Ocena pracy doktorskiej lek. wet. Eweliny Długołęckiej pt. Wybrane endometrialne uwarunkowania resorpcji zarodków u klaczy

Transkrypt

1 INSTYTUT ROZRODU ZWIERZĄT I BADAŃ ŻYWNOŚCI POLSKIEJ AKADEMII NAUK ul. Tuwima 10; Olsztyn 5, skr poczt.55; tel (89) , fax: (089) ; institute@pan.olsztyn.pl; Olsztyn, 28. stycznia 2019 r. Prof. dr hab. n. wet. Dariusz J. Skarżyński Zakład Immunologii i Patologii Rozrodu Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności PAN ul. Tuwima 10, OLSZTYN Ocena pracy doktorskiej lek. wet. Eweliny Długołęckiej pt. Wybrane endometrialne uwarunkowania resorpcji zarodków u klaczy I. PODSTAWA PRAWNA I OCENA FORMALNA Recenzja została opracowana na wniosek Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego, zgodnie z wymaganiami Ustawy z dnia 14 marca 2003 roku o stopniach i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki wraz z późniejszymi zmianami (Dz. U. z 2003 r, Nr 65, poz. 595; Dz.U. z 2005 r, Nr 164 poz oraz Dz.U. z 2011 r. Nr 84 poz. 4). Przedstawiona do oceny praca spełniają warunki formalne określone w ww. Ustawie i rozporządzeniach Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego oraz Komisji Centralnej do Spraw Stopni i Tytułów. Praca została przygotowana przejrzyście i w sposób umożliwiający właściwa i pełną ocenę oraz zapoznanie się z istotą osiągnięcia naukowego. II. PROBLEM NAUKOWY I ZNACZENIE BADAŃ Wczesna zamieralność zarodków jest jedną z częściej występujących przyczyn niepłodności zwierząt gospodarskich, w tym klaczy. Zarówno zaburzenia procesu matczynego rozpoznania ciąży, jak również implantacji zarodka, a także patogeneza zaburzeń funkcji błony śluzowej macicy, w tym stanów zapalnych śluzówki macicy (endometritis) klaczy, mogących doprowadzać do wczesnej śmierci zarodkowej są ciągle otartymi problemami badawczymi. Stąd istotne jest poznanie na poziomie komórkowych i sub-komórkowym (receptorowym i przekaźnictwa wewnątrzkomórkowego, enzymatycznym, molekularnym) patogenezy wczesnej zamieralności 1

2 zarodków klaczy oraz dalsze poszukiwanie nowych wiarygodnych i miarodajnych metod diagnostyki wczesnej ciąży i jej zaburzeń. Zagadnienia te są tematem zainteresowania wielu grup badawczych na całym świecie i są ciągle nieopisanymi i nieodkrytymi wyzwaniami, szczególnie w odniesieniu do badań podstawowych, stanowiących podstawę rozwoju i opracowania bardziej wydajnych i niezawodnych metod diagnostycznych opartych np. na nowych molekularnych biomarkerach. W odróżnieniu od innych gatunków zwierząt i człowieka, u klaczy znacznie słabszy jest rozwój badań nad powtarzalnymi i skutecznymi metodami diagnostyki wczesnej śmierci zarodkowej, umożliwiających późniejsze zastosowanie nowoczesnych algorytmów postępowania profilaktycznego i terapeutycznego, opartych o innowacyjne technologie biomedyczne. W ten szeroki i nowatorski nurt badań włącza się praca doktorska pani lek wet. Eweliny Długołęckiej. W odniesieniu do poznania przyczyn i patomechanizmów wczesnej śmierci zarodkowej, konieczne staje się, co podkreśla Doktorantka, określenie statusu cytologicznego, bakteriologicznego i histopatologicznego śluzówki macicy klaczy ze stwierdzoną śmiercią zarodkową oraz opisanie na poziomie komórkowym i molekularnym zmian w wydzielaniu i działaniu mediatorów stanów zapalnych, z uwzględnieniem mechanizmów enzymatycznych i receptorowych. Kolejnym zadaniem jest określenie zależności występowania resorpcji zarodków z intensywnością przebiegu stanów zapalnych błony śluzowej macicy, a także jej zwyrodnienia - występowaniem