Aktywowany poli(glikol etylenowy),

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US94/13013 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO95/13312, PCT Gazette nr 21/95 (54) Int.Cl.7: C08G 65/32 A61K 47/48 C08K 5/36 Aktywowany poli(glikol etylenowy), ( 5 4 ) sposób wytwarzania aktywowanego poli(glikolu etylenowego), koniugat biologicznie aktywny, sposób wytwarzania koniugatu poli(glikolu etylenowego sposób wytwarzania sulfonu winylowego i sposób wytwarzania sulfonu haloetylowego (30) Pierwszeństwo: ,US,08/ (73) Uprawniony z patentu: SHEARWATER POLYMERS INC., Huntsville, US (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 18/96 (72) Twórca wynalazku: J.Milton Harris, Huntsville, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 12/00 (74) Pełnomocnik: Lipska-Trych Zofia, POLSERVICE PL B1 ( 5 7 ) 1 Aktywowany poli(glikol etylenowy) o ogólnym wzorze R-(OCH2CH2)n-Y w którym n oznacza liczbę całkowitą od 5 do 3000, Y jest wybrany z grupy składającej się z -NH-OC-CH2-CH2-SO2-CH=CH2, -CO-NH-CH2-CH2-SO2- CH=CH2 i SO2-CH2-CH2-X, gdzie X oznacza chlorowiec, a R jest wybrany z grupy składającej się z H-, H3C-, CH2=CH-SO2-, X-CH2-CH2-SO2-, CH2=CH-SO2- CH2-CH2-CO-NH-, CH2=CH-SO2-CH2-CH2-NH-CO- 6 Sposób wytwarzania aktywowanego poli(glikolu etylenowego) mającego aktywne ugrupowanie sulfonowe kowalentnie związane z poli(glikolem etylenowym), znamienny tym, że obejmuje etap przyłączenia ugrupowania zawierającego siarkę bezpośrednio do atomu węgla poli(glikolu etylenowego) a następnie przekształcenia ugrupowania zawierającego siarkę w aktywne ugrupowanie sulfonowe 13 Sposób wytwarzania aktywowanego poli(glikolu etylenowego) mającego aktywne ugrupowanie sulfonowe kowalentnie związane z poli(glikolem etylenowym), znamienny tym, że obejmuje aktywowanie poli(glikolu etylenowego) z wytworzeniem reaktywnego ugrupowania aminowego kowalentnie związanego z poli(glikolem etylenowym), dostarczenie łączącego ugrupowania zawierającego aktywne ugrupowanie sulfonu i aktywne ugrupowanie estru sukcynoimidylowego oraz reakcję reaktywnego ugrupowania aminowego z aktywnym ugrupowaniem estru sukcynoimidylowego z wytworzeniem aktywowanego polimeru. 15 Sposób wytwarzania aktywowanego poli(glikolu etylenowego) mającego aktywne ugrupowanie sulfonowe kowalentnie związane z poli(glikolem etylenowym), znamienny tym, że obejmuje aktywowanie poli(glikolu etylenowego) z wytworzeniem reaktywnego ugrupowania estrowego sukcynoimidylowego kowalentnie związanego z wymienionym polimerem, dostarczenie łączącego ugrupowania zawierającego aktywne ugrupowanie sulfonu i aktywne ugrupowanie aminowe oraz reakcję reaktywnego ugrupowania aminowego z aktywnym ugrupowaniem estru sukcynoimidylowego z wytworzeniem polimeru. 17 Koniugat biologicznie aktywny, znamienny tym, że zawiera aktywną biologicznie cząsteczkę i aktywowany poli(glikol etylenowy) o ogólnym wzorze R-(OCH2CH2)n-Y w którym n oznacza liczbę całkowitą od 5 do 3000, Y jest wybrany z grupy składającej się z -NH-OC-CH2-CH2-SO2-CH=CH2, -CO-NH-CH2- CH2-SO2-CH=CH2 i SO2-CH2-CH2-X, gdzie X oznacza chlorowiec, a R jest wybrany z grupy składającej się z H-, H3C-, CH2=CH-SO2-, X-CH2-CH2-SO2-, CH2=CH-SO2-CH2-CH2-CO-NH-, CH2=CH-SO 2-CH2-CH2-NH-CO-, przy czym aktywowany poli(glikol etylenowy) jest kowalentnie związany z aktywną biologicznie cząsteczką przez aktywne ugrupowanie sulfonu 22 Sposób wytwarzania koniugatu poli(glikolu etylenowego) i biologicznie aktywnej cząsteczki mającej ugrupowanie tiolowe, znamienny tym, że obejmuje dostarczenie aktywowanego poli(glikolu etylenowego) otrzymanego sposobem polegającym na przyłączeniu ugrupowania zawierającego siarkę bezpośrednio do atomu węgla poli(glikolu etylenowego) a następnie przekształceniu ugrupowania zawierającego siarkę w aktywne ugrupowanie sulfonowe, reakcję biologicznie aktywnej cząsteczki z aktywowanym poli(glikolem etylenowym) z wytworzeniem kowalentnego wiązania pomiędzy ugrupowaniem tiolowym wymienionej biologicznie aktywnej cząsteczki i aktywnym ugrupowaniem sulfonu aktywowanego poli(glikolu etylenowego) 24 Sposób wytwarzania koniugatu poli(glikolu etylenowego) i biologicznie aktywnej cząsteczki zawierającej ugrupowanie tiolowe, znamienny tym, że obejmuje etapy (a) poddania poli(glikolu etylenowego) mającego co najmniej jedno aktywne ugrupowanie hydroksylowe reakcji ze związkiem w celu wytworzenia poli(glikolu etylenowego) podstawionego albo estrem albo halogenkiem, (b) poddania poli(glikolu etylenowego) z etapu (a) podstawionego estrem albo halogenkiem reakcji z merkaptoetanolem w celu zamiany ugrupowania estrowego lub halogenkowego na rodnik merkaptoetanolowy,

2 Aktywowany poli(glikol etylenowy), sposób wytwarzania aktywowanego poli(glikolu etylenowego), koniugat biologicznie aktywny, sposób wytwarzania koniugatu poli(glikolu etylenowego), sposób wytwarzania sulfonu winylowego i sposób wytwarzania sulfonu haloetylowego Zastrzeżenia patentowe 1. Aktywowany poli(glikol etylenowy) o ogólnym wzorze R-(OCH2 CH2)n-Y w którym n oznacza liczbę całkowitą od 5 do 3000; Y jest wybrany z grupy składającej się z -NH-OC-CH2-CH2-SO2-CH=CH2, -CO-NH-CH2-CH2-SO2-CH=CH2 i SO2-CH2-CH2-X, gdzie X oznacza chlorowiec, a R jest wybrany z grupy składającej się z H-, H3C-, CH2=CH- SO2-, X-CH2-CH2-SO2-, CH2 =CH-SO2-CH2-CH2-CO-NH-, CH2 =CH-SO2-CH2-CH2-NH-CO-. 2. Aktywowany poli(glikol etylenowy) według zastrz. 1, w którym n oznacza liczbę całkowitą od 45 do Aktywowany poli(glikol etylenowy) według zastrz. 1, w którym Y oznacza -CO- NH-CH2-CH2-SO2-CH=CH2. 4. Aktywowany poli(glikol etylenowy) według zastrz. 1, w którym Y oznacza -NH- CO-CH2-CH2-SO2-CH=CH2. 5. Aktywowany poli(glikol etylenowy) według zastrz. 1, w którym Y oznacza -SO2- CH2-CH2-Cl. 6. Sposób wytwarzania aktywowanego poli(glikolu etylenowego) mającego aktywne ugrupowanie sulfonowe kowalentnie związane z poli(glikolem etylenowym), znamienny tym, że obejmuje etap przyłączenia ugrupowania zawierającego siarkę bezpośrednio do atomu węgla poli(glikolu etylenowego) a następnie przekształcenia ugrupowania zawierającego siarkę w aktywne ugrupowanie sulfonowe. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etap wydzielania aktywowanego polimeru mającego aktywne ugrupowanie sulfonu. 8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że etap przyłączenia ugrupowania zawierającego siarkę bezpośrednio do atomu węgla poli(glikolu etylenowego) obejmuje etapy aktywowania co najmniej jednej aktywowalnej grupy hydroksylowej na polimerze i poddania wytworzonego związku reakcji z zawierającym alkohol ugrupowaniem tiolowym w celu spowodowania bezpośredniego przyłączenia siarki do łańcucha węgiel-węgiel poli(glikolu etylenowego). 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że etap aktywowania co najmniej jednej aktywowalnej grupy hydroksylowej wybiera się z etapów składających się z podstawienia hydroksylowego i zastąpienia wodoru hydroksylowego bardziej reaktywnym ugrupowaniem. 10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że ugrupowaniem tiolowym zawierającym alkohol jest merkaptoetanol. 11. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że ugrupowanie tiolowe zawierające alkohol przekształca się w aktywne ugrupowanie sulfonowe na etapach utleniania do sulfonu siarki w ugrupowaniu zawierającym siarkę i poddania produktu reakcji z ugrupowaniem aktywującym lub podstawiającym grupę hydroksylową. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że sulfon jest aktywnym sulfonem etylowym i sposób obejmuje dodatkowo etap wytworzenia ugrupowania sulfonu winylowego na polimerze w wyniku reakcji aktywnego sulfonu etylowego z silną zasadą. 13. Sposób wytwarzania aktywowanego poli(glikolu etylenowego) mającego aktywne ugrupowanie sulfonowe kowalentnie związane z poli(glikolem etylenowym), znamienny tym, że obejmuje aktywowanie poli(glikolu etylenowego) z wytworzeniem reaktywnego ugrupowania aminowego kowalentnie związanego z poli(glikolem etylenowym), dostarczenie

3 łączącego ugrupowania zawierającego aktywne ugrupowanie sulfonu i aktywne ugrupowanie estru sukcynoimidylowego oraz reakcję reaktywnego ugrupowania aminowego z aktywnym ugrupowaniem estru sukcynoimidylowego z wytworzeniem aktywowanego polimeru. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że aktywne ugrupowanie sulfonu oznacza -NH-CO-CH2-CH2-SO2-CH=CH Sposób wytwarzania aktywowanego poli(glikolu etylenowego) mającego aktywne ugrupowanie sulfonowe kowalentnie związane z poli(glikolem etylenowym), znamienny tym, że obejmuje aktywowanie poli(glikolu etylenowego) z wytworzeniem reaktywnego ugrupowania estrowego sukcynoimidylowego kowalentnie związanego z wymienionym polimerem, dostarczenie łączącego ugrupowania zawierającego aktywne ugrupowanie sulfonu i aktywne ugrupowanie aminowe oraz reakcję reaktywnego ugrupowania aminowego z aktywnym ugrupowaniem estru sukcynoimidylowego z wytworzeniem polimeru. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako aktywne ugrupowanie sulfonu stosuje się -CO-NH-CO-CH2-CH2-SO2-CH=CH Koniugat biologicznie aktywny, znamienny tym, że zawiera aktywną biologicznie cząsteczkę i aktywowany poli(glikol etylenowy) o ogólnym wzorze R-(OCH2 CH2)n-Y w którym n oznacza liczbę całkowitą od 5 do 3000; Y jest wybrany z grupy składającej się z -NH-OC-CH2-CH2-SO 2-CH=CH2, -C0-NH-CH2-CH2-SO2-CH=CH2 i SO2 -CH2-CH2-X, gdzie X oznacza chlorowiec, a R jest wybrany z grupy składającej się z H-, H3C-, CH2=CH- SO2-, X-CH2-CH2-SO2-, CH2=CH-SO2-CH2-CH2-CO-NH-, CH2 =CH-SO2-CH2-CH2-NH-CO-, przy czym aktywowany poli(glikol etylenowy) jest kowalentnie związany z aktywną biologicznie cząsteczką przez aktywne ugrupowanie sulfonu. 18. Koniugat według zastrz. 17, znamienny tym, że n oznacza liczbę całkowitą od 45 do Koniugat według zastrz. 17, znamienny tym, że Y oznacza -CO-NH-CH2-CH2- SO2-CH=CH Koniugat według zastrz. 17, znamienny tym, że Y oznacza -NH-OC-CH2-CH2- SO2-CH=CH Koniugat według zastrz. 17, znamienny tym, że Y oznacza -SO2-CH2 -CH2-Cl. 22. Sposób wytwarzania koniugatu poli(glikolu etylenowego) i biologicznie aktywnej cząsteczki mającej ugrupowanie tiolowe, znamienny tym, że obejmuje dostarczenie aktywowanego poli(glikolu etylenowego) otrzymanego sposobem polegającym na przyłączeniu ugrupowania zawierającego siarkę bezpośrednio do atomu węgla poli(glikolu etylenowego) a następnie przekształceniu ugrupowania zawierającego siarkę w aktywne ugrupowanie sulfonowe, reakcję biologicznie aktywnej cząsteczki z aktywowanym poli(glikolem etylenowym) z wytworzeniem kowalentnego wiązania pomiędzy ugrupowaniem tiolowym wymienionej biologicznie aktywnej cząsteczki i aktywnym ugrupowaniem sulfonu aktywowanego poli(glikolu etylenowego). 23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że biologicznie aktywną cząsteczkę wybiera się z grupy składającej się z syntetyków, biomateriałów, białek, środków farmaceutycznych, komórek i witamin. 24. Sposób wytwarzania koniugatu poli(glikolu etylenowego) i biologicznie aktywnej cząsteczki zawierającej ugrupowanie tiolowe, znamienny tym, że obejmuje etapy: (a) poddania poli(glikolu etylenowego) mającego co najmniej jedno aktywne ugrupowanie hydroksylowe reakcji ze związkiem w celu wytworzenia poli(glikolu etylenowego) podstawionego albo estrem albo halogenkiem; (b) poddania poli(glikolu etylenowego) z etapu (a) podstawionego estrem albo halogenkiem reakcji z merkaptoetanolem w celu zamiany ugrupowania estrowego lub halogenkowego na rodnik merkaptoetanolowy; (c) poddania podstawionego merkaptoetanolem poli(glikolu etylenowego) z etapu (b) reakcji ze środkiem utleniającym w celu utlenienia do sulfonu siarki w ugrupowaniu merkaptoetanolowym;

