Mutacje onkogenu BCR-ABL u chorych z CML leczonych imatynibem: ocena związku z kliniczną, cytogenetyczną i molekularną progresją choroby

Transkrypt

1 PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 3, str MARTA BARAŃSKA, KRZYSZTOF LEWANDOWSKI, MICHAŁ GNIOT, MARIA LEWANDOWSKA, MIECZYSŁAW KOMARNICKI Mutacje onkogenu BCR-ABL u chorych z CML leczonych imatynibem: ocena związku z kliniczną, cytogenetyczną i molekularną progresją choroby BCR-ABL gene mutations in CML patients treated with imatinib: relation with clinical, cytogenetic and molecular disease progression Katedra i Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych Układu Krwiotwórczego Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Kierownik: Prof. dr hab. Mieczysław Komarnicki STRESZCZENIE Celem pracy była ocena obecności mutacji punktowych domen kinazy BCR-ABL w trakcie leczenia imatynibem chorych na przewlekłą białaczkę szpikową, a takŝe związku pomiędzy obecnością mutacji onkogenu BCR-ABL a progresją kliniczną, cytogenetyczną i molekularną. Do grupy badanej zakwalifikowano 46 chorych na przewlekłą białaczkę szpikową leczonych imatynibem doustnie w dawce 400 mg dziennie. W podgrupie 1 znalazło się 18 chorych, którzy otrzymali imatynib jako leczenie pierwszoliniowe, a w podgrupie 2 28 chorych uprzednio leczonych interferonem alfa z arabinozydem cytozyny (IFN+AraC), hydroksykarbamidem (HU) lub transplantacją allogenicznych macierzystych komórek hematopoetycznych (allosct). W podgrupie 1 w trakcie 40 miesięcznej obserwacji skumulowane prawdopodobieństwo uzyskania całkowitej remisji hematologicznej (CHR) oceniono na 94%, całkowitej odpowiedzi cytogenetycznej (CCyR) na 90% oraz większej odpowiedzi molekularnej (MMR) na 74%. U chorych naleŝących do podgrupy 2 odsetki te były w większości niŝsze i wynosiły odpowiednio 96%, 72% oraz 38%. Stwierdzono, Ŝe prawdopodobieństwo uzyskania MMR jest większe u chorych, którzy w 12 miesiącu terapii uzyskali przynajmniej większą odpowiedź cytogenetyczną (MCyR) lub redukcję ilości onkogenu BCR-ABL o przynajmniej 2 log. Oporność mutacyjną potwierdzono u 20% chorych leczonych imatynibem od chwili rozpoznania oraz u 30,8% chorych będących w fazie późnej przewlekłej CML (uprzednio leczonych IFN, HU lub allosct). U badanych chorych zidentyfikowano obecność następujących mutacji punktowych onkogenu BCR-ABL: M244V, D276G, F317L (2 osoby) oraz F359I. Dodatkowo wykazano, Ŝe ryzyko wystąpienia mutacji jest znamiennie wyŝsze u chorych, którzy po 12 miesiącach terapii imatynibem nie uzyskali przynajmniej MCyR. Wykazano takŝe, Ŝe uzyskanie redukcji ilości kopii transkryptu BCR- ABL o 3 log w 12 miesiącu terapii znacznie zmniejsza ryzyko wystąpienia oporności mutacyjnej. SŁOWA KLUCZOWE: Przewlekła białaczka szpikowa Imatynib Oporność Mutacje onkogenu BCR-ABL

2 646 M. BARAŃSKA i wsp. SUMMARY The aim of the study was the assessment of the appearance of BCR-ABL kinase domain point mutations during imatinib treatment of CML patients. Additionally, the relation of the presence of BCR-ABL oncogene mutation and clinical, cytogenetic and molecular progression was evaluated. Forty six CML patients treated with imatinib in the dose of 400 mg daily have been qualified to the study group. They were divided into: subgroup 1 including eighteen patients treated with first-line imatinib, and subgroup 2- consisted of twenty eight patients treated previously with interferon alfa with low-dose cytarabine (IFN+AraC), hydroxyurea (HU) or allotransplantation of hematopoietic stem cells (allosct). In subgroup 1, during a 40-month observation, the cumulative probability of complete hematological remission (CHR) was 94%, complete cytogenetic response (CCyR) 90% and major molecular response (MMR) 74%. In subgroup 2 the results were 96%, 72% and 38% respectively. In whole patients population probability of MMR was higher among patients who during a 12-month therapy reached at least major cytogenetic response (MCyR) or 2 log reduction of BCR-ABL oncogene. Molecular resistance was confirmed 20% of CML patients treated with imatinib since diagnosis and 30,8% persons treated with second-line imatinib. In our cohort of patients the presence of the following BCR-ABL oncogene point mutations was identifiedt: M244V, D276G, F317L (2 persons) and F359I. Additionaly the risk of appearance of the mutations was significantly higher in the group of patients who after 12-month imatinib therapy did not reach at least MCyR. Moreover, the 3 log reduction of BCR- ABL transcript in the 12 th month of the therapy significantly decreases the risk of mutational resistance. KEY WORDS: Chronic myeloid leukemia Imatinib Resistance BCR-ABL oncogene mutations WSTĘP Według róŝnych źródeł CML stanowi 15 20% wszystkich białaczek u ludzi. Najczęściej do wystąpienia objawów choroby dochodzi u osób w wieku od 45 do 55 lat [1]. Analiza podłoŝa molekularnego przewlekłej białaczki szpikowej umoŝliwiła zrozumienie mechanizmów odpowiedzialnych za transformację nowotworową wielopotencjalnej komórki krwiotwórczej i powstanie klonu komórkowego cechującego się obecnością charakterystycznej aberracji cytogenetycznej t(9;22) odpowiedzialnej za powstanie genu fuzji BCR-ABL. Poznanie budowy transkryptów BCR-ABL oraz właściwości i roli kodowanego przez niego białka o aktywności kinazy tyrozynowej stało się podstawą opracowania nowych leków swoiście blokujących wiązanie ATP w centrum aktywnym enzymu. Ich stosowanie prowadzi do zablokowania przekazywania sygnałów komórkowych, a w przypadku chorych z CML do ograniczenia proliferacji wczesnych komórek progenitorowych BCR-ABL+. Jednym z najlepiej poznanych leków o aktywności inhibitora kinazy tyrozyny jest imatynib (Imatinib mesylate, Glivec, STI571 signal transuduction inhibitor) [2, 3]. Wykazano, Ŝe imatynib łączy się jedynie z nieaktywną, zdefosforylowaną formą kinazy. Przeprowadzone badania kliniczne potwierdziły wysoką skuteczność imatynibu w hamowaniu rozwoju objawów choroby zarówno w przypadku pacjentów z potwierdzoną ekspresją onkogenu BCR-ABL p210kd, p190kd jak i p230kd. Imatynib okazał się być takŝe inhibitorem innych komórkowych kinaz tyrozynowych ABL (C- ABL, v-abl, TEL-ABL), a takŝe dwóch receptorowych kinaz tyrozynowych: c-kit i