i przebiegiem włóknienia śluzówki macicy klaczy (chronicznego degenerującego zapalenia błony śluzowej macicy endometrosis). Należy więc podkreślić, że zagadnienia poruszane w pracy doktorskiej przez panią lek. wet. Ewelinę Długołecką są bardzo aktualne. Uważam, że podjęta tematyka badawcza jest oryginalna, nowatorska i ważna zarówno dla badań podstawowych, w zakresie poszerzenia wiedzy na temat patomechanizmów zamierania zarodków i stanów zapalnych błony śluzowej macicy klaczy, a także ma znaczenie praktyczne w odniesieniu do rozwoju badań stosowanych poszukujących nowych metod diagnostycznych i terapeutycznych. III. OPIS I OGÓLNA CHARAKTERYSTYKA PRACY Oceniana rozprawa jest typową, eksperymentalną pracą monograficzną, obejmuje 104 strony maszynopisu, 14 rycin i schematów, 4 zestawy fotografii oraz 221 pozycji piśmiennictwa. Należy jednak wskazać, że Autorka oparła się jednak raczej na starszej literaturze: niemalże 42% (92 z 221) cytowanych prac jest 20-letnia lub starsza, a tylko 12,7% (28 prac z 221 cytowanych) można zaliczyć do najnowszych (5-letnie i młodsze prace). Praca zawiera typowe dla rozprawy doktorskiej rozdziały, opracowane z zachowaniem właściwych wzajemnych proporcji. Jest napisana poprawnym i przystępnym językiem naukowym. Chociaż Doktorantka nie oparła się manierze wtrącania niepotrzebnie 2

3 obcojęzycznych wyrazów (slangu anglojęzycznego) w miejscach, gdzie istnieją już polskojęzyczne odpowiedniki (lub ich spolszczone wersje, które weszły już do polskiej naukowej nomenklatury). Szczególnie ma to miejsce w opisie metod biologii molekularnej i immunohistochemii. Patrz np. Załączniki metodyczne, opis i treść niektórych Tabel, itd. Nazwy genów winny być podane kursywą. Ponadto Doktorantka często zapomina, że w tekście już raz zdefiniowała skrót danej nazwy i zamiennie przez cały tekst stosuje zarówno pełne nazwy, jak i skróty, a nawet wielokrotnie je ponownie definiuje. W 22-stronicowym Wstępie, Doktorantka w sposób prosty i przejrzysty przedstawiła stan współczesnej wiedzy na temat fizjologicznych i molekularnych mechanizmów odpowiedzialnych za rozwój i funkcje błony śluzowej macicy klaczy, patogenezy i diagnostyki stanów zapalnych błony śluzowej macicy (endometritis) oraz wczesnej zamieralności zarodków. Rozpoczynając od ogólnego opisu specyfiki gatunkowej rozrodu klaczy omawia kolejno regulacje hormonalne ciąży wraz przyczyny i znaczenie wczesnej zamieralnosci zarodków u klaczy. Rozpatruje przyczyny zaburzeń płodności klaczy skupiając się przede wszystkim na przyczynach odpowiedzialnych za rozwój stanów zapalnych, przechodząc do szczegółowej klasyfikacji i charakterystyki różnych typów stanów zapalnych (stany zapalne kliniczne i podkliniczne) i szczegółowo opisuje różnice metodyczne i trudności w diagnostyce różnych typów stanów zapalnych, co jest do dziś otwartą kartą w naukach i medycynie weterynaryjnej, stanowiąc ciągle wyzwanie dla badaczy i klinicystów. W kolejnych podrozdziałach Wstępu Doktorantka przedstawia szczegółowo patobiologię błony śluzowej macicy w przebiegu endometritis omawiając szczegółowo immunoendokrynne mechanizmy patogenezy, uwzględniając receptorowe i molekularne mechanizmy działania wybranych cytokin prozapalnych oraz innych mediatorów zapalenia, w tym szczegółowo opisując mechanizmy produkcji, działania oraz rolę metabolitów kwasu arachidonowego (prostaglandyn) i tlenku azotu. Wstęp stanowi dobre wprowadzenie do postawienia hipotez roboczych i celów pracy, które podzielono na 2 zadania. Zakładanymi przez Doktorantkę celami rozprawy doktorskiej było: 1. określenie statusu cytologicznego, bakteriologicznego i histopatologicznego macicy klaczy ze stwierdzoną śmiercią zarodkową, w prawidłowej ciąży oraz w fazie diestrus, a także ich porównanie miedzy grupami, 2. porównanie ekspresji wybranych czynników prozapalnych lub enzymów odpowiedzialnych za ich produkcję na poziomie genu (mrna) oraz białka (analiza immunohistochemiczna). 3

