Zastosowanie reakcji duplex real-time PCR do identyfikacji wirusów grypy podtypu A(H1)pdm09 i A(H3)

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2012, 64: Zastosowanie reakcji duplex real-time PCR do identyfikacji wirusów grypy podtypu A(H1)pdm09 i A(H3) Development of duplex real-time PCR assay for identification of influenza viruses of subtype A(H1)pdm09 and A(H3) Ilona Stefańska 1, Tomasz Dzieciątkowski 2, Lidia B. Brydak 1,3, Magdalena Romanowska 1 1 Zakład Badania Wirusów Grypy. Krajowy Ośrodek ds. Grypy, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego-Państwowy Zakład Higieny, Warszawa 2 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny 3 Katedra Mikrobiologii i Immunologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Szczeciński Zaprojektowano zestaw starterów i sond oraz zoptymalizowano warunki reakcji real-time PCR w formacie duplex do różnicowania wirusów grypy typu A, obejmujących podtyp A(H1)pdm09 oraz A(H3). Opracowana metoda może być stosowana w wirusologicznym nadzorze nad grypą, a także diagnostyce laboratoryjnej wykonywanej na potrzeby pacjenta. ABSTRACT Introduction: Among different laboratory techniques used in influenza surveillance, methods based on molecular biology, such as real-time PCR, play increasingly important role. They allow detection and identification of viruses currently circulating in human population and responsible for infections and diseases. The aim of the study was to develop duplex real-time PCR assay for detection and differentiation of influenza virus subtype A(H1N1) pdm09 and A(H3N2). Methods: Specific primers targeting a highly conservative region of haemagglutinin gene and a dual-color TaqMan probes, labeled with fluorophore JOE (560 nm) and quencher BHQ-1 or CalFluor Red 610 (610 nm) and BHQ-2 were designed. The specificity of duplex reaction was evaluated using RNA isolated from reference strains of influenza virus A(H1N1)pdm09, A(H3N2), A(H1N1) and A(H5N1), B and other respiratory pathogens. Sensitivity of the assay was tested using serial dilutions of plasmid constructs carrying fragment of specific viral HA gene, in range between 10 and 10 5 copies/sample. A number of 116 clinical samples were 1 Praca naukowa finansowana ze środków na naukę w latach jako projekt badawczy nr N N

2 130 I. Stefańska i inni Nr 2 tested using developed duplex qpcr assay in comparison with the CDC monoplex assay. Results: Positive duplex qpcr results were obtained only in samples containing RNA of influenza viruses of a specific subtype. The limit of detection (LOD) of developed method amounted up to 27 copies/sample for A(H1N1)pdm09 and up to 37 copies/sample for A(H3N2). Conclusions: The results show that developed TaqMan-based duplex qpcr assay is a valuable diagnostic tool in influenza virus surveillance for using in direct study of clinical specimens as well as identification of isolated strains of influenza virus. Scientific study financed by the sources provided for science in years as the scientific project no. N N WSTĘP W nadzorze nad grypą znajdują zastosowanie różne techniki laboratoryjne, umożliwiające wykrywanie i identyfikację wirusów aktualnie krążących w populacji i odpowiedzialnych za wywoływanie zakażeń i zachorowań. W pierwszym etapie korzysta się zazwyczaj z szybkich metod diagnostycznych, umożliwiających uzyskanie wyniku w ciągu tego samego dnia lub kilku dni, co jest istotne ze