu weryfikacji wyników w komplementarnych podejściach eksperymentalnych. Wyznaczyłam zależne od temperatury entropowe i entalpowe wkłady do energii swobodnej Gibbsa dla oddziaływao eif4e z analogami kapu. Badania te pokazały w pierwszym rzędzie entalpowy charakter tych oddziaływao. Jednocześnie ujawniły złożony ich obraz, gdyż bazują one na przyciąganiu elektrostatycznym i kooperatywnym utworzeniu trójwarstwowego układu pierścieniowego wraz z trzema wiązaniami wodorowymi, czemu towarzyszą procesy termodynamicznie sprzężone, takie jak zmiany konformacyjne eif4e, zmiany konformacyjne kapu (konieczne zerwanie self-stackingu w związkach dinukleotydowych), protonacja kapu i zmiany hydratacji powstającego kompleksu, a także uwolnienie kationu monowalencyjnego neutralizującego łaocuch fosforanowy w roztworze (M8.). Wszystkie te procesy mają swoje odbicie w parametrach termodynamicznych (M9, D2.). Wyniki uzyskane z nieliniowej analizy van t Hoffa wykazały, że skutkiem niezerowej, dodatniej wartości zmiany pojemności cieplnej przy stałym ciśnieniu ( C p ) dla naturalnych dinukleotydowych analogów kapu w temperaturze fizjologicznej (37 C) oddziaływanie to jest jednocześnie korzystne entalpowo i entropowo, w odróżnieniu od temperatur typowo eksperymentalnych (20 C), dla których w większości przypadków zmiany standardowej molowej entropii były ujemne. Zwróciłam również uwagę na obiecujący związek p-cl-bz7gtp, który spełnia liniowe równanie van t Hoffa z dodatnią zmianą entropii na skutek wypchnięcia do roztworu przez duży podstawnik na N7 zakonserwowanej sieci cząsteczek wody strukturalnej uwięzionych w kieszeni wiążącej 7-metyloguanozynę (D2.). Przewidywania te zostały wkrótce potwierdzone przez struktury krystalograficzne eif4e z bz 7 GMP i p-f-bz 7 GMP (45). Badania termodynamiczne ujawniły również istnienie nietrywialnej kompensacji entalpowo-entropowej w serii kongenerów kapu, która umożliwiła interpretację parametrów termodynamicznych w języku fizyki statystycznej, wskazując na dużą różnicę pomiędzy średnią energią wewnętrzną mikrostanów konformacyjnych eif4e, a energią tego mikrostanu, który odpowiada stanowi związanemu z kapem (D2.). Rozwiązana później metodami NMR struktura białka apo-eif4e potwierdziła duże fluktuacje pętli zawierających tryptofany, a zwłaszcza Trp102 (46). Innym przejawem zmian konformacyjnych eif4e jest deagregacja krótszej formy tego białka (33-217) pod wpływem tworzenia specyficznych kompleksów z 7-podstawionymi analogami kapu, podczas gdy forma apo tego białka pozostaje całkowicie zagregowana, co stwierdziłam za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (D9,12.). Jedną z poważniejszych kontrowersji towarzyszących opisowi własności eif4e jest selektywnośd izoform eif4e człowieka oraz robaków pasożytniczych względem 7- monometyloguanozyno- (MMG) i 2,2,7-trimetyloguanozynokapu (TMG) w kontekście potencjalnego projektowania leków przeciwpasożytniczych. W organizmach robaków istotna 31

32 częśd populacji mrna posiada TMG kap na skutek składania genów w procesie typu trans (ang. trans-splicing). Zainteresowanie białkiem eif4e chorobotwórczego płazioca, przywry Schistosoma mansoni wywodzi się stąd, że z powodu zakażeo tym pasożytem cierpi ok. dwieście milionów osób, u których często rozwijają się śmiertelne powikłania nowotworowe. W organizmie tym występuje tylko jedna forma eif4e, która zatem mogłaby byd celem terapeutycznym, pod warunkiem znalezienia specyfiku działającego selektywnie na białko przywry. Konieczne było scharakteryzowanie oddziaływania tego białka z obiema formami kapu 5 mrna (MMG i TMG) w kontekście znanej już (M8.) silnej, kilkusetkrotnej różnicy powinowactwa ssaczego eif4e do MMG i TMG. W pracy D3. pokazaliśmy, że w jakościowych eksperymentach biochemicznych białko eif4e S. mansoni wiąże obie formy kapu. Ilościowe pomiary metodami miareczkowania fluorescencyjnego (D8.) wykazały, że różnica stałych dysocjacji jest ok. pięciokrotna, czyli stosunkowo niewielka w porównaniu z selektywnością białka ssaczego, przy czym powinowactwo eif4e S. mansoni do TMG kapu jest zbliżone do białka ssaczego. Rozwiązane w tej pracy dwie struktury krystalograficzne z m 7 GpppG i m 7 GpppA okazały się identyczne - a tylko położenie luźno związanego pierwszego transkrybowanego nukleozydu jest inne (w pobliżu pętli S1-S2) niż w kompleksach z białkiem ssaczym (w pobliżu pętli S7-S8). Zmiany przesunięd chemicznych NMR wykazały, że położenie bardzo wielu aminokwasów jest inaczej zaburzane w kompleksie z m 7 GpppG niż z m 3 2,2,7 