4 Rozdział Materiały i Metody (20 stron), zawiera opis wykonanych badań klinicznych, doświadczeń naukowych i zastosowanych metod analitycznych: metody bakteriologiczne, badania histopatologiczne, metody ekspresji badanych czynników (enzymów i cytokin) na poziomie mrna (ilościowa reakcja łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym - qpcr) i białka (analizy immunohistochemiczne). Na podkreślenie zasługuje fakt, iż Doktorantka rozdział Materiały i Metody wzbogaciła tabelami i rysunkami, które w prosty i przejrzysty sposób dokumentują zastosowane procedury eksperymentalne i analityczne, co pozwala w pełni zrozumieć założenia pracy i znacznie ułatwiają późniejsze śledzenie i ocenę wyników badań. Doktoranta szczegółowo dokonała opisu stosowanych metod wraz ze wskazaniem źródeł i podaniem szczegółowych instrukcji producentów odpowiednich kitów, co pozwala w przyszłości powtórzyć i potwierdzić podobne badania. W Rozdziale Wyniki (8 stron, 5 rycin, jeden zestaw fotografii oraz jedna tabela) Doktorantka w sposób uporządkowany przedstawiła otrzymane wyniki i obserwacje naukowobadawcze. Rozdział podzielono na 3 podrozdziały dobrze systematyzując opis wyników badań, co ułatwia czytelnikom ich śledzenie i ocenę. W Dyskusji (Rozdział 7), zawartej na 17 stronach, Doktorantka opisuje, na tle literatury światowej, otrzymane wyniki oraz szczegółowo je interpretuje. W mojej ocenie Doktorantka wykorzystała większość najistotniejszych publikacji do analizy i porównania przeprowadzonych badań i poprawnie omówiła otrzymane wyniki na tle danych, doniesień zawarty w światowej literaturze z tego obszaru. Zastanawia jedynie po co Doktorantka cytuje w Dyskusji wyniki własne, a ich po prostu nie podaje (pozycja 48), skoro są to dane jeszcze nieopublikowane (praca w recenzji), a z analizy tytułu wynika, że jest to praca zawierająca także dane z przedstawionej rozprawy doktorskiej. Oczywistym, swego rodzajem ograniczeniem tej części rozprawy jest duża zmienność otrzymanych wyników wynikająca z małej liczby zwierząt w poszczególnych grupach badawczych i dodatkowe współzależności poszczególnych badanych parametrów od statusu badanych zwierząt (stopień zaawansowania stanu zapalnego, wiek klaczy, różny dzień po owulacji, faza ciąży, występowanie włóknienia śluzówki macicy, itd.). Jednakże wstępna analiza otrzymanych wyników pozwala na potwierdzenie założonej hipotezy, iż w śluzówce macicy klaczy ze zdiagnozowaną zamieralnością zarodków dochodzi do zmian w produkcji niektórych mediatorów prozapalnych: czynnik martwicy nowatorów- i tlenek azotu (pośrednio poprzez wykazanie zmian w ekspresji indukowalnej syntazy tlenku azotu inos). Wskazano 4