4 (d) poddania sulfonu z etapu (c) reakcji ze związkiem w celu zamiany grupy hydroksylowej ugrupowania merkaptoetanolowego na ugrupowanie estrowe lub halogenkowe z wytworzeniem aktywnego ugrupowania sulfonu etylowego; (e) poddanie sulfonu etylowego etapu (d) reakcji z zasadą w celu wytworzenia aktywowanego poli(glikolu etylenowego) mającego aktywne ugrupowanie sulfonu winylowego; (f) izolowania sulfonu winylowego poli(glikolu etylenowego) etapu (e) i (g) poddania aktywnego ugrupowania sulfonu winylowego reakcji z ugrupowaniem tiolowym biologicznie aktywnej cząsteczki z wytworzeniem koniugatu. 25. Sposób wytwarzania koniugatu poli(glikolu etylenowego) i biologicznie aktywnej cząsteczki zawierającej ugrupowanie tiolowe, znamienny tym, że obejmuje etapy: (a) poddania poli(glikolu etylenowego) mającego co najmniej jedno aktywne ugrupowanie hydroksylowe reakcji ze związkiem w celu wytworzenia poli(glikołu etylenowego) podstawionego albo estrem albo halogenkiem; (b) poddania poli(glikolu etylenowego) z etapu (a) podstawionego estrem albo halogenkiem reakcji z merkaptoetanolem w celu zamiany ugrupowania estrowego lub halogenkowego na rodnik merkaptoetanolowy; (c) poddania podstawionego merkaptoetanolem poli(glikolu etylenowego) z etapu (b) reakcji ze środkiem utleniającym w celu utlenienia do sulfonu siarki w ugrupowaniu merkaptoetanolowym; (d) poddania sulfonu z etapu (c) reakcji ze związkiem w celu przekształcenia grupy hydroksylowej ugrupowania merkaptoetanolu w ugrupowanie halogenkowe tworząc aktywowany poli(glikol etylenowy) mający aktywne ugrupowanie sulfonu etylowego; (e) izolowania aktywowanego poli(glikolu etylenowego) etapu (d) i (f) poddania aktywnego ugrupowania sulfonu etylowego reakcji z ugrupowaniem tiolowym biologicznie aktywnej cząsteczki tworząc wspomniany koniugat. 26. Sposób wytwarzania koniugatu poli(glikolu etylenowego) i biologicznie aktywnej cząsteczki zawierającej ugrupowanie tiolowe, znamienny tym, że aktywuje się poli(glikol etylenowy) z wytworzeniem reaktywnego ugrupowania aminowego kowalentnie związanego z poli(glikolem etylenowym), zapewnia się cząsteczkę łącznika mającą aktywne ugrupowanie sulfonowe i aktywne ugrupowanie estru sukcynoimidylowego, poddaje się reaktywne ugrupowanie aminowe reakcji z aktywnym ugrupowaniem estru sukcynoimidylowego z wytworzeniem aktywowanego poli(glikolu etylenowego) mającego aktywne ugrupowanie sulfonu kowalentnie związane z poli(glikolem etylenowym) i poddaje się aktywne ugrupowanie sulfonu reakcji z ugrupowaniem tiolowym biologicznie aktywnej cząsteczki z wytworzeniem koniugatu. 27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że jako aktywne ugrupowanie sulfonowe stosuje się -NH-OC-CH2-CH2-SO2-CH=CH Sposób wytwarzania koniugatu poli(glikolu etylenowego) i biologicznie aktywnej cząsteczki zawierającej ugrupowanie tiolowe, znamienny tym, że aktywuje się poli(glikol etylenowy) z wytworzeniem reaktywnego ugrupowania estru sukcynimidylowego kowalentnie związanego z poli(glikolem etylenowym), zapewnia się cząsteczkę łącznika mającą aktywne ugrupowanie sulfonu i aktywne ugrupowanie aminowe, poddaje się reaktywne ugrupowanie aminowe reakcji z aktywnym ugrupowaniem estru sukcynimidylowym z wytworzeniem aktywowanego poli(glikolu etylenowego) zawierającego aktywne ugrupowanie sulfonu oraz poddaje się aktywne ugrupowanie sulfonu aktywowanego poli(glikolu etylenowego) reakcji z ugrupowaniem tiolowym aktywnej biologicznie cząsteczki z wytworzeniem koniugatu. 29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że jako aktywne ugrupowanie sulfonu stosuje się -CO-NH-CH2-CH2-SO2-CH=CH Sposób wytwarzania sulfonu winylowego poli(glikolu etylenowego), znamienny tym, że obejmuje etapy: (a) poddania poli(glikolu etylenowego) mającego co najmniej jedno aktywne ugrupowanie hydroksylowe reakcji ze związkiem w celu wytworzenia poli(glikolu etylenowego) podstawionego albo estrem albo halogenkiem;

5 (b) poddania poli(glikolu etylenowego) z etapu (a) podstawionego estrem albo halogenkiem reakcji z merkaptoetanolem w celu zamiany ugrupowania estrowego lub halogenkowego na rodnik merkaptoetanolowy; (c) poddania podstawionego merkaptoetanolem poli(glikolu etylenowego) z etapu (b) reakcji ze środkiem utleniającym w celu utlenienia do sulfonu siarki w ugrupowaniu merkaptoetanolowym; (d) poddania sulfonu z etapu (c) reakcji ze związkiem w celu zamiany grupy hydroksylowej ugrupowania merkaptoetanolowego na ugrupowanie estrowe lub halogenkowe; (e) poddania sulfonu etylenowego z etapu (d) reakcji z zasadą w celu wytworzenia sulfonu winylowego poli(glikolu etylenowego). 31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etapy izolowania sulfonu winylowego poli(glikolu etylenowego). 32. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że halogenkiem z etapu (d) jest chlor i produktem etapu (d) jest sulfon chloroetylowy poli(glikolu etylenowego). 33. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo etapy rozpuszczania kryształów sulfonu chloroetylowego poli(glikolu etylenowego) w rozpuszczalniku organicznym przed reakcją z zasadą w celu wytworzenia sulfonu winylowego poli(glikolu etylenowego), i izolowania produktu sulfonu winylowego poli(glikolu etylenowego), przez odsączenie w celu usunięcia zasady i odparowanie rozpuszczalnika. 34. Sposób wytwarzania sulfonu haloetylowego poli(glikolu etylenowego), znamienny tym, że obejmuje etapy: (a) poddania poli(glikolu etylenowego) mającego co najmniej jedno aktywne ugrupowanie hydroksylowe reakcji ze związkiem w celu wytworzenia poli(glikolu etylenowego) podstawionego albo estrem albo halogenkiem; (b) poddania poli(glikolu etylenowego) z etapu (a) podstawionego estrem albo halogenkiem reakcji z merkaptoetanolem w celu zamiany ugrupowania estrowego lub halogenkowego na rodnik merkaptoetanolowy; (c) poddania podstawionego merkaptoetanolem poli(glikolu etylenowego) z etapu (b) reakcji ze środkiem utleniającym w celu utlenienia do sulfonu siarki w ugrupowaniu merkaptoetanolowym; (d) poddania sulfonu z etapu (c) reakcji ze związkiem w celu zamiany grupy hydroksylowej ugrupowania merkaptoetanolowego na ugrupowanie halogenkowe z wytworzeniem sulfonu haloetylowego poli(glikolu etylenowego). 35. Sposób według zastrz. 34, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etap izolowania sulfonu haloetylowego poli(glikolu etylenowego). * * * Przedmiotem wynalazku jest aktywowany poli(glikol etylenowy), sposób wytwarzania aktywowanego poli(glikolu etylenowego), koniugat biologicznie aktywny i sposób wytwarzania koniugatu biologicznie aktywnego, sposób wytwarzania sulfonu winylowego i sposób wytwarzania sulfonu haloetylowego. Pochodne polimerów hydrofilowych stosuje się do modyfikowania charakterystyki powierzchni i cząsteczek. Badano zastosowanie poli(glikolu etylenowego) ( PEG ) w środkach farmaceutycznych, na sztucznych wszczepach i do innych zastosowań, gdzie duże znaczenie ma zgodność biologiczna. Zaproponowano różne pochodne poli(glikolu etylenowego) ( pochodne PEG ), które mają aktywne ugrupowanie umożliwiające przyłączenie PEG do środków farmaceutycznych i wszczepów oraz ogólnie do cząsteczek i powierzchni w celu zmodyfikowania charakterystyki fizycznej lub chemicznej cząsteczek lub powierzchni. Na przykład zaproponowano pochodne PEG do sprzęgania PEG z powierzchniami w celu kontrolowania zwilżania, gromadzenia statycznego i przyłączania innych rodzajów cząsteczek do powierzchni, włącznie z białkami i resztami białek. W szczególności zaproponowano stosowanie pochodnych PEG w celu przyłączania do powierzchni plastykowych

6 soczewek kontaktowych, aby zmniejszyć gromadzenie się białek i ograniczyć przymglenie wzroku. Zaproponowano stosowanie pochodnych PEG do przyłączania ich do sztucznych naczyń krwionośnych w celu zmniejszenia gromadzenia się białek i niebezpieczeństwa blokady. Pochodne PEG zaproponowano do unieruchamiania białek na powierzchni, np. w enzymatycznej katalizie reakcji chemicznych. W innych przykładach zaproponowano przyłączanie pochodnych PEG do cząsteczek, włącznie z białkami, w celu osłaniania cząsteczki przed atakiem chemicznym, w celu ograniczenia niekorzystnych wpływów ubocznych cząsteczki lub w celu zwiększenia wymiarów cząsteczki, aby w ten sposób potencjalnie uzyskać substancje użyteczne leczniczo, które jednak pod innymi względami nie są przydatne, lub są nawet szkodliwe w stosunku do żywego organizmu. Małe cząsteczki, które normalnie byłyby wydalone poprzez nerki, pozostają zatrzymane w strumieniu krwi, jeśli ich wymiary zwiększą się w wyniku przyłączenia zgodnej biologicznie pochodnej PEG. Białka i inne substancje, które dają odpowiedź immunologiczną po ich wstrzyknięciu, mogą być w pewnym stopniu ukryte przed układem immunologicznym w wyniku sprzęgania cząsteczki PEG z białkiem. Pochodne PEG zaproponowano także do oddzielania powinowactwa od masy komórkowej, np. powinowactwa enzymów. Podczas oddzielania powinowactwa, pochodna PEG zawiera grupę funkcyjną do odwracalnego sprzęgania z enzymem zawartym w masie komórkowej. PEG i koniugat enzymu są oddzielane od masy komórkowej, a następnie enzym jest oddzielany od pochodnej PEG, jeśli to jest pożądane. Sprzęganie pochodnych PEG z białkami ilustruje pewne trudności, jakie występują podczas przyłączania PEG do powierzchni i cząsteczek. W przypadku licznych powierzchni i cząsteczek, liczba miejsc dostępnych do reakcji sprzęgania w pochodnej PEG jest w pewnej mierze ograniczona. Białka np. mają zwykle ograniczoną liczbę i wyróżnione rodzaje reaktywnych miejsc dostępnych do sprzęgania. Jeszcze większe problemy wynikają z faktu, że pewne miejsca reaktywne mogą być odpowiedzialne za aktywność biologiczną białka, gdy enzym katalizuje pewne reakcje chemiczne. Pochodna PEG przyłączona do dostatecznej liczby takich miejsc mogłaby niekorzystnie wpływać na aktywność białka. Miejsca reaktywne, które tworzą miejsca przyłączania pochodnych PEG do białek, są określane przez strukturę białka. Białka, włącznie z enzymami, są zbudowane z różnych sekwencji α-aminokwasów, które mają ogólną strukturę H2N-CHR-COOH. Ugrupowanie α- aminowe (H2N-) jednego aminokwasu łączy się z ugrupowaniem karboksylowym (-COOH) sąsiedniego aminokwasu, z wytworzeniem wiązań amidowych, które można przedstawić jako -(NH-CHR-CO)n, przy czym n może mieć wartość setek lub tysięcy. Fragment przedstawiony przez R może zawierać miejsca reaktywne do biologicznej aktywności białka i do przyłączania pochodnych PEG. W lizynie np., która jest aminokwasem tworzącym część łańcucha głównego większości białek, ugrupowanie -NH2 jest obecne w położeniu epsilon, a także w położeniu alfa. Grupa epsilon-nh2 może reagować w środowisku alkalicznym. Wiele pracy poświęcono opracowaniu pochodnych PEG przyłączanych do ugrupowania epsilon-nh2 w lizynowej frakcji białka. Wspólną cechą tych wszystkich pochodnych PEG jest to, że lizynowa frakcja aminokwasów białka zwykle ulega dezaktywacji, co może być wadą, gdy lizyna ma znaczenie dla aktywności białka W publikacji PCT WO 92/16292 ujawniono siarkolubną matrycę absorpcyjną, którą można stosować do oczyszczania immunoglobulin za pomocą wiązania jonowego i strącania. Jak przedstawiono w tej publikacji struktura siarkolubnej matrycy absorpcyjnej obejmuje 3 różne części: (a) polimer hydrofilowy, który zwykle jest agarozą; (b) sulfon dietylowy połączony z polimerem hydrofilowym przez tlen, azot lub atom siarki; i (c) aromatyczny lub hetero-aromatyczny ligand połączony z grupą sulfonu dietylowego. Matryce stosowano do siarkolubnego wiązania z immunoglobulinami. Ujawniono, że grupa sulfonu dietylowego pochodzi z sulfonu diwinylowego. Ponadto, grupa sulfonu dietylowego jest połączona swoimi dwoma końcami z agarozą i ligandem. Grupa sulfonu dietylowego w żaden sposób nie jest aktywną grupą to znaczy nie jest zdolna do reagowania z proteiną lub peptydem lub powierzchnią z wytworzeniem wiązania kowalencyjnego. Rozwiązanie według publikacji WO 92/16292 zatem nie ujawnia aktywowanego polimeru według wynalazku.