3 Mutacje onkogenu BCR-ABL u chorych z CML 647 PDGFR (platelet-derived growth factor receptor, receptor płytkopochodnego czynnika wzrostu) [4, 5]. W wieloośrodkowym, randomizowanym badaniu IRIS (International Randomized Interferon versus STI571) porównano skuteczność leczenia IFN-alfa w połączeniu z arabinozydem cytozyny (Ara-C) ze skutecznością terapii imatynibem u chorych we wczesnej (6 miesięcy od rozpoznania) fazie przewlekłej CML. Do kaŝdego z ramion badania zakwalifikowano 553 chorych. Po 42 miesiącach obserwacji wykazano, Ŝe 98% chorych leczonych imatynibem osiągnęło całkowitą remisję hematologiczną (CHR), 91% większą (wg aktualnej nomenklatury częściową) remisję cytogenetyczną (MCyR), a 84% całkowitą remisję cytogenetyczną (CCyR). W grupie chorych leczonych IFN+AraC odsetki CHR, MCyR i CCyR były istotnie niŝsze i wynosiły odpowiednio 55, 20 i 7,5%. Dziś wiadomo, Ŝe u części chorych z CML dochodzi do rozwoju oporności na leczenie imatynibem. Oporność pierwotna dotyczy głównie pacjentów w zaawansowanych fazach choroby. O oporności pierwotnej mówimy wówczas, gdy po 3 miesiącach podawania imatynibu nie udaje się uzyskać CHR, po 6 miesiącach jakiejkolwiek odpowiedzi cytogenetycznej (CyR), a po 1 roku MCyR. Oporność wtórna moŝe pojawić się we wszystkich fazach CML. Dwuroczna ocena wykazała, Ŝe oporność na imatynib występuje u 80% chorych w fazie przełomu blastycznego oraz u 40 50% w fazie akceleracji CML. Oporność wtórna dotyczy takŝe około 10% chorych w fazie przewlekłej choroby leczonych uprzednio interferonem. Mechanizm rozwoju oporności ma IKT jest złoŝony i ma najczęściej charakter oporności będącej wynikiem mutacji onkogenu BCR-ABL znoszących/zmniejszających wraŝliwość na imatynib [6, 7]. Mutacje punktowe w regionie kodującym domeny kinazy tyrozynowej są najczęstszą przyczyną rozwoju oporności na imatynib [6]. Wykrywane są one u około 50 do 90% pacjentów z CML z opornością na leczenie IKT. Ich obecność związana jest z obniŝeniem wraŝliwości kinazy BCR-ABL na imatynib od około 3 do 100 razy [8, 9]. Zmutowane domeny enzymu wykazują znacznie zmniejszone powinowactwo do imatynibu. W części przypadków potwierdzono takŝe całkowity brak wraŝliwości na lek. Konsekwencje biologiczne substytucji aminokwasowych w obrębie domen kinazy tyrozynowej są róŝnorodne. Mutacje punktowe w domenie odpowiedzialnej za wiązanie imatynibu, zmieniają jej konformację przestrzenną, utrudniając dostęp i przyłączenie leku [10, 11]. Zmutowana domena kinazy tyrozynowej najczęściej nie traci zdolności do wiązania cząsteczki ATP. Prowadzi to do zachowania funkcji biologicznych kinazy BCR-ABL, niewygaszania sygnału proliferacyjnego i selekcji klonalnej zmutowanych komórek Ph+. Część substytucji aminokwasowych będących wynikiem mutacji punktowych onkogenu BCR-ABL, zlokalizowana jest poza centrum aktywnym. Ich obecność moŝe prowadzić do zmiany przestrzennej struktury białka BCR-ABL, wpływając na proces autoinhibicji kinazy oraz mechanizmy prowadzące do jej aktywacji. Postuluje się takŝe moŝliwość rozwoju oporności niemutacyjnej na IKT, związanej między innymi z amplifikacją i nadmierną ekspresją onkogenu BCR-ABL czy teŝ ewolucją klonalną komórek CML z rozwojem alternatywnych szlaków sygnałowych [12, 13, 14]. Do czynników ograniczających skuteczność imatynibu naleŝą równieŝ zmniej-