5 także na zależności występowania wczesnej śmierci zarodkowej od subklinicznych stanów zapalnych śluzówki macicy (endometritis subclinica) i włóknienia (endometrosis). Z powodu tej dużej zmienności danych możliwość wysuwania uogólnionych i ostatecznych wniosków, na tym etapie badań jest oczywiście ograniczona i bardzo trudna. Pomimo tego, ten rozdział pod względem merytorycznym i intelektualnym jest bardzo wartościową części pracy i należy docenić Doktorantkę, która mimo tych kłopotów interpretacyjnych omówiła i przedyskutowała logicznie otrzymane wyniki. Pracę zakończono Wnioskami (Rozdział 8), gdzie na podstawie uzyskanych wyników postawiono 3 wnioski. Ze względu na przedstawione w opisie rozdziału Dyskusja problemy interpretacji wyników, Wnioski te są raczej podsumowaniem wyników, ale mogą być jednak podstawą do kolejnych, nowych - oryginalnych hipotez badawczych i dalszych badań. IV. UWAGI i KOMENTARZE SZCZEGÓŁOWE 1. Tytuł: Tytuł pracy nie do końca odzwierciedla wykorzystane metody i otrzymane wyniki pracy. Doktorantka nie badała endometrialnych uwarunkowań resorpcji zarodków, a po prostu ekspresję wybranych czynników prozapalnych. Tytuł można było uszczegółowić uwzględniając konkretne mechanizmy badane w pracy 2. Wstęp: 2.1. Strona 15/Linia Co doktorantka miała na myśli opisując, że jedną z ról brodawki macicznej jest zapobieganie cofania się zawartości światła macicy do jajowodu. Jakie substancje, płyny miałaby się cofać z macicy do jajowodu. Może chodzi po prostu o przedostawanie się zawartości Strona 15/Linia 19. Chyba chodzi tu o migracje, przemieszczanie się zarodka w świetle macicy, a nie jego poruszanie się Strona 16/Linia Proszę opisać mechanizm i działanie gonadotropiny kosmówkowej (ecg) w formowaniu się dodatkowych ciałek żółtych u klaczy w ciąży. Zastosowano pewien skrót myślowy i w jednym zdaniu opisano dwa zupełnie oddzielne mechanizmy Strona 18/Linia Hormony mogą działać parakrynnie, ale nie są wydzielane parakrynnie. Tu zapewne chodzi o lokalną produkcje i wydzielanie oksytocyny (OXT) w układzie rodnym klaczy. 5

6 2.5. Strona 28/Linia Tlenek azotu (NO) nie może ulegać ekspresji, jest to prosta cząsteczka gazowa. Ekspresji mogą ulegać enzymy zaangażowane w jego produkcję. Podobnie nie wykazano wzrostu stężenia mrna, ale raczej wzrost jego ekspresji lub liczby kopii cząsteczki mrna Rycina 1. Raczej niewłaściwe jest łączenie mechanizmów regulujących ekspresję i aktywność dwóch różnych izoform syntazy NO (NOS) na jednym schemacie i wskazywanie, że te same czynniki (np. TNF ) mogą indukować też izoformę sródbłonkową (enos), które nie podlega indukcji przez czynniki prozapalne. enos jest izoformą konstytutywną, co oznacza, że dostarcza stałą, niezależną od czynników prozapalnych ilość NO. 3. Cel i Założenia Pracy 3.1. Strona 35/Linia 4. W pracy badano status błony śluzowej macicy klaczy raczej w stadium, w którym zaszedł już proces wczesnej śmierci zarodkowej, a nie zachodzi (patrz też strona 36) Brak wcześniejszego wytłumaczenia w tekście Wstępu, czemu w pracy oceniano ekspresję i immunolokalizację enos, izoformy konstytutywnej, niezwiązanej czynnościowo z procesem zapalnym i nie jest zazwyczaj indukowana przez czynniki immunologiczne. enos nie jest generalnie uznawana za czynnik prozapalny. Patrz też strona 38/Linia Materiały i Metody: 4.1. Nie podano informacji, czy klacze użyte do badań były kryte w sposób naturalny, czy też wykonano u nich sztuczną inseminację? 