7 Natomiast w publikacji PCT WO 93/01498 ujawniono polimer mający aktywowaną grupę sulfonu winylowego połączoną z polimerem, takim jak glikol polietylenowy. Jednak, grupa sulfonu winylowego w polimerze ujawnionym w publikacji WO 93/01498 pochodzi z sulfonu diwinylowego. Cząsteczka sulfonu diwinylowego ma grupę winylową przyłączoną do każdego boku grupy sulfonowej. W istocie polimer według WO 93/01498 wytwarzano za pomocą reakcji polimeru takiego jak glikol polietylenowy bezpośrednio z sulfonem diwinylowym. Ujawniony pośredni reaktywny polimer miał dwa atomy węgla łączące macierzysty polimer i grupę sulfonową. Te dwa dodatkowe atomy węgla pochodzą z jednej z dwóch grup winylowych cząsteczki sulfonu diwinylowego. W tym przypadku żadne połączenie estrowe lub amidowe nie tworzy się w przeciwieństwie do rozwiązania według wynalazku, w którym sulfon diwinylowy nie bierze udziału w syntezie. Ponadto według publikacji WO 93/01498 sulfon diwinylowy reaguje bezpośrednio z macierzystym polimerem, przy czym dwie grupy winylowe w cząsteczce sulfonu diwinylowego mogą być aktywne w tym samym czasie i reagować z dwoma różnymi cząsteczkami polimeru macierzystego powodując sieciowanie. Takie sieciowanie daje mniej wolnych aktywnych ugrupowań sulfonu winylowego dostępnych w reakcji sprzęgającej. Natomiast w sposobie według wynalazku znaczące sieciowanie nie występuje. Ponadto, ponieważ sposób ujawniony w cytowanej publikacji WO 93/01498 obejmuje sulfon diwinylowy można się spodziewać, że pewne zanieczyszczenie spowodowane przez nieprzereagowany lub częściowo przereagowany reagent sulfonowy jest nieuchronne w pośrednim reagencie aktywnego polimeru jak również w koniugatach wytworzonych z tego pośredniego reagenta polimerowego. Ze stanu techniki również wiadomo, że sulfon diwinylowy jest toksyczny gdy wprowadzony do organizmu zwierzęcia. A zatem pośredni polimer i koniugaty ujawnione w WO 93/01498 nie są odpowiednie do zastosowań farmaceutycznych in vivo, w przeciwieństwie do tych według wynalazku. Rozwiązanie według wynalazku dodatkowo istotnie różni się od wynalazku według WO 93/01498 tym, że gdy aktywnym ugrupowaniem sulfonu według wynalazku jest ugrupowanie sulfonu winylowego pochodzącego z aktywnej grupy sulfonu etylowego to grupa sulfonowa jest połączona bezpośrednio z końcowym atomem węgla polimeru. W przeciwieństwie do tego ugrupowanie sulfonu winylowego w polimerze ujawnionym w publikacji WO 93/01498 nie tylko, że pochodzi z sulfonu diwinylowego ale tworzy grupę etylową pomiędzy końcowym atomem węgla polimeru a grupą sulfonową. Patent US , Zalipsky, ujawnia, że cząsteczki PEG aktywowane funkcyjną grupą oksykarbonylo-n-dikarboksyimidową mogą być przyłączone w warunkach alkalicznych w wodzie do grupy aminowej polipeptydu poprzez wiązanie uretanowe. Uważa się, że aktywny węglan N-sukcynoimidu PEG tworzy trwałe, odporne na hydrolizę wiązania uretanowe z grupami aminowymi. Stwierdzono, że grupa aminowa jest bardziej reaktywna w środowisku zasadowym przy ph od około 8,0 do 9,5, a reaktywność ta gwałtownie maleje przy niższych wartościach ph. Jednakże przy wartościach ph od 8,0 do 9,5 szybko także wzrasta hydroliza niesprzężonej pochodnej PEG. Zalipsky unika trudności związanej ze wzrostem szybkości reakcji niesprzężonej pochodnej PEG z wodą przez użycie nadmiaru pochodnej PEG do związania powierzchni białka. W wyniku użycia tego nadmiaru, zostaje związana z PEG liczba reaktywnych miejsc epsilon-aminowych dostateczna do zmodyfikowania białka zanim ta pochodna PEG ulegnie hydrolizie i stanie się niereaktywna. Sposób Zalipsky ego nadaje się do przyłączenia lizynowej frakcji białka do pochodnej PEG na jednym aktywnym miejscu pochodnej PEG. Jednakże, jeśli szybkość hydrolizy pochodnej PEG jest znaczna, to może być utrudnione uzyskanie przyłączenia do więcej niż jednego aktywnego miejsca na cząsteczce PEG, ponieważ zwykły nadmiar nie zmniejsza szybkości hydrolizy. Na przykład, liniowy PEG z aktywnymi miejscami na każdym końcu przyłączy się do białka na jednym końcu, lecz, jeśli szybkość hydrolizy jest znaczna, to będzie on reagował z wodą na drugim końcu i zostanie osłonięty za pomocą mało reaktywnego ugrupowania hydroksylowego, reprezentowanego strukturalnie jako -OH, ale raczej nie utworzy hantlowej struktury cząsteczkowej z przyłączonymi białkami lub z innymi pożądanymi grupami na

8 każdym końcu. Podobna trudność powstaje wtedy, gdy jest pożądane sprzęganie cząsteczki z powierzchnią za pomocą środka wiążącego typu PEG, ponieważ PEG jest przyłączany najpierw do powierzchni lub sprzęga z cząsteczką a przeciwny koniec pochodnej PEG musi pozostać reaktywny do kolejnej reakcji. Jeśli problemem jest występowanie hydrolizy, to przeciwny koniec zwykle staje się nieaktywny. W patencie US , Zalipsky, ujawniono także kilka innych pochodnych PEG z wcześniejszych patentów. Uważa się, że ester sukcynoilo-n-hydroksylsukcynoimidu PEG tworzy wiązania estrowe, które mają ograniczoną trwałość w środowiskach wodnych, co powoduje niekorzystnie krótki okres półtrwania tej pochodnej. Stwierdzono, że chlorek cyjanurowy PEG wykazuje niepożądaną toksyczność i jest niespecyficzny w reakcji z określonymi grupami funkcyjnymi na białku. Z tego powodu pochodna typu chlorku cyjanurowego PEG może powodować niepożądane skutki uboczne i może zmniejszać aktywność białka, ponieważ przyłącza się do kilku rodzajów aminokwasów na różnych miejscach reaktywnych. Sądzi się, że fenylowęglan PEG wytwarza toksyczne hydrofobowe reszty fenolowe, które wykazują powinowactwo do białek. Uważa się, że PEG aktywowany za pomocą karbonylodiimidazolu reaguje zbyt wolno z funkcyjnymi grupami białka i wymaga długich czasów reakcji, aby uzyskać dostateczne zmodyfikowanie białka. Zaproponowano stosowanie także innych pochodnych PEG do przyłączania ich do grup funkcyjnych na aminokwasach innych niż epsilon-nh2 lizyny. Histydyna zawiera reaktywne ugrupowanie iminowe, przedstawione strukturalnie jako -N(H)-, lecz wiele pochodnych reagujących z epsilon-nh2 reaguje także z -N(H)-. Cysteina zawiera reaktywne ugrupowanie tiolowe, przedstawione strukturalnie jako -SH, lecz maleimidowa pochodna PEG, która reaguje z tym ugrupowaniem, jest podatna na hydrolizę. Jak widać z powyższego próbnego przeglądu, poświęcono znaczny wysiłek na opracowanie różnych pochodnych PEG do przyłączania różnych białek, w szczególności do ugrupowania -NH2 na lizynowej frakcji aminokwasu. Okazało się, że wiele z tych pochodnych stwarza trudności podczas wytwarzania i stosowania. Niektóre tworzą nietrwałe wiązania z białkiem, które ulegają hydrolizie i dlatego są nie bardzo trwałe w środowiskach wodnych, takich jak strumienie krwi. Niektóre tworzą trwalsze wiązania, ale ulegają hydrolizie przed utworzeniem wiązania, co oznacza, że reaktywna grupa na pochodnej PEG może zostać zdezaktywowana zanim będzie możliwe przyłączenie białka. Niektóre pochodne wykazują pewną toksyczność i dlatego są mało przydatne do stosowania in vivo. Niektóre reagują zbyt wolno, aby mogły być użyteczne w praktyce. Niektóre powodują utratę aktywności białka w wyniku przyłączania się do miejsc powodujących aktywność białka. Niektóre nie są specyficzne pod względem miejsc, do których się przyłączają, co także może być powodem utraty pożądanej aktywności i powodem niepowtarzalności wyników. Według wynalazku aktywowany poli(glikol etylenowy) charakteryzuje się ogólnym wzorem R-(OCH2CH2)n-Y w którym n oznacza liczbę całkowitą od 5 do 3000; Y jest wybrany z grupy składającej się z -NH-OC-CH2-CH2-SO2-CH=C H 2, -CO-NH-CH2-CH2-SO2-CH=C H 2 i SO2-CH2-CH2-X, gdzie X oznacza chlorowiec, a R jest wybrany z grupy składającej się z H-, H3C-, CH2=CH- SO2-, X-CH2-CH2-SO2-, CH2 =CH-SO 2-CH2-CH2-CO-NH-, CH2=CH-SO 2-CH2-CH2-NH-CO-. Korzystnie we wzorze ogólnym aktywowanego poli(glikol etylenowego) n oznacza liczbę całkowitą od 45 do 110. Korzystnie we wzorze ogólnym aktywowanego poli(glikol etylenowego) Y oznacza -CO-NH-CH2-CH2-SO2-CH-CH2. Korzystnie we wzorze ogólnym aktywowanego poli(glikol etylenowego) Y oznacza -NH-CO-CH2-CH2-SO2-CH=CH2. Korzystnie we wzorze ogólnym aktywowanego poli(glikol etylenowego) Y oznacza -SO2-CH2-CH2-Cl.

9 Według wynalazku sposób wytwarzania aktywowanego poli(glikolu etylenowego) mającego aktywne ugrupowanie sulfonowe kowalentnie związane z poli(glikolem etylenowym), charakteryzuje się tym, że obejmuje etap przyłączenia ugrupowania zawierającego siarkę bezpośrednio do atomu węgla poli(glikolu etylenowego) a następnie przekształcenia ugrupowania zawierającego siarkę w aktywne ugrupowanie sulfonowe. Sposób obejmuje dodatkowo etap wydzielania aktywowanego polimeru mającego aktywne ugrupowanie sulfonu, a etap przyłączenia ugrupowania zawierającego siarkę bezpośrednio do atomu węgla poli(glikolu etylenowego) obejmuje etapy aktywowania co najmniej jednej aktywowalnej grupy hydroksylowej na polimerze i poddania wytworzonego związku reakcji z zawierającym alkohol ugrupowaniem tiolowym w celu spowodowania bezpośredniego przyłączenia siarki do łańcucha węgiel-węgiel poli(glikolu etylenowego). Wymieniony etap aktywowania co najmniej jednej aktywowalnej grupy hydroksylowej wybiera się z etapów składających się z podstawienia hydroksylowego i zastąpienia wodoru hydroksylowego bardziej reaktywnym ugrupowaniem. Ugrupowaniem tiolowym zawierającym alkohol jest merkaptoetanol. W sposobie według wynalazku ugrupowanie tiolowe zawierające alkohol korzystnie przekształca się w aktywne ugrupowanie sulfonowe na etapach utleniania do sulfonu siarki w ugrupowaniu zawierającym siarkę i poddania produktu reakcji z ugrupowaniem aktywującym lub podstawiającym grupę hydroksylową. Sulfon jest aktywnym sulfonem etylowym i sposób obejmuje dodatkowo etap wytworzenia ugrupowania sulfonu winylowego na polimerze w wyniku reakcji aktywnego sulfonu etylowego z silną zasadą. W drugim aspekcie wynalazku sposób wytwarzania aktywowanego poli(glikolu etylenowego) mającego aktywne ugrupowanie sulfonowe kowalentnie związane z poli(glikolem etylenowym), charakteryzuje się tym, że obejmuje aktywowanie poli(glikolu etylenowego) z wytworzeniem reaktywnego ugrupowania aminowego kowalentnie związanego z poli(glikolem etylenowym), dostarczenie łączącego ugrupowania zawierającego aktywne ugrupowanie sulfonu i aktywne ugrupowanie estru sukcynoimidylowego oraz reakcję reaktywnego ugrupowania aminowego z aktywnym ugrupowaniem estru sukcynoimidylowego z wytworzeniem aktywowanego polimeru. Korzystnie aktywne ugrupowanie sulfonu oznacza -NH-CO-CH2-CH2-SO2-CH=CH2. W kolejnym aspekcie wynalazku sposób wytwarzania aktywowanego poli(glikolu etylenowego) mającego aktywne ugrupowanie sulfonowe kowalentnie związane z poli(glikolem etylenowym), charakteryzuje się tym, że obejmuje aktywowanie poli(glikolu etylenowego) z wytworzeniem reaktywnego ugrupowania estrowego sukcynoimidylowego kowalentnie związanego z wymienionym polimerem, dostarczenie łączącego ugrupowania zawierającego aktywne ugrupowanie sulfonu i aktywne ugrupowanie aminowe oraz reakcję reaktywnego ugrupowania aminowego z aktywnym ugrupowaniem estru sukcynoimidylowego z wytworzeniem polimeru. Korzystnie jako aktywne ugrupowanie sulfonu stosuje się -CO-NH-CO-CH2-CH2-SO2- CH=CH2. Według wynalazku koniugat biologicznie aktywny, charakteryzuje się tym, że zawiera aktywną biologicznie cząsteczkę i aktywowany poli(glikol etylenowy) o ogólnym wzorze R-(OCH2 CH2)n-Y w którym n oznacza liczbę całkowitą od 5 do 3000; Y jest wybrany z grupy składającej się z -NH-OC-CH2-CH2-SO2-CH=CH2, -CO-NH-CH2-CH2-SO2-CH=CH2 i SO2-CH2-CH2-X, gdzie X oznacza chlorowiec, a R jest wybrany z grupy składającej się z H-, H3C-, CH2-CH- SO2-, X-CH2-CH2-SO2-, CH2 =CH-SO2-CH2-CH2-CO-NH-, CH2 =CH-SO2-CH2-CH2-NH-CO-, przy czym aktywowany poli(glikol etylenowy) jest kowalentnie związany z aktywną biologicznie cząsteczką przez aktywne ugrupowanie sulfonu. W strukturze koniugatu n oznacza korzystnie liczbę całkowitą od 45 do 110, a Y oznacza korzystnie -CO-NH-CH2-CH2-SO2-CH=CH2, lub -NH-OC-CH2-CH2-SO2-CH=CH2, lub Y oznacza -SO2-CH2-CH2-Cl.