GpppG, przy czym kilka residuów o znacznych różnicach znajduje się w rejonach odległych od kieszeni wiążącej kap wskazując na długozasięgowe zmiany konformacyjne. Praca ta potwierdziła wnioski z pracy H3., że giętkośd konformacyjna białka może byd głównym czynnikiem, który umożliwia izoformom eif4e płazioców wiązanie obu form kapu. Ze względu na to, że uzyskanie struktury krystalograficznej z eif4e S. mansoni okazało się niemożliwe, kontynuacją tego wątku była praca D4., rozwiązująca pierwszą strukturę krystalograficzną z udziałem TMG kapu w kompleksie z eif4e z modelowego nicienia, glisty świoskiej (Ascaris suum), który wcześniej zidentyfikowano jako zdolny do oddziaływania z obiema formami kapu (MMG i TMG) (47). Struktura krystalograficzna i wyniki NMR pokazały, że odziaływanie z TMG kapem jest podobne do MMG, a jedyną wyraźną różnicą w miejscu wiążącym jest brak jednego wiązania wodorowego między N 2 guaniny a grupą karboksylową Glu116 (odp. Glu103 w białku ssaczym), natomiast oddziaływania z różnymi formami kapu prowadzą do innych zmian konformacyjnych. Stałe dysocjacji wyznaczone dla eif4e S. mansoni (D3.) i A. suum (D4.) pokazały, że selektywnośd eif4e ssaków wynika z podwyższonego powinowactwa do formy monometylowanej kapu, podczas gdy oddziaływania z formą trimetylowaną pozostają dla wszystkich trzech organizmów na zbliżonym, niskim poziomie. Te publikacje rozwiały wątpliowości dotyczące rzekomego wysokiego powinowactwa eif4e robaków do hipermtylowanej formy kapu. Owszem, ich powinowactwo do TMG jest zbliżone do MMG, lecz jest jednakowo niskie, a nie wysokie, na poziomie stałej asocjacji ssaczego eif4e do TMG (M8.). Zupełnie innym białkiem oddziałującym wybiórczo z TMG kapem - ale nie kapem mrna lecz bogatych w urydynę małych jądrowych RNA (ang. uridine-rich small nuclear RNA, U snrna) - jest snurportyna (31), zaangażowana w import dojądrowy spliceosomalnych U snrnp. Cechą wyróżniającą snurportynę spośród innych białek oddziałujących z kapem jest wymóg warstwowego ułożenia pierścieni 2,2,7-trimetyloguanozyny i zasady pierwszego transkrybowanego nukleozydu (self-stacking) (Rys. 5.). Ideą tego nowego kierunku badao jest znalezienie niehydrolizowalnych analogów TMG kapu o możliwie najwyższym powinowactwie do snurportyny, w celu ich syntetycznego 32

33 włączenia w potencjalne terapeutyczne snrna, niwelujące brak odpowiednich czynników białkowych koniecznych do poprawnego składania genów w niektórych chorobach genetycznych. Badania licznych analogów TMG kapu wykazały odpornośd na degradację enzymatyczną i niewielkie podniesienie powinowactwa dla niektórych z analogów modyfikowanych w łaocuchu trifosforanowym kapu (D6,14.). Natomiast seria badao z użyciem chemicznych analogów TMG kapu ze zmienionymi podstawnikami egzocyklicznej grupy aminowej N2 ujawniła wyjątkową selektywnośd tego białka względem obecności wyłącznie dwóch grup metylowych przy N2 (D7.). Jakakolwiek zmiana, czy to w kierunku podstawienia samym atomem wodoru, czy podstawnikami o bardziej rozbudowanych grupach funkcyjnych prowadzi do całkowitej utraty zdolności oddziaływania ze snurportyną. Wynika to częściowo z bardzo wysokiej sztywności konformacyjnej tego białka, szczególnie w miejscu wiążącym kap z udziałem Trp107 i Trp 276, w kontraście do własności konformacyjnych eif4e, gdzie tryptofany oddziałujące z kapem są zlokalizowane na luźnych pętlach. Brak podstawnika metylowego powoduje natomiast poważną zmianę własności fizykochemicznych kapu ze względu na obniżenie bariery rotacji. Własności te maja swoje odbicie w parametrach spektralnych poszczególnych analogów TMG kapu. (A) (B) Rys. 5. Struktura krystalograficzna (A) snurportyny (pdb 1xk5) z dinukleotydowym analogiem TMG kapu, (B) miejsca wiążącego kap. Ostatnim tematem badawczym, jakie rozpoczęłam po doktoracie, jest projektowanie sond molekularnych do metod innych niż optyczne, w celu uniknięcia typowych artefaktów. Obiecująca w tym względzie jest technika EPR i pod tym kątem zaprojektowaliśmy wraz z dr. hab. Januszem Stępioskim z UW analog kapu zawierający trwały wolny rodnik, m 7 GTP- TEMPO (trifosforan P1-(7-metyloguanozyny-5 ) P3-(2,2,6,6-tetrametylo-1-piperydynyloksyl- 4). Praca D13. referuje przebieg syntezy oraz pełną charakterystykę spektroskopową (1D, 2D NMR, EPR, MS) i jest pierwszym w literaturze doniesieniem o kompletnych, bezpośrednio otrzymanych widmach 1 H, 13 C i 31 P NMR związku paramagnetycznego zawierającego TEMPO, włączając w to częśd wolnorodnikową, bez konwersji w pochodną N-hydroksylaminową. 33