4.2. Strona 36/Linia W którym dniu po kryciu/inseminacji były pobierane bioptaty u klaczy w grupie doświadczalnej. Brak wskazania dokładnego dnia/dni pobrania bioptatów błony śluzowej macicy u klaczy. Co oznacza stwierdzenie powyżej 25 dnia ciąży. Czy biopsje były więc robione w tej grupie ciąży od 25 dnia po inseminacji/kryciu do którego dnia? Uwaga dotyczy wszystkich grup klaczy 4.3. Strona 37/Linia 3-7. Analogiczna uwaga jak poprzednio. Czy jest możliwe to ustalenia w którym dniu po owulacji były pobrane próby u poszczególnych klaczy. Faza diestrus u klaczy trwa około dni. W przypadku prezentowanych badań próby mogły być pobierane od 5/6 do 15/16 dnia po owulacji. W tym okresie status transkryptomiczny, proteomiczny, metabolomiczny (czynnościowy) błony śluzowej zmienia się dramatycznie. Patrz np. praca Merk i wsp. (Biol Reprod 2010; 83: ) Strona 37/Linia 3-7. Analogiczna uwaga jak poprzednio. Próby pobierane były od 14 do 25 dnia ciąży. Dla uwierzytelnienia tej grupy Autorka odwołuje się do Fotografii 1 i 2. 6

7 Ale Fotografia 1 zawiera obraz ciąży 35 dniowej. Czy więc część prób była pobierana w 35 dniu ciąży? Miedzy dniem 15 a 25 ciąży (nie mówiąc już o dniu 35 ciąży) dochodzi w śluzówce macicy do gwałtownych zmian w ekspresji czynników regulacyjnych. Grupa ta, uznana za kontrolną - II jest więc, jak poprzednia, wysoce niejednorodna, bez dodatkowego podziału na poszczególne dni/okresy krytyczne. Patrz prace: Haneda i wsp. (Dom. Animal Endocrinol, 2008; 36: ), Merk i wsp. (Biol Reprod 2010; 83: ); Klein i wsp. (Biol Reprod 2010; 83: ), Patterson i wsp. (Mol Reprod Develop 2012; 79: ), Gibson i wsp. (Placenta 2017: ), Read i wsp. (Reproduction 2018; 156: ) Strona 37/Linia 18. Co oznacza, że próby krwi pobierano tego samego dnia. W parę minut przed/lub po pobraniu bioptatów, czy też w parę/kilkanaście godzin po/przed? Po co pobierano krew do badań, skoro ani w rozdziale Materiały i Metody, ani Wyniki nie opisano co z ta krwią robiono dalej, ani czemu te próby służyły. Można to tylko wywnioskować pośrednio na podstawie danych zawartych w Streszczeniu i opisie metody podziału klaczy na poszczególne grupy badawcze Strona 38/Linia 2. Z wymienionych czynników tylko TNF można uznać za czynnik prozapalny. inos, COX-2, PGES to enzymy zaangażowane w produkcje czynników prozapalnych: tlenku azotu, prostaglandyn i specyficznie PGE2, odpowiednio Strona 39/Linia 20. W pracy nie wykonywano żadnych badań na poziomie genomu ( genetyczych ). Winno być: Próbki do badań transkryptomicznych 4.8. Strona 39/Linia 20. Nie znam definicji ewentualnego RNA. Zapewniam Doktorantkę, że w pobranych wg opisanej procedury próbach znajduje się zarówno DNA, jak i RNA. Ewentualnie, to przy źle pobranych i niewłaściwie utrwalonych próbach, może dojść do degradacji RNA. Ale w momencie wkładania bioptatu do probówki zawierającej mrnalater na pewno jest tam niezdegradowane RNA Strona 39/Linia 20 i dalej (analizy immonohistochemiczne i histopatologiczne). Czemu służyła odmienna procedura do analiz histo-patologicznych i immunocytochemii? Zgodnie z moim doświadczeniem, ilość materiału pobrana do badań histopatologicznych w zupełności wystarczyłaby aby dalej dokonać badań immunocytochemicznych, nawet jeśli ta tkanka była uprzednio użyta do wykonania rozmazu w kierunku cytologii, a część można było użyć do badań bakteriologicznych. Czy w opisanej procedurze utrwalania tkanek do badań immunohistochemicznych używano na pewno 4% formalinę tylko przez niespełna 30 minut, czy też formaldehyd? Czy 30 minutowe zanurzenie tkanki w formalinie było wystarczające do jej utrwalenia? Jak później zabezpieczano tkankę przez 60 dni przed kontaminacją (strona 40/Linia 2-4)? Nie podano stężenia użytej sacharozy? Wg podanych dalej informacji (np. strona 42/Linia 3) 7