10 Według wynalazku sposób wytwarzania koniugatu polimerowego biologicznie aktywnej cząsteczki mającej ugrupowanie tiolowe, charakteryzuje się tym, że obejmuje dostarczenie aktywowanego poli(glikolu etylenowego) otrzymanego sposobem polegającym na przyłączeniu ugrupowania zawierającego siarkę bezpośrednio do atomu węgla poli(glikolu etylenowego) a następnie przekształceniu ugrupowania zawierającego siarkę w aktywne ugrupowanie sulfonowe, reakcję biologicznie aktywnej cząsteczki z aktywowanym poli(glikolem etylenowym) z wytworzeniem kowalentnego wiązania pomiędzy ugrupowaniem tiolowym wymienionej biologicznie aktywnej cząsteczki i aktywnym ugrupowaniem sulfonu aktywowanego poli(glikolu etylenowego). Biologicznie aktywną cząsteczkę wybiera się z grupy składającej się z syntetyków, biomateriałów, białek, środków farmaceutycznych, komórek i witamin. W kolejnym aspekcie wynalazku sposób wytwarzania koniugatu poli(glikolu etylenowego) biologicznie aktywnej cząsteczki zawierającej ugrupowanie tiolowe, charakteryzuje się tym, że obejmuje etapy: (a) poddania poli(glikolu etylenowego) mającego co najmniej jedno aktywne ugrupowanie hydroksylowe reakcji ze związkiem w celu wytworzenia poli(glikolu etylenowego) podstawionego albo estrem albo halogenkiem; (b) poddania poli(glikolu etylenowego) z etapu (a) podstawionego estrem albo halogenkiem reakcji z merkaptoetanolem w celu zamiany ugrupowania estrowego lub halogenkowego na rodnik merkaptoetanolowy; (c) poddania podstawionego merkaptoetanolem poli(glikolu etylenowego) z etapu (b) reakcji ze środkiem utleniającym w celu utlenienia do sulfonu siarki w ugrupowaniu merkaptoetanolowym; (d) poddania sulfonu z etapu (c) reakcji ze związkiem w celu zamiany grupy hydroksylowej ugrupowania merkaptoetanolowego na ugrupowanie estrowe lub halogenkowe z wytworzeniem aktywnego ugrupowania sulfonu etylowego; (e) poddanie sulfonu etylowego etapu (d) reakcji z zasadą w celu wytworzenia aktywowanego poli(glikolu etylenowego) mającego aktywne ugrupowanie sulfonu winylowego; (f) izolowania sulfonu winylowego poli(glikolu etylenowego) etapu (e) i (g) poddania aktywnego ugrupowania sulfonu winylowego reakcji z ugrupowaniem tiolowym biologicznie aktywnej cząsteczki z wytworzeniem koniugatu. W dalszym aspekcie wynalazku sposób wytwarzania koniugatu poli(glikolu etylenowego) biologicznie aktywnej cząsteczki zawierającej ugrupowanie tiolowe, charakteryzuje się tym, że obejmuje etapy: (a) poddania poli(glikolu etylenowego) mającego co najmniej jedno aktywne ugrupowanie hydroksylowe reakcji ze związkiem w celu wytworzenia poli(glikolu etylenowego) podstawionego albo estrem albo halogenkiem; (b) poddania poli(glikolu etylenowego) z etapu (a) podstawionego estrem albo halogenkiem reakcji z merkaptoetanolem w celu zamiany ugrupowania estrowego lub halogenkowego na rodnik merkaptoetanolowy; (c) poddania podstawionego merkaptoetanolem poli(glikolu etylenowego) z etapu (b) reakcji ze środkiem utleniającym w celu utlenienia do sulfonu siarki w ugrupowaniu merkaptoetanolowym; (d) poddania sulfonu z etapu (c) reakcji ze związkiem w celu przekształcenia grupy hydroksylowej ugrupowania merkaptoetanolu w ugrupowanie halogenkowe tworząc aktywowany poli(glikol etylenowy) mający aktywne ugrupowanie sulfonu etylowego; (e) izolowania aktywowanego poli(glikolu etylenowego) etapu (d) i (f) poddania aktywnego ugrupowania sulfonu etylowego reakcji z ugrupowaniem tiolowym biologicznie aktywnej cząsteczki tworząc wspomniany koniugat. W innym aspekcie wynalazku sposób wytwarzania koniugatu poli(glikolu etylenowego) i biologicznie aktywnej cząsteczki zawierającej ugrupowanie tiolowe, charakteryzuje się tym, że aktywuje się poli(glikol etylenowy) z wytworzeniem reaktywnego ugrupowania aminowego kowalentnie związanego z poli(glikolem etylenowym), zapewnia się cząsteczkę łącznika mającą aktywne ugrupowanie sulfonowe i aktywowane ugrupowanie estru sukcynoimidylo-

11 wego, poddaje się reaktywne ugrupowanie aminowe reakcji z aktywnym ugrupowaniem estru sukcynoimidylowego z wytworzeniem aktywowanego poli(glikolu etylenowego) mającego aktywne ugrupowanie sulfonu kowalentnie związane z poli(glikolem etylenowym) i poddaje się aktywne ugrupowanie sulfonu reakcji z ugrupowaniem tiolowym biologicznie aktywnej cząsteczki z wytworzeniem koniugatu. W powyższym sposobie jako aktywne ugrupowanie sulfonowe korzystnie stosuje się -NH-OC-CH2-CH2-SO2-CH=CH2. W kolejnym aspekcie wynalazku sposób wytwarzania koniugatu poli(glikolu etylenowego) i biologicznie aktywnej cząsteczki zawierającej ugrupowanie tiolowe, charakteryzuje się tym, że aktywuje się poli(glikol etylenowy) z wytworzeniem reaktywnego ugrupowania estru sukcynimidylowego kowalentnie związanego z poli(glikolem etylenowym), zapewnia się cząsteczkę łącznika mającą aktywne ugrupowanie sulfonu i aktywne ugrupowanie aminowe, poddaje się reaktywne ugrupowanie aminowe reakcji z aktywnym ugrupowaniem estru sukcynimidylowym z wytworzeniem aktywowanego poli(glikolu etylenowego) zawierającego aktywne ugrupowanie sulfonu oraz poddaje się aktywne ugrupowanie sulfonu aktywowanego poli(glikolu etylenowego) reakcji z ugrupowaniem tiolowym aktywnej biologicznie cząsteczki z wytworzeniem koniugatu. Jako aktywne ugrupowanie sulfonu korzystnie stosuje się -CO- NH-CH2-CH2-SO2-CH-CH2. Według wynalazku sposób wytwarzania sulfonu winylowego poli(glikolu etylenowego) charakteryzuje się tym, że obejmuje etapy: (a) poddania poli(glikolu etylenowego) mającego co najmniej jedno aktywne ugrupowanie hydroksylowe reakcji ze związkiem w celu wytworzenia poli(glikolu etylenowego) podstawionego albo estrem albo halogenkiem; (b) poddania poli(glikolu etylenowego) z etapu (a) podstawionego estrem albo halogenkiem reakcji z merkaptoetanolem w celu zamiany ugrupowania estrowego lub halogenkowego na rodnik merkaptoetanolowy; (c) poddania podstawionego merkaptoetanolem poli(glikolu etylenowego) z etapu (b) reakcji ze środkiem utleniającym w celu utlenienia do sulfonu siarki w ugrupowaniu merkaptoetanolowym; (d) poddania sulfonu z etapu (c) reakcji ze związkiem w celu zamiany grupy hydroksylowej ugrupowania merkaptoetanolowego na ugrupowanie estrowe lub halogenkowe; (e) poddania sulfonu etylenowego z etapu (d) reakcji z zasadą w celu wytworzenia sulfonu winylowego poli(glikolu etylenowego). Sposób ten dodatkowo obejmuje etapy izolowania sulfonu winylowego poli(glikolu etylenowego). W tym sposobie halogenkiem z etapu (d) jest chlor i produktem etapu (d) jest sulfon chloroetylowy poli(glikolu etylenowego). Sposób powyższy obejmuje dodatkowo etapy rozpuszczania kryształów sulfonu chloroetylowego poli(glikolu etylenowego) w rozpuszczalniku organicznym przed reakcją z zasadą w celu wytworzenia sulfonu winylowego poli(glikolu etylenowego), i izolowania produktu sulfonu winylowego poli(glikolu etylenowego), przez odsączenie w celu usunięcia zasady i odparowanie rozpuszczalnika. Według wynalazku sposób wytwarzania sulfonu haloetylowego poli(glikolu etylenowego) charakteryzuje się tym, że obejmuje etapy: (a) poddania poli(glikolu etylenowego) mającego co najmniej jedno aktywne ugrupowanie hydroksylowe reakcji ze związkiem w celu wytworzenia poli(glikolu etylenowego) podstawionego albo estrem albo halogenkiem; (b) poddania poli(glikolu etylenowego) z etapu (a) podstawionego estrem albo halogenkiem reakcji z merkaptoetanolem w celu zamiany ugrupowania estrowego lub halogenkowego na rodnik merkaptoetanolowy; (c) poddania podstawionego merkaptoetanolem poli(glikolu etylenowego) z etapu (b) reakcji ze środkiem utleniającym w celu utlenienia do sulfonu siarki w ugrupowaniu merkaptoetanolowym; (d) poddania sulfonu z etapu (c) reakcji ze związkiem w celu zamiany grupy hydroksylowej ugrupowania merkaptoetanolowego na ugrupowanie halogenkowe z wytworzeniem