4 648 M. BARAŃSKA i wsp. szone wchłanianie leku z przewodu pokarmowego, zwiększony metabolizm wątrobowy, zaburzenia wiązania leku z białkami osocza oraz zaburzenia transportu leku przez błonę komórkową [12]. MATERIAŁ I METODY W niniejszej pracy przeprowadzono ocenę pojawiania się mutacji onkogenu BCR- ABL w trakcie stosowania imatynibu, a takŝe związku pomiędzy obecnością mutacji onkogenu BCR-ABL z progresją kliniczną, cytogenetyczną i molekularną przewlekłej białaczki szpikowej. Porównano równieŝ odpowiedź na leczenie, częstość mutacji oraz przeŝycie wolne od progresji choroby w grupach chorych na przewlekłą białaczkę szpikową otrzymujących imatynib w leczeniu pierwszoliniowym lub drugoliniowym po uprzedniej terapii hydroksykarbamidem i/lub IFN alfa w połączeniu z arabinozydem cytozyny lub przeszczepieniem allogenicznych komórek krwiotwórczych. Dynamikę odpowiedzi na leczenie imatynibem określano w oparciu o ilościowy pomiar liczby kopii transkryptu BCR-ABL metodą RQ-PCR w materiale uzyskanym w wyniku izolacji całkowitego RNA z komórek jądrzastych krwi obwodowej chorych na przewlekłą białaczkę szpikową. Ocenie końcowej poddano 46 chorych, których podzielono na dwie podgrupy. Do podgrupy 1 zakwalifikowano 18 chorych (12 kobiet i 6 męŝczyzn) w wieku od lat (średnio 45,16) ze świeŝo rozpoznaną przewlekłą białaczką szpikową, którzy otrzymali imatynib w pierwszej linii leczenia. W dniu rozpoczęcia leczenia imatynibem 17 chorych (tj. 94,4%) znajdowało się w fazie przewlekłej CML, a 1 chory (tj. 5,6%) w fazie akceleracji. Dla wszystkich chorych obliczono wartość wskaźnika Sokala. W oparciu o jego wartość 2 chorych (tj. 11,1%) zakwalifikowano do grupy niskiego ryzyka (Sokal score <0,8), 9 chorych (tj. 50%) do grupy pośredniego ryzyka (Sokal score 0,8 1,2) i 7 chorych (tj. 38,9%) do grupy wysokiego ryzyka (Sokal score >1,2) niepomyślnego przebiegu choroby. Do podgrupy drugiej zakwalifikowano 28 chorych (12 kobiet i 16 męŝczyzn) w wieku od lat (średnio 52,82 lata) otrzymujących imatynib jako leczenie drugiego rzutu. Wśród nich byli: 1. Pacjenci uprzednio leczeni interferonem alfa w dawce docelowej 5 mln j.m./m²/d w skojarzeniu z arabinozydem cytozyny podawanym przez 10 dni w dawce 20 mg/m²/d (INF+AraC). W grupie tej było 24 chorych (10 kobiet i 14 męŝczyzn) w wieku od lat (średnio 53,5 lata). Sześcioro z nich (tj. 21,4%) przerwało leczenie interferonem z powodu objawów nietolerancji. U 12 chorych (tj. 42,8%) powodem zaprzestania terapii było stwierdzenie oporności na interferon (progresja cytogenetyczna), a u 6 pacjentów (tj. 21,4%) utrata wcześniej uzyskanej CyR. W chwili rozpoczęcia terapii imatynibem 23 chorych (95,8%) znajdowało się w fazie przewlekłej, a 1 chory (4,2%) w fazie akceleracji CML. Średni czas od rozpoznania CML do włączenia leczenia imatynibem wyniósł 36,8 miesięcy (zakres miesiące).

5 Mutacje onkogenu BCR-ABL u chorych z CML Chorzy uprzednio leczeni hydroksykarbamidem. Do grupy tej włączono 1 pacjentkę lat 74, w fazie przewlekłej CML, zakwalifikowaną do leczenia imatynibem 36 miesięcy od rozpoznania choroby. 3. Pacjenci uprzednio leczeni allogeniczną transplantacją szpiku kostnego od zgodnego w układzie HLA dawcy rodzinnego: 3 osoby (1 kobieta i 2 męŝczyzn) w wieku od lat (średnio 40,6 lat). W chwili podjęcia decyzji o rozpoczęciu terapii imatynibem 2 z nich znajdowało się w fazie przewlekłej, a 1 w fazie akceleracji CML. Średni czas od rozpoznania CML do włączenia imatynibu dla wymienionych osób wynosił 46 miesięcy (zakres miesięcy). Tabela 1. Charakterystyka chorych na przewlekłą białaczkę szpikową leczonych imatynibem Table 1. Characteristics of patients with chronic myeloid leukemia treated with imatinib Podgrupa 1 Podgrupa 2 imatynib w leczeniu pierwszoliniowym chorzy leczeni uprzednio IFN+AraC chorzy leczeni uprzednio HU chorzy leczeni uprzednio allobmt Liczebność grupy n=18 n=24 n=1 n=3 Płeć K-12 M-6 K-10 M-14 K-1 K-1 M-2 Wiek (lata) (średnio 45,16) (średnio 53,5) (średnio 40,6) Faza CML w dniu rozpoczęcia terapii imatynibem: przewlekła akceleracji Czas od rozpoznania CML do włączenia terapii imatynibem (miesiące) (średnio 36,8) (średnio 46) Materiałem wyjściowym do badań molekularnych było 9 ml krwi obwodowej pobranej z nakłucia Ŝyły odłokciowej do probówko-strzykawek zawierających EDTA (Sarstedt). Procedurę pobierania krwi powtarzano u kaŝdego chorego co 3 miesiące przez okres co najmniej 12 miesięcy. Całkowity RNA izolowano z krwi pełnej w oparciu o metodykę z uŝyciem Trizolu. Przed przystąpieniem do badań molekularnych określano stopień czystości próbek oraz stęŝenie końcowe RNA. StęŜenie RNA określano w próbkach o objętości 1,2 µl przez pomiar absorpcji światła UV metodą spektrofotometryczną w aparacie ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer (NanoDrop, USA). Po pomiarze ilości RNA próbki RNA rozcieńczano do stęŝenia roboczego 1500 ng/ µl. Reakcję syntezy cdna przeprowadzono z uŝyciem zestawu odczynników ImProm- II Reverse Transcription System (Promega). Obecność onkogenu BCR-ABL wykrywano metodą nested-pcr opracowaną w oparciu o raport z European BIOMED-1 Concerted Action [15]. Analizę ilości transkryptu BCR-ABL przeprowadzono w aparacie RotorGene 2000 (Corbett Research) z uŝyciem zestawu do ilościowej oceny transkryptu b2a2 i b3a2 (Robogene M-bcr cdna Quantification Module, Roboscreen).