względu na cotygodniową częstotliwość raportowania danych wymaganą przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) oraz Europejskie Centrum ds. Zapobiegania i Kontroli Chorób (ECDC) (5, 17). Znajdują tutaj zastosowanie techniki oparte na amplifikacji kwasów nukleinowych (PCR, real-time PCR), pozwalające na wykrywanie sekwencji swoistych dla danego patogenu oraz techniki immunofluorescencyjne (IF) lub immunoenzymatyczne (ELISA) pozwalające wykrywać swoiste antygeny wirusowe (8, 12, 17). Drugim etapem badań w wirusologicznym nadzorze nad grypą, niejednokrotnie czasochłonnym, ale niezbędnym zwłaszcza z punktu widzenia doboru odpowiednich szczepów do produkcji szczepionki przeciwko grypie, jest izolacja wirusa w hodowli komórkowej lub zarodkach kurzych, a następnie identyfikacja wyizolowanego szczepu wyżej wymienionymi metodami, tj. PCR, real-time PCR, IF lub ELISA oraz charakterystyka izolatu poprzez przeprowadzenie analizy antygenowej i/lub genetycznej. Obecnie, spośród szybkich metod diagnostycznych coraz powszechniej w laboratoriach stosowane są testy PCR oraz real-time PCR (qpcr) (11). Obie powyższe metody mogą być ukierunkowane na wykrycie jednej sekwencji docelowej lub w formacie multiplex na wykrycie wielu sekwencji w jednej reakcji. Realizując cele nadzoru nad grypą oczekuje się, by potwierdzone przypadki zakażeń wywołanych wirusami grypy A były identyfikowane z dokładnością do podtypu (17). Tym samym w każdym przypadku podejrzenia grypy typu A powinno zostać przeprowadzone badanie przynajmniej w kierunku podtypów A(H1) i A(H3), jako najczęściej wywołujących zakażenia u ludzi i niejednokrotnie wspólnie krążących w danym sezonie epidemicznym (15, 18). Przy zastosowaniu do tego celu metody PCR lub qpcr w formacie monoplex, wymagałoby to przeprowadzenia dwóch niezależnych reakcji. Dlatego też celem badań prezentowanych w niniejszym artykule było zaprojektowanie odpowiednich starterów i sond oraz dobór i zoptymalizowanie warunków reakcji w formacie duplex do

3 Nr 2 Real time PCR w identyfikacji wirusów grypy 131 określenia podtypów hemaglutyniny wirusów grypy A, A(H1N1)pdm09 i A(H3N2) obecnie krążących w populacji. MATERIAŁ I METODY Startery i sondy fluorescencyjne typu TaqMan zaprojektowano do konserwatywnych sekwencji kodujących białko hemaglutyniny (HA) wirusa grypy podtypu A(H1N1)pdm09 oraz A(H3N2). Regiony konserwatywne i jednocześnie unikatowe dla danego podtypu ustalono na podstawie porównania sekwencji kilkudziesięciu szczepów dostępnych w bazie GenBank oraz The Influenza Sequence Database. Oligonukleotydy zaprojektowano z wykorzystaniem oprogramowania LightCycler Probe Design 2 (Roche Diagnostics ). Ich swoistość sprawdzono in silico wykorzystując program BLAST, a następnie w standardowym PCR połączonym z elektroforetyczną analizą otrzymanych produktów w 2% żelu agarozowym. Możliwość tworzenia struktur drugorzędowych oraz homo- i hetero-dimerów analizowano programem OligoAnalyzer 3.1. Na podstawie wyników wykonanych analiz dobrano najbardziej optymalny zestaw startery/sonda do wykrywania podtypu A(H1)pdm09 oraz A(H3). Jedną sondę wyznakowano na końcu 5 fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym JOE (560 nm), a na końcu 3 wygaszaczem BHQ-1, drugą odpowiednio fluoroforem Cal Fluor Red 610 (610 nm) oraz BHQ-2. W oparciu o zaprojektowane sondy i startery opracowano reakcję duplex two-step qpcr do jednoczesnego wyrywania wirusa grypy