8 utrwalenie tkanki do badań histologicznych i immunocytochemicznych wykonano przy użyciu 4% formaldehydu. Również w Załączniku 10.4 (strona 108) napisano, ze próby utrwalono formaldehydem. Czemu służyło kolejne utrwalenie w 4% paraformaldehydzie już raz utrwalonej w formalinie tkanki przed wykonaniem badań immunocytochemicznych (strona 52, Załącznik 10.4)? Brak informacji na temat użytych przeciwciał drugorzędowych. Czy do immunolokalizacji wszystkich badanych białek wykonano barwienia kontrolne - negatywne z użyciem specyficznych IgG lub odpowiednich peptydów blokujących? W Tabeli 5 wykazano użycie tylko peptydu blokującego dla PGES. Czy preparaty rzeczywiście oglądano i fotografowano pod powiększeniem 5- lub 10-krotnym? Czy też liczby te oznaczają użyte obiektywy? Badania ekspresji genów. - Strona 43/Linia 3 oraz Załącznik 10 (strona 100): Jaką ilość tkanki poddano homogenizacji. W Tekście i Załączniku wartości te różnią się (10 mg versus 20 mg)? - Strona 45 oraz Tabela 4. Jakie były przesłanki do użycia w przypadku analizy ekspresji TNF i enos na poziomie mrna innych stosunkowo wysokich stężeń starterów niż stężenia dla genu referencyjnego (GAPDH), przy jednocześnie otrzymanej bardzo wysokiej procentowej wydajności (powyżej 160%)? Różnica ta mogła wpływać na końcową analizę i interpretację wyników (patrz zastosowana prosta metoda analizy poziomu ekspresji - strona 47). - Rysunki 4-9. Pokazanie krzywych topnienia dla pojedynczych prób nie pozwala ocenić jakości analizy. Przedstawienie wykresów dla kilku prób daje dopiero pogląd na temat uzyskanego produktu reakcji. Chyba, że rysunki przedstawiają jedną reprezentatywną próbę z większej ilości wykonanych analiz Analiza statystyczna: Jakie przesłanki skłoniły doktorantkę do połącznie w jedna grupę klaczy z kategorii I, IIA i IIB, zamiast przyjętego w literaturze ewentualnego łączenia kategorii I i IIA oraz łączenia kategorii III z kategoria IIB? Z analizy Tabeli 6. wynika, że w dwóch grupach klaczy (Grupy kontrolne I. i II.) do kategorii III endometrosis zakwalifikowano tylko po jednej klaczy (n=1). 5. Wyniki: Ze względu na słaba jakość, jak również bardzo mały rozmiar prezentowanych zdjęć, bardzo trudno jest ocenić wyniki analiz immunohistochemicznych badanych czynników. Szkoda, że prezentację wyników Doktorantka ograniczyła do przedstawienia jedynie jednego zestawu składającego się aż z 20 fotografii o rozmiarach zaledwie 3 cm na 4 cm. Bardzo więc trudno ocenić, czy silne zabarwienie tła w kontroli (szczególnie zdjęcia D, H i L) 8

9 jest spowodowane niespecyficzną reakcją czy też niedostateczną jakością prezentowanych fotografii. Większe powiększenia i rozmiary fotografii pozwoliłyby także dokładnie ocenić oddzielnie reakcje barwną (intensywność barwienia lub ilość wybarwionych jader) w poszczególnych strukturach endometrium: nabłonku powierzchniowym i gruczołowym, naczyniach krwionośnych, a także w komórkach immunologicznych i zmianach fibrotycznych. Ponadto, wizualną ocenę natężenia uzyskanego sygnału (patrz strona 53) można było przedstawić w formie Tabeli z odpowiednio dobranymi symbolami dla przyjętych trzech kryteriów oceny. Znacznie ułatwiłoby to ocenę i zrozumienie otrzymanych wyników. Czy skali na fotografiach odpowiada wielkość 50 m czy 500 m. Podano różne liczby na fotografiach i w opisie. V. PODSUMOWANIE Doktorantka podjęła bardzo trudny temat i niezwykle istoty ze względów ogólnopoznawczych i praktycznych. Na uznanie zasługuje sam fakt podjęcia badań nad udziałem cytokin prozapalnych, metabolitów kwasu arachidonowego, tlenku azotu w patogenezie wczesnej śmierci zarodkowej u klaczy, używając nowatorskiego i pionierskiego modelu badawczego. Realizacja postawionych celów badawczych wymagała zaangażowania