SPRAWOZDANIE Z REALIZACJI ZADANIA:

Transkrypt

1 SPRAWOZDANIE Z REALIZACJI ZADANIA: BADANIA NAD ZRÓśNICOWANIEM MIĘDZY- I WEWNĄTRZPOPULACYJNYM PIERWIOSNKI LEKARSKIEJ (Primula officinalis L.), RÓśEŃCA GÓRSKIEGO (Rhodiola rosea L.) I TURÓWKI LEŚNEJ (Hierochloë australis (Schrad.) Roem et Schult.) wykonanego w Katedrze Roślin Warzywnych i Leczniczych Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie na podstawie decyzji Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi nr HOR hn /11 z dn r. Kierownik projektu: Prof. dr hab. Zenon Węglarz Zastępca kierownika i główny wykonawca: dr Katarzyna Bączek Wykonawcy: dr Anna Pawełczak dr Jarosław Przybył dr Małgorzata Pelc dr Ewelina Pióro-Jabrucka mgr Agnieszka Kuczerenko inŝ. Marcin Ejdys Marianna Gzowska Warszawa, grudzień 2011 r. 1

2 SPIS TREŚCI I Pierwiosnka lekarska (Primula officinalis L.) 4 1. Metodyka Badania terenowe Badania polowe Ocena zdolności kiełkowania nasion 6 2. Wyniki Badania terenowe Skład gatunkowy stanowisk naturalnych Ocena chemiczna surowców TLC HPLC Badania polowe Ocena zdolności kiełkowania nasion 27 II RóŜeniec górski (Rhodiola rosea L.) Badania terenowe Kolekcja ex situ Charakterystyka rozwojowa Charakterystyka rozwojowa roślin rozmnaŝanych wegetatywnie Charakterystyka rozwojowa roślin rozmnaŝanych generatywnie Charakterystyka morfologiczna i rozwojowa kwiatów 57 III Turówka leśna (Hierochloë australis (Schrad.) Roem. et. Schult.) Metodyka Badania terenowe Badania polowe Ocena zdolności kiełkowania nasion Wyniki Badania terenowe Skład gatunkowy stanowisk naturalnych Ocena chemiczna surowców Ocena zdolności kiełkowania nasion 91 IV Metodyka ogólna Metodyka analiz chemicznych Oznaczanie ogólnej zawartości związków biologicznie aktywnych Oznaczanie zawartości związków biologicznie aktywnych przy uŝyciu analiz chromatograficznych (TLC i HPLC) Metodyka oceny zdolności kiełkowania nasion Statystyczna analiza wyników 105 2

3 WSTĘP Badania przeprowadzone w roku 2011 wykonane zostały zgodnie z opisem i harmonogramem projektu załączonym w karcie zadania, we wniosku. W pracach nad pierwiosnką lekarską (Primula officinalis L.) i turówką leśną (Hierochloë australis (Schrad.) Roem. et Schult.) skoncentrowano się na lokalizacji i opisie wybranych stanowisk naturalnych na których te gatunki występują oraz charakterystyce chemicznej pozyskanych z tych roślin surowców. Z kaŝdej populacji zebrany został takŝe reprezentatywny materiał rozmnoŝeniowy, który uŝyty został w roku bieŝącym do załoŝenia doświadczeń ex situ. W badaniach nad róŝeńcem górskim główną uwagę poświęcono szczegółowej charakterystyce rozwojowej roślin rozmnaŝanych generatywnie i wegetatywnie ze szczególnym uwzględnieniem, w ujęciu dynamicznym, rozwoju organów generatywnych. Przeprowadzono takŝe częściową ocenę zawartości i składu chemicznego związków biologicznie aktywnych w uzyskanych surowcach. W roku bieŝącym pozyskano takŝe w ramach ekspedycji naukowej przeprowadzonej na terenie Wschodnich Karpat materiał rozmnoŝeniowy dwóch populacji róŝeńca górskiego. 3

4 I. Pierwiosnka lekarska (Primula officinalis L.) 1. METODYKA 1.1. BADANIA TERENOWE Badania terenowe przeprowadzono na ośmiu naturalnych stanowiskach pierwiosnki lekarskiej zlokalizowanych na terenie województwa podlaskiego. Lokalizacja stanowisk tego gatunku oraz ich dokumentacja prowadzona była przy udziale pracowników firmy Dary Natury z siedzibą na Podlasiu, zajmującą się skupem i przetwarzaniem surowców zielarskich. Badania terenowe prowadzono wiosną, na początku kwitnienia roślin. Za pomocą GPS określono połoŝenie geograficzne kaŝdego stanowiska, a następnie określono ilościowość badanych obiektów oraz skład gatunków towarzyszących i ich ilościowość metodą Brauna-Blanqueta. Zastosowano układ warstwowy fitocenozy, wyodrębniając następujące warstwy: A drzewa B krzewy C rośliny zielne Do określenia ilościowości posłuŝono się siedmiostopniową skalą Brauna-Blanqueta, która ujmuje jednocześnie liczebność i stopień pokrycia: 5 gatunek pokrywający więcej niŝ ¾ powierzchni zdjęcia, liczba osobników dowolna 4 gatunek pokrywający ½ ¾ powierzchni zdjęcia, liczba osobników dowolna 3 gatunek pokrywający ¼ ½ powierzchni zdjęcia, liczba osobników dowolna 2 gatunek pokrywający 5 25% powierzchni zdjęcia, liczba osobników dowolna lub bardzo duŝa liczba osobników, przy niŝszym pokryciu 1 gatunek umiarkowanie liczny i pokrywający mniej niŝ 5% powierzchni lub niezbyt liczny, ale o wyŝszym stopniu pokrycia + gatunek nieliczny, pokrywający tylko niewielką powierzchnię r gatunek rzadki tylko 1-2 okazy, zajmujące bardzo małą powierzchnię. 4

5 Tab. 1. Wykaz stanowisk naturalnych pierwiosnki lekarskiej Lp. Populacja Współrzędne geograficzne 1. Drohiczyn 1 N E Drohiczyn 2 N E Sytki N E Kirkuty N E ' 5. Mień N 53 o E 021 o Ruś N E Spieszyn N E Wyręby N E Do badań wytypowano stanowiska na których ilościowość pierwiosnki wynosiła minimum 2, tj. liczba osobników, wg skali Brauna-Blanqueta, na stanowisku była duŝa (5-25 % pokrycia powierzchni zdjęcia). Z kaŝdego stanowiska pobrano próby surowców: kwiatów oraz korzeni do badań fitochemicznych. Kwiaty pierwiosnki suszono w temperaturze 35 C, a korzenie w 45 C w suszarce typu SLW 240STD, POL-EKO. Uzyskane surowce poddano analizie chemicznej na zawartość związków fenolowych przy uŝyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Chromatografię cienkowarstwową zastosowano równieŝ do oceny zawartości w korzeniach kwasu prymulowego I, który jest najwaŝniejszym związkiem saponinowym w tym surowcu. Szczegółową metodykę analiz chemicznych przedstawiono w rozdziale IV BADANIA POLOWE Z oznaczonych naturalnych stanowisk pobrano wegetatywny materiał rozmnoŝeniowy w celu załoŝenia kolekcji ex situ pierwiosnki lekarskiej na Polu Doświadczalnym KRWiL w Wilanowie. Kolekcję załoŝono na początku maja br. Jesienią z kolekcji wykopano po 8 roślin badanych populacji w celu określenia masy korzeni i zawartości w nich związków biologicznie aktywnych. Korzenie suszono i analizowano pod kątem zawartości związków biologicznie czynnych analogicznie jak surowiec zebrany ze stanowisk naturalnych. 5

6 1.3. OCENA ZDOLNOŚCI KIEŁKOWANIA NASION Z oznaczonych stanowisk pierwiosnki lekarskiej zebrano równieŝ nasiona, które zostały ocenione pod kątem wartości siewnej. Ocenę tą przeprowadzono w Pracowni Nasiennictwa i Nasionoznawstwa w Katedrze Roślin Warzywnych i Leczniczych. Oznaczono następujące parametry jakościowe: 1. wilgotność nasion, 2. masę 1000 nasion, 3. zdolność kiełkowania. Pełną metodykę badań opisano w rozdziale IV. 6

7 2. WYNIKI 2.1. BADANIA TERENOWE Skład gatunkowy stanowisk naturalnych W Polsce pierwiosnka lekarska występuje na całym niŝu, a rzadziej na Pogórzu Karpackim. Rośnie ona na leśnych polanach, suchych łąkach oraz na słonecznych pagórkach. Jest to gatunek charakterystyczny dla ciepłolubnych dąbrów w obrębie klasy Querco-Fagetea i rzędu Quercetalia pubescenti-petraeae. Spośród oznaczonych naturalnych stanowisk pierwiosnki lekarskiej (tab. 1) do tych zbiorowisk moŝna zaliczyć stanowiska Sytki (nr 3), Ruś (nr 6), Spieszyn (nr 7) oraz Wyręby (nr 8) (tab. 4, 7-9, fot. 5, 9-11). Pierwiosnka lekarska moŝe występować równieŝ na ciepłolubnych murawach kserotermicznych, zbiorowisk naleŝących do klasy Festuco-Brometea. Murawy kserotermioczne rozwijają się na siedliskach suchych o odczynie zasadowym, często zasobnych w składniki pokarmowe są to najczęściej zbocza wzgórz, dolin i wąwozów. Do tego typu siedlisk moŝemy zaliczyć pozostałe cztery stanowiska: Drohiczyn 1 (nr 1), Drohiczyn 2 (nr 2), Kirkuty (nr 4) oraz Mień (nr 5) (tab. 2, 3, 5, 6, fot. 1-4, 6-8). W naszym kraju pierwiosnka lekarska została objęta częściową ochroną gatunkową wraz z pierwiosnką wyniosłą Primula elatior (Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 14 sierpnia 2001 r.). Do zanikania pierwiosnki lekarskiej na stanowiskach naturalnych przyczyniają się takie działania człowieka, jak przekształcanie wielogatunkowych łąk ekstensywnych w łąki intensywne, na których prowadzone są monokultury bogate jedynie w cenne gatunki traw pastewnych, zaorywanie muraw kserotermicznych lub intensywny wypas bydła, a takŝe fragmentacja siedlisk powodująca zmniejszenie plenności nasion i ich zdolności kiełkowania. Powodem jest równieŝ niekontrolowany zbiór roślin ze stanu naturalnego dla celów leczniczych oraz dekoracyjnych w ogrodach przydomowych. 7