12 sulfonu haloetylowego poli(glikolu etylenowego). Dodatkowym etapem jest etap izolowania sulfonu haloetylowego poli(glikolu etylenowego). Niniejszy wynalazek ujawnia rozpuszczalne w wodzie i odporne na hydrolizę pochodne poli(glikolu etylenowego) ( PEG ) i podobnych polimerów hydrofilowych, które mają jedno lub kilka aktywnych ugrupowań sulfonowych. Pochodne polimerowe z aktywnymi ugrupowaniami są bardzo selektywne podczas sprzęgania z ugrupowaniami tiolowymi zamiast z ugrupowaniami aminowymi na cząsteczkach i na powierzchniach, zwłaszcza przy ph około 9 lub poniżej. Ugrupowanie sulfonowe, wiązanie pomiędzy polimerem a ugrupowaniem sulfonowym i wiązanie pomiędzy ugrupowaniem tiolowym a ugrupowaniem sulfonowym nie są zwykle odwracalne w środowiskach redukujących i są odporne na hydrolizę w ciągu długich okresów czasu w środowiskach wodnych o ph około 11 lub poniżej. Zatem za pomocą aktywnych polimerowych pochodnych sulfonowych można modyfikować charakterystykę fizyczną i chemiczną różnorodnych substancji w środowiskach wodnych stawiających ostre wymagania. Można np. optymalizować warunki modyfikowania substancji aktywnych biologicznie w celu zachowania ich dużej aktywności biologicznej. Środki farmaceutyczne, od aspiryny do penicyliny, mogą być użytecznie modyfikowane w wyniku przyłączania aktywnych polimerowych pochodnych sulfonowych, jeśli te środki farmaceutyczne są zmodyfikowane tak, aby zawierały ugrupowania tiolowe. Mogą być także użytecznie modyfikowane duże białka zawierające jednostki cysteinowe, które mają aktywne ugrupowania tiolowe. Do wprowadzania grup cysteinowych w pożądane miejsca w białku można stosować techniki z technologii rekombinantów DNA ( inżynierii genetycznej ). Te cysteiny można sprzęgać z aktywnymi polimerowymi pochodnymi sulfonowymi w celu uzyskania odpornych na hydrolizę wiązań na różnorodnych białkach, które normalnie nie zawierają jednostek cysternowych. Specyficznymi ugrupowaniami w aktywowanych polimerach według wynalazku są takie ugrupowania, które mają co najmniej dwa atomy węgla połączone z grupą sulfonową -SO2- poprzez miejsce reaktywne w dla tiolowo specyficznych reakcjach sprzęgania na atomie węgla drugim od grupy sulfonowej. Mówiąc dokładniej, aktywnymi ugrupowaniami sulfonowymi są ugrupowania sulfonu winylowego, aktywne sulfony etylowe, włącznie z sulfonami haloetylowymi i tiolospecyficzne aktywne pochodne tych sulfonów. Ugrupowanie sulfonu winylowego można przedstawić strukturalnie jako -SO2-CH= CH2 ; aktywne ugrupowanie sulfonu etylowego można przedstawić strukturalnie jako -SO2-CH2-CH2-Z, w którym Z może oznaczać halogen lub inną odszczepialną grupę, która może być podstawiona tiolem z wytworzeniem wiązania sulfonowego i tiolowego -SO2-CH2-CH2-S-W, w którym W oznacza cząsteczkę aktywną biologicznie, powierzchnię lub pewną inną substancję. Pochodne sulfonów winylowych i etylowych mogą zawierać także inne podstawniki, o ile zostanie zachowana rozpuszczalność w wodzie i tiolowo specyficzna reaktywność miejsca reaktywnego na drugim węglu. Wynalazek obejmuje odporne na hydrolizę koniugaty substancji mających ugrupowania tiolowe z pochodnymi polimerowymi mającymi aktywne ugrupowania sulfonowe. Na przykład, rozpuszczalny w wodzie, aktywowany sulfonem polimer PEG może być sprzężony z biologicznie aktywną cząsteczką w reaktywnym miejscu tiolowym. Wiązanie, za pomocą którego PEG jest sprzęgany z biologicznie aktywną cząsteczką, obejmuje ugrupowanie tiolowe sprzęgnięte z ugrupowaniem tiolowym i ma strukturę PEG-SO2-CH2-CH2-W, w której W oznacza biologicznie aktywną cząsteczką, przy czym ugrupowanie sulfonowe przed sprzęganiem PEG mogło być ugrupowaniem sulfonu winylowego lub aktywnym ugrupowaniem sulfonu etylowego. Przedmiotem wynalazku są także biomateriały zawierające powierzchnię mającą jedno lub kilka reaktywnych miejsc tiolowych i jeden lub kilka rozpuszczalnych w wodzie aktywowanych sulfonem polimerów według wynalazku sprzężonych z powierzchnią za pomocą wiązania sulfonowego i tiolowego. Biomateriały i inne substancje mogą być także sprzęgane z pochodnymi polimerów aktywowanych sulfonem poprzez wiązanie inne niż wiązanie sulfonowe i tiolowe, takie jak zwykłe wiązanie aminowe, aby pozostawić bardziej odporną na hydrolizę grupę aktywującą, a mianowicie ugrupowanie sulfonowe, dostępne do następnych reakcji.

13 Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania aktywowanych polimerów według wynalazku. Ugrupowanie zawierające siarkę jest związane bezpośrednio z atomem węgla polimeru, a następnie przeprowadzone w aktywne ugrupowanie sulfonowe. Alternatywnie można wytworzyć ugrupowanie sulfonowe przez przyłączenie środka łączącego, który ma ugrupowanie sulfonowe na jednym końcu, do zwykłego aktywowanego polimeru, tak aby uzyskany polimer miał ugrupowanie sulfonowe na swym końcu. Mówiąc dokładniej, rozpuszczalny w wodzie polimer mający co najmniej jedno aktywne ugrupowanie hydroksylowe, jest poddawany reakcji w celu wytworzenia polimeru podstawionego mającego na sobie ugrupowanie bardziej reaktywne. Wytworzony podstawiony polimer poddaje się reakcji w celu zastąpienia bardziej reaktywnego ugrupowania przez ugrupowanie zawierające siarkę, które ma co najmniej dwa atomy węgla i w którym ugrupowanie zawierające siarkę jest związane bezpośrednio z atomem węgla polimeru. Następnie ugrupowanie zawierające siarkę jest poddawane reakcjom w celu utlenienia siarki, -S-, do sulfonu, -SO2- i wprowadzenia dostatecznie reaktywnego miejsca na drugi atom węgla ugrupowania zawierającego sulfon w celu wytworzenia wiązań z ugrupowaniami zawierającymi tiol. Mówiąc bardziej dokładnie, sposób wytwarzania aktywowanych polimerów według wynalazku obejmuje poddawanie poli(glikolu etylenowego) reakcji ze związkiem aktywującym hydroksyl w celu wytworzenia estru lub z pochodną zawierającą halogen w celu wytworzenia PEG podstawionego halogenem. Uzyskany aktywowany PEG poddaje się następnie reakcji z merkaptoetanolem w celu zastąpienia ugrupowania estrowego lub halogenku rodnikiem merkaptoetanolowym. Siarkę w ugrupowaniu merkaptoetanolowym utlenia się do sulfonu. Sulfon etanolowy aktywuje się albo w wyniku aktywowania ugrupowania hydroksylowego, albo w wyniku podstawienia ugrupowania hydroksylowego bardziej aktywnym ugrupowaniem, takim jak halogen. Następnie aktywny sulfon etylowy PEG można przeprowadzić w sulfon winylowy, jeśli to jest pożądane, w wyniku rozszczepienia aktywowanego hydroksylu lub innego aktywnego ugrupowania i wprowadzenia podwójnego wiązania węgiel-węgiel w sąsiedztwie grupy sulfonowej -SO2-. Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania koniugatu substancji z pochodną polimerową, która ma aktywne ugrupowanie sulfonowe. Sposób obejmuje etap utworzenia wiązania pomiędzy pochodną polimerową i substancją, przy czym wiązanie to może być pomiędzy ugrupowaniem sulfonowym a ugrupowaniem tiolowym. Zatem, przedmiotem wynalazku są aktywowane polimery, które mają specyficzną reaktywność, są trwałe w wodzie i w środowiskach redukujących i tworzą trwalsze niż dotychczas wiązania z powierzchniami i cząsteczkami, włącznie z cząsteczkami aktywnymi biologicznie. Aktywowany polimer może być użyty do modyfikowania charakterystyk powierzchni i cząsteczek, gdy duże znaczenie ma zgodność biologiczna. Ponieważ aktywowany polimer jest trwały w środowiskach wodnych i tworzy trwałe wiązania z ugrupowaniami tiolowymi, to można wybrać warunki najbardziej odpowiednie do zachowania aktywności substancji aktywnych biologicznie i do optymalizacji szybkości reakcji sprzęgania polimerowego. Droga syntetyczna wytwarzania aktywnych sulfonów poli(glikolu etylenowego) i podobnych polimerów obejmuje co najmniej cztery etapy, w których siarka jest wiązana z cząsteczką polimeru, a następnie przeprowadzona w kilku reakcjach w aktywną sulfonową grupę funkcyjną Cząsteczka wyjściowego polimeru PEG ma co najmniej jedno ugrupowanie hydroksylowe, -OH, które może brać udział w reakcjach chemicznych i które uważa się za aktywne ugrupowanie hydroksylowe. Cząsteczka PEG może mieć kilka aktywnych ugrupowań hydroksylowych dostępnych do reakcji chemicznej, jak to objaśniono poniżej. Te aktywne ugrupowania hydroksylowe są w rzeczywistości stosunkowo mało reaktywne i pierwszym etapem syntezy jest wytwarzanie PEG z ugrupowaniem bardziej reaktywnym. Ugrupowanie bardziej reaktywne uzyskuje się zwykle jednym z dwóch sposobów - aktywacji hydroksylowej lub podstawienia hydroksylowego. Są możliwe także inne sposoby, co powinno być jasne dla fachowca, lecz dwoma sposobami stosowanymi najczęściej jest właśnie aktywacja hydroksylowa i podstawienie hydroksylowe. W sposobie aktywacji hydroksylowej, atomu wodoru -H na ugrupowaniu hydroksylowym zostaje zastąpiony grupą bardziej reaktywną. Zwykle PEG poddaje się reakcji z kwasem lub pochodną kwasu, taką jak

14 chlorek kwasowy, z wytworzeniem reaktywnego estru, w którym PEG jest związany z ugrupowaniem kwasowym poprzez wiązanie estrowe. Ugrupowanie kwasowe jest zwykle bardziej reaktywne niż ugrupowanie hydroksylowe. Estrami są zwykle estry sulfonianowe, karboksylowe i fosforowe. Halogenkami kwasów sulfonylowych przydatnymi do wykonywania wynalazku są: chlorek metanosulfonylu i chlorek p-toluenosulfonylu. Chlorek metanosulfonylu ma wzór strukturalny CH3 SO2 Cl i jest także znany jako chlorek mezylu. Estry metanosulfonylowe są niekiedy nazywane mezylanami. Chlorek p-toluenosulfonylu ma wzór strukturalny H3CC6 4 SO2Cl i jest znany także jako chlorek tozylu. Estry toluenosulfonylowe są niekiedy nazywane tozylanami. W reakcji podstawienia cała grupa -OH jest podstawiona przez bardziej reaktywne ugrupowanie, zwykle przez halogenek. Na przykład chlorek tionylu o wzorze strukturalnym SOCl2 można poddać reakcji z PEG z wytworzeniem bardziej reaktywnego PEG podstawionego chlorem. Zastąpienie ugrupowania hydroksylowego innym ugrupowaniem nazywa się niekiedy w technice aktywacją hydroksylową. Określenie aktywacja hydroksylowa powinno być odnoszone w niniejszym opisie zarówno do podstawienia, jak i do estryfikacji i do innych sposobów aktywacji hydroksylowej. Określenia grupa, grupa funkcyjna, ugrupowanie, ugrupowanie aktywne, miejsce reaktywne i rodnik są w technice chemicznej w pewnym stopniu synonimami i są stosowane w technice i w niniejszym opisie, odnosząc się do wyraźnych, możliwych do określenia części cząsteczki lub jednostek cząsteczki lub do jednostek, które wykonują pewną funkcję lub mają aktywność i są reaktywne z innymi cząsteczkami lub częściami cząsteczek. W tym sensie można uważać białko lub resztę białka za cząsteczkę albo za grupę funkcyjną lub ugrupowanie, gdy jest ono sprzężone z polimerem. Określenie PEG jest stosowane w technice i w niniejszym opisie do opisania dowolnego z kilku polimerów kondensacyjnych glikolu etylenowego o wzorze ogólnym przedstawionym za pomocą struktury H(OCH2CH2)nH. PEG jest znany także jako polioksyetylen, poli(tlenek etylenu), poliglikol i polieteroglikol. PEG może być wytwarzany w postaci kopolimerów tlenku etylenu z wieloma innymi monomerami. Poli(glikol etylenowy) jest używany do zastosowań biologicznych, ponieważ ma bardzo korzystne właściwości i jest ogólnie aprobowany do zastosowań biologicznych i biotechnicznych. PEG jest to zwykle substancja klarowna, bezbarwna, bez zapachu, rozpuszczalna w wodzie, odporna na ogrzewanie i na działanie wielu czynników chemicznych, nie ulega hydrolizie i nie psuje się oraz jest nietoksyczna. Poli(glikol etylenowy) jest uważany za zgodny biologicznie, tzn., że PEG może współistnieć z żywymi tkankami lub organizmami nie powodując szkody. Mówiąc dokładniej, PEG nie jest immunogeniczny, tzn., że nie wykazuje tendencji do wytwarzania w ciele odpowiedzi immunologicznej. Po przyłączeniu do ugrupowania spełniającego w ciele pewną pożądaną funkcję, PEG wykazuje tendencję do maskowania ugrupowania i może zmniejszać lub eliminować jakąkolwiek odpowiedź immunologiczną, dzięki czemu organizm może tolerować obecność tego ugrupowania. Zatem, PEG aktywowane sulfonem według wynalazku powinny być zasadniczo nietoksyczne i nie powinny wykazywać tendencji do odpowiedzi immunologicznej lub do powodowania blokad lub innych niepożądanych efektów. Na drugim etapie syntezy łączy się siarkę bezpośrednio z atomem węgla w polimerze w takiej postaci, że może być ona przeprowadzona w sulfon etylowy lub w pochodną sulfonu etylowego o podobnych właściwościach reaktywnych. Określenie etylowy odnosi się do ugrupowania z identyfikowalną grupą dwóch połączonych ze sobą atomów węgla. Aktywna pochodna sulfonowa PEG wymaga, aby drugi od grupy sulfonowej atom węgla w łańcuchu dostarczał miejsce reaktywne do utworzenia wiązań ugrupowań tiolowych z sulfonem. Taki wynik można uzyskać w wyniku reakcji podstawienia alkoholem aktywnego ugrupowania wytworzonego na pierwszym wymienionym powyżej etapie, którym to ugrupowaniem jest zwykle PEG podstawiony estrem lub halogenkiem, przy czym alkohol ten zawiera także reaktywne ugrupowanie tiolowe połączone z grupą etylową, a więc ugrupowanie tioetanolowe. Ugrupowanie tiolowe utlenia się do sulfonu, a drugi z kolei atom węgla od sulfonu na grupie etylowej staje się miejscem reaktywnym.