dużego potencjału metodycznego, jaki i zapewne pracy zespołowej, a przede wszystkim żmudnego i wieloletniego zbierania oryginalnego materiału badawczego mogącego na koniec stanowić bazę do przeprowadzenia odpowiednich analiz oraz doskonały materiał do dalszych pogłębionych studiów w przyszłości. Jest to pierwszy - istotny krok w dalszych badaniach. W mojej opinii rozprawa doktorska pani lek. wet. Eweliny Długołeckiej wnosi wkład do rozwoju nauki z zakresu patologii rozrodu klaczy. Oceniana rozprawa nie tylko dostarcza nowych danych, które wzbogacają już istniejącą wiedzę na temat patogenezy zamieralności zarodków, wydzielania i działania podstawowych mediatorów stanów zapalnych błony śluzowej macicy klaczy, ale również, stanowi doskonałą podstawą do dalszych badań zmierzających do opracowania nowych strategii diagnostycznych i terapeutycznych zaburzeń płodności klaczy. Wartość ocenianej rozprawy wynika także z próby zbadania wybranych - molekularnych, enzymatycznych aspektów matczynego rozpoznania i utrzymania ciąży u klaczy. Jej zaletą jest podjęcie, z zastosowaniem oryginalnego modelu badawczego, próby analizy wybranych czynników wpływających na przyczyny i predyspozycje do występowania zaburzeń wczesnej ciąży u klaczy. Należy stwierdzić także, że uzyskane obserwacje i wyniki wzbogacają pośrednio dotychczasową wiedzę także na temat molekularnych mechanizmów powstawania stanów zapalnych macicy oraz udziału włóknienia błony śluzowej macicy (endometrosis) w etiopatogenezie wczesnej śmierci zarodkowej. 9

10 Przedstawione w recenzji uwagi i pytania, często w odniesieniu do zagadnień szczegółowych, formy, sposobu i analizy danych są naturalnym elementem toku recenzji, prowadzącym do udoskonalenia pracy i wskazania dalszych kierunków badawczych. Stanowią też głos w dyskusji nad postępem badań nad przyczynami niepłodności klaczy, nie do końca poznanej patogenezy resorpcji zarodków. Uwagi te nie umniejszają pozytywnej oceny pracy, a jedynie mogą być przydatne podczas planowania kolejnych etapów badań - do konstruowania założeń i opracowywania rozwiązań metodycznych, jak również mogą być pomocne w opracowaniu dodatkowych doświadczeń i analiz, koniecznych do zamknięcia i podsumowania postawionych problemów badawczych oraz opracowania ich w formie publikacji. Na podstawie analizy wyników ocenianej rozprawy doktorskiej można uznać, że Doktorantka posiada nie tylko zasób wiedzy teoretycznej z zakresu biologii (morfologii i funkcji) oraz patologii układu rodnego klaczy, ale oprócz sporego już doświadczenia klinicznego, poznała również i przyswoiła wiele nowoczesnych narzędzi badawczych, takich jak: metody biologii molekularnej, metody immunodiagnostyczne. VI. WNIOSEK KOŃCOWY Przedstawiona do oceny praca pt. Wybrane endometrialne uwarunkowania resorpcji zarodków klaczy spełnia wymagania stawiane pracom doktorskim określone w Ustawie z dnia 14 marca 2003 roku o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz.U nr 65 poz. 595) wraz z późniejszymi zmianami (Ustawa z dnia 18 marca 2011 r. o zmianie Ustawy - Prawo o szkolnictwie wyższym, ustawy o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki oraz o zmianie niektórych innych ustaw; Dz.U nr 84 poz. 455). Zwracam się do Wysokiej Rady Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego z wnioskiem o dopuszczenie lek wet. Eweliny Długołęckiej do dalszych etapów przewodu doktorskiego. prof. dr hab. n. wet. Dariusz J. Skarżyński ZAKŁAD IMMUNOLOGII I PATOLOGII ROZRODU tel ; fax: ; d.skarzynski@pan.olsztyn.pl 10