8 Stanowisko 1 Miejscowość: Drohiczyn 1 N E Tab. 2. Wykaz głównych gatunków występujących na stanowisku 1 WARSTWA NAZWA GATUNKOWA ILOŚCIOWOŚĆ C Phleum pratense 3 C Centaurea jacea 3 C Agrimonia eupatoria 3 C Campanula glomerata 3 C Vicia cracca 2 C Plantago lanceolata 2 C Achillea millefolium 2 C Poa pratensis 2 C Lysimachia nummularia 2 C Primula veris 2 C Ranunculus acris 1 C Medicago sativa 1 C Crepis biennis 1 C Cichorium intybus 1 C Rumex acetosella 1 C Trifolium arvense 1 C Galium verum 1 C Lotus corniculatus + 8

9 Fot. 1. Stanowisko w miejscowości Drohiczyn 1 Fot. 2. Pierwiosnka lekarska na stanowisku Drohiczyn 1 9

10 Stanowisko 2 Miejscowość: Drohiczyn 2 N E Tab. 3. Wykaz głównych gatunków występujących na stanowisku 2 WARSTWA NAZWA GATUNKOWA ILOŚCIOWOŚĆ B Prunus spinosa 1 C Achillea millefolium 5 C Galium verum 4 C Ajuga reptans 4 C Plantago lanceolata 4 C Primula veris 3 C Thymus pulegioides 3 C Dactylis glomerata 3 C Salvia pratensis 3 C Briza media 3 C Solidago virgaurea 3 C Potentilla anserina 3 C Filipendula hexapetala 2 C Veronica spicata 3 C Fragaria vesca 3 C Origanum vulgare 2 C Campanula patula 2 C Rumex acetosella 2 C Agrimonia eupatoria 2 C Medicago sativa 1 10

11 Fot. 3. Stanowisko w miejscowości Drohiczyn 2 Fot. 4. Pierwiosnka lekarska na stanowisku Drohiczyn 2 11

12 Stanowisko 3 Miejscowość: Sytki N E Tab. 4. Wykaz głównych gatunków występujących na stanowisku 3 WARSTWA NAZWA GATUNKOWA ILOŚCIOWOŚĆ B Corylus avellana 1 C Ficaria verna 4 C Primula officinalis 2 C Asarum europaeum 3 C Viola odorata 2 C Geum urbanum 2 C Fragaria vesca 1 C Maianthemum bifolium 1 C Anemone nemorosa 1 Fot. 5.Stanowisko w miejscowości Sytki 12

13 Stanowisko 4 Miejscowość: Kirkuty N E Tab. 5. Wykaz głównych gatunków występujących na stanowisku 4 WARSTWA NAZWA GATUNKOWA ILOŚCIOWOŚĆ B Crataegus monogyna 2 B Prunus spinosa 1 C Achillea millefolium 1 C Primula officinalis 2 C Dactylis glomerata 3 C Hypericum perforatum 1 C Potentilla erecta + C Urtica dioica r C Thymus pulegioides + C Origanum vulgare r C Taraxacum officinale + C Plantago lanceolata + Fot. 6 Fot. 7 Fot. 6 i 7. Stanowisko w miejscowości Kirkuty 13

14 Stanowisko 5 Miejscowość: Mień N 53 o E 021 o Tab. 6. Wykaz głównych gatunków występujących na stanowisku 5 WARSTWA NAZWA GATUNKOWA ILOŚCIOWOŚĆ B Crataegus monogyna 3 C Primula officinalis 3 C Elymus repens 3 C Dactylis glomerata 3 C Veronica chamaedrys 2 C Ranunculus repens 1 C Pimpinella saxifraga + C Urtica dioica + C Plantago major + Fot. 8. Stanowisko w miejscowości Mień 14

15 Stanowisko 6 Miejscowość: Ruś N E Tab. 7. Wykaz głównych gatunków występujących na stanowisku 6 WARSTWA NAZWA GATUNKOWA ILOŚCIOWOŚĆ A Pinus sylvestris 4 B Corylus avellana 2 C Anemone nemorosa 3 C Hepatica nobilis 3 C Convallaria majalis 3 C Primula officinalis 2 C Fragaria vesca 1 C Ranunculus repens 1 C Oxalis acetosella 1 C Taraxacum officinale + Fot. 9.Stanowisko w miejscowości Ruś 15

16 Stanowisko 7 Miejscowość: Spieszyn N E Tab. 8. Wykaz głównych gatunków występujących na stanowisku 7 WARSTWA NAZWA GATUNKOWA ILOŚCIOWOŚĆ A Pinus sylvestris 2 B Corylus avellana 2 B Alnus glutinosa 1 B Rubus idaeus 1 C Fragaria vesca 2 C Polygonatum multiflorum 2 C Primula officinalis 2 C Anemone nemorosa 1 C Convallaria majalis 1 C Viola odorata 1 C Urtica dioica + Fot. 10. Stanowisko w miejscowości Spieszyn 16

17 Stanowisko 8 Miejscowość: Wyręby N E Tab. 9. Wykaz głównych gatunków występujących na stanowisku 8 WARSTWA NAZWA GATUNKOWA ILOŚCIOWOŚĆ B Corylus avellana 2 B Carpinus betulus 2 C Fragaria vesca 4 C Anemone nemorosa 4 C Veronica chamaedrys 3 C Primula officinalis 2 C Melandrium album 1 C Malva alcea 1 C Astragalus glacyphyllos 1 Fot. 11. Pierwiosnka lekarska na stanowisku Wyręby 17

18 Ocena chemiczna surowców TLC A. KWIATY Fot. 12. Chromatogram TLC ekstraktów z kwiatów pierwiosnki lekarskiej obserwowany w świetle UV o długości fali 366 nm, po upochodnieniu roztworem aldehydu anyŝowego Fot. 13. Chromatogram TLC ekstraktów z kwiatów pierwiosnki lekarskiej obserwowany w świetle widzialnym, po upochodnieniu roztworem aldehydu anyŝowego WZORCE: 1 kwas prymulowy I, 2 kwas prymulowy II, 3 prymweryna, 4 prymulaweryna; EKSTRAKTY Z KWIATÓW: 5 stanowisko Drohiczyn 1, 6 stanowisko Drohiczyn 2, 7 stanowisko Kirkuty, 8 stanowisko Ruś, 9 stanowisko Mień, 10 stanowisko Spieszyn, 11 stanowisko Sytki, 12 stanowisko Wyręby ; 13 mieszanina wzorców 18

19 B. KORZENIE Fot. 14. Chromatogram TLC ekstraktów z korzeni pierwiosnki lekarskiej obserwowany w świetle UV o długości fali 366 nm, po upochodnieniu roztworem aldehydu anyŝowego Fot. 15. Chromatogram TLC ekstraktów z korzeni pierwiosnki lekarskiej obserwowany w świetle widzialnym, po upochodnieniu roztworem aldehydu anyŝowego WZORCE: 1 kwas prymulowy I, 2 kwas prymulowy II, 3 prymweryna, 4 prymulaweryna; EKSTRAKTY KORZENI: 5 stanowisko Drohiczyn 1, 6 stanowisko Drohiczyn 2, 7 stanowisko Kirkuty, 8 stanowisko Ruś, 9 stanowisko Mień, 10 stanowisko Spieszyn, 11 stanowisko Sytki, 12 stanowisko Wyręby ; 13 mieszanina wzorców 19

20 OCENA ZAWARTOŚCI KWASU PRYMULOWEGO I W KORZENIACH PIERWIOSNKI PRZY UśYCIU TLC Fot. 16. Chromatogram TLC ekstraktów z korzeni pierwiosnki lekarskiej wykorzystany do określenia zawartości kwasu prymulowego I w zebranych surowcach WZORZEC (KWAS PRYMULOWY I): S1 20 µl S2 30 µl S3 40 µl S4 50 µl S5 60 µl Pv1 ekstrakt z korzeni zebranych ze stanowiska Drohiczyn 1 Pv2 - ekstrakt z korzeni zebranych ze stanowiska Drohiczyn 2 Pv3 - ekstrakt z korzeni zebranych ze stanowiska Kirkuty Pv4 ekstrakt z korzeni zebranych ze stanowiska Ruś Pv5 ekstrakt z korzeni zebranych ze stanowiska Mień Pv6 ekstrakt z korzeni zebranych ze stanowiska Spieszyn Pv7 ekstrakt z korzeni zebranych ze stanowiska Sytki Pv8 - ekstrakt z korzeni zebranych ze stanowiska Wyręby Wyk. 1. Zawartość kwasu prymulowego I w korzeniach pierwiosnki lekarskiej (%) Wartości oznaczone tymi samymi literami nie róŝnią się między sobą istotnie statystycznie na poziomie α = 0,01 20

21 HPLC Tab. 10. Zawartość związków fenolowych w kwiatach pierwiosnki lekarskiej (mg x 100g -1 s.m.) Populacja Związki fenolowe Średnio CV Orientyna Rutozyd rutynozyd izoramnetyny glukozyd izoramnetyny Astragalina (+)-Katechina Kwas chlorogenowy Tab. 11. Zawartość związków fenolowych w korzeniach pierwiosnki lekarskiej (mg x 100g -1 s.m.) Populacja Związki fenolowe Średnio CV Prymweryna Prymulaweryna Kwas rozmarynowy

22 Rys. 1. Przykładowy chromatogram ekstraktu z kwiatów pierwiosnki lekarskiej (HPLC) Rys. 2. Przykładowy chromatogram ekstraktu z korzeni pierwiosnki lekarskiej (HPLC) 22

23 2.2. BADANIA POLOWE Tab. 12. ŚwieŜa i powietrznie sucha masa korzeni pierwiosnki lekarskiej (g x roślina -1 ) Populacja przeniesiona do kolekcji świeŝa masa korzeni (g) sucha masa korzeni (g) 1. Drohiczyn (górka) 25,51 d 7,62 d 2. Drohiczyn (wąwóz) 22,96 cd 7,30 d 3. Sytki 25,67 d 6,79 bc 4. Kirkuty 20,93 c 7,12 c 5. Mień 28,50 d 8,23 e 6. Ruś 16,69 b 6,12 b 7. Spieszyn 12,43 a 5,87 a 8. Wyręby 16,59 b 6,02 b Wartości oznaczone tymi samymi literami w kolumnach nie róŝnią się między sobą istotnie statystycznie na poziomie α = 0,05 Fot. 17.Kolekcja pierwiosnki lekarskiej na Polu Doświadczalnym KRWiL w Wilanowie 23

24 Tablica 1. Korzenie pierwiosnki wykopane z kolekcji ex situ 24

25 A. TLC Fot. 18. Chromatogram TLC ekstraktów z korzeni pierwiosnki lekarskiej przeniesionej do kolekcji ex situ Wzorce: W1 - prymweryna, W2 - prymuloweryna, W3 - kwas prymulowy I, W4 - kwas prymulowy II EKSTRAKTY Z KORZENI: 1 stanowisko Drohiczyn 1, 2 stanowisko Drohiczyn 2, 3 stanowisko Kirkuty, 4 stanowisko Ruś, 5 stanowisko Mień, 6 stanowisko Spieszyn, 7 stanowisko Sytki, 8 stanowisko Wyręby ; Wmix mieszanina wzorców B. HPLC Tab. 13. Zawartość związków fenolowych w korzeniach pierwiosnki lekarskiej (mg x 100g -1 s.m.) Związki fenolowe Populacja średnia CV Primweryna 1052, , , , , , , , ,10 15,57 Primulaweryna 751, , ,04 574,30 885,75 603,57 782,37 637,00 853,54 34,35 Rys. 3. Przykładowy chromatogram ekstraktu z korzeni pierwiosnki lekarskiej z kolekcji ex situ (HPLC) 25