podtypu A(H1)pdm09 oraz A(H3). Real-time PCR wykonywano z użyciem aparatu LightCycler 2.0 i zestawu LightCycler TaqMan Master Mix (Roche Diagnostics ). Stężenia starterów i sondy oraz warunki reakcji dupleksowej dobrano eksperymentalnie. Odczyt fluorescencji odbywał się przy długościach fali odpowiednich dla zastosowanych barwników reporterowych (560 nm i 610 nm). Wzrost poziomu fluorescencji był proporcjonalny do ilości produktu w mieszaninie. Swoistość reakcji dupleksowych sprawdzano wykorzystując jako matrycę RNA wyizolowane z różnych szczepów referencyjnych wirusa grypy podtypu A(H1N1)pdm09, A(H3N2), A(H1N1) i A(H5N1), typu B, jak i szczepów referencyjnych innych wirusów oraz bakterii wywołujących zakażenia układu oddechowego, tj. wirusa RS typu A i B (RSV- -A, RSV-B), paragrypy typu 1, 2 i 3 (PIV-1, -2, -3), ludzkiego koronawirusa (hcov) OC43 i NL63, ludzkiego metapneumowirusa (hmpv), ludzkiego adenowirusa typu 4 (hadv-4), ludzkiego rinowirusa (hrv), S. pneumoniae (ATCC 6301), K. pneumoniae (ATCC 4211) oraz H. influenzae (ATCC 9006). Jako kontrolę ujemną reakcji wykorzystano RNA wyizolowane z niezakażonej linii komórkowej MDCK. RNA izolowano z objętości 140 μl zestawem QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen ), zgodnie z instrukcją producenta. Odwrotną transkrypcję przeprowadzano zestawem Transcriptor First Strand cdna Synthesis Kit z losowymi heksamerami (Roche Diagnostics ). Do określenia czułości metody oraz zakresu jej liniowości wykorzystano plazmidy pbluescript z wklonowanym fragmentem cdna (385 nukleotydów) obejmującym region genu HA (Epoch LifeScience ), do którego zaprojektowano uprzednio startery i sondę. Plazmidy namnażano w hodowlach płynnych transformowanych kompetentnych komórek E. coli szczepu DH5α. Do izolacji plazmidowego DNA stosowano zestaw Plasmid Midi AX (A&A Biotechnology ), a stężenie oczyszczonego DNA mierzono spektrofotometrycznie.

4 132 I. Stefańska i inni Nr 2 Rozcieńczenia ciętych restryktazą PdiI (MBI Fermentas ) plazmidów wykonywano w jałowej, wolnej od RN-az i DN-az wodzie w zakresie od 10 0 do 10 5 kopii/próbkę. Granicę wykrywalności metody (LOD) ustalono jako najniższe stężenie cdna, które zostanie wykryte z 95% prawdopodobieństwem przy badaniu co najmniej 24 próbek stanowiących powtórzenia 5-ciu rozcieńczeń DNA plazmidowego w dziesiętnej skali logarytmicznej (1). Materiał kliniczny do badań stanowiło 116 próbek wymazów z nosa i gardła pobranych od chorych w sezonie epidemicznym 2008/2009 (n=27), 2009/2010 (n=55) i 2010/2011 (n=34). We wszystkich próbkach wykrywano równolegle RNA wirusa grypy A(H1N1) pdm09, A(H3N2) i B z wykorzystaniem reakcji monopleksowej one-step qpcr ze starterami i sondą rekomendowanymi przez Center for Disease Control and Prevention (CDC). Do badań w charakterze kontroli ujemnej włączono także 20 próbek płynu pęcherzykowo-oskrzelikowego (BALF), pobranych od pacjentów bez klinicznych i radiologicznych objawów zakażenia dolnych dróg oddechowych. Materiał ten uzyskano podczas diagnostycznej bronchoskopii, do której wskazanie stanowiły nieinfekcyjne choroby płuc lub śródpiersia. WYNIKI I OMÓWIENIE Na genom wirusa grypy składa się osiem odrębnych segmentów jednoniciowego RNA o ujemnej polarności, co pociąga za sobą brak mechanizmów zapewniających korekcję błędów pojawiających się podczas replikacji wirusa oraz stwarza możliwość zajścia reasortacji, tym samym sprzyja ciągłej ewolucji