15 Związki zawierające ugrupowania tiolowe -SH są związkami organicznymi podobnymi do alkoholi, które zawierają ugrupowanie hydroksylowe -OH, z ta różnicą, że w tiolach co najmniej jedno ugrupowanie hydroksylowe jest zastąpione przez siarkę. Aktywujące ugrupowanie na pochodnej PEG z pierwszej reakcji, którym zwykle jest halogenek lub ugrupowanie kwasowe estru, jest odszczepiane od polimeru i zastępowane przez rodnik alkoholowy związku tioetanolowego. Siarka w ugrupowaniu tiolowym alkoholu jest połączona bezpośrednio z atomem węgla na polimerze. Alkoholem powinien być związek, który albo dostarcza ugrupowanie tioetanolowe do bezpośredniego przyłączenia do węgla w łańcuchu polimeru, lub który może być z łatwością przeprowadzony w ugrupowanie tioetanolowe lub podstawione ugrupowanie o podobnych właściwościach reaktywnych. Przykładem takiego alkoholu jest merkaptoetanol, który może być przedstawiony wzorem HSCH2CH2OH i który czasem nazywa się tioetanolem. Na trzecim etapie syntezy stosuje się środek utleniający w celu przeprowadzenia siarki przyłączonej do węgla w grupę sulfonową -SO2. Istnieją liczne takie środki utleniające, włącznie z nadtlenkiem wodoru i nadboranem sodu. Może być przy tym przydatny katalizator, taki jak kwas wolframowy. Jednakże wytworzony sulfon nie jest w postaci aktywnej do tioloselektywnych reakcji i jest konieczne usunięcie mało reaktywnego ugrupowania hydroksylowego alkoholu, który został dodany w reakcji podstawienia na drugim etapie. Na czwartym etapie przeprowadza się ugrupowanie hydroksylowe alkoholu dodanego na drugim etapie w postać bardziej reaktywną albo poprzez aktywowanie grupy hydroksylowej albo poprzez podstawienie grupy hydroksylowej bardziej reaktywną grupą podobnie jak na pierwszym etapie w tej sekwencji reakcji. Podstawienie odbywa się zwykle za pomocą halogenku z wytworzeniem sulfonu haloetylowego lub jego pochodnej mającej miejsce reaktywne na drugim węglu od ugrupowania sulfonowego. Zwykle drugi węgiel na grupie etylowej będzie aktywowany przez halogen chlorkowy lub bromkowy. Aktywacja hydroksylu powinna wprowadzić miejsce reaktywne o reaktywności podobnej do reaktywności estru sulfonianowego. Odpowiednimi reagentami są kwasy, halogenki kwasowe i inne związki, wymienione powyżej w pierwszym etapie reakcji, a zwłaszcza chlorek tionylu służący do podstawienia grupy hydroksylowej atomem chloru. Wytworzony polimeryczny aktywowany sulfon etylowy jest trwały, izolowany i nadaje się do tiolo-selektywnych reakcji sprzęgania. Jak pokazano w przykładach, sulfon chloroetylowy PEG jest trwały w wodzie o ph około 7 lub poniżej, lecz może być korzystnie stosowany w tiolo-selektywnych reakcjach sprzęgania w warunkach zasadowego ph co najmniej równego około 9. W reakcji sprzęgania tiolowego jest możliwe, że ugrupowanie tiolowe zastąpi chlorek, jak w następującej reakcji: PEG-SO2-CH2-CH2-Cl + W-S-H - > PEG-SO2-CH2-CH2-S-W, gdzie W oznacza ugrupowanie, z którym jest połączone ugrupowanie tiolowe SH i może być cząsteczką aktywną biologicznie, powierzchnią lub pewną inną substancją. Chociaż nie chcemy być związani przez teorię, uważamy na podstawie obserwowanej kinetyki reakcji, jak to pokazano w przykładzie III, że sulfony chloroetylowe, inne aktywowane sulfony etylowe i ich reaktywne pochodne są przeprowadzane w sulfony winylowe PEG i że to właśnie sulfon winylowy PEG lub jego pochodna jest w rzeczywistości związany z ugrupowaniem tiolowym. Nie mniej jednak, nie można odróżnić, czy wytworzone wiązanie sulfonowe i tiolowe pochodzi z aktywnego sulfonu etylowego PEG, czy też z sulfonu winylowego PEG, a zatem aktywny sulfon etylowy może być stosowany przy wartościach ph powyżej 7 w celu połączenia z grupami tiolowymi. Także sulfon winylowy PEG jest trwały i izolowany i może tworzyć wiązania tioloselektywne i odporne na hydrolizę, zwykle w ciągu znacznie krótszego czasu niż sulfon haloetylowy lub inny aktywowany sulfon etylowy, jak to objaśniono poniżej. Na piątym etapie, który też może być włączony do syntezy, aktywowany sulfon etylowy podaje się reakcji z dowolnymi zasadami, takimi jak wodorotlenek sodu lub trietyloamina, w celu wytworzenia sulfonu winylowego PEG lub jednej z jego aktywnych pochodnych do stosowania w tiolo-selektywnych reakcjach sprzęgania.

16 Jako pokazano w poniższych przykładach, a zwłaszcza w przykładzie III, sulfon winylowy PEG reaguje szybko z ugrupowaniami tiolowymi i jest odporny na hydrolizę w wodzie o ph około 11 w ciągu co najmniej kilku dni. Reakcję można przedstawić następująco: PEG-SO2-CH=CH2 + W-S-H -> PEG-SO2-CH2-CH2-S-W. Uważa się, że ugrupowania tiolowe przyłącza się poprzez podwójne wiązanie. Ugrupowanie W-S przyłącza się do końcowego CH2 podwójnego wiązania, które jest drugim węglem od grupy sulfonowej -SO2. Wodór H przyłącza się do CH podwójnego wiązania. Jednak przy ph powyżej około 9, selektywność zamiany ugrupowania sulfonowego na tiol zmniejsza się i ugrupowanie sulfonowe staje się trochę bardziej reaktywne z grupami aminowymi. Alternatywnie, do powyższej syntezy można wytwarzać sulfono-aktywowane pochodne PEG w wyniku przyłączenia do PEG aktywowanego inną grupą funkcyjną środka łączącego mającego ugrupowanie sulfonowe. Na przykład, amino-aktywowany PEG, PEG-NH2, poddaje się reakcji w korzystnych warunkach przy ph około 9 lub poniżej, z małą cząsteczką, która ma aktywne sukcynoimidylowe ugrupowanie estrowe NHS-O2C na jednym końcu i ugrupowanie sulfonowe, sulfonu winylowego -SO2-CH=CH2, na drugim końcu. Amino-aktywowany PEG tworzy trwałe wiązanie z estrem sykcynoimidylowym. Wytworzony PEG jest aktywowany za pomocą ugrupowania sulfonu winylowego na końcu i jest odporny na hydrolizę. Reakcję i wytworzony amino-aktywowany PEG można przedstawić następująco: PEG-NH2 + NHS-O2 C-CH2-CH2-SO2-CH=CH2 -> PEG-NH-OC-CH2-CH2-SO2-CH=CH2. Podobny aktywowany PEG można otrzymać w wyniku reakcji aktywowanego aminą PEG, takiego jak aktywny ester sukcynimidylowy PEG, PEG-CO2-NHS, z małą cząsteczką która na jednym końcu ma ugrupowanie aminowe, a na drugim końcu ugrupowanie sulfonu winylowego. Ester sukcynoimidylowy tworzy trwałe wiązanie z ugrupowaniem aminowym, jak następuje: PEG-CO2-NHS +NH2-CH2-CH2-SO2-CH=CH2 PEG-CO-NH-CH2-CH2-SO2-CH=CH2. Aktywne sulfony PEG według wynalazku mogą mieć dowolny ciężar cząsteczkowy i mogą być liniowe lub rozgałęzione z setkami ramion. PEG może być podstawiony lub niepodstawiony, pod warunkiem, że pozostaje co najmniej jedno miejsce reaktywne do podstawienia ugrupowaniami sulfonowymi. PEG ma zwykle średni ciężar cząsteczkowy od 200 do , a jego właściwości biologiczne mogą się zmieniać w zależności od ciężaru cząsteczkowego, stopnia rozgałęzienia i stopnia podstawienia; z tego powodu nie wszystkie tego rodzaju pochodne mogą być przydatne do zastosowań biologicznych i biotechnicznych. Do większości zastosowań biologicznych i biotechnicznych stosuje się w zasadzie liniowy, prostołańcuchowy sulfon winylowy PEG, sulfon bis(winylowy) PEG lub aktywowany sulfon etylowy PEG, w zasadzie niepodstawiony z wyjątkiem ugrupowań sulfonu winylowego lub sulfonu etylowego i, jeśli to jest pożądane, innych dodatkowych grup funkcyjnych. Do wielu zastosowań biologicznych i biotechnicznych podstawnikami mogą zwykle być grupy niereaktywne, takie jak wodór H- i metyl CH3- ( m-peg ). PEG może mieć więcej niż jedno ugrupowanie sulfonu winylowego lub ugrupowanie prekursorowe lub też PEG może być osłonięty na jednym końcu mało reaktywnym ugrupowaniem, takim jak rodnik metylowy, -CH3. Osłonięta postać może być przydatna np. wtedy, gdy jest pożądane po prostu przyłączenie łańcuchów polimerowych w różnych miejscach tiolowych wzdłuż łańcucha białkowego. Przyłączenie cząsteczek PEG do cząsteczki aktywnej biologicznie, takiej jak białko lub inny środek farmaceutyczny, lub do powierzchni, nazywa się czasem PEGilowaniem. Liniowy PEG z aktywnymi grupami hydroksylowymi na każdym końcu może być aktywowany na każdym końcu za pomocą sulfonu winylowego lub jego prekursora lub pochodnych o podobnej reaktywności, w celu uczynienia go dwufunkcyjnym. Dwufunkcyjną strukturę, np. sulfon bis(winylowy) PEG, nazywa się czasem strukturą hantli i może być ona stosowana np. jako łącznik lub rozdzielnik w celu przyłączenia cząsteczki aktywnej biologicznie do powierzchni lub w celu przyłączenia więcej niż jednej takiej cząsteczki aktywnej biologicznie do cząsteczki PEG. Odporność na hydrolizę ugrupowania sulfonowego czyni je szczególnie przydatnym do zastosowań dwufunkcyjnych lub heterodwufunkcyjnych.

17 Innym zastosowaniem sulfonu winylowego PEG i jego prekursora jest aktywowany dendrytycznie PEG, w którym kilka ramion PEG jest przyłączonych do centralnej struktury rdzeniowej. Dendrytyczne struktury PEG mogą być silnie rozgałęzione i są znane zwykle jako cząsteczki gwiaździste. Gwiaździste cząsteczki są opisane ogólnie w patencie US , Merrill, który włącza się do niniejszego opisu jako odnośnik. Sulfonowe ugrupowania mogą być stosowane do uzyskania aktywnej grupy funkcyjnej na jednym końcu łańcucha PEG wychodzącego z rdzenia i służącego jako łącznik do przyłączenia grupy funkcyjnej do ramion gwiaździstej cząsteczki. Sulfon winylowy PEG, jego prekursory i pochodne mogą być stosowane do przyłączenia bezpośrednio do powierzchni i do cząsteczek mających ugrupowanie tiolowe. Jednakże zwykle heterodwufunkcyjną pochodną PEG mającą ugrupowanie sulfonowe na jednym końcu i inne ugrupowanie funkcyjne na drugim końcu przyłącza się za pomocą tego innego ugrupowania do powierzchni lub cząsteczki. Heterodwufunkcyjną hantlowa struktura PEG, gdy jest podstawiona jednym z innych aktywnych ugrupowań, może być użyta np. do przenoszenia białka lub innej aktywnej biologicznie cząsteczki poprzez wiązania sulfonowe na jednym końcu i poprzez inne wiązanie na drugim końcu, takie jak wiązanie amidowe, w celu wytworzenia cząsteczki mającej dwie różne aktywności. Heterodwufunkcyjny PEG mający ugrupowanie sulfonowe na jednym końcu i amino-specyficzne ugrupowanie na drugim końcu może być przyłączany zarówno do cysteinowych, jak również do lizynowych frakcji białek. Można uzyskać trwałe wiązanie aminowe, a potem w miarę potrzeby może być wykorzystane w następnych tiolo-specyficznych reakcjach odporne na hydrolizę, nieprzereagowane ugrupowanie sulfonowe. Inne grupy aktywne dla heterodwufunkcyjnych sulfono-aktywowanych PEG mogą być wybrane spośród różnorodnych związków. Do zastosowań biologicznych i biotechnicznych podstawnikami są zwykłe reaktywne ugrupowania stosowane zwykle w chemii PEG do aktywowania PEG, takie jak aldehydy, sulfonian trifluoroetylu, nazywany czasem także trezylanem, ester n- hydroksysukcynoimidu, chlorek cyjanurowy, fluorek cyjanurowy, azydek acylowy, bursztynian, grupa p-diazobenzylowa, grupa 3-(p-diazofenyloksy)-2-hydroksypropoksylowa i inne. Przykłady aktywnych ugrupowań innych niż sulfonowe są podane w: Davis i in., US Patent ; Lee i in., US Patent i ; Iwasaki i in., US Patent ; Katre i in., US Patent , i ; Nakagawa i in, US Patent ; Nitecki i in., US Patent i ; Saifer, US Patent ; Zalipsky, US Patent ; Shadle i in., US Patent ; Rhee i in., US Patent ; Europejskie Zgłoszenie Patentowe ; i Międzynarodowe Zgłoszenia PCT US86/01252; GB89/01261; GB89/01262; GB89/01263; US90/03252; US90/06843; US91/06193; US92/00432; i US92/02047, których treść włącza się do niniejszego opisu jako odnośnik. Dla fachowca powinno być jasne, że omówione powyżej struktury hantlowe mogą być użyte do przenoszenia bardzo różnorodnych podstawników i kombinacji podstawników. Mogą być nimi modyfikowane środki farmaceutyczne, takie jak aspiryna, witaminy, penicylina i inne środki, zbyt liczne, aby można je wymienić; polipeptydy lub białka i fragmenty białek o różnych grupach funkcyjnych i ciężarach cząsteczkowych; komórki różnego rodzaju; powierzchnie dla biomateriałów; prawie dowolne substancje. Stosowane w niniejszym opisie określenie białko należy rozumieć w ten sposób, że obejmuje ono peptydy i polipeptydy, które są polimerami aminokwasów. Określenie biomateriał oznacza materiał, zwykle syntetyczny, czasem wykonany z plastyku, który nadaje się do wszczepiania w żywy organizm w celu naprawy uszkodzonych lub chorych części. Jako przykład biomateriału można podać sztuczne naczynia krwionośne. Jedna prostołańcuchowa pochodna PEG według wynalazku do zastosowań biologicznych i biotechnicznych ma podstawową strukturę R-(OCH2CH2)n-Y. Monomer PEG, czyli OCH2CH2, jest korzystnie w zasadzie niepodstawiony i nierozgałęziony wzdłuż głównego łańcucha polimeru. Dolny indeks n może mieć wartość od około 5 do Częściej zakres ten wynosi od około 5 do 2200, co odpowiada ciężarowi cząsteczkowemu od około 220 do Jeszcze częściej zakres ten wynosi od około 34 do 1100, co odpowiada zakresowi ciężarów cząsteczkowych od około 1100 do Większość zastosowań wykonuje się