26 Wartość surowcowa korzeni pierwiosnki lekarskiej oceniana jest na podstawie zawartości w nich saponin (w tym kwasu prymulowego) oraz związków fenolowych tj. prymweryny i prymulaweryny. Korzenie badanych populacji róŝniły się miedzy sobą znacznie pod względem zawartości tych związków (fot , tab. 11, wyk. 1, rys. 2). NajwyŜszą zawartością kwasu prymulowego I charakteryzowały się korzenie populacji nr 8, pochodzące z okolic miejscowości Wyręby, a najniŝszą populacji nr 3, z okolic miejscowości Sytki (fot. 16, wyk. 1). Jeszcze większe róŝnice wystąpiły w przypadku prymweryny i prymulaweryny. W przypadku pierwszej skrajne wartości wynosiły 766,94 i 1493,19, a drugiej 291,40 i 842,13 mg/100g. s.m. surowca (tab. 11). W kwiatach, zarówno kwas prymulowy jak i prymaweryna oraz prymulaweryna albo w ogóle nie występowały, albo występowały jedynie w niewielkich ilościach (fot. 12 i 13, rys. 1). W kwiatach wystąpiły głównie flawonoidy, a w szczególności rutozyd, 3-rutynozyd izoramnetyny i 3-glukozyd izoramnetyny (tab. 10). Populacje pierwiosnki róŝniły się pod względem zawartości wszystkich zidentyfikowanych związków flawonoidowych. Na uwagę zasługuje to, Ŝe w dwóch populacjach tj. populacji nr 1 i 7 większość tych związków wystąpiła w bardzo niewielkich ilościach. Masa korzeni roślin wprowadzonych wiosną do kolekcji ex situ (populacje 1-8) i wykopanych jesienią była niewielka (tab. 12, fot. 17, tablica 1). Porównanie składu chemicznego korzeni roślin pozyskiwanych ze stanowisk naturalnych i tych samych roślin wprowadzonych do uprawy wskazuje Ŝe zawartość prymweryny i prymulaweryny w tych pierwszych jest niŝsza (tab. 11 i 13, fot. 18, rys. 3). 26

27 2.3. OCENA ZDOLNOŚCI KIEŁKOWANIA NASION Tab. 14. Wartość siewna nasion Stanowisko z którego pochodziły nasiona Wilgotność nasion (%) Masa 1000 nasion (g ) Zdolność kiełkowania (%) Drohiczyn 1 7,7 0, Drohiczyn 2 7,2 0, Sytki 7,6 0, Kirkuty 7,8 0, Mień 7,5 0, Ruś 8,1 0, Spieszyn 8,0 0, Wyręby 8,3 0, Wartości oznaczone tymi samymi literami w kolumnach nie róŝnią się między sobą istotnie statystycznie na poziomie α = 0,05 Nasiona badanych populacji pierwiosnki lekarskiej róŝniły się w niewielkim stopniu masą jednostkową. Wstępna ocena zdolności kiełkowania wykazała, Ŝe róŝnice pod tym względem pomiędzy populacjami równieŝ nie były szczególnie znaczące (tab. 14, fot. 19 i 20). Fot. 19. Nasiona pierwiosnka lekarskiego w teście zdolności kiełkowania Fot. 20. Etapy kiełkowania nasion pierwiosnka lekarskiego 27

28 II. RóŜeniec górski (Rhodiola rosea L.) 1. BADANIA TERENOWE W 2005 i 2008 roku pracownicy Katedry Roślin Warzywnych i Leczniczych SGGW przeprowadzili ekspedycje naukowe do Mongolii w celu pozyskania materiałów rozmnoŝeniowych róŝeńca górskiego. W ekspedycjach tych uczestniczyli przedstawiciele Uniwersytetu Rolniczego w Ułan Bator. W 2005 roku ekspedycja objęła obszar centralnej i północno-wschodniej Mongolii, a w 2009 roku okolice Moron oraz jeziora Khuvsgul (góry Ałtaj). Łącznie zlokalizowano 8 stanowisk naturalnych róŝeńca (tab. 15). Z wszystkich stanowisk pobierano nasiona oraz próby kłączy, które poddano analizie chemicznej na zawartości związków fenolowych (przy uŝyciu HPLC). W przypadku gdy ilościowość róŝeńca na stanowisku naturalnym wynosiła minimum 2 (wg skali Brauna-Blanqueta) kłącza róŝeńca pobierano równieŝ w celu przygotowania z nich sadzonek. Kłącza jednej z populacji róŝeńca (nr 112) pochodziły z rejonu Ałtaju Rosyjskiego. Pozyskano je w 2001 roku z ogrodu botanicznego w Mińsku Białoruskim jako wegetatywny materiał rozmnoŝeniowy. We wrześniu 2011 roku przeprowadzono równieŝ ekspedycję naukową na Ukrainę w celu zbioru materiałów rozmnoŝeniowych róŝeńca górskiego z rejonu wschodnich Karpat. Przy udziale lokalnych zbieraczy ziół zlokalizowano dwa stanowiska naturalne tego gatunku (tab. 15), z których równieŝ zebrano kłącza do badań fitochemicznych oraz jako materiał do przygotowania sadzonek. Uzyskany podczas ekspedycji naukowych materiał rozmnoŝeniowy (kłącza i nasiona) wykorzystano do załoŝenia kolekcji ex situ róŝeńca górskiego na Polu Doświadczalnym SGGW. 28

29 Tab. 15. Lokalizacja stanowisk naturalnych róŝeńca górskiego Populacja N E Wysokość n.p.m. (m) rok zbioru pochodzenie 5/ Mongolia Mongolia Mongolia Mongolia Mongolia Mongolia Mongolia Mongolia Ukraina Ukraina 29

30 Fot. 21. Stanowisko naturalne nr 5/23 w Mongolii (2005 r.) Fot. 22. RóŜeniec górski na stanowisku nr 5/23 (2005 r.) 30

31 Fot. 23. Ałtaj mongolski (2009 r.) Fot. 24. Zbiór róŝeńca górskiego na terenie Ałtaju w Mongolii (2009 r.) 31

32 Fot. 25. Stanowisko naturalne nr 21 w Mongolii (2009 r.) Fot. 26. Stanowisko naturalne nr 22 w Mongolii (2009 r.) 32

33 Fot. 27. Stanowisko naturalne nr 25 w Mongolii (2009 r.) Fot. 28. Rośliny róŝeńca na stanowisku nr 25 (2009 r.) 33

34 Fot. 29. Stanowisko naturalne nr 27 w Mongolii (2009 r.) Fot. 30. Fot.. Zbiór kłączy róŝeńca na stanowisku nr 27 w Mongolii (2009 r.) 34

35 Fot. 31. Stanowisko naturalne nr 1 róŝeńca górskiego na Ukrainie Karpaty wschodnie (2011 r.) Fot. 32. Rośliny róŝeńca na stanowisku nr 1 na Ukrainie (2009 r.) 35

36 Tab. 16. Zawartość związków fenolowych w kłączach róŝeńca górskiego pochodzących ze stanowisk naturalnych (mg 100g -1 s.m.) Stanowiska z których pochodził Związki fenolowe surowiec salidrozyd rozawina rozaryna rozyna p-tyrozol akohol transcynamonowy st. 5/23 280, ,59 748,51 17,50 18,83 129,25 st , , ,35 16,92 10,53 177,54 st , , ,05 21,22 21,58 143,71 st , ,36 491,93 120,80 18,15 37,19 st , ,06 881,86 22,44 9,64 43,89 st , ,55 497,76 73,77 19,27 127,76 st , ,39 258,35 77,37 14,88 16,54 st , ,46 456,66 23,17 18,02 132,63 st , , ,22 544,36 39,00 494,76 st , ,27 892,36 503,30 32,45 769,63 średnia 401, ,79 796,71 142,09 20,24 207,29 CV 32,30 49,56 46,61 143,83 45,13 115,27 Rys. 4. Chromatogram ekstraktu z kłączy róŝeńca górskiego (populacja 22) Stanowiska naturalne róŝeńca górskiego z których pozyskiwano materiał roślinny (kłącza i nasiona) były znacząco odległe od siebie i róŝniły się zarówno ukształtowaniem terenu (zawsze tereny górskie), jak i szatą roślinną (tab. 15, fot ). Zawartość głównych związków biologicznie aktywnych w wyjściowym materiale roślinnym pochodzącym ze stanowisk naturalnych była silnie zróŝnicowana. RóŜnice te dotyczyły równieŝ dwóch najwaŝniejszych związków tj. salidrozydu i rozawiny (tab.16, rys. 4). 36

37 2. KOLEKCJA EX SITU A. ROŚLINY ROZMNAśANE WEGETATYWNIE Kłącza róŝeńca górskiego zebrane ze stanowisk naturalnych podczas ekspedycji naukowych posłuŝyły jako wegetatywny materiał rozmnoŝeniowy do załoŝenia kolekcji ex situ tego gatunku. W 2010 roku kolekcja ta obejmowała rośliny pochodzące z sześciu stanowisk: 5/23, 6, 22, 25, 51 i 112. Wiosną 2011 roku rośliny te wykopano, przygotowano z nich sadzonki wegetatywne i wysadzono na odpowiednio przygotowanym nowym stanowisku na Polu Doświadczalnym w Wilanowie (fot. 37 i 38). B. ROŚLINY ROZMNAśANE GENERATYWNIE Nasiona róŝeńca górskiego pochodzące ze stanowisk naturalnych tego gatunku (populacja nr 5/23, 6, 27, 51) wysiewano 21 stycznia 2011 roku w Ośrodku Szklarniowym SGGW do skrzynek ogrodniczych wypełnionych substratem torfowym (fot. 33 i 34). Przed wysiewem nasiona odkaŝano w 5% roztworze podchlorynu sodu. Od momentu kiełkowania nasion siewki były doświetlane (16h światła i 8h ciemności). W połowie marca rośliny pikowano do wielodoniczek o ilości oczek 160 wypełnionych substratem torfowym (fot. 35 i 36). W drugiej połowie maja uzyskaną rozsadę wysadzono na Polu Doświadczalnym w Wilanowie w ilości po 120 szt. (fot. 37, 39 i 40). Jesienią 2011 r. z kolekcji badanych populacji rozmnaŝanych z nasion wykopano po 10 roślin w celu określenia zawartości w nich związków biologicznie aktywnych. Kłącza suszono i analizowano pod kątem zawartości tych związków analogicznie jak surowce zebrane ze stanowisk naturalnych. 37