wirusa (16). Najbardziej znaczące zmiany zachodzą w przypadku dwóch genów kodujących glikoproteiny będące głównymi antygenami powierzchniowymi, HA (segment 4) i NA (segment 6). Wysoki współczynnik mutacji oraz ogromna zmienność w obrębie tych genów doprowadziły do wyróżnienia 16 podtypów HA (oznaczonych od H1 do H16) oraz 9 podtypów NA (oznaczonych od N1 do N9) (6). W obrębie poszczególnych podtypów znane są także różne warianty, co dodatkowo utrudnia opracowanie swoistej reakcji ukierunkowanej tylko na jeden określony podtyp wirusa grypy. Startery i sondy wykorzystane w reakcji zaprojektowano do regionów wysoce konserwatywnych w obrębie genu kodującego HA u wirusów podtypu A(H1N1)pdm09 i A(H3N2), jednocześnie swoistych tylko dla wykrywanego podtypu. Swoistość reakcji potwierdzono na każdym z trzech etapów, obejmujących analizę in silico z wykorzystaniem programu BLAST, standardowy PCR z analizą produktów w żelu agarozowym oraz real-time PCR, przy czym obie metody wykonywano z matrycą swoistą (A(H1N1)pdm09/A(H3N2)) i nieswoistą (typ B, podtyp A(H3N2)/A(H1N1)pdm09, A(H1N1), A(H5N1), inne czynniki etologiczne wywołujące zakażenia układu oddechowego podane w materiałach i metodach). Analiza BLAST wykluczyła występowanie sekwencji homologicznych w ludzkim genomie oraz materiale genetycznym wirusów grypy innego typu/podtypów, a w reakcji PCR połączonej z analizą elektroforetyczną nie obserwowano niespecyficznych produktów, co świadczy o wysokiej swoistości zaprojektowanej reakcji. W opracowanej metodzie duplex real-time PCR wynik dodatni, wyrażony wykładniczym przyrostem fluorescencji w mieszaninie reakcyjnej, uzyskano tylko dla próbek zawierających materiał genetyczny wirusa grypy swoistego podtypu. W pozostałych próbkach, zawierających kontrolne cdna z niezakażonej linii MDCK oraz nieswoistą matrycę, nie zaobserwowano wzrostu fluorescencji (Ryc. 1). Po rozdziale elektroforetycznym uzyskanych w reakcji produktów, nie stwierdzono niespecyficznych amplikonów.

5 Nr 2 Real time PCR w identyfikacji wirusów grypy 133 Tabela I. Sekwencje zaprojektowanych starterów i sond do wykrywania wirusa grypy podtypu A(H1) pdm09 i A(H3). Nazwa Sekwencja (5 3 ) Długość Pozycja amplikonu nukleotydowa H1v_F GTATTATCATTTCAGATACACCAGTCC * H1v_R GACATTTTCCAATTGTGATCGG 119 pz * H1v_P JOE-AACACCAGCCTCCCATTTCAGAA-BHQ * H3_F TTGATTAACAGCACAGGGAATCTA ** H3_R TGCATTCAGAATTGCATTTGCC ** 114 pz CalFluor Red H3_P ** 610-AGCTCAATAATGAGATCAGATGCACC- BHQ2 * wg sekwencji szczepu referencyjnego A(H1N1)pdm09 o nr FJ (GenBank) ** wg sekwencji szczepu referencyjnego A(H3N2) o nr GQ (GenBank) Sekwencje starterów i sond zostały przedstawione w tabeli I. Mieszanina reakcyjna po optymalizacji obejmowała: 4µl LC TaqMan MasterMix, 1 µm startera H3_ F i H3_R oraz 1,5 µm startera H1v_ F i H1v_R, po 150 nm każdej z sond, 3-5µl cdna oraz wodę do końcowej objętości 20 µl. Reakcję rozpoczynał pojedynczy etap aktywacji (hot-start) termostabilnej DNA polimerazy przez 10 min. w 95ºC, po którym następowało 40 cykli składających się z denaturacji w 95ºC przez 10 sek., przyłączania starterów w 60ºC przez 20 sek. oraz wydłużania nici w temp. 72ºC przez 5 sek. Real-time PCR kończyło schładzanie próbek do 40ºC przez sek. Odczyt fluorescencji odbywał się na koniec każdego cyklu wydłużania przy długości fali 560 nm i 610 nm, właściwej dla odpowiednio fluoroforu JOE i CalFluor Red 610. Podczas ustalania zakresu liniowości metody