18 przy użyciu ciężarów cząsteczkowych w zakresie od 2000 do 5000, co odpowiada wartości n od około 45 do 110. W powyższej strukturze Y oznacza -SO2-, CH=CH2 lub -SO 2-CH2-CH2-X, gdzie X oznacza halogen. R oznacza grupę taką samą jak Y lub różną od niej. R może oznaczać: H-, H3C-. CH2=CH-SO 2-, Cl-CH2-CH2-SO2-, lub polimerową grupę aktywującą różną od CH2=CH-SO 2- i Cl-CH2-CH2-SO2-, jak podawano w powyższych patentach i opublikowanych zgłoszeniach patentowych. Aktywne pochodne polimerowe są rozpuszczalne w wodzie, są odporne na hydrolizę i tworzą rozpuszczalne w wodzie i odporne na hydrolizę wiązania z grupami tiolowymi. Te pochodne uważa się za nieskończenie rozpuszczalne w wodzie lub zbliżone do nieskończonej rozpuszczalności i po sprzężeniu ich z tą pochodną mogą umożliwiać przechodzenie do roztworu cząsteczek skądinąd nierozpuszczalnych. Odporność pochodnych na hydrolizę oznacza, że wiązanie pomiędzy polimerem a ugrupowaniem sulfonowym jest trwałe w wodzie i że ugrupowanie sulfonu winylowego nie reaguje z wodą przy ph poniżej około 11 w ciągu długiego okresu czasu, co najmniej kilku dni, a możliwie w ciągu nieskończenie długiego okresu czasu, jak to pokazano w przykładzie III poniżej. Można przeprowadzić aktywowany sulfon etylowy w sulfon winylowy w warunkach zasadowego ph, uzyskując taką samą odporność. Odporność na hydrolizę wiązania tiolowego oznacza, że koniugaty aktywowanego polimeru i substancji mającej ugrupowanie tiolowe są trwałe przy wiązaniu sulfon-tiol w ciągu długich okresów czasu w środowiskach wodnych przy ph poniżej około 11. Można się spodziewać, że większość białek utraci swą aktywność w środowisku zasadowym przy ph 11 i powyżej, czyli dla fachowca jest jasne, że wiele zastosowań aktywnych sulfonowych pochodnych PEG będzie miało miejsce przy ph poniżej 11, bez względu na trwałość ugrupowania sulfonowego przy wyższym ph. Do tego, by sulfon mógł być użyteczny do modyfikowania białek i innych substancji, jest konieczne jedynie, aby sulfon był trwały w ciągu czasu pozwalającego na przereagowanie ugrupowania sulfonowego z reaktywnym ugrupowaniem tiolowym na białku lub na innej substancji. Szybkość reakcji ugrupowania sulfonowego z tiolem może się zmieniać w zależności od ph, jak pokazano w przykładzie II poniżej, od około 2 minut do 30 minut, to znaczy, że reakcja ta jest znacznie szybsza od szybkości ewentualnej hydrolizy. Przewiduje się, że sulfon winylowy będzie mógł reagować z tiolem w znacznie szerszym zakresie czasów reakcji, ponieważ jest trwały w ciągu długich okresów czasu. Także, jak pokazano w przykładzie III poniżej, w warunkach zasadowego ph sulfon chloroetylowy nie ulega hydrolizie, ale jest przeprowadzany w sulfon winylowy, który pozostaje trwały w ciągu kilku dni i jest nawet bardziej reaktywny względem grup tiolowych. Zatem, dla celów modyfikowania charakterystyki substancji także aktywne sulfony etylowe mogą być uważane za odporne na hydrolizę w ciągu dłuższych okresów czasu i w szerokim zakresie ph. Przyjmuje się, że także inne niż PEG polimery rozpuszczalne w wodzie nadają się do podobnego modyfikowania i aktywowania za pomocą aktywnego ugrupowania sulfonowego. Jako te inne polimery można wymienić: poli(alkohol winylowy) ( PVA ); inne poli(tlenki alkilenowe), takie jak poli(glikol propylenowy) ( PPG ) itp.; poli(oksyetylowane poliole), takie jak poli(oksyetylowana gliceryna), poli(oksyetylowany sorbitol), poli(oksyetylowana glukoza) itp. Polimery te mogą być homopolimerami albo kopolimerami i terpolimerami bezładnymi lub blokowymi opartymi na monomerach powyższych polimerów, o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, albo mogą być podstawione lub niepodstawione, podobne do PEG, lecz mające co najmniej jedno aktywne miejsce dostępne dla reakcji utworzenia ugrupowania sulfonowego. W następującym przykładzie I przedstawiono syntezę, izolowanie i charakteryzowanie sulfonu chloroetylowego poli(glikolu etylenowego), a następnie wytwarzanie sulfonu winylowego poli(glikolu etylenowego) z sulfonu chloroetylowego. Wytwarzanie innych polimerycznych sulfonów mających reaktywne miejsca na drugim atomie węgla od grupy sulfonowej jest podobne i etapy tego wytwarzania powinny być oczywiste dla fachowca na podstawie poniższego przykładu I i na podstawie podanych powyżej polimerów.

19 Przykład I. Synteza Etapy reakcji mogą być przedstawione strukturalnie w następujący sposób: (1) PEG-OH + CH3SO2Cl -> PEG-OSO2CH3 (2) PEG-OSO2CH3 + HSCH2CH2OH PEG-SCH2CH2OH (3) PEG-SCH2CH2OH + H2O2 -> PEG-SO2CH2CH2OH (4) PEG-SO2 CH2 CH2 OH + SOCl2 ->PEG-SO2 CH2 CH2 Cl (5) PEG-SO2CH2CH2Cl + NaOH -> PEG-SO2-CH=CH2 + HCl. Każdą z powyższych reakcji szczegółowo opisano poniżej: Reakcja 1. Reakcja 1 przedstawia wytwarzanie metanosulfonylowego estru poli(glikolu etylenowego), który jest także nazywany metanosulfonianem lub mezylanem poli(glikolu etylenowego). Tozylan i halogenki mogą być wytwarzane podobnymi sposobami, które, jak sądzimy, są oczywiste dla fachowca. W celu wytworzenia mezylanu, 25 g PEG o ciężarze cząsteczkowym 3400 wysuszono przez destylację azeotropową w 150 ml toluenu. Podczas suszenia PEG oddestylowano około połowy toluenu. 40 ml suchego dichlorometanu dodano do toluenu i roztworu PEG, następnie ochłodzono w kąpieli lodowej. Do ochłodzonego roztworu dodano 1,230 ml przedestylowanego chlorku metanosulfonylu, co odpowiada 1,06 gramorównoważnika w stosunku do grup hydroksylowych PEG, i 2, 664 ml suchej trietyloaminy, co odpowiada 1,3 gramorównoważnika w stosunku do grup hydroksylowych PEG. Stosowane w niniejszym określenie gramorównoważnik można uważać za ciężar równoważnikowy i podaje ono ilość związku, która przereaguje z gramorównoważnikiem grup hydroksylowych PEG. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono na noc, przy czym ogrzała się ona w ciągu tego czasu do temperatury pokojowej. Wytrącił się chlorowodorek trietyloamoniowy, który odsączono. Następnie zmniejszono objętość do 20 ml przy użyciu wyparki obrotowej. Mezylan wytrącono przez dodanie go do 100 ml zimnego suchego eteru etylowego. Metodą NMR stwierdzono 100-proc. konwersję grup hydroksylowych na grupy mezylanowe. Reakcja 2. Reakcja 2 przedstawia wytwarzanie merkaptoetanolu poli(glikolu etylenowego) w wyniku reakcji metylanu z merkaptoetanolem. Reakcja powoduje wyparcie rodnika metanosulfonianowego z PEG. Siarka w rodniku merkaptoetanolowym jest związana bezpośrednio z węglem w łańcuchu głównym węgiel-węgiel PEG. 20 g mezylanu w reakcji 1 rozpuszczono w 150 ml wody destylowanej. Roztwór mezylanu w wodzie ochłodzono przez zanurzenie w kąpieli lodowej. Do ochłodzonego roztworu dodano 2, 366 ml merkaptoetanolu, co odpowiada 3 gramorównoważnikom w stosunku do grup hydroksylowych PEG. Dodano także 16,86 ml 2N NaOH. Całość ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w ciągu 3 godzin, co oznacza, że powstające podczas reakcji pary skraplano w sposób ciągły i zawracano do reakcji. Wytworzony merkaptoetanol poli(glikolu etylenowego) ekstrahowano trzykrotnie dichlorometanem, stosując za każdym razem około 25 ml dichlorometanu. Frakcje organiczne połączono i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Zmniejszono objętość do 20 ml i wytrącono produkt przez dodanie go do 150 ml zimnego suchego eteru. Analiza NMR w dimetylosulfotlenku d6-dmso dała następujące piki dla PEG- SCH2CH2OH: 2,57 ppm, tryplet, -CH2-S-; 2,65 ppm, tryplet, -S-CH2-; 3,5 ppm, singlet łańcucha głównego; i 4, 76 ppm, tryplet, -OH. Pik hydroksylowy przy 4,76 ppm wskazywał na 81-proc. stopień podstawienia. Stwierdzono, że piki hydroksylowe często dawały zaniżone procentowe wartości stopnia podstawienia i dlatego przyjęto, że pik 2,65 ppm dla -S-CH2- jest pewniejszy i potwierdza 100-proc. stopień podstawienia. Reakcja 3. Reakcja 3 przedstawia utlenianie nadtlenkiem markaptoetanolu poli(glikolu etylenowego) w celu przeprowadzenia siarki S w sulfon SO2. Wytwarza się przy tym sulfon etanolowy PEG. 20 g PEG-SCH2CH2OH rozpuszczono w 30 ml 0,123 M roztworu kwasu wolframowego i ochłodzono w kąpieli lodowej. Roztwór kwasu wolframowego przygotowano przez roz-

20 puszczenie kwasu w roztworze wodorotlenku sodu o ph 11,5 i następne nastawienie ph 5,6 za pomocą lodowatego kwasu octowego. Do roztworu kwasu wolframowego i merkaptoetanolu poli(glikolu etylenowego) dodano 20 ml wody destylowanej i 2,876 ml 30% nadtlenku wodoru, co odpowiada 2,5 gramorównoważnika w stosunku do grup hydroksylowych, po czym mieszaninę reakcyjną pozostawiono na noc, aby ogrzała się w ciągu tego czasu do temperatury pokojowej. Utleniony produkt ekstrahowano trzykrotnie dichlorometanem, stosując za każdym razem około 25 ml dichlorometanu. Frakcje organiczne połączono, przemyto rozcieńczonym wodnym dwuwęglanem sodu i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Zmniejszono objętość do 20 ml. Wytrącono produkt, sulfon etanolowy PEG, przez dodanie go do zimnego suchego eteru etylowego. Analiza NMR w dimetylosulfotlenku d6-dmso dała następujące piki dla PEG- SO2CH2CH2OH: 3,25 ppm, tryplet, -CH2-SO2-; 3,37 ppm, tryplet, -SO2-CH2-; 3,50 ppm, łańcuch główny; 3,77 ppm, tryplet, -CH2OH; 5,04 ppm, tryplet, -OH. Pik hydroksylowy przy 5,04 ppm wskazywał na 85-proc. stopień podstawienia. Jednakże pik przy 3,37 ppm dla -SO2- CH2- wskazywał na 100-proc. stopień podstawienia i jest uważany za pewniejszy. Reakcja 4. Reakcja 4 przedstawia końcowy etap w syntezie, izolowaniu i charakteryzowaniu sulfonu chloroetylowego poli(glikolu etylenowego). W celu wytworzenia produktu rozpuszczono 20 g sulfonu etanolowego poli(glikolu etylenowego), PEG-SO2CH2CH2OH, w 100 ml świeżo destylowanego chlorku tionylu i roztwór ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w ciągu nocy. Chlorek tionylu destylowano nad chinoliną. Nadmiar chlorku tionylu usunięto przez destylację. Dodano 50 ml toluenu i 50 ml dichlorometanu i usunięto je przez destylację. W celu izolowania produktu rozpuszczono sulfon chloroetylowy PEG w 20 ml dichlorometanu i wytrącono przez dodanie do 100 ml zimnego suchego eteru etylowego. Wytrącony osad przekrystalizowano z 50 ml octanu etylu w celu izolowania produktu. Do scharakteryzowania produktu zastosowano magnetyczny rezonans jądrowy. Analiza NMR w dimetylosulfotlenku d6-dmso dała następujące piki dla PEG-SO2CH2CH2 Cl; 3,50 ppm, łańcuch główny; 3,64 ppm, tryplet, -CH2SO2-; 3,80 ppm, tryplet, -SO2-CH2-. Przy 3,94 ppm pojawił się mały tryplet zanieczyszczenia hydroksylowego. Obliczenie procentowego stopnia podstawienia dla tego widma było utrudnione z powodu zbliżenia ważnych pików do bardzo dużego piku łańcucha głównego. Reakcja 5. Reakcja 5 przedstawia konwersję sulfonu chloroetylowego poli(glikolu etylenowego) z reakcji w etapie 4 na sulfon winylowy poli(glikolu etylenowego) oraz izolowanie i scharakteryzowanie produktu, sulfonu winylowego. Sulfon winylowy PEG wytworzono z łatwością przez rozpuszczenie stałego sulfonu chloroetylowego PEG w rozpuszczalniku dichlorometanie i następne dodanie 2 równoważników NaOH. Roztwór przesączono w celu usunięcia zasady i rozpuszczalnik odparowano w celu izolowania produktu końcowego PEG-SO2-CH=CH2, sulfonu winylowego PEG. Sulfon winylowy PEG scharakteryzowano metodą analizy NMR w dimetylosulfotlenku d6-dmso. Analiza NMR dała następujące piki: 3,50 ppm, łańcuch główny; 3,73 ppm, tryplet, -CH2-SO2-; 6,21 ppm, tryplet, =CH2 ; 6,97 ppm, dublet dubletów, -SO2-CH-. Pik 6,97 ppm dla -SO2-CH- wskazywał na 84-proc. stopień podstawienia. Pik 6,21 ppm dla =CH2 wskazywał na 94-proc. stopień podstawienia. Miareczkowanie merkaptoetanolem i 2,2'-ditiodipirydyną wskazywało na 95-proc. stopień podstawienia. Przykład II. Reaktywność tiolo-selektywna Przykład II pokazuje, że sulfon winylowy PEG i jego prekursor, sulfon chloroetylowy PEG, są znacznie bardziej reaktywne z grupami tiolowymi (-SH) niż z grupami aminowymi (-NH2) lub z grupami iminowymi (-NH-). Związki zawierające grupy tiolowe są związkami organicznymi, które przypominają alkohole zawierające grupę hydroksylową -OH, z tą różnicą, że w tiolach tlen w grupie hydroksylowej jest zastąpiony siarką. Tiole są nazywane czasem sulfohydrylami lub merkaptanami. Sulfon winylowy PEG zawiera grupę sulfonu wi-