38 Fot. 33. Kiełkujące nasiona róŝeńca górskiego (populacja 5/23) Fot. 34. Siewki róŝeńca górskiego 38

39 Fot. 35. Rozsada róŝeńca górskiego w szklarni SGGW Fot. 36. Rozsada róŝeńca górskiego 39

40 Fot. 37. Kolekcja ex situ róŝeńca górskiego na Polu Doświadczalnym w Wilanowie widok ogólny (jesień 2011 r.) Fot. 38. Rośliny pochodzące ze stanowiska nr 5/23, rozmnaŝane wegetatywnie kolekcja ex situ 40

41 Fot. 39. Populacja 5/23, rośliny rozmnaŝane generatywnie kolekcja ex situ Fot. 40. Populacja 51, rośliny rozmnaŝane generatywnie kolekcja ex situ 41

42 Tab. 17. Zawartość związków fenolowych w kłączach róŝeńca górskiego pochodzących z kolekcji ex situ (mg 100g -1 s.m.) Związki fenolowe Populacja salidrozyd rozawina rozaryna rozyna p-tyrozol akohol transcynamonowy st. 5/23 144, ,78 731,24 49,99 11,98 192,45 st. 6 62, ,97 592,33 43,46 45,48 205,80 st , , ,44 54,12 27,66 306,38 st , ,91 633,55 48,08 39,15 161,10 średnia 86, ,30 808,39 48,91 31,07 216,43 CV 47,13 45,03 39,27 9,04 47,34 29,03 W pierwszym roku wegetacji roślin (w warunkach uprawy polowej w 2011 roku) zawartość salidrozydu w kłączach roślin rozmnaŝanych generatywnie była niŝsza niŝ w kłączach roślin zebranych z naturalnych stanowisk, natomiast zawartość rozawiny, rozyny, p-tyrozolu i alkoholu trans cynamonowego (z wyjątkiem populacji 6) była wyŝsza (tab. 16 i 17). 42

43 3. CHARAKTERYSTYKA ROZWOJOWA 3.1. Charakterystyka rozwojowa roślin rozmnaŝanych wegetatywnie Materiał badawczy stanowiły rośliny uzyskane z sadzonek kłączowych opisane w rozdziale 2A. Obserwacje polowe dotyczyły: przebiegu faz rozwojowych roślin w okresie ; liczby wytworzonych przez rośliny pędów asymilacyjnych i generatywnych oraz udziału procentowego kwitnących roślin Ŝeńskich i męskich obserwowane w 3 terminach: , , W tabeli 18 przedstawiono, w ujęciu dynamicznym, charakterystykę rozwojową roślin rozmnaŝanych wegetatywnie, na przykładzie roślin pochodzących ze stanowisk 5/23. Tab. 18. Szczegółowe obserwacje faz rozwojowych na przykładzie roślin pochodzących ze stanowiska 5/23 Data Faza rozwojowa roślin obserwacji rośliny Ŝeńskie - kwitnienie i początek zawiązywania nasion w zaląŝniach, słupki zielone, znamiona słupków wilgotne, na starszych kwiatostanach zasychające (fot. 41); rośliny męskie - pełnia kwitnienia kwiatów, płatki świeŝe, Ŝółte, rozwinięte wszystkie kwiaty w kwiatostanie, pylniki otwarte, pylące (fot. 42); we wszystkich kwiatach obecność Ŝółtych nektarników; obecność pąków II generacji pędów na kłączu rośliny męskie - kwiaty uschnięte; rośliny Ŝeńskie - rozwój nasion w owocach (mieszkach), owoce zielone (fot. 43); u części roślin początek rozwoju pędów II generacji 43

44 wzrost pędów II generacji (długości 1-3 cm, nie moŝna jeszcze stwierdzić czy są jedynie asymilacyjne, czy generatywne) przebarwianie się owoców (dojrzewanie) na Ŝółto lub czerwono; kwiaty pręcikowe na I generacji pędów prawie całkowicie opadły, lecz wszystkie pędy I gen. są zielone; u niektórych roślin następuje rozwój pędów II generacji, na części z nich widać juŝ pąki kwiatowe (fot.44), inne są dopiero w fazie pąków na kłączu u nasady pędów I generacji początek otwierania się owoców i osypywania się nasion zawiązanych w owocostanach I generacji pędów; początek kwitnienia kwiatów na pędach II generacji pełnia kwitnienia na pędach II generacji (nie wszystkie pąki kwiatostanowe rozwinęły się, część uschła, kwitnie mniej roślin niŝ na I generacji pędów) osypywanie się nasion z owoców zawiązanych na pędach I generacji pędy wegetatywne I generacji zaczęły się przebarwiać na Ŝółto lub czerwonawo i leŝą na powierzchni ziemi; pędy generatywne roślin Ŝeńskich po osypaniu nasion zaczynają zasychać; pędy II generacji są zielone, cieńsze i słabsze od pędów I generacji i rzadko generatywne; sukcesywnie pojawiają się kolejne pąki pędowe na kłączu i rozwijają się z nich młode pędy róŝnej długości trudno stwierdzić czy jest to II, czy III generacja pędów; na niektórych pędach I generacji w kątach liści powstały pędy boczne sukcesywny wzrost kolejnych młodych pędów wegetatywnych i generatywnych, bez wyraźnego wyodrębnienia kolejnej generacji pędów (fot. 45); występuje gnicie wierzchołków niektórych młodych pędów, co spowodowało słabe kwitnienie sukcesywny wzrost kolejnych młodych pędów wegetatywnych i generatywnych, kwitnienie nielicznych roślin najstarsze pędy uschły, młodsze rozkładają się płasko na powierzchni ziemi; początek przebarwiania liści; osypywanie nasion zawiązanych na II generacji pędów; sukcesywny wzrost kolejnych młodych pędów generatywnych - pojawianie się kwitnących kwiatostanów, lecz na bardzo silnie skróconych łodygach (1-2 cm) (fot. 46) uschnięte pędy większości roślin; u podstawy pędów widoczne, pokryte łuskami pąki, które rozwiną się w następnym sezonie wegetacyjnym 44

45 Fot. 41. Roślina Ŝeńska kwitnąca na I generacji pędów (początek maja) Fot. 42. Roślina męska kwitnąca na I generacji pędów (początek maja) 45

46 Fot. 43. Rozwój owoców na pędzie generatywnym rośliny Ŝeńskiej (połowa maja) Fot 44. Rozwój II generacji pędów (początek czerwca) 46

47 Fot. 45. Sukcesywny rozwój kolejnych pędów asymilacyjnych nie moŝna wyodrębnić kolejnych generacji pędów (koniec lipca) Fot. 46. Wytworzony jesienią pęd generatywny o silnie skróconej łodydze (wrzesień) 47

48 Tab. 19. Charakterystyka rozwojowa roślin rozmnaŝanych wegetatywnie Data obserwacji Pochodzenie materiału Liczba pędów/roślinę % roślin kwitnących w terminie obserwacji rozmnoŝeniowego Generatywnych Asymilacyjnych Ogółem śeńskich Męskich (nr stanowiska) /23 1,8 7,5 a 50,0 31,0 19,0 6 1,4 4,1 bc 25,0 12,5 12,5 22 0,4 1,8 c 21,4 14,3 7,1 25 0,2 2,2 c 7,7 7,7 0,0 51 0,5 5,7 ab 28,6 28,6 0, ,8 4,3 b 19,4 3,3 16, /23 0,1 13,1 a 7,7 1,9 5,8 6 0,3 9,3 ab 12,5 12,5 0,0 22 0,1 5,0 c 7,1 7,1 0,0 25 0,2 4,7 c 15,4 15,4 0,0 51 0,0 8,2 ab 0,0 0,0 0, ,2 9,5 ab 6,2 0,0 6, /23 0,1 23,9 a 3,8 0,0 3,8 6 0,0 24,0 a 0,0 0,0 0,0 22 0,0 6,1 b 0,0 0,0 0,0 25 0,0 6,3 b 0,0 0,0 0,0 51 0,0 23,1 ab 0,0 0,0 0, ,0 19,3 ab 0,0 0,0 0,0 średnie oznaczone tymi samymi literami w jednym terminie obserwacji nie róŝnią się istotnie na poziomie α=0.05 Rośliny pochodzące z róŝnych stanowisk róŝniły się pod względem intensywności wytwarzania pędów asymilacyjnych w czasie wegetacji (tab. 19). W pierwszym i drugim terminie obserwacji rośliny ze stanowiska 5/23 wyróŝniały się największą liczbą pędów. Dopiero pod koniec lipca zbliŝoną liczbę pędów wytworzyły rośliny ze stanowiska 6. Najmniejszą liczbą pędów, przez cały okres wegetacji, charakteryzowały się rośliny pochodzące ze stanowisk 22 i

49 Najwięcej roślin kwitnących obserwowano na początku maja. Jedynie w przypadku roślin pochodzących ze stanowiska 25 w drugim terminie obserwacji (połowa czerwca kwitnienie na II generacji pędów) zaobserwowano dwukrotnie więcej roślin kwitnących niŝ w pierwszym terminie obserwacji. W drugim terminie obserwacji nie kwitły jedynie rośliny pochodzące ze stanowiska 51. Pod koniec lipca kwitły jedynie nieliczne rośliny pochodzące ze stanowiska 5/23. Wśród kwitnących roślin pochodzących ze stanowisk 5/23, 6, 22 i 112 obserwowano rośliny męskie i Ŝeńskie, natomiast ze stanowisk 25 i 51 wyłącznie Ŝeńskie. 49

50 3.2. Charakterystyka rozwojowa roślin rozmnaŝanych generatywnie Materiał roślinny stanowiły 4 populacje róŝeńca: 5/23, 6, 27 i 51 opisane w rozdziale 2B. Obserwacje polowe dotyczyły: przebiegu faz rozwojowych roślin w okresie liczby wytworzonych przez rośliny pędów asymilacyjnych i generatywnych oraz liczby roślin, które weszły w fazę generatywną w 4 terminach: , , , W tabeli 19 przedstawiono, w ujęciu dynamicznym, charakterystykę rozwojową roślin rozmnaŝanych generatywnie. Tab. 20. Szczegółowe obserwacje faz rozwojowych badanych populacji Data Faza rozwojowa roślin Populacja obserwacji obecność 1-3 pędów wytworzonych w szklarni (fot. 47); wszystkie pąki II generacji pędów widoczne na kłączu; wszystkie początek wzrostu pędów II generacji - u niektórych roślin 6, 27, 51 widoczne pędy nad powierzchnią ziemi; rozwój II generacji pędów u nielicznych roślin widoczne pąki 6, 27, kwiatowe; początek kwitnienia nielicznych roślin (fot. 48); 6, 27, kwitnienie nielicznych roślin; 6, 27, 51 część roślin w obrębie populacji wykazuje rozwój pędów II wszystkie generacji, a część początek rozwoju pędów III generacji; rozwój nowych pędów generatywnych i asymilacyjnych; wszystkie zawiązywanie się owoców; 6, 27, 51 u niektórych roślin rozgałęzianie się pędów asymilacyjnych 5/23, 6 i 27 wzrost młodych pędów z kątów liści starszych pędów (fot. 49); 50