6 650 M. BARAŃSKA i wsp. Do reakcji PCR stosowano polimerazę o wysokiej czułości AmpliTaqGold (Applied Biosystems) rekomendowaną przez Roboscreen Company. Wykrywanie mutacji punktowych w obrębie domen kinazy tyrozynowej BCR-ABL metodą bezpośredniego sekwencjonowania przeprowadzono w oparciu o zmodyfikowaną metodykę zaproponowaną przez Soverini i wsp. [16]. Metodą wewnętrznego (nested) PCR amplifikowano fragmenty onkogenu BCR-ABL zawierające trzy główne domeny kinazy tyrozynowej BCR-ABL: pętlę-p, domenę katalityczną oraz pętlę aktywacyjną. W pierwszym etapie wykonywano preferencyjną amplifikację fragmentu ABL-A onkogenu BCR-ABL (z pominięciem prawidłowego transkryptu ABL) o długości 1504 pz dla b2a2 lub 1579 pz dla b3a2. Następnie amplifikowano ABL-B i ABL-C otrzymując fragmenty cdna o optymalnej wielkości dla reakcji sekwencjonowania (393pz i 482pz). Fragment B onkogenu BCR-ABL zawierał pętlę-p, natomiast fragment C domenę katalityczną i pętlę aktywacyjną. W przypadku nie uzyskania produktów PCR metodą Soverini i wsp. stosowano alternatywną metodę przygotowywania materiału do sekwencjonowania opracowaną przez Branford i Hughes [17]. Sekwencjonowanie produktów PCR przeprowadzono z wykorzystaniem aparatu - Applied Biosystems 3130 Genetic Analyser. WYNIKI W grupie chorych otrzymujących imatynib jako leczenie pierwszoliniowe optymalną odpowiedź na imatynib po 12 miesiącach terapii stwierdzono u 6 chorych (tj. 33,3%). U 10 chorych (tj. 55,5%) rozpoznano odpowiedź suboptymalną ze względu na brak spełnienia kryterium całkowitej remisji cytogenetycznej. Brak odpowiedzi na imatynib rozpoznano u 2 chorych (tj. 11,1%), którzy po roku leczenia uzyskali jedynie mniejszą odpowiedź cytogenetyczną. W ciągu kolejnych miesięcy obserwacji u kolejnych 3 chorych stwierdzono utratę odpowiedzi na leczenie imatynibem (utrata MCyR lub CCyR). Ostatecznie brak lub utratę odpowiedzi na terapię rozpoznano u 5/18 chorych tj. 27.8%. Optymalną odpowiedź na imatynib po 12 miesiącach terapii w grupie osób otrzymujących imatynib jako leczenie drugoliniowe stwierdzono jedynie u 7 chorych (tj. 25%). 16 pacjentów z tej grupy (tj. 57,2%) spełniało kryteria odpowiedzi suboptymalnej: czternastu chorych nie osiągnęło całkowitej remisji cytogenetycznej, a u 2 zaobserwowano wzrost ilości transkryptu BCR-ABL. Brak odpowiedzi na imatynib stwierdzono u 5 chorych (tj. 17,9%), którzy po roku leczenia nie uzyskali większej odpowiedzi cytogenetycznej. W ciągu dalszej obserwacji u kolejnych 8 chorych stwierdzono utratę odpowiedzi na leczenie imatynibem (utrata MCyR lub CCyR). Ostatecznie brak lub utratę odpowiedzi na terapię IKT stwierdzono u 13/28 chorych tj. 46,4%. W trakcie 40-miesięcznej obserwacji skumulowane prawdopodobieństwo CHR w grupie chorych otrzymujących imatynib w leczeniu pierwszoliniowym oceniono na 94%, a w leczeniu drugoliniowym na 96%. Na podstawie analizy wyników własnych stwierdzono brak znamiennych statystycznie róŝnic w skumulowanym prawdopodobieństwie uzyskania odpowiedzi hematologicznej w grupie chorych otrzymujących imatynib w leczeniu pierwszo- i drugoliniowym. Wymienionej zaleŝności nie potwierdzono takŝe dla chorych bez i z mutacjami onkogenu BCR-ABL.

7 Mutacje onkogenu BCR-ABL u chorych z CML 651 W niniejszej pracy potwierdzono występowanie znamiennych statystycznie róŝnic w skumulowanym prawdopodobieństwie uzyskania CCyR pomiędzy chorymi z CML otrzymującymi imatynib w leczeniu pierwszo- i drugoliniowymn (p=0,02 w teście logrank). W trakcie 40-miesięcznej obserwacji skumulowane prawdopodobieństwo uzyskania CCyR oceniono na 90% w grupie chorych otrzymujących imatynib w leczeniu pierwszoliniowym i na 72% w grupie uprzednio leczonej IFN lub allobmt. Wyniki własne potwierdziły takŝe wpływ obecności mutacji onkogenu BCR-ABL na częstość uzyskiwania CCyR. W 36 miesiącu terapii imatynibem CCyR potwierdzono u 85% chorych bez mutacji i tylko u 33% chorych, u których w trakcie leczenia potwierdzono obecność mutacji domen kinazy BCR-ABL (p=0,004 w teście log-rank). W badaniu własnym stwierdzono występowanie znamiennych statystycznie róŝnic w skumulowanym prawdopodobieństwie uzyskania MMR w zaleŝności od stopnia redukcji transkryptu BCR-ABL w 12 miesiącu terapii. W trakcie 45-miesięcznej obserwacji skumulowane prawdopodobieństwo uzyskania MMR w grupie chorych, u których stwierdzono redukcję ilości kopii BCR-ABL w 12 miesiącu terapii o 1 log, 2 log i 3 log wyniosło odpowiednio 30%, 74% i 70%. Badania własne potwierdziły takŝe zaleŝność pomiędzy uzyskaniem MMR a odpowiedzią cytogenetyczną w 12 miesiącu terapii imatynibem. Skumulowane prawdopodobieństwo uzyskania MMR w 52 miesiącu obserwacji w grupie chorych, którzy uzyskali przynajmniej MCyR po 12 miesiącu terapii imatynibem wyniosło 86%. Warte podkreślenia jest równieŝ to, Ŝe wśród chorych, którzy po 12 miesiącach terapii nie osiągnęli MCyR, u Ŝadnego nie rozpoznano MMR (p=0,008 w teście log-rank). W grupie chorych z CML poddanych ocenie w badaniu własnym zidentyfikowano obecność następujących mutacji punktowych onkogenu BCR-ABL: M244V, D276G, F317L (2 chorych) oraz F359I. Oporność mutacyjną potwierdzono u 20% chorych leczonych imatynibem od chwili rozpoznania oraz u 30,8% chorych będących w późnej fazie przewlekłej CML (uprzednio leczonych IFN, HU lub allosct). Wyniki własne potwierdziły występowanie róŝnic w skumulowanym prawdopodobieństwie wystąpienia mutacji onkogenu BCR-ABL w zaleŝności od stopnia odpowiedzi cytogenetycznej w 12 miesiącu terapii. Częstość mutacji była znamiennie niŝsza w grupie chorych, którzy nie uzyskali MCyR w ciągu pierwszego roku terapii (p=0,01 w teście log-rank). Dla wszystkich chorych z CML leczonych imatynibem obliczono prawdopodobieństwo przeŝycia wolnego od progresji choroby (PFS) do fazy akceleracji lub przełomu blastycznego oraz prawdopodobieństwo przeŝycia wolnego od zdarzeń niepoŝądanych (EFS) metodą analizy Kaplana-Meiera. Do zdarzeń niepoŝądanych zaliczono: zgon z jakiegokolwiek powodu w trakcie terapii imatynibem, progresję objawów CML do fazy akceleracji lub przełomu blastycznego, utratę CHR, utratę MCyR oraz wzrost liczby leukocytów we krwi obwodowej. Uzyskane wyniki własne potwierdziły występowanie róŝnic w EFS i PFS u chorych bez i z obecnością mutacji BCR-ABL. W trakcie 48-miesięcznej obserwacji w grupie chorych bez mutacji prawdopodobieństwo EFS określono na 64%, a prawdopodobieństwo PFS na 96%. Obecność mutacji zmniejszała prawdopodobieństwo EFS i PFS do 20%.