21 nylowego -SO2-CH= CH2. Sulfon chloroetylowy PEG zawiera grupę sulfonu chloroetylowego -SO2 CH2 CH2 Cl. Selektywność względem tioli jest ważna w przypadku modyfikowania białka, ponieważ oznacza ona, że jednostki cysteinowe (zawierające -SH) będą modyfikowane wybiórczo przed jednostkami lizynowymi (zawierającymi -NH2) i jednostkami histydynowymi (zawierającymi -NH-). Selektywność sulfonu winylowego PEG względem tioli oznacza, że PEG może być selektywnie przyłączony do jednostek cysteinowych i w ten sposób zostaje zachowana aktywność białka względem specyficznych białek i kontrolowana liczba cząsteczek PEG przyłączonych do białka. Względną reaktywność sulfonu winylowego PEG z grupami tiolowymi i aminowymi oznaczano przez pomiar szybkości reakcji sulfonu winylowego PEG z estrem metylowym N- α-acetylolizyny i z merkaptoetanolem. Ester metylowy N-α-acetylolizyny jest modelem lizyny zawierającym grupę aminową i nazwę jego skraca się do Lys-NH2. Merkaptoetanol służy jako model cysteiny zawierający grupę tiolową i nazwę jego skraca się do Cys-SH. W podobny sposób oznaczono względną reaktywność sulfonu chloroetylowego PEG. Ta cząsteczka służy jako osłonięta postać sulfonu winylowego, ponieważ jest trwała w kwasie, ale przechodzi w sulfon winylowy PEG po dodaniu zasady. Reaktywność sulfonu winylowego PEG i prekursora, sulfonu chloroetylowego PEG, zbadano przy ph: 8,0, 9,0 i 9,5. Buforami do regulowania ph były: 0,1 M fosforan o ph 8,0 i 0,1 M boran o ph 9,0 i o ph 9,5. Podczas pomiaru reaktywności merkaptoetanolu dodawano do obu buforów 5 mm kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) w celu opóźnienia konwersji tiolu na disiarczek. Podczas reakcji pochodnych PEG według wynalazku z Lys-NH2 dodawano, z jednoczesnym mieszaniem, 3mM roztwór pochodnej PEG do 0,3 mm roztworu Lys-NH2 w buforze odpowiednim dla każdej z trzech wartości zasadowego ph. Przebieg, reakcji monitorowano przez dodanie fluorescaminy do roztworu reakcyjnego w celu wytworzenia fluorescencyjnej pochodnej w wyniku reakcji z pozostającymi grupami aminowymi. Etap monitorowania wykonywano przez dodanie 50 μl mieszaniny reakcyjnej do 1,950 ml buforu fosforanowego o ph 8,0 i następnie dodanie 1,0 ml roztworu fluorescaminy, z jednoczesnym silnym mieszaniem. Roztwór fluorescaminy zawierał 0,3 mg fluorosceaminy na 1 ml acetonu. Fluorescencję mierzono 10 minut po mieszaniu. Stwierdzono wzbudzenie przy długości fali 390 nm. Emisja światła zachodziła przy 475 nm. Nie stwierdzono żadnej reakcji w ciągu 24 godzin przy ph 8,0 ani dla sulfonu winylowego PEG, ani dla sulfonu chloroetylowego PEG. Przy ph 9,5 reakcja była powolna, ale wszystkie grupy aminowe przereagowały po kilku dniach. Podczas reakcji z Cys-SH sulfonu winylowego PEG i prekursora, sulfonu chloroetylowego PEG, dodawano 2 mm roztwór pochodnej PEG do 0,2 mm roztworu Cys-SH w buforze odpowiednim dla każdej z trzech wartości zasadowego ph. Przebieg reakcji monitorowano przez dodanie 4-ditiopirydyny do roztworu reakcyjnego. 4-Ditiopirydyna reaguje z Cys-SH z wytworzeniem 4-tiopirydonu, który absorbuje światło nadfioletowe. Etap monitorowania wykonano przez dodanie 50 μl mieszaniny reakcyjnej do 0,950 ml 0,1 M buforu fosforanowego o ph 8,0 i następne dodanie 1,0 ml 2mM 4-ditiopirydyny w tym samym buforze. Absorbancję 4-tiopirydonu mierzono przy 324 nm. Zarówno sulfon winylowy PEG, jak również sulfon chloroetylowy PEG wykazywały reaktywność względem Cys-SH, przy czym sulfon winylowy PEG wykazywał większą reaktywność. Przy ph 9,0 reakcja zakończyła się w ciągu 2 minut przy użyciu sulfonu winylowego i w ciągu 15 minut przy użyciu sulfonu chloroetylowego. Jednakże reakcje te były zbyt szybkie, aby można było dokładnie oznaczyć stałe szybkości. Przy ph 8,0 reakcje były powolniejsze, ale nadal zakończyły się w ciągu 1 godziny dla sulfonu winylowego i w ciągu 3 godzin dla sulfonu chloroetylowego. Konwersja sulfonu chloroetylowego na sulfon winylowy jest znacznie powolniejsza niż reakcja sulfonu winylowego z Cys-SH. Zatem wydaje się, że szybkość reakcji sulfonu chloroetylowego z Cys-SH zależy od szybkości konwersji sulfonu chloroetylowego na sulfon winylowy. Nie mniej jednak, te szybkości reakcji były jeszcze znacznie większe niż w przypadku reakcji z Lys-NH2 -

22 Powyższe badania kinetyczne wykazują co następuje: Sulfon winylowy PEG jest znacznie bardziej reaktywny z grupami tiolowymi niż z grupami aminowymi, co wskazuje na to, że przyłączenie sulfonu winylowego PEG do białka zawierającego zarówno grupy cysteinowe, jak i lizynowe, zachodzi głównie w wyniku reakcji z cysteiną. Ponieważ reaktywność z grupami aminowymi jest zbliżona do reaktywności z grupami iminowymi, dlatego reaktywność podjednostek histydynowych będzie także znacznie mniejsza niż reaktywność z podjednostkami cysternowymi. Selektywność względem grup tiolowych jest także wyraźna przy niższych wartościach ph dla sulfonu chloroetylowego PEG i sulfonu winylowego PEG, chociaż reakcje sulfonu chloroetylowego PEG są trochę powolniejsze. Przydatność wielu pochodnych PEG jest ograniczona, ponieważ reagują one szybko z wodą i w ten sposób przeszkadzają w próbach przyłączenia pochodnej do cząsteczek i do powierzchni w warunkach środowiska wodnego. Poniższy przykład III pokazuje, że sulfon chloroetylowy PEG jest trwały w wodzie. Przykład III. Odporność na hydrolizę Sulfon winylowy PEG rozpuszczono w ciężkiej wodzie, tlenku deuteru D2 O, i monitorowano metodą NMR. Reakcja nie zachodziła. Roztwór sulfonu chloroetylowego PEG wytworzył sulfon winylowy PEG w ciężkiej wodzie, którą buforowano boranem do ph 9,0. Monitorowanie metodą NMR pokazało, że po wytworzeniu sulfon winylowy PEG jest trwały w ciężkiej wodzie w ciągu 3 dni. Sulfon chloroetylowy PEG jest trwały w wodzie, dopóki roztwór nie stanie się zasadowy, po czym ulega konwersji na sulfon winylowy. Wykazano konwersję na sulfon winylowy przez rozpuszczenie sulfonu chloroetylowego w wodzie o ph 7 i w buforze boranowym o ph 9. Pochodną PEG ekstrahuje się do chlorku metylenu. Po usunięciu chlorku metylenu analiza NMR wykazała, że sulfon chloroetylowy PEG jest trwały przy obojętnym ph 7,0 i reaguje z zasadą z wytworzeniem sulfonu winylowego PEG. Sulfon winylowy jest trwały w ciągu kilku dni, nawet przy zasadowym ph. Znaczna odporność na hydrolizę i tiolo-specyficzna reaktywność sulfonu winylowego PEG oznacza, że sulfon winylowy PEG i jego prekursor są przydatne do modyfikowania cząsteczek i powierzchni w środowisku wodnym, jak to pokazuje następny przykład IV. Przykład IV. Sprzęganie białka Dwoma sposobami wykazano modyfikowanie białka w wyniku przyłączenia pochodnej PEG do albuminy surowicy wołowej (BSA, od -bovine serum albumine). BSA jest białkiem. Rodzima niemodyfikowana BSA zawiera grupy cystynowe, które nie zawierają grup tiolowych. Jednostki cystynowe są związane za pomocą wiązań disiarczkowych S-S. W pierwszym sposobie, sulfon winylowy m-peg o ciężarze cząsteczkowym 5000 poddawano reakcji z niemodyfikowaną BSA w ciągu 24 godzin w 0,1 M buforze boranowym o ph 9,5 w temperaturze pokojowej. 1 ml roztworu zawierał 1mg BSA i 1 mg sulfonu winylowego m-peg o ciężarze cząsteczkowym Wyniki uzyskane dla związku modelowego z przykładu II pokazały, że podjednostki lizyny (i ewentualnie podjednostki histydyny) mogą być modyfikowane w tych dość zasadowych warunkach i pod nieobecność wolnych grup tiolowych dostępnych dla reakcji. Przyłączenie do podjednostek lizynowych wykazano dwoma sposobami: Po pierwsze, chromatografia wykluczania według wielkości (SEC) pokazała, że ciężar cząsteczkowy białka zwiększył się o około 50%, co wskazuje na przyłączenie około 10 cząsteczek PEG do cząsteczki białka. Po drugie, analiza za pomocą fluorescaminy wykazała, że liczba grup lizynowych w cząsteczce BSA zmniejszyła się o około 10. W drugim sposobie, BSA poddano działaniu tributylofosfiny w celu zredukowania wiązań disiarczkowych S-S do grup tiolowych -SH, które są dostępne dla reakcji. Modyfikowany BSA poddano następnie działaniu sulfonu chloroetylowego PEG przy ph 8,0 w 0,1 M buforze fosforanowym w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny. 1 ml roztworu zawierał 1 mg modyfikowanej BSA i 1 mg sulfonu chloroetylowego m-peg o ciężarze cząsteczkowym Wyniki pokazały, że grupy lizynowe były niereaktywne w tych warunkach. Jednak grupy tiolowe były reaktywne.

23 Przyłączenie PEG do białka wykazano metodą chromatografii wykluczania według wielkości, która pokazała, że ciężar cząsteczkowy białka zwiększył się o około 25%. Analiza za pomocą fluorescaminy wykazała, że liczba podjednostek lizyny w białku nie zmieniła się, co potwierdziło fakt, że przyłączenie PEG nie miało miejsca na podjednostkach lizyny. W ten sposób potwierdzono podstawienie na grupach tiolowych. Wynalazek zastrzeżony w niniejszym opisie przedstawiono dla kilku szczegółowych przykładowych rozwiązań. Jednak powyższy opis nie ma ograniczać wynalazku do podanych przykładowych rozwiązań i fachowiec powinien móc rozpoznać, że mogą być wprowadzane zmiany w ramach zakresu i celu wynalazku, jak to opisano w powyższym opisie. Przeciwnie, wynalazek obejmuje wszelkie alternatywy, modyfikacje i odpowiedniki, jakie mogą być włączone w ramach rzeczywistego zakresu i celu wynalazku, określonych w załączonych zastrzeżeniach patentowych.