51 sukcesywny wzrost kolejnych młodych pędów asymilacyjnych i generatywnych. Na jednej roślinie obecne owocostany z dojrzewającymi mieszkami, kwitnące i rozkwitające kwiatostany oraz bardzo młode pędy generatywne z pąkami kwiatowymi ciągły wzrost, bez wyróŝniających się kolejnych generacji pędów (fot. 50); sukcesywny wzrost nowych pędów, najmłodsze pędy generatywne na bardzo skróconej łodydze (1-2 cm); początek osypywania się nasion z pierwszych zawiązanych owoców; u części roślin zamarły juŝ wszystkie pędy, lecz u ok. 50% roślin pędy są jeszcze zielone lub przebarwiające się na Ŝółto lub czerwono; obecność kolejnych młodych pędów generatywnych z kwiatami w pąkach na bardzo skróconej łodydze u podstawy pędów widoczne pokryte łuskami pąki, które rozwiną się w następnym sezonie wegetacyjnym (fot.51). wszystkie, zwłaszcza 51 6, 51 6, 27, 51 wszystkie wszystkie, zwłaszcza 51 wszystkie 51

52 Fot. 47. Roślina z populacji 5/23 po wysadzeniu w pole (początek maja) Fot. 48. Kwitnąca roślina z populacji 27 (początek czerwca) 52

53 Fot. 49. Roślina z populacji 27 z młodymi pędami wytworzonymi w kątach liści starszych pędów asymilacyjnych Fot. 50. Roślina z populacji 51 kwitnąca na sukcesywnie rozwijających się pędach generatywnych (początek sierpnia) 53

54 Fot. 51. Roślina z populacji 51 po zakończeniu wegetacji (połowa października) 54

55 Tab. 21. Charakterystyka rozwojowa badanych populacji Liczba pędów/roślinę % roślin Data obserwacji Populacja z rozgałęzionymi w fazie generatywnych asymilacyjnych pędami generatywnej asymilacyjnymi /23 0,0 2,6 ab 0,0 0,0 6 0,03 2,9 a 3,0 0,0 27 0,05 2,2 b 1,6 0,0 51 0,04 2,8 ab 3,8 0, /23 0,0 3,2 b 0,0 1,3 6 0,03 4,0 b 3,0 2,0 27 0,1 2,9 b 5,6 1,1 51 0,1 5,8 a 6,9 0, /23 0,2 7,5 b 10,2 10,2 6 0,1 9,1 b 7,6 5,3 27 0,1 6,4 b 8,0 17,4 51 0,4 14,5 a 16,1 0, /23 0,3 8,6 ab 14,1 14,8 6 0,1 10,3 ab 9,9 9,8 27 0,1 6,4 b 8,0 21,9 51 0,6 13,5 a 22,8 3,6 średnie oznaczone tymi samymi literami w jednym terminie obserwacji nie róŝnią się istotnie na poziomie α=

56 W pierwszym terminie obserwacji, miesiąc po wysadzeniu w pole, średnia liczba pędów roślin ze wszystkich badanych populacji była zbliŝona i nie przekraczała 3 (tab. 21). Składały się na nią pędy I generacji wytworzone jeszcze w szklarni a takŝe pierwsze młode pędy II generacji wytworzone w polu. W przypadku niewielkiej liczby roślin z populacji 6, 27 oraz 51 na części pędów II generacji powstały pąki kwiatowe (fot. 48). W kolejnych terminach obserwacji liczba roślin, które weszły w fazę generatywną była w tych populacjach coraz większa. Jedynie w populacji 5/23 pierwsze kwitnące rośliny zaobserwowano dopiero na początku sierpnia (w trzecim terminie obserwacji). W kolejnych terminach stwierdzono takŝe róŝnice w intensywności wytwarzania kolejnych pędów asymilacyjnych przez rośliny naleŝące do róŝnych populacji. Najszybciej rozwijały się rośliny z populacji 51. TakŜe w tej populacji najwięcej roślin weszło w fazę generatywną w czasie swego pierwszego sezonu wegetacyjnego. Począwszy od początku lipca obserwowano powstawanie młodych pędów, nie tylko z pąków rozwijających się na kłączu, lecz takŝe z kątów liści wytworzonych juŝ pędów asymilacyjnych (fot. 44). Rośliny z rozgałęzionymi pędami asymilacyjnymi obserwowano we wszystkich populacjach. Najwięcej ich było w populacji

57 3.3. Charakterystyka morfologiczna i rozwojowa kwiatów Materiał roślinny analizowany pod względem kwitnienia i zawiązywania nasion stanowiły: rośliny uzyskane ze stanowiska naturalnego 5/23, rozmnoŝone wegetatywnie; populacja 51 (rośliny rozmnaŝane generatywnie). Zakres badań: 1. Analiza budowy kwiatów roślin Ŝeńskich i męskich ze stanowiska 5/23 oraz Ŝeńskich, męskich i obupłciowych z populacji 51. Identyfikację roślin Ŝeńskich i męskich i obupłciowych przeprowadzano na podstawie morfologii kwiatów i zawiązywania się owoców. Kwiaty zbierano sukcesywnie w miarę zakwitania roślin. Z kwiatostanu (podbaldachu) kaŝdej badanej rośliny pobierano 5 kwiatów, które podlegały szczegółowej analizie. Pod mikroskopem stereoskopowym określono liczbę składników tworzących poszczególne okółki kwiatu: działek kielicha, płatków korony, pręcików, nektarników i słupków roślin Ŝeńskich, męskich i obupłciowych. Ponadto w przypadku roślin z populacji 51 określono długość składników kwiatu (mm). Badania przeprowadzono dla 6 roślin Ŝeńskich, 6 męskich i 3 obupłciowych z tej populacji. 2. Opis anomalii rozwojowych występujących w budowie kwiatów roślin z populacji Ocena Ŝywotności pyłku wytwarzanego w pylnikach roślin męskich pochodzących ze stanowiska 5/23 oraz roślin męskich i obupłciowych z populacji 51. Wykorzystano pośrednią metodę szybkiej oceny Ŝywotności pyłku polegającą na barwienia pyłku w mieszaninie 2 % roztworu karminu w 45% kwasie octowym. Ziarna zawierające Ŝywotną cytoplazmę zabarwiają się w tym odczynniku na czerwono, podczas gdy nieŝywotne pozostają bezbarwne. Pyłek ze świeŝo zebranych kwiatów umieszczano na szkiełku podstawowym i nanoszono kroplę barwnika z dodatkiem gliceryny w stosunku 1:1. Po wybarwieniu określano pod mikroskopem liczbę 57

58 wybarwionych i niewybarwionych ziaren w kilku polach widzenia obejmujących nie mniej niŝ 100 ziaren dla kaŝdej próbki pyłku. 4. Ocena efektywności zawiązywania nasion w owocach powstałych na pędach generatywnych roślin Ŝeńskich ze stanowiska 5/23 oraz roślin Ŝeńskich i obupłciowych z populacji 51. Zabezpieczone przed osypywaniem się nasion w polu owocostany po osiągnięciu dojrzałości ścięto, przeniesiono do laboratorium i po wysuszeniu określono liczbę owoców (mieszków) w kwiatostanie oraz liczbę zawiązanych nasion. 58

59 Tab. 22. Charakterystyka morfologii kwiatów Ŝeńskich i męskich roślin pochodzących ze stanowiska 5/23 Zakres zmienności liczby Płeć rośliny Barwa kwiatów Działek Płatków kielicha korony Pręcików Słupków śeńska Zielona Męska śółta Wśród roślin pochodzących ze stanowiska 5/23, kwitnących na I generacji pędów, zidentyfikowano osobniki Ŝeńskie i męskie. Rośliny Ŝeńskie wytwarzały kwiaty słupkowe (bez pręcików) o bardzo krótkich zielonkawych płatkach korony (fot. 41). Słupki kwiatów takŝe były zielone. Po zapyleniu kaŝdy słupek przekształcał się w oddzielny owoc mieszek zawierający nasiona (fot. 43.). Kwiaty roślin męskich były funkcjonalnie pręcikowe posiadały kilka przylegających do siebie drobnych słupków, które nie przekształcały się w owoce, tylko zamierały po przekwitnięciu (fot. 42). Płatki kwiatów roślin męskich były Ŝółte. Zarówno w kwiatach słupkowych, jak i funkcjonalnie pręcikowych występowały Ŝółte lub pomarańczowe nektarniki, których liczba była zbliŝona do liczby słupków. Liczba elementów kwiatów (w poszczególnych okółkach) roślin męskich i Ŝeńskich charakteryzowała się duŝym zakresem zmienności, nawet w obrębie jednego kwiatostanu (tab. 22). 59

60 Tab. 23. A. Charakterystyka morfologii kwiatów roślin z populacji nr 51. Liczba składników tworzących okółki kwiatu Liczba składników okółka kwiatu Składniki okółka Płeć roślin Zakres Współczynnik kwiatu Średnia zmienności zmienności (%) Rośliny Ŝeńskie 3,8 b 0,0-6,0 45,7 Działki kielicha Rośliny męskie 4,0 ab 2,0-5,0 14,1 Rośliny obupłciowe 4,9 a 3,0-10,0 31,9 Rośliny Ŝeńskie 3,7 b 0,0-6,0 53,5 Płatki korony Rośliny męskie 4,8 a 4,0-6,0 13,8 Rośliny obupłciowe 5,5 a 4,0-10,0 26,5 Rośliny Ŝeńskie Pręciki Rośliny męskie 9,3 a 8,0-12,0 10,7 Rośliny obupłciowe 9,9 a 5,0-19,0 37,7 Rośliny Ŝeńskie 3,9 b 0,0-9,0 44,3 Nektarniki Rośliny męskie 4,0 ab 3,0-5,0 10,4 Rośliny obupłciowe 4,8 a 0,0-10,0 38,7 Rośliny Ŝeńskie 4,8 a 3,0-11,0 32,5 Słupki Rośliny męskie 3,9 b 3,0-5,0 11,1 Rośliny obupłciowe 4,8 a 2,0-10,0 34,4 średnie oznaczone tymi samymi literami nie róŝnią się istotnie na poziomie α=