stwierdzono, że użyta metoda real-time PCR umożliwiała wykrycie matrycy we wszystkich badanych rozcieńczeniach (Ryc. 2, A i B). Świadczy to o szerokim zakresie liniowości opracowanej reakcji. Przy użyciu opisanego uprzednio algorytmu (Burns i Valdiva, 2008) wyznaczono także granicę wykrywalności metody, która wynosiła 27 kopii/próbkę w przypadku wirusa A(H1N1)pdm09 oraz 37 kopii/ próbkę w przypadku wirusa A(H3N2) (1). W kolejnym etapie badań oceniano wartość kliniczną opracowanej reakcji duplex real- -time PCR. Wzrost poziomu fluorescencji, będący następstwem przyrostu ilości produktu w mieszaninie zaobserwowano w 78 próbkach materiału klinicznego, spośród których 61 było dodatnich dla wirusa A(H1)pdm09, a 17 dla wirusa A(H3). W pozostałych 38 próbkach nie wykazano obecności sekwencji typowych dla wykrywanych podtypów wirusa. Uzyskane wyniki były zgodne z wynikami reakcji z zastosowaniem starterów rekomendowanych przez CDC, które wykazały obecność RNA A(H1N1)pdm09 w 61 próbkach i A(H3N2) w 17 próbkach. Spośród 38 próbek ujemnych w reakcji duplex real-time PCR, w 19 próbkach przebadanych metodą wg CDC wykryto wirusa typu B (w tym w jednej próbce wykryto także wirusa A(H1N1)pdm09), a w 20 nie stwierdzono badanych wirusów grypy. W żadnej z 20 próbek BALF pochodzących od pacjentów bez objawów zakażenia dolnych dróg oddechowych nie stwierdzono wzrostu fluorescencji. Duża zmienność wirusów grypy, zwłaszcza wirusa grypy A, w tym pojawianie się nowych wariantów, jak A(H1N1)pdm09 w 2009 r., sprawia, że opracowywanie nowych reakcji PCR z nowymi zestawami starterów i sond pozostaje stale aktualną potrzebą. Spośród wielu

6 134 I. Stefańska i inni Nr 2 Ryc. 1. Wynik reakcji qpcr w kierunku wykrywania i różnicowania wirusa grypy A(H1)pdm09 oraz A(H3). Krzywe widoczne na wykresach oznaczają amplifikację cdna szczepów wzorcowych wirusa grypy A(H1)pdm09 (A) oraz A(H3) (B). * H1v oznacza A(H1)pdm09 publikacji na ten temat, opisujących reakcje real-time PCR w formatach multiplex, nieliczne są jednak doniesienia obejmujące jednoczesne podtypowanie w jednej reakcji ostatnio krążących szczepów wirusa grypy A, tj. A(H1N1)pdm09 i A(H3N2) (2, 10). Więcej prac skupia się natomiast na rozróżnianiu jedynie typów wirusa A i B, ewentualnie włącza do tego schematu reakcji wykrywanie wyłącznie jednego podtypu wirusa, zwykle A(H5N1) lub

7 Nr 2 Real time PCR w identyfikacji wirusów grypy 135 2A 2B Ryc. 2. Wyniki reakcji qpcr oceniających zakres liniowości opracowanej metody do wykrywania i różnicowania wirusa grypy A(H1)pdm09 (Ryc. 2A) oraz A(H3) (Ryc. 2B). * H1v oznacza A(H1)pdm09; K kontrolę ujemną

8 136 I. Stefańska i inni Nr 2 A(H1N1)pdm09 lub też całkowicie ogranicza się do wykrywania jednego podtypu (3, 4, 7, 9, 13, 14). Niniejsza praca przedstawia natomiast warunki przeprowadzenia reakcji duplex real-time PCR z użyciem zaprojektowanego zestawu starterów i sond do wykrywania i różnicowania zakażeń wywołanych przez wirusy grypy podtypu A(H1N1)pdm09 i A(H3N2). Rezultaty, dotyczące swoistości reakcji i jej czułości z użyciem matrycy pochodzącej ze szczepów referencyjnych, jak i próbek klinicznych wskazują na możliwość zastosowania opracowanej przez autorów metody do badań prowadzonych w ramach nadzoru nad grypą, przy czym może ona mieć zastosowanie zarówno do bezpośredniego badania próbek klinicznych, jak i do wstępnej identyfikacji izolowanych szczepów wirusa grypy. Podziękowania Autorzy