8 652 M. BARAŃSKA i wsp. Zidentyfikowane w badaniu własnym mutacje onkogenu BCR-ABL M244V nt(877) A>G Inicjały chorego IG Wynik sekwencjonowania D276G nt(974) A>G MJ F317L nt(1098) C>A AK F317L nt(1096) T>C IK F359I nt(1222) T>A EK Ryc. 1. Zidentyfikowane mutacje genu BCR-ABL u badanych chorych z CML leczonych imatynibem Fig. 1. Identified mutations of BCR-ABL gene in CML patients treated with imatinib in the presented study OMÓWIENIE WYNIKÓW Uzyskane wyniki przeprowadzonej oceny odpowiedzi hematologicznej, cytogenetycznej i molekularnej w obu podgrupach pacjentów leczonych imatynibem są zbieŝne z wynikami analiz przeprowadzonych w większych grupach chorych na CML. W badaniu IRIS po 5-letniej obserwacji chorych otrzymujących imatynib w pierwszej linii

9 Mutacje onkogenu BCR-ABL u chorych z CML 653 leczenia skumulowane prawdopodobieństwo CHR oceniono na 98% [18]. Natomiast w badaniu Hochhaus i wsp. oceniającym skuteczność imatynibu w grupie chorych, którzy utracili odpowiedź na leczenie IFN, skumulowane prawdopodobieństwo CHR w 6 roku leczenia oceniono na 96% [19]. W niniejszej pracy potwierdzono występowanie znamiennych statystycznie róŝnic w skumulowanym prawdopodobieństwie uzyskania CCyR pomiędzy chorymi z CML otrzymującymi imatynib w leczeniu pierwszo- i drugoliniowym. W badaniu IRIS skumulowane prawdopodobieństwo uzyskania CCyR wyniosło 87% dla chorych leczonych imatynibem od chwili rozpoznania CML. W badaniu GIMEMA [20] skumulowane prawdopodobieństwo uzyskania CCyR dla grupy chorych z CML uprzednio leczonych interferonem wyniosło 55%, a w badaniu Hochhaus i wsp. 57% [19]. Jakość odpowiedzi molekularnej (stopnia redukcji ilości kopii transkryptu BCR- ABL w badaniu RQ-PCR) u chorych leczonych imatynibem było i jest przedmiotem wielu analiz. W badaniu własnym potwierdzono występowanie znamiennych statystycznie róŝnic w skumulowanym prawdopodobieństwie uzyskania MMR w zaleŝności od stopnia redukcji transkryptu BCR-ABL w 12 miesiącu terapii, a takŝe zaleŝność pomiędzy uzyskaniem MMR a odpowiedzią cytogenetyczną w 12 miesiącu terapii imatynibem. W badaniu oceniono skumulowane prawdopodobieństwo uzyskania MMR w grupie chorych otrzymujących imatynib w leczeniu pierwszo- i drugoliniowym. W 40 miesiącu terapii skumulowane prawdopodobieństwo uzyskania MMR wyniosło odpowiednio 74% i 38%. W teście log-rank nie potwierdzono jednak znamiennych statystycznie róŝnic w prawdopodobieństwie uzyskania MMR pomiędzy obu grupami ocenianych chorych. SpostrzeŜenie to jest zbieŝne z wynikami duŝych badań klinicznych. W badaniu IRIS w trakcie 5-letniej obserwacji prawdopodobieństwo uzyskania MMR w grupie chorych otrzymujących imatynib w leczeniu pierwszoliniowym oszacowano na 70% [21]. W badaniu Kantarijan i wsp. odsetek ten dla chorych uprzednio leczonych interferonem był niŝszy i wynosił 43% [22]. Wyniki własne potwierdziły takŝe występowanie róŝnic w skumulowanym prawdopodobieństwie wystąpienia mutacji onkogenu BCR-ABL w zaleŝności od stopnia odpowiedzi cytogenetycznej w 12 miesiącu terapii. I tak, częstość mutacji była znamiennie wyŝsza w grupie chorych, którzy nie uzyskali MCyR w ciągu pierwszego roku terapii. Co ciekawe wyniki własne nie potwierdziły związku pomiędzy stopniem redukcji transkryptu BCR-ABL w 12 miesiącu terapii, a wystąpieniem mutacji domen kinazy BCR-ABL w tym okresie. Warte podkreślenia jest jednak to, Ŝe w trakcie 40- miesięcznej obserwacji chorych, którzy w 12 miesiącu terapii uzyskali redukcję BCR- ABL o 3 log, u Ŝadnego chorego nie doszło do rozwoju oporności mutacyjnej. Iacobucci i wsp. analizowali prawdopodobieństwo utraty odpowiedzi cytogenetycznej u chorych z CML leczonych imatynibem w zaleŝności od stopnia CyR w 12 miesiącu terapii. W trakcie 4-letniej obserwacji nie potwierdzono większego prawdopodobieństwa utraty CyR i progresji choroby w grupie chorych, którzy uzyskali CCyR po 12 miesiącach terapii. W badaniu tym nie oceniano jednak szczegółowo przyczyn utraty odpowiedzi, w tym mutacji onkogenu BCR-ABL [23]. Lahaye i wsp. stwierdzili, Ŝe uzyskanie MCyR w ciągu 12 miesięcy terapii imatynibem wiąŝe się z mniejszym ryzykiem

10 654 M. BARAŃSKA i wsp. wystąpienia zdarzeń niepoŝądanych oraz progresji choroby [24]. W badaniu Soverini i wsp. potwierdzono natomiast obecność mutacji punktowych onkogenu BCR-ABL u 45% chorych, którzy po 12 miesiącach leczenia imatynibem nie uzyskali przynajmniej MCyR [25]. W badaniu własnym skumulowane prawdopodobieństwo wystąpienia mutacji w grupie chorych z CML otrzymujących imatynib w leczeniu pierwszo- i drugoliniowym nie róŝniło się znamiennie. Oporność mutacyjną potwierdzono u 20% chorych leczonych imatynibem od chwili rozpoznania oraz u 30,8% chorych będących w późnej fazie przewlekłej CML (uprzednio leczonych IFN, HU lub allosct). Odsetki te są zbieŝne z wynikami innych analiz przeprowadzanych w większych grupach chorych na przewlekłą białaczkę szpikową [25]. W badaniu własnym u 27,8% chorych z CML otrzymujących imatynib w leczeniu pierwszoliniowym potwierdzono brak skuteczności leku lub utratę odpowiedzi na leczenie. Co ciekawe, w grupie tej obecność mutacji punktowej kinazy tyrozynowej BCR-ABL potwierdzono jedynie u jednego chorego. Podobne zjawisko zaobserwowano u dwukrotnie większej liczby chorych, którzy otrzymywali imatynib w leczeniu drugoliniowym brak skuteczności leku lub utratę odpowiedzi na leczenie stwierdzono u 46,4% chorych, u czterech z nich potwierdzono obecność mutacji punktowych kinazy tyrozynowej BCR-ABL. Wyniki te są zbieŝne z rezultatami uzyskanymi przez Jabbour w wsp. dotyczącymi częstości występowania mutacji BCR-ABL u chorych z CML, którzy nie odpowiedzieli lub utracili odpowiedź na imatynib w trakcie leczenia. W badaniu tym mutacje punktowe domen kinazy tyrozynowej BCR-ABL zidentyfikowano u 24% (16/68) chorych z CML we wczesnej fazie przewlekłej oraz u 42% (28/66) chorych w późnej fazie przewlekłej CML. W badaniu tym zbliŝone rezultaty uzyskano analizując częstość mutacji domen kinazy BCR-ABL w grupie chorych uprzednio leczonych interferonem alfa. I tak, mutacje punktowe zidentyfikowano u 48% chorych, którzy otrzymali imatynib z powodu braku lub utraty odpowiedzi na IFN oraz o 23% chorych, którzy otrzymywali imatynib w leczeniu pierwszoliniowym [26]. W badaniu własnym w grupie chorych z CML poddanych ocenie w trakcie terapii imatynibem potwierdzono pojawienie się następujących mutacji punktowych onkogenu BCR-ABL: M244V, D276G, F317L (2 chorych) oraz F359I. Obecność wszystkich z nich została juŝ wcześniej potwierdzona u chorych z CML i przedstawiona w opublikowanych metaanalizach. Soverini i wsp. oraz Nicolini i wsp. [27, 28] zwrócili uwagę na duŝą częstość występowania mutacji M244V u chorych z CML leczonych imatynibem. Obecność wymienionej mutacji szczególnie często stwierdzano w fazie przewlekłej choroby [12], a klon komórkowy BCR-ABL M244V wykazywał duŝą wraŝliwość na terapię zarówno nilotynibem jak i dasatynibem [29]. Cortes i wsp. podkreślają fakt preferencyjnego pojawiania się określonych mutacji domen kinazy BCR-ABL u chorych leczonych poszczególnymi IKT w sposób sekwencyjny. Jedną z nich jest mutacja F317L, której obecność potwierdzono u znacznej części liczby chorych leczonych dasatynibem (30). Klony komórkowe BCR-ABL F317L wykrywane były najczęściej w fazie przewlekłej CML, a badania in vitro potwierdziły jej wraŝliwość na nilotynib [29].

11 Mutacje onkogenu BCR-ABL u chorych z CML 655 W dostępnych publikacjach stosunkowo mało danych dotyczy występowania mutacji D276G [31, 27, 28]. Podkreśla się jednak, Ŝe jej pojawienie wiąŝe się ze złym rokowaniem i bardzo szybką progresją objawów choroby do fazy blastycznej [32]. Jak dotąd nie określono wraŝliwości klonów komórkowych BCR-ABL D276G na nilotynib i dasatynib. Obserwacja przebiegu klinicznego choroby u prezentowanej w niniejszym opracowaniu pacjentki MJ z obecnością mutacji D276G wydaje się potwierdzać wraŝliwość klonu komórkowego BCR-ABL D276G na dasatynib. U chorej tej najpierw potwierdzono obecność fazy przewlekłej, a po 6 miesiącach terapii uzyskanie CHR. W toku dalszej obserwacji potwierdzono takŝe redukcję ilości kopii transkryptu BCR- ABL o 1 log. Substytucje aminokwasowe w pozycji F359 onkogenu BCR-ABL naleŝą do jednych z najczęściej opisywanych defektów prowadzących do utraty wraŝliwości na leczenie imatynibem. W dostępnym piśmiennictwie dokładnie scharakteryzowano wraŝliwość na leczenie i przebieg kliniczny chorych z obecnością mutacji F359C, F359V oraz F359A. Znacznie mniej danych dotyczy mutacji F359I. Dotychczas nie określono jednoznacznie wraŝliwości klonów komórkowych BCR-ABL F359I na nilotynib i dasatynib. Wiadomo, Ŝe mutacje w pozycji F359 przyczyniają się do zakłócenia mechanizmów odpowiedzialnych za autoinhibicję kinazy BCR-ABL i jej tranformację do konformacji aktywnej, niewraŝliwej na imatynib i nilotynib [33, 34]. von Bubnoff i wsp. potwierdzili skuteczność nilotynibu u chorych z obecnością mutacji F359I [35]. Przedstawione ostatnio wyniki prób klinicznych potwierdzają wysoką skuteczność równieŝ dasatynibu wobec klonów BCR-ABL F359I. TakŜe Alfonso Quintás-Cardama i wsp. potwierdzili skuteczność dasatynibu chorego z podwójną mutacją G250E+F359I, uprzednio opornego na terapię zarówno imatynibem jak i nilotynibem. U przedstawionego w niniejszym opracowaniu pacjenta po 3 miesiącach terapii dasatynibem uzyskano CHR, a badanie molekularne potwierdziło całkowitą eliminację klonu BCR-ABL F359I [36]. RównieŜ przebieg kliniczny choroby u pacjenta EK potwierdza wraŝliwość mutacji F359I na dasatynib. NaleŜy takŝe przypomnieć, Ŝe u w/w chorego wcześniej rozpoznano oporność na imatynib i nilotynib, a 6-miesięczna terapia dasatynibem doprowadziła do uzyskania częściowej remisji hematologicznej i redukcji ilości kopii onkogenu BCR-ABL o 1 log. Wszyscy chorzy z grupy własnej, u których potwierdzono obecność mutacji domen kinazy BCR-ABL, utracili wcześniej uzyskaną całkowitą lub większą odpowiedź cytogenetyczną. Co ciekawe, juŝ w 18 miesiącu obserwacji, a więc w większości przed identyfikacją obecności mutacji, aŝ u 40% z nich stwierdzono utratę odpowiedzi cytogenetycznej. SpostrzeŜenie to znajduje swoje potwierdzenie w międzynarodowych rekomendacjach dotyczących monitorowania odpowiedzi cytogenetycznej i molekularnej u chorych z CML leczonych imatynibem [37]. Podkreślono w nich konieczność wykonywania badań na obecność mutacji onkogenu BCR-ABL u chorych, u których stwierdzono brak lub utratę odpowiedzi cytogenetycznej lub molekularnej. Jest to szczególnie istotne w przypadku obecności mutacji w obrębie pętli-p oraz mutacji T315I. WiąŜe się to bowiem nie tylko z wczesną utratą wraŝliwości na leczenie, ale takŝe z progresją objawów choroby oraz zmniejszeniem prawdopodobieństwa całkowi-

12 656 M. BARAŃSKA i wsp. tego przeŝycia [28]. Z wymienionych powodów identyfikacja mutacji w tych obszarach powinna prowadzić do natychmiastowej zmiany postępowania terapeutycznego. Wydaje się, Ŝe nieco inną strategię moŝna przyjąć w przypadkach oporności związanej z obecnością mutacji punktowych poza pętlą P. Oporność w tych przypadkach rozwija się bowiem mniej dynamicznie i często moŝe być kontrolowana poprzez zwiększenie dawki imatynibu. Niezwykle rzadko obecność zmutowanych klonów udaje się potwierdzić za pomocą bardzo czułych technik biologii molekularnej (np. ASO-PCR) jeszcze przed rozpoczęciem terapii. Najczęściej zjawisko to dotyczy chorych w zaawansowanych fazach CML. Willis i wsp. zaobserwowali, Ŝe u niektórych chorych zmutowane klony komórkowe nie ulegają ekspansji i zanikają w trakcie terapii imatynibem [38]. Z tego powodu w aktualnie obowiązujących rekomendacjach nie zaleca się wykonywania badań przesiewowych w kierunku obecności mutacji onkogenu BCR-ABL przed rozpoczęciem terapii IKT. To samo dotyczy chorych, którzy uzyskali optymalną odpowiedź na imatynib. Wykazano bowiem, Ŝe obecność mutacji domen kinazy BCR-ABL u chorych w CCyR najczęściej ma charakter przejściowy i zwykle nie wiąŝe się ze wzrostem ilości transkryptu BCR-ABL i progresją objawów choroby. PIŚMIENNICTWO 1. Załącznik nr 2 do zarządzenia nr 24/2005 Prezesa NFZ. Leczenie przewlekłej białaczki szpikowej. 2. Mauro M J, O Dwyer M, Heinrich MC, and Druker BJ. STI571: a paradigm of new agents for cancer therapeutics.j. Clin. Oncol. 2002; 20: Melo J, Barnes DJ. Switching off oncogenic signals in chronic myeloid leukemia. The Hematology Journal. 2004; 5: Sattler M, Griffin JD. Mechanisms of transformation by the BCR/ABL oncogene. Int. J. Hematol. 2001; 73: Sawyers CL, Hochhaus A, Feldman E, Goldman JM et al. Imatinib induces hematologic and cytogenetic responses in patients with chronic myelogenous leukemia in myeloid blast crisis: results of a phase II study. Blood. 2002; 99: Barańska M, Lewandowski K. Mutacje punktowe onkogenu BCR-ABL prowadzące do zmniejszenia wraŝliwości na terapię imatinibem. Acta Hemat. Pol. 2005; 38: Barańska M, Lewandowski K. MoŜliwe konsekwencje biologiczne terapii STI571. Acta Hemat.Pol. 2007; 38: 1: Tauchi T, Ohyashiki K. The second generation of BCR-ABL tyrosine kinase inhibitors. Int. J. Hematol. 2006; 83: Deininger M, Buchdunger E, Druker BJ. The development of imatinib as a therapeutic agent for chronic myeloid leukemia. Blood. 2005; 105: Gambacorti-Passerini CB, Gunby RH, Pizza R, Galietta A, Rostagno R, Scapozza L. Molecular mechanisms of resistance to imatinib In Philadelphia-chromosome-positive leukaemias. The Lancet Oncology. 2003; 4: Tauchi T, Ohyashiki K. The second generation of BCR-ABL tyrosine kinase inhibitors. Int. J. Hematol. 2006; 83: Apperley JF. Part I: Mechanisms of resistance to imatinib in chronic myeloid leukemia. Lancet Oncol. 2007; 8: Sacha T. Molekularne mechanizmy oporności na imatinib. Acta Haematologica Polonica. 2003; 3:

13 Mutacje onkogenu BCR-ABL u chorych z CML Hochhaus A, Kreil S, Corbin AS, La Rosee P, Muller MC et al. Molecular and chromosomal mechanisms of resistance to imatinib (STI571) therapy. Leukemia. 2002; 16: European BIOMED-1 Concerted Action. Investigation of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia. 1999; 13: Soverini S, Martinelli G, Amabile M, Poerio A, Bianchini M, et al. Denaturing-HPLC-based assay for detection of ABL mutations in chronic myeloid leukemia patients resistant to Imatinib. Clin Chem. 2004; 50: Branford S, Hughes T. Detection of BCR-ABL mutations and resistance to imatinib mesylate. From: Methods in Molecular Medicine, Vol. 125: Myeloid Leukemia: Methods and Protocols. Edited by: Iland H, Hertzberg M, Marlton P: Humana Press Inc., Totowa, NJ. 18. Druker BJ, Guilhot F, O'Brien SG, Gathmann I, Kantarjian H et al. Five-year follow-up of patients receiving imatinib for chronic myeloid leukemia. N Engl J Med. 2006; 355: Hochhaus A, Druker B, Sawyers C, Guilhot F, Schiffer CA et al. Favorable long-term follow-up results over 6 years for response, survival, and safety with imatinib mesylate therapy in chronic-phase chronic myeloid leukemia after failure of interferon-alpha treatment. Blood. 2008; 111: Palandri F, Iacobucci I, Martinelli G, Amabile M, Poerio A, et al, CML GIMEMA Working Party on. Long-term outcome of complete cytogenetic responders after imatinib 400 mg in late chronic phase, philadelphia-positive chronic myeloid leukemia: the GIMEMA Working Party on CML. J Clin Oncol. 2008; 26: Labussière H, Hayette S, Tigaud I, Michallet M, Nicolini FE. Treatment of chronic myeloid leukemia in Bull Cancer. 2007; 94: Kantarjian HM, Cortes JE, O'Brien S, Luthra R, Giles F et al. Long-term survival benefit and improved complete cytogenetic and molecular response rates with imatinib mesylate in Philadelphia chromosome-positive chronic-phase chronic myeloid leukemia after failure of interferon-alpha. Blood. 2004; 104: Iacobucci I, Rosti G, Amabile M, Poerio A, Soverini S et al. Comparison between patients with Philadelphia-positive chronic phase chronic myeloid leukemia who obtained a complete cytogenetic response within 1 year of imatinib therapy and those who achieved such a response after 12 months of treatment. J Clin Oncol. 2006; 24: Lahaye T, Riehm B, Berger U, et al. Response and resistance in 300 patients with BCR-ABL positive leukemias treated with imatinib in a single center: a 4.5-year follow-up. Cancer. 2005; 103: Soverini S, Martinelli G, Rosti G, Bassi S, Amabile M et al. ABL mutations in late chronic phase chronic myeloid leukemia patients with up-front cytogenetic resistance to imatinib are associated with a greater likelihood of progression to blast crisis and shorter survival: a study by the GIMEMA Working Party on. J Clin Oncol. 2005; 23: Jabbour E, Kantarjian H, Jones D, Talpaz M, Bekele N, et al. Frequency and clinical significance of BCR-ABL mutations in patients with chronic myeloid leukemia treated with imatinib mesylate.. Leukemia. 2006; 20: Soverini S, Colarossi S, Gnani A, Rosti G, Castagnetti F, et al., GIMEMA Working Party on Chronic Myeloid Leukemia. Contribution of ABL kinase domain mutations to imatinib resistance in different subsets of Philadelphia-positive patients: by the GIMEMA Working Party on Chronic Myeloid Leukemia. Clin Cancer Res. 2006; Tom 12, 24, strony Nicolini FE, Corm S, Lê QH, Sorel N, Hayette S, et al. Mutation status and clinical outcome of 89 imatinib mesylate-resistant chronic myelogenous leukemia patients: a retrospective analysis from the French intergroup of CML (Fi(phi)-LMC GROUP). Leukemia. 2006; 20: O Hare T, Walters DK, Stoffregen EP, et al. In vitro activity of Bcr-Abl inhibitors AMN107 and BMS against clinically relevant imatinib-resistant Abl kinase domain mutants. Cancer Res. 2005; 65:

14 658 M. BARAŃSKA i wsp. 30. Cortes J, Jabbour E, Kantarjian H, Yin CC, Shan J et al. Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors. Blood. 2007; 110: Hughes T, Deininger M, Hochhaus A, Branford S, Radich J, et al. Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood. 2006; 108: Leguay T, Desplat V, Marit G, Mahon FX. D276G mutation is associated with a poor prognosis in imatinib mesylate-resistant chronic myeloid leukemia patients. Leukemia. 2005; 19: Tokarski JS, Newitt JA, Chang CYJ, Cheng JD, Wittekind M et al. The structure of dasatinib (BMS ) bound to activated ABL kinase domain elucidates its inhibitory activity against imatinibresistance ABL mutants. Cancer Res. 2006; 66: Weisberg E, Manley P, Mestan J, Cowan-Jacob S, Ray A, Griffin JD. AMN107 (nilotinib): a novel and selective inhibitor of BCR-ABL. Br J Can. 2006; 94: von Bubnoff N, Manley PW, Mestan J, Sanger J, Peschel C, Duyster J. Bcr-Abl resistance screening predicts a limited spectrum of point mutations to be associated with clinical resistance to the Abl kinase inhibitor nilotinib (AMN107). Blood. 2006; 108: Quintás-Cardama A, Kantarjian H, Jones D, Nicaise C, O Brien S et al. Dasatinib (BMS ) is active in Philadephia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia after imatinib and nilotinib (AMN107) therapy failure. Blood. 2007; 109: Baccarani M, Pane F, Saglio G. Monitoring treatment of chronic myeloid leukemia. Haematologica. 2008; 93: Willis SG, Lange T, Demehri S, Otto S, Crossman L et al. High-sensitivity detection of BCR-ABL kinase domain mutations in imatinib-patients: correlation with clonal cytogenetic evolution but not response to therapy. Blood. 2005; 106: Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres Autora: Marta Barańska Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych Układu Krwiotwórczego Ul. Szamarzewskiego Poznań marta.baranska@onet.eu