61 Tab. 23. B. Charakterystyka morfologii kwiatów roślin z populacji nr 51. Długość składników tworzących okółki kwiatu Długość składników okółka kwiatu (mm) Składniki okółka Płeć roślin Zakres Współczynnik kwiatu Średnia zmienności zmienności (%) Rośliny Ŝeńskie 1,3 b 0,0-2,4 39,8 Działki kielicha Rośliny męskie 1,6 ab 1,0-2,9 17,3 Rośliny obupłciowe 1,8 a 1,2-2,1 27,0 Rośliny Ŝeńskie 1,2 b 0,0-1,8 35,6 Płatki korony Rośliny męskie 3,0 a 2,4-4,0 15,3 Rośliny obupłciowe 3,3 a 2,0-4,0 13,2 Rośliny Ŝeńskie Pręciki Rośliny męskie 3,8 a 2,6-5,0 16,7 Rośliny obupłciowe 3,7 a 2,2-5,1 17,2 Rośliny Ŝeńskie 0,6 b 0,0-0,9 32,5 Nektarniki Rośliny męskie 1,3 a 1,0-2,3 18,9 Rośliny obupłciowe 1,2 a 0,0-1,9 33,2 Rośliny Ŝeńskie 4,5 a 2,9-6,5 19,8 Słupki Rośliny męskie 2,8 b 1,9-3,8 19,4 Rośliny obupłciowe 3,2 b 2,4-6,4 24,6 średnie oznaczone tymi samymi literami nie róŝnią się istotnie na poziomie α=

62 Wśród zakwitających roślin z populacji 51 zidentyfikowano rośliny Ŝeńskie o kwiatach słupkowych, męskie o kwiatach funkcjonalnie pręcikowych oraz obupłciowe. Kwiatostany roślin obupłciowych wykazywały ogólne podobieństwo do kwiatostanów roślin męskich. Kwiaty miały Ŝółte płatki korony i widoczne pręciki o Ŝółtych główkach, lecz w miarę ich przekwitania obserwowano zawiązywanie się owoców. Dotyczyło to jednak tylko części kwiatów w kwiatostanie (fot. 57A i 57B ). Przeprowadzona szczegółowa analiza budowy kwiatów roślin z tej populacji wykazała, Ŝe: Rośliny Ŝeńskie Wytwarzały kwiaty, które składały się z działek kielicha, płatków korony i słupkowia (fot. 52 i 53 A). Płatki korony były bardzo zbliŝone pod względem kształtu, barwy i długości do działek kielicha i trudno je było od siebie odróŝnić. Liczba tych składników kwiatu była zmienna. Liczba słupków była bardzo zmienna, a ich długość w czasie kwitnienia trzykrotnie przewyŝszała długość działek kielicha i płatków (tab. 23A i 23B). W czasie pełni kwitnienia obserwowano białawe znamiona słupków i obecność zaląŝków w zaląŝniach. Po zapyleniu znamiona słupków zasychały, a zaląŝnie rozrastały się tworząc owoce mieszki zawierające nasiona (fot. 57B). W niewielkiej liczbie kwiatów słupkowych niektórych roślin występowały anomalie rozwojowe. Najczęściej spotykano częściowo lub całkowicie nie zrośnięte zaląŝnie, tworzące kształt podobny do rynny zawierającej odkryte zaląŝki (fot. 54A). Bardzo rzadko obserwowano zdeformowane pojedyncze pręciki (fot. 54B). W niektórych kwiatach brak było działek kielicha lub płatków korony. 62

63 Rośliny męskie Wytwarzały kwiaty funkcjonalnie pręcikowe składające się z działek kielicha, płatków korony, pręcikowia i słupkowia. Płatki korony były dłuŝsze niŝ płatki kwiatów roślin Ŝeńskich i miały Ŝółte zabarwienie, czym wyraźnie odróŝniały się od zielonych działek kielicha (fot. 55 i 56A). Liczba pręcików była dość zmienna, lecz ogólnie równała się sumie liczb działek i płatków korony (tab. 23A). Słupki były krótsze od pręcików i krótsze niŝ słupki kwiatów Ŝeńskich, a takŝe nie posiadały wyraźnie ukształtowanych znamion (tab. 23B, fot. 56B). Po rozcięciu zaląŝni obserwowano wewnątrz zaląŝki, lecz nie rozwijały się one w nasiona i po przekwitnięciu kwiatów słupkowie zamierało tak jak pozostałe części składowe kwiatu. Pośród przebadanych kwiatów funkcjonalnie pręcikowych nie zaobserwowano anomalii rozwojowych. Rośliny obupłciowe Kwiaty tych roślin składały się z takich samych części jak kwiaty roślin męskich. Liczba i długość działek kielicha, płatków korony a takŝe pręcików nie róŝniły się od liczby i długości takich samych składników kwiatów roślin męskich, wykazywały jednak większą zmienność (tab. 23A i 23B). Pod względem liczby słupków kwiaty roślin obupłciowych przypominały kwiaty Ŝeńskie. Średnia długość słupków roślin obupłciowych przewyŝszała nieco długość niefunkcjonalnych słupków kwiatów roślin męskich, lecz róŝnica ta nie była istotna statystycznie. Charakterystyczne dla tych roślin było występowanie w obrębie jednego kwiatostanu kwiatów o róŝnej morfologii. RóŜnice w morfologii kwiatów roślin obupłciowych ilustrują fotografie 58A-D. Młode, świeŝo rozwinięte kwiaty były do siebie bardzo podobne, róŝnice zaznaczały się w miarę ich rozwoju. W przypadku części kwiatów następował wzrost słupków, kształtowanie znamion a następnie rozwój owoców 63

64 zawierających nasiona. Pozostałe kwiaty, podobnie jak w przypadku roślin męskich, po zakończeniu okresu pylenia zamierały całkowicie nie zawiązując owoców (fot. 57B). Dość duŝa, w porównaniu do kwiatów roślin męskich i Ŝeńskich, była częstość występowania kwiatów anormalnych (fot. 58D). Anomalie morfologiczne dotyczyły wszystkich składników kwiatu. Na płatkach korony lub działkach kielicha powstawały dość często nagie zaląŝki. Obserwowano takŝe występowanie nie w pełni ukształtowanych pylników na wierzchołkach płatków (fot. 59A). Nitki pręcików były często przyrośnięte na całej długości do płatków lub słupków. Słupki w takiej konfiguracji były zniekształcone i nie miały znamion. Same pręciki wykazywały deformacje główki lub główki i nitki (fot. 59B - 59D). W niektórych kwiatach pylniki o nitkach przyrośniętych do słupków miały uformowane małe słupki w miejscu główek (fot. 52E). W obrębie kwiatów wszystkich roślin niezaleŝnie od płci na dnie kwiatowym u podstawy słupków występowały Ŝółte lub pomarańczowe nektarniki o języczkowatym kształcie. Były one dłuŝsze w kwiatach roślin męskich i obupłciowych niŝ w kwiatach roślin Ŝeńskich (tab. 23B). 64

65 Fot.52. Kwiatostan rośliny Ŝeńskiej z kwiatami słupkowym w pełni kwitnienia Fot. 53.A. Fot. 53.B. Fot 53. Kwiat rośliny Ŝeńskiej 53.A. Kwiat słupkowy 53.B. Rozwijający się mieszek, niedojrzałe nasienie, słupek i zaląŝek (od lewej do prawej) 65

66 Fot. 54.A. Anomalie rozwojowe występujące w kwiatach słupkowych - nie zrośnięte zaląŝnie ukazujące nagie zaląŝki Fot. 54.B. Anomalie rozwojowe występujące w kwiatach słupkowych - zdeformowany pręcik 66

67 Fot. 55. Kwiatostan rośliny męskiej o kwiatach funkcjonalnie pręcikowych Fot. 56.A. Kwiat rośliny męskiej - kwiat funkcjonalnie pręcikowy 67

68 Fot. 56.B. Kwiat rośliny męskiej - składniki okółków kwiatu funkcjonalnie pręcikowego (od lewej do prawej): działka kielicha i pręcik, płatek korony i pręcik, nektarnik i słupki. W rozciętych słupkach widoczne zaląŝki 68

69 Fot. 57.A. Kwiatostan rośliny obupłciowe - początek kwitnienia kwiatów Fot. 57.B. Kwiatostan rośliny obupłciowej - ten sam kwiatostan z zawiązującymi się owocami 69

70 Typy kwiatów występujące w kwiatostanach roślin obupłciowych Fot. 58.A. Młody kwiat obupłciowy Fot. 58.B. Kwiat obupłciowy z zawiązującymi się owocami 70

71 Fot. 58.C. Kwiat o budowie zbliŝonej do kwiatów funkcjonalnie pręcikowych wytwarzanych przez rośliny męskie Fot. 58.D. Kwiat zdeformowany z licznymi anomaliami w budowie słupków i pręcików 71

72 Anomalie rozwojowe w kwiatach roślin obupłciowych Fot. 59.A. Płatek korony z pylnikiem na wierzchołku i nagimi zaląŝkami po stronie wewnętrznej Fot. 59.B. Anomalie w rozwoju pręcików (od lewej do prawej): pręcik z małym słupkiem w miejscu główki, pręcik o nitce przyrośniętej do płatka korony 72

73 Fot. 59.C. Anomalie w rozwoju pręcików (od lewej do prawej): pręcik o zdeformowanej główce, staśmiony pręcik o podwójnej główce Fot. 59.D. Anomalie w rozwoju pręcików i słupków pręciki zrośnięte ze słupkami, główki pręcików na wierzchołkach słupków w miejscu znamion, zaląŝnie nie zrośnięte, widoczne nagie zaląŝki 73

74 Fot. 59.E. Anomalie w rozwoju pręcików i słupków pręciki zrośnięte ze słupkami, w miejscu główki pręcika znajduje się mały słupek 74

75 Tab. 24. śywotność pyłku roślin męskich pochodzących ze stanowiska 5/23 Generacja pędów % Ŝywotnych ziaren pyłku (termin zbioru kwiatów) średnia zakres zmienności współczynnik zmienności (%) II generacja pędów 82,3 74,1-92,8 10,6 ( ) II lub III generacja pędów ( ) 90,2 82,6-98,2 8,7 śywotność pyłku wytwarzanego w kwiatach roślin męskich pochodzących ze stanowiska 5/23 była wysoka i nie zmieniała się istotnie w trakcie wegetacji. Wartości współczynników zmienności obliczone dla próbek pyłku pobranych z róŝnych roślin były niskie (tab.24). Tab. 25. śywotność pyłku roślin męskich i obupłciowych naleŝących do populacji 51N % Ŝywotnych ziaren pyłku Płeć roślin współczynnik średnia zakres zmienności zmienności (%) Rośliny męskie 86,6** 79,7-95,1 8,0 Rośliny obupłciowe 46,9 40,9-52,2 12,1 ** róŝnica istotna na poziomie α=0,01 Rośliny męskie z populacji 51 wytwarzały pyłek o wysokiej Ŝywotności podobnie jak rośliny męskie ze stanowiska 5/23, natomiast pyłek wytwarzany przez rośliny obupłciowe charakteryzował się istotnie niŝszą Ŝywotnością (tab. 25.). Fotografia 60A przedstawia wybarwione na czerwono w blisko 100% ziarna pyłku rośliny męskiej zawierające Ŝywotną cytoplazmę. Na fotografii 60B widoczne są ziarna wybarwione i niewybarwione nieŝywotne wytworzone w pylnikach rośliny obupłciowej. 75