składają podziękowania st. tech. Pani Urszuli Dorocie Ostapiuk z Zakładu Badania Wirusów Grypy. Krajowego Ośrodka ds. Grypy w NIZP-PZH za przygotowanie szczepów referencyjnych wirusa grypy wykorzystywanych przy opracowywaniu i optymalizacji reakcji real-time PCR. PIŚMIENNICTWO 1. Burns M, Valdiva. Modelling the limit of detection in real-time quantitative PCR. Eur Food Res Technol; 2008; 226: Chen Y, Cui D, Zheng S i inni. Simultaneous detection of influenza A, influenza B, and respiratory syncytial viruses and subtyping of influenza A H3N2 virus and H1N1 (2009) virus by multiplex real-time PCR. J Clin Microbiol; 2011; 49: Chidlow G, Harnett G, Williams S i inni. Duplex real-time reverse transcriptase PCR assays for rapid detection and identification of pandemic (H1N1) 2009 and seasonal influenza A/H1, A/H3, and B viruses. J Clin Microbiol; 2010; 48: Ellis JS, Curran MD. Simultaneous molecular detection and confirmation of influenza AH5, with internal control. Methods Mol Biol; 2011; 665: European Centre for Disease Prevention and Control. Influenza surveillance in Europe Stockholm: ECDC; December 2011, Fereidouni SR, Beer M, Vahlenkamp T i inni. Differentiation of two distinct clusters among currently circulating influenza A(H1N1)v viruses, March-September Euro Surveill 2009; 14(46), 19 November 2009, Huber I, Campe H, Sebah D i inni. A multiplex one-step real-time RT-PCR assay for influenza surveillance. Euro Surveill 2011; 16(7), 17 February 2011, Manuguerra J-C, Hannoun C: Influenza and other viral respiratory diseases. Surveillance and laboratory diagnosis. Institut Pasteur. Paris Ng EK, Cheng PK, Ng AY i inni. Influenza A H5N1 detection. Emerg Infect Dis; 2005;11: Qin M, Wang DY, Huang F i inni: Development of single-tube multiplex real-time PCR for simultaneous detection of novel influenza A H1N1 and human seasonal influenza A H1N1 and H3N2 virus. Bing Du Xue Bao; 2010; 26: Romanowska M, Stefańska I, Donevski S i inni. Infections with A(H1)2009 influenza virus in Poland during the last pandemic the experiences of the National Influenza Center. Adv Exp Med Biol 2012; (w druku). 12. Stefańska I, Romanowska M, Brydak LB. Metody wykrywania wybranych wirusów wywołujących zakażenia układu oddechowego. Postępy Hig Med Dośw 2012; (w druku).

9 Nr 2 Real time PCR w identyfikacji wirusów grypy Templeton KE, Scheltinga SA, Beersma MFC i inni. Rapid and sensitive method using multiplex real-time PCR for diagnosis of infections by influenza A and influenza B viruses, Respiratory Syncytial Virus, and Parainfluenza Viruses 1, 2, 3, and 4. J Clin Microbiol; 2004; 42: van Elden LJ, Nijhuis M, Schipper P i inni. Simultaneous detection of influenza viruses A and B using real-time quantitative PCR. J Clin Microbiol; 2001; 39: Webster RG: Influenza: an emerging microbial pathogen. W: Emerging Infections. Red. Academic Press, 1998, Webster RG, Bean WJ, Gorman OT i inni. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol Rev; 1992; 56: World Health Organization: Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza. 2011, 1-140, World Health Organization. Review of the winter influenza season, northern hemisphere. Weekly Epid Rec 2011; 22(86): , Otrzymano: 6 III 2012 r Adres Autora: Warszwa, ul. Chocimska 24, Zakład Badania Wirusów Grypy. Krajowy Ośrodek ds. Grypy, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego-Państwowy Zakład Higieny i.stefanska@gmail.com

10