Syntezy izotopomerów L-tyrozyny i ich wykorzystanie do badania mechanizmu działania. ania β-tyrozynazy

Transkrypt

1 Syntezy izotopomerów Ltyrozyny i ich wykorzystanie do badania mechanizmu działania ania βtyrozynazy Wojciech Augustyniak Promotor: prof. dr hab. Marianna Kańska Pracownia Peptydów Wydział hemii UW

2 Plan Wstęp ogólna charakterystyka βtyrozynazy Syntezy Ltyrozyny znakowanej: węglem w pozycjach 1, 2, 3 i 1 Ltyrozyny deuterem i trytem we wszystkich nielabilnych pozycjach Ltyrozyny Badania mechanizmu działania βtyrozynazy: mechanizm proponowany w literaturze wyniki i wnioski z badań kinetycznych efektów izotopowych: wodoru 1 / 2 i 1 / 3 na k cat /K m, oraz 1 / 3 na k cat we wszystkich pozycjach w Ltyrozynie węgla 12 / na k cat /K m w pozycjach 2, 3 i 1 Ltyrozyny propozycja kinetycznego mechanizmu działania βtyrozynazy Podsumowanie

3 βtyrozynaza PL 2 PLP N 3 podczas reakcji ulega rozerwaniu wiązanie pomiędzy alifatycznym i aromatycznym atomem węgla proton z pozycji α jest częściowo przenoszony na atom węgla 1 reszty aromatycznej katalizuje także reakcję syntezy Ltyrozyny z pochodnych fenolu i pirogronianu, racemizację alaniny, wymianę atomu wodoru α w kilku Laminokwasach oraz deaminację atomu węgla α do aktywności katalitycznej konieczne są kationy jednowartościowe (K, Rb, s lub N 4 ); jony Na i Li to inhibitory PL

4 βtyrozynaza inaczej: fenololiaza tyrozynowa PL, E występowanie: Gramujemne Enterobacteriaceae i niektóre stawonogi budowa: białko α/β wymiary 135Å x 60Å x 4Å 4 podjednostki po 51kDa symetria P znana struktura krystalograficzna zastosowanie: biotechnologiczne otrzymywanie dopy oznaczanie PLP w materiale biologicznym utylizacja odpadów fenolowych

5 Synteza [1 ]Ltyrozyny l Na K N N Na 48% 82% PM PAL 48% 37%

6 Synteza [2 ]Ltyrozyny 85% 44% PAL 2 N PM 63% 2 N

7 Synteza [3[ ]Ltyrozyny YAD 22% 63% 5.0% PAL PM 28%

8 Synteza [1 ]Ltyrozyny AgN 3 Ag EtI Et % Ag 60% Et 70% Et 96% Na S PL 12% u 2.4%

9 Syntezy [2 2 ]Ltyrozyny S PL D 2 D 24% 100% rpaza D 2

10 Syntezy [2 3 ]Ltyrozyny 61% 77% 40% PAL 82% PM rpaza 98%

11 Synteza [3R 2 ] i [3R 3 ]Ltyrozyny D PAL D PM D 1.9% PAL PM 20% N 95% 2

12 Synteza [3S 2 ] i [3S 3 ]Ltyrozyny D PAL D % PAL 5.8% PAL PM 10% 82%

13 Syntezy [2,6,6 3 2 ]Ltyrozyny K 2 Ptl 4 l l 2 85% 79% 10% S PL PM 58%

14 Mechanizm dzia Mechanizm działania ania βtyrozynazy tyrozynazy N 3 N N P N K 257 N P N N P N N P N N P N P N 3

15 Kinetyczne efekty izotopowe Metody wyznaczania KIE: α = v L /v niekonkurencyjna (KIE na V max i na V max /K m ) poprzez bezpośrednie pomiary parametrów kinetycznych dla reakcji z obydwoma izotopologami badanego związku o wzbogaceniu bliskim 100%; KIE oblicza się z bezpośredniego porównania V max i V max /K m dla reakcji z obydwoma izotopologami. Zaleta metody wyznaczenie KIE na V max ; wada duże błędy eksperymentalne konkurencyjna (KIE na V max /K m ) poprzez pomiary względnej zawartości izotopologów w ich mieszaninie w substratach (R 0 ) i produktach reakcji (R p ); KIE oblicza się z równania Bigeleisena: Rp ln(1 f ) R0 α = ln(1 f) Zaleta metody duża precyzja; wada nie można zmierzyć KIE na V max

16 Metoda niekonkurencyjna wyznaczania KIE w reakcji katalizowanej przez βtyrozynazę 1U/ml PL 50µM PLP p M KP i 0.2M Kl 1mM D 2 20U/ml LD 0.4mM NAD N 3 Dodatek NAD i dużego nadmiaru LD czyni reakcję nieodwracalną i umożliwia bezpośredni pomiar kinetyki poprzez spektrofotometryczny pomiar spadku absorpcji przy 340nm v V max 0.5 V max V v = (K max m [S] [S]) Pomiar szybkości reakcji dla różnych stężeń Ltyrozyny umożliwia wyznaczenie V max i K m z równania MichaelisaMenten K m [S]

17 Metoda konkurencyjna wyznaczania KIE w reakcji katalizowanej przez βtyrozynazę 1U/ml PL 50µM PLP p M KP i 0.2M Kl 1mM D 2 20U/ml LD 2eq NAD N 3 W badaniach stosowałem metodę podwójnego znakowania stosując znacznik 1 (podczas określania KIE 1 / 3 ), oraz 3,5 3 2 (KIE 12 / ) jako standardy wewnętrzne NAD i LD przekształcają nietrwały pirogronian w trwały Lmleczan Po rozdziale produktów i substratów za pomocą chromatografii jonowymiennej wyznaczałem radioaktywność właściwą wyjściowych substratów (R 0 ), produktów (R p ) i stopień konwersji (f); KIE obliczałem używając równanie Yankwichaonga: R ln(1 f R α = ln(1 f) 0 p )

18 1 / 3 KIE w pozycji α R 0 /R p rośnie podczas reakcji od wartości odpowiadającym odwrotnemu KIE do dużych wartości normalnych R 0 /R p nie zależy w prosty sposób od stężeń produktów i substratów reakcji oraz od czasu reakcji Eksperyment 1 NMR wykazał szybką wymianę protonu α z wodą na początku reakcji Początkowa wymiana trytu z wodą powoduje obniżenie wartości R 0 /Rp na początku reakcji, i jej wzrost w miarę zachodzenia reakcji eliminacji Mniej niż 1% trytu z pozycji α jest przenoszone na atom węgla 4 powstającego fenolu R 0 /R p R 0 /R p Reakcja w 2 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,10 0,20 0,30 0,40 f Reakcja w D 2 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 f

19 1 / 2 KIE w pozycji α Kinetyczny efekt izotopowy Rozpuszczalnikowy efekt izotopowy 2 D 2 α V 3.34 ± ±0.13 α V/K 2.42 ± ±0.61 Ltyrozyna [2 2 ]Ltyrozyna α V 1.49 ± ±0.11 α V/K 1.81 ± ±0.31 Pierwszorzędowe KIE świadczą o bezpośrednim zaangażowaniu atomu wodoru α podczas reakcji Niezależność KIE α i rozpuszczalnikowego efektu izotopowego świadczy o tym, że atom wodoru α i cząsteczka wody biorą udział w tym samym stanie przejściowym Porównanie KIE α na V max i na V max /K m wskazuje na to, że oderwanie protonu α ma większe znaczenie dla szybkości reakcji, niż jego następcza wymiana z rozpuszczalnikiem

20 KIE wodoru w pozycjach β α V/K = 1.09 ± ,00 α V/K 4,00 3,00 2,00 1,00 0,10 0,20 0,30 0,40 f D α V =1.09±0.04 D α V/K = 0.98 ± 0.10 KIE trytu w pozycji βs jest normalny i rośnie podczas reakcji do wartości typowych dla efektów pierwszorzędowych, podczas gdy KIE trytu w pozycji βr jest drugorzędowy i nie zmienia się podczas reakcji ryt w powstającym pirogronianie ulega szybkiej i całkowitej wymianie z wodą; nie ma wymiany trytu wyjściowej Ltyrozyny z rozpuszczalnikiem

21 KIE wodoru w pierścieniu aromatycznym α V/K = ± D α V = 1.04 ± 0.05 D α V/K = 0.99 ± 0.12 α V/K = ± D α V = 1.26 ± 0.06 D α V/K = 0.99 ± 0.11 dwrotny KIE trytu w pozycji 2,6 Ltyrozyny świadczy o podobieństwie otoczenia tych atomów wodoru pomiędzy stanem przejściowym najwolniejszego etapu a fenolem (produktem reakcji) związanym z enzymem Znaczący KIE deuteru na V max w pozycji 3,5 Ltyrozyny może być wywołany bliskością grupy hydroksylowej zaangażowanej w dearomatyzację i rearomatyzację układu podczas reakcji KIE deuteru na V max w pozycji 3,5 Ltyrozyny w porównaniu do KIE na V max /K m świadczy o istotności tych atomów wodoru dla dysocjacji kompleksu enzymfenol

22 12 / KIE 1,05 α V/K = ± α V/K 1,00 0,95 0,90 α V/K = ± ,85 0,10 0,20 0,30 0,40 f

23 V max / K m Kinetyczny model reakcji katalizowanej przez βtyrozynazę = k 3 k E Szybkość reakcji: 2 k 1 Ph k 2 k 3 S EQ EA E k 1 k 2 k k 3 3 k k 2 k k 1 [E] k [Ph] Ph Początkowa szybkość reakcji: k 2 k1 [E] Vmax / K m = k k 2 P 1 Stała inhibicji mieszanej dla fenolu: V (V max max /K /K m m ) i [Ph] k 2 k 1 [Ph] = 1 = 1 K k (k k ) i K i k = 3 (k k 2 2 k k 1 1 ) substrat Ltyrozyna Ltyrozyna [3 2 2 ]Ltyrozyna rozpuszczalnik 2 D 2 2 K i [µm] 4 ± 28 9 ± ± 25

24 Podsumowanie Wykonałem syntezę czterech izotopomerów Ltyrozyny znakowanych w pozycjach 1, 2, 3 i 1 ; trzech izotopomerów znakowanych deuterem w pozycjach 2, 3R i 3S; oraz czterech izotopomerów znakowanych trytem w pozycjach 2, 3R, 3S i 2,6. W celu otrzymania powyższych związków użyłem nowych podejść syntetycznych, które umożliwiły mi otrzymanie powyższych związków po raz pierwszy trzymane związki użyłem do wyznaczenia kinetycznych efektów izotopowych w reakcji hydrolitycznego rozkładu Ltyrozyny katalizowanego przez fenololiazę tyrozynową. 1 / 2 KIE wyznaczałem metodą niekonkurencyjną używając pomiarów kinetyki, a do badań efektów 1 / 3 i 12 / użyłem metody konkurencyjnej radiochemicznej. Łącznie wyznaczyłem 3 efekty węgla, 16 efektów deuteru i 8 efektów trytu, a także poczyniłem wiele dodatkowych obserwacji Wykonane przez mnie badania pozwoliły zaobserwować istotne i nieznane wcześniej zjawiska (np. względną zmianę szybkości poszczególnych etapów procesu podczas reakcji powodującą zmianę KIE; zaangażowanie protonu α i cząsteczki wody podczas tego samego stanu przejściowego reakcji; oderwanie protonów z pozycji β i ich różne zachowanie się podczas reakcji; istotność atomów wodoru w pozycji 3,5 podczas końcowych etapów reakcji), które rzuciły nowe światło na badany przeze mnie mechanizm

25 prof. Marianna Kańska dr Ryszard Kański Podziękowania Koleżanki i koledzy z zespołu (w szczególności dr Jacek Jemielity, dr Jarosław Bukowski, mgr Piotr Suchecki, mgr Elżbieta Boroda, mgr Małgorzata Kozłowska, mgr Edyta Panufnik); i uczestnicy programu Krajowego Funduszu na rzecz Dzieci: Radosław Lipiński, Łukasz Jaremko, Mariusz Jaremko, Joanna Sekuła i Jarosław Prus prof. Robert Phillips (University of Georgia) prof. Floris Rutjes, hristien Schortinghuis i pozostali członkowie grupy prof. Rutjesa z University of Nijmegen mgr Agnieszka Brzezińska (IBD PAN) dr Aleksandra Wysłouchieszyńska, mgr Joanna Żuberek, Lilia Żukowa, mgr Jacek lędzki (IBB PAN) mgr Paweł kulski, mgr Grzegorz Wrona (IBD PAN) prof. Piotr Paneth (Politechnika Łódzka) mgr Grzegorz Łach (Pracownia hemii Kwantowej) mgr Marcin Nowogródzki (Ih PAN)