76 Fot. 60.A. Fot. 60.B. Fot. 60. Pyłek roślin z populacji 51 wybarwiony w acatokarminie 60.A. roślina męska 60.B. roślina obupłciowa Tab. 26. Efektywność zawiązywania się nasion w owocach powstałych na I i II generacji pędów roślin Ŝeńskich ze stanowiska 5/23 Generacja Liczba owoców (mieszków)/ owocostan Liczba nasion/owoc pędów współczynnik zakres współczynnik zakres (termin zbioru średnia średnia zmienności zmienności zmienności (%) zmienności nasion) (%) I 166, ,1 3,9 0,0-12,0 59,7 ( ) II ( ) 124, ,1 3,3 0,1-6,6 80,5 Owocostany roślin Ŝeńskich pochodzących z tego samego stanowiska róŝniły się pod względem barwy i wielkości zawiązanych owoców (fot. 61). Liczba owoców wytworzonych w jednym owocostanie, a takŝe liczba nasion zawiązanych w jednym owocu na I i II generacji pędów były zbliŝone i charakteryzowały się bardzo duŝą zmiennością (tab. 26, fot. 62). Na obu generacjach pędów występowały owocostany z dobrze wykształconymi owocami (mieszkami) nie zawierającymi nasion. Owoce z największą liczbą nasion (12 nasion/owoc) zebrano z pędów I generacji. 76

77 Fot. 61. RóŜnorodność barwy i rozmiarów suchych owoców zebranych z roślin populacji 5/23 Fot. 62. Nasiona róŝeńca 77

78 Tab. 27. Efektywność zawiązywania nasion na II generacji pędów roślin Ŝeńskich i obupłciowych populacji 51 Liczba owoców (mieszków) w owocostanie Liczba nasion w owocu Płeć roślin współczynnik współczynnik zakres zakres średnia zmienności średnia zmienności zmienności zmienności (%) (%) Rośliny Ŝeńskie 33, ,9 0,6 0,0-1,7 113,1 Rośliny obupłciowe 74, ,4 1,5 0,0-4,0 104,0 Zarówno rośliny Ŝeńskie, jak i obupłciowe z populacji 51 wykazywały zdolność do zawiązywania nasion w owocach w swym pierwszym sezonie wegetacyjnym. Nasion tych było jednak bardzo mało w przeliczeniu na owoc, poniewaŝ wiele rozwijających się mieszków było pustych (tab. 27). 78

79 III. Turówka leśna (Hierochloë australis (Schrad.) Roem. et Schult.) 1. METODYKA 1.1. BADANIA TERENOWE Badania terenowe przeprowadzono na sześciu stanowiskach naturalnych turówki leśnej zlokalizowanych na terenie północno-wschodniej Polski. Lokalizacja stanowisk tego gatunku oraz ich dokumentacja prowadzona była przy udziale pracowników firmy Dary Natury z siedzibą na Podlasiu, zajmującą się skupem i przetwarzaniem surowców zielarskich oraz lokalnych zbieraczy ziół. Badania terenowe prowadzono wczesnym latem, kiedy rośliny te zbierane są po raz pierwszy w sezonie wegetacyjnym przez zbieraczy ziół. Za pomocą GPS określono połoŝenie geograficzne stanowisk (tab. 28), a następnie określono ilościowość badanych obiektów oraz skład gatunków towarzyszących i ich ilościowość metodą Brauna-Blanqueta. Zastosowano układ warstwowy fitocenozy, wyodrębniając następujące warstwy: A drzewa B krzewy C rośliny zielne Do określenia ilościowości posłuŝono się siedmiostopniową skalą Brauna-Blanqueta, która ujmuje jednocześnie liczebność i stopień pokrycia: 5 gatunek pokrywający więcej niŝ ¾ powierzchni zdjęcia, liczba osobników dowolna 4 gatunek pokrywający ½ ¾ powierzchni zdjęcia, liczba osobników dowolna 3 gatunek pokrywający ¼ ½ powierzchni zdjęcia, liczba osobników dowolna 2 gatunek pokrywający 5 25% powierzchni zdjęcia, liczba osobników dowolna lub bardzo duŝa liczba osobników, przy niŝszym pokryciu 1 gatunek umiarkowanie liczny i pokrywający mniej niŝ 5% powierzchni lub niezbyt liczny, ale o wyŝszym stopniu pokrycia + gatunek nieliczny, pokrywający tylko niewielką powierzchnię r gatunek rzadki tylko 1-2 okazy, zajmujące bardzo małą powierzchnię. 79

80 Tab. 28. Lokalizacja stanowisk naturalnych turówki leśnej Lp. Stanowisko Koordynaty 1 Wiercień DuŜy N 52º E 022º51'175 2 Koryciny N 52º E 022º45'718 3 Strabla N 52º E 022º04'989 4 Ruciane Nida N 52º E 021º34'290 5 Wejsuny N 52º E 021º31'632 6 Jedwabno N 52º E 020º42'982 Do badań wytypowano stanowiska na których ilościowość turówki wynosiła minimum 1, tj. liczba osobników, wg skali Brauna-Blanqueta, na stanowisku była duŝa i wynosiła okazów (pokrywanie powierzchni zdjęcia nie przekraczało 5 %). Z kaŝdego stanowiska pobrano próby liści do badań fitochemicznych. Ponadto ze stanowiska Jedwabno na którym ilościowość turówki wynosiła 3 ocenie poddano 10 losowo wybranych roślin turówki z których równieŝ zebrano materiał roślinny do badań. Uzyskane surowce suszono w temperaturze 35 C w suszarce typu SLW 240STD, POL- EKO, a następnie poddano je analizie chemicznej na ogólną zawartość kumaryn, flawonoidów i kwasów fenolowych. Ze względu na fakt, Ŝe liście turówki to surowiec kumarynowy, przeprowadzono równieŝ szczegółową analizę chromatograficzną związków kumarynowych przy uŝyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Szczegółową metodykę analiz chemicznych przedstawiono w rozdziale IV BADANIA POLOWE Z oznaczonych stanowisk naturalnych pobrano wegetatywny materiał rozmnoŝeniowy w celu załoŝenia kolekcji ex situ turówki leśnej na Polu Doświadczalnym KRWiL w Wilanowie (fot. 63). Uzyskane sadzonki turówki wysadzono w lipcu br. na częściowo zacienionym stanowisku symulującym naturalne warunki, w których turówka rośnie (fot. 64). 80

81 Fot. 63. Materiał wegetatywny (sadzonki) turówki leśnej uŝyty do załoŝenia kolekcji ex situ na polu doświadczalnym KRWiL w Wilanowie Fot. 64. Kolekcja turówki leśnej na polu doświadczalnym KRWiL w Wilanowie (20 września 2011 r.) 81

82 1.3. OCENA ZDOLNOŚCI KIEŁKOWANIA NASION Ze stanowisk naturalnych turówki leśnej pobrano próby nasion w celu określenia ich zdolności kiełkowania. Ocenę tą przeprowadzono w Pracowni Nasiennictwa i Nasionoznawstwa w Katedrze Roślin Warzywnych i Leczniczych. Pełną metodykę badań opisano w rozdziale IV. Ocenę zdolności kiełkowania przeprowadzono równieŝ w warunkach polowych. Nasiona turówki leśnej wysiewano 8 lipca br. w ilości po 50 szt. w 2 powtórzeniach na rozsadniku na Polu Doświadczalnym KRWiL w Wilanowie (fot. 65). Jako podłoŝe do kiełkowania zastosowano substrat torfowy. Rozsadnik był zacieniony siatką raszlową ograniczającą dostęp światła słonecznego o 35%. Ocenę zdolności kiełkowania w warunkach polowych wykonano po 10 tygodniach od wysiewu. Fot. 65. Rozsadnik na który wysiano nasiona turówki 82

83 2. WYNIKI 2.1. BADANIA TERENOWE Skład gatunkowy stanowisk naturalnych turówki leśnej Turówka leśna występuje na obszarze północno-wschodniej Europy. Zachodnia granica występowania przebiega przez Niemcy, na południu sięga północnych granic obszaru śródziemnomorskiego, natomiast na północy obejmuje południową Finlandię, Estonię, Łotwę i Litwę. W Polsce turówka leśna występuje na rozproszonych stanowiskach w rejonie dolnej Wisły, Puszczy Piskiej, na Pojezierzu Mazurskim, na Białostocczyźnie w Puszczy Knyszyńskiej, Augustowskiej i Białowieskiej, a takŝe w okolicach Nurca i Siemiatycz. W centralnej Polsce turówkę leśną spotyka się bardzo rzadko w Puszczy Białej. W pozostałej części kraju gatunek ten występuje sporadycznie. Na wymienionych obszarach skupia się cały zbiór turówki, chociaŝ stanowiska te są wszędzie bardzo ubogie. Jako gatunek subkontynentalny turówka leśna wymaga umiarkowanie ciepłych warunków klimatycznych. Występuje na stanowiskach o stałej wilgotności, raczej suchych, ciepłych i umiarkowanie nasłonecznionych, o glebach lekkich, przepuszczalnych, w górnej warstwie próchnicznych, dość kwaśnych. Turówka leśna spotykana jest w mało zwartych lasach mieszanych i sosnowych, na wyrębach leśnych, w mieszanych lasach dębowych typu świetlistej dąbrowy, a takŝe w lasach dębowo-grabowych. Najczęściej moŝna ją spotkać w zbiorowiskach naleŝących do dąbrów acydofilnych oraz w borach mieszanych. Na podstawie składu gatunkowego naturalne stanowiska opisane w sprawozdaniu moŝna przypisać do zbiorowisk subborealnych borów mieszanych Serratulo-Pinetum. W skład drzewostanu wchodzą tutaj głównie: sosna zwyczajna (Pinus sylvestris) i świerk pospolity (Picea abies), a w stałej domieszce występują dąb szypułkowy (Quercus robur), brzoza brodawkowata (Betula pendula) oraz czasem grab zwyczajny (Carpinus betulus). Warstwy poszycia są dość bogate, składają się z leszczyny pospolitej (Corylus avellana) i jarząbu pospolitego (Sorbus aucuparia). Głównymi gatunkami tworzącymi warstwę zielną są m.in.: borówka czarna (Vaccinium myrtillus) i konwalijka dwulistna (Maianthemum bifolium). 83

84 Tab. 29. Skład gatunkowy stanowisk naturalnych turówki leśnej Warstwa Stanowisko / ilościowość Gatunek Wiercień Koryciny Strabla Ruciane Wejsuny Jedwabno DuŜy Nida A Pinus sylvestris A Quercus robur A Betula pendula B Quercus robur B Carpinus betulus B Corylus avellana 1 r B Picea abies B Juniperus communis B Rubus idaeus B Frangula alnus r - 1 C Sorbus aucuparia C Quercus robur + r C Hierochloë australis C Vaccinium myrtillus C Maianthemum bifolium C Convallaria majalis C Urtica dioica + - r r - - C Fragaria vesca C Veronica officinalis C Hieracium pilosella C Viola canina - - r C Stellaria holostea r + 3 C Oxalis acetosella

85 Fot. 66. Turówka leśna na stanowisku Wierceń DuŜy Fot. 67. Stanowisko Koryciny 85

86 Fot. 68. Turówka leśna na stanowisku Strabla Fot. 69. Stanowisko Ruciane Nida 86

87 Fot. 70. Stanowisko Wejsuny Fot. 71. Stanowisko Jedwabno 87

88 OCENA CHEMICZNA SUROWCÓW A. ZRÓśNICOWANIE CHEMICZNE POMIĘDZY POPULACJAMI Tab. 30. Ogólna zawartość związków biologicznie aktywnych w liściach turówki leśnej (%) Stanowisko Związki biologicznie Wiercień Koryciny Strabla Ruciane Wejsuny aktywne DuŜy Nida Jedwabno średnia CV Kumaryny 0,48 0,58 0,51 0,23 0,51 0,36 0,45 28,66 Flawonoidy 0,18 0,20 0,24 0,08 0,11 0,06 0,15 49,68 Kwasy polifenolowe 0,14 0,15 0,24 0,21 0,17 0,19 0,18 20,60 Tab. 31. Zawartość zidentyfikowanych związków kumarynowych w liściach turówki leśnej (mg x 100g -1 s.m.) Stanowisko Związki kumarynowe Wiercień DuŜy Koryciny Strabla Ruciane Nida Wejsuny Jedwabno średnia CV Kumaryna 236,55 207,50 111,50 205,40 375,40 279,45 235,97 37,22 3,4dihydroksykumaryna 72,75 122,45 29,05 38,85 74,85 65,90 67,31 48,84 Kwas o-kumarowy 52,85 63,90 52,85 54,65 69,55 62,70 59,42 11,72 Rys. 5. Przykładowy chromatogram ekstraktu z turówki leśnej (populacja Wiercień DuŜy) 88

89 B. ZRÓśNICOWANIE CHEMICZNE W OBRĘBIE POPULACJI Tab. 32. Zawartość zidentyfikowanych związków kumarynowych w liściach turówki leśnej pochodzącej ze stanowiska Jedwabno (mg x 100g -1 s.m.) Związki kumarynowe NR ROŚLINY średnia CV Kumaryna 356,95 97,20 182,75 292,15 495,05 461,80 150,30 123,15 408,75 339,30 290,74 49,79 3,4-dihydroksykumaryna 58,00 19,60 29,20 31,90 67,15 108,50 30,55 16,95 67,15 98,05 52,71 61,53 Kwas o-kumarowy 71,50 45,70 49,35 53,70 77,80 75,90 50,45 47,65 51,40 90,55 61,40 25,98 Rys. 6. Przykładowy chromatogram ekstraktu z turówki leśnej (rośl. 4) 89

90 Zawartość i skład chemiczny związków fenolowych w liściach badanych populacji oznaczono przy uŝyciu metod chemicznych i instrumentalnych. Ogólna zawartość kumaryn w liściach wahała się od 0,23 do 0,58%. Populacje były takŝe zróŝnicowane pod względem zawartości flawonoidów i kwasów polifenolowych (tab. 30). Podobnie jak w przypadku ogólnej zawartości związków kumarynowych, równieŝ zawartość kumaryny, odpowiedzialnej za jakość przemysłową surowca, była bardzo zróŝnicowana. Jej skrajne wartości w populacjach wynosiły 111,50 (st. Strabla) i 375,40 (st. Wejsuny) (tab. 31, rys. 5). W przypadku kumaryny, jeszcze większe zróŝnicowanie niŝ między populacjami wystąpiło w obrębie wytypowanej do szczegółowej analizy populacji Jedwabno (skrajne wartości dla pojedynczych roślin: od 97,20 do 495,05 mg x 100g -1 s.m.) (tab. 32, rys. 6). 90

91 2.2. OCENA ZDOLNOŚCI KIEŁKOWANIA NASION Ocena zdolności kiełkowania nasion turówki leśnej Tab. 33. Zdolność kiełkowania nasion turówki leśnej (%) Stanowisko z którego pochodziły nasiona w warunkach laboratoryjnych w warunkach polowych Wiercień DuŜy Koryciny Strabla Ruciane Nida Wejsuny 8 15 Jedwabno średnia 17,3 36,3 Fot. 72. Nasiona turówki leśnej w teście zdolności kiełkowania 91

92 Fot. 73. Etapy kiełkowania nasion turówki leśnej Fot. 74. Siewki turówki leśnej z doświadczenia polowego (wrzesień 2011r.). RóŜnice w zdolności kiełkowania nasion pomiędzy populacjami były ponad 3-krotne, a zdolność ta oznaczana w warunkach polowych była 2-krotnie wyŝsza niŝ w warunkach laboratoryjnych (tab. 33, fot ). 92

93 IV. METODYKA OGÓLNA 1. Metodyka analiz chemicznych 1.1. Oznaczanie ogólnej zawartości związków biologicznie aktywnych A. Oznaczanie ogólnej zawartości związków kumarynowych (wg Wierzchowska- Renke i Stecka 1976) Zawartość kumaryny oznaczano metodą spektrofotometryczną (Wierzchowska- Renke i Stecka 1976). W celu wykonania oznaczenia 0,8 g sproszkowanego surowca ekstrahowano 100 cm 3 chloroformu przez 4 godziny, we wrzącej łaźni wodnej, w aparacie Soxhleta. Uzyskany wyciąg przeniesiono do kolby miarowej o objętości 100 cm 3. Rozcieńczenie do pomiaru przygotowano w probówce na 10 cm 3, pobierając 1 cm 3 wyciągu i uzupełniając go 9 cm 3 chloroformu. Absorpcję kumaryny zmierzono przy długości fali 314 nm, w kuwecie o grubości 1 cm,w spektrofotometrze firmy CECIL CE Series. Zawartość kumaryny obliczono wg wzoru: C%=(C*100)/0,80 C= A 314 /α 314 gdzie: C stęŝenie kumaryny A 314 absorpcja kumaryny przy długości fali 314 nm α 314 współczynnik absorpcja kumaryny przy długości fali 314 nm = 40,20 93

94 B. Oznaczanie ogólnej zawartości flawonoidów wg FP VI Zawartość flawonoidów oznaczono spektrofotometrycznie, po ich ekstrakcji z surowca. Przygotowanie wyciągu: Do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml odwaŝono ok. 0,5 g średnio sproszkowanego surowca. Dodano 20 ml acetonu, 2 ml kwasu solnego, 1 ml roztworu metenaminy (urotropiny) i utrzymywano 30 min. we wrzeniu, w łaźni wodnej pod chłodnicą zwrotną. Hydrolizat przesączono przez watę do kolby miarowej o pojemności 100 ml, po czym osad wraz z watą umieszczono ponownie w kolbie okrągłodennej, dodano 20 ml acetonu i ponownie utrzymywano 10 min. we wrzeniu. Wytrawianie powtórzono jeszcze raz. Wyciągi przesączono do tej samej kolby miarowej i uzupełniono acetonem do kreski. 20 ml roztworu odmierzono do rozdzielacza (1), dodano 20 ml wody i 15 ml octanu etylu. Ekstrahowano poprzez wstrząsanie ok. 3 min. i pozostawiono do rozdzielenia się warstw. Dolną warstwę (acetonowo-wodną) przeniesiono do drugiego rozdzielacza (2), a górną (octanową) przeniesiono do pierwszego rozdzielacza (1), w którym znajdował się roztwór octanowy. Roztwór ze zlewki ponownie przelano do drugiego rozdzielacza (2), dodano 10 ml octanu etylu i wstrząsano ok. 3 min. Czynności opisane powyŝej powtórzono 3 razy. Połączone warstwy octanowe w rozdzielaczu pierwszym (1) przemyto dwukrotnie po 40 ml wody. Dolną warstwę (wodną) odrzucono. Górną warstwę (octanową) przesączono przez watę do kolby miarowej o pojemności 50 ml i uzupełniono octanem etylu do kreski. Przygotowanie roztworów do badań: Do 2 kolb miarowych o pojemności 25 ml wlano po 10 ml roztworu podstawowego, dodano 2 ml roztworu chlorku glinu i uzupełniono mieszaniną kwasu octowego z metanolem do kreski. Przygotowanie roztworu porównawczego: Do kolby miarowej o pojemności 25 ml wlano 10 ml roztworu podstawowego i uzupełniono mieszaniną kwasu octowego z metanolem do kreski. Po 45 minutach zmierzono absorbancję roztworów przy długości fali 425 nm, jako odnośnik stosując roztwór porównawczy. Obliczono procentową zawartość flawonoidów (X), w przeliczeniu na kwercetynę wg wzoru: 94

95 gdzie: A absorbancja roztworu badanego, k przelicznik dla kwercetyny k = 0,875, m odwaŝka surowca [g]. 95

96 C. Oznaczanie ogólnej zawartości fenolokwasów wg FP VI Zawartość fenolokwasów oznaczono spektrofotometrycznie, po ich ekstrakcji z surowca. Przygotowanie wyciągu: Do kolby stoŝkowej o pojemności 100 ml z doszlifowanym korkiem odwaŝono dokładnie ok. 1 g miałko sproszkowanego surowca, dolano 25 ml wody i wytrząsano mechanicznie 30 min. Ekstrakcję powtórzono. Uzyskane wyciągi przesączono przez watę do kolby miarowej i uzupełniono wodą do 50 ml. Przygotowanie roztworu do badań: Do kolby miarowej pojemności 10 ml odmierzono kolejno: 5 ml wody, 1 ml wyciągu, 1 ml kwasu solnego (18 g/l), 1 ml odczynnika Arnova, 1 ml wodorotlenku sodu (40 g/l) i uzupełniono wodą. Natychmiast zmierzono absorbancję roztworu, przy 490 nm. Przygotowanie roztworu porównawczego: Do kolby miarowej pojemności 10 ml odmierzono kolejno: 5 ml wody, 1 ml kwasu solnego (18 g/l), 1 ml odczynnika Arnova, 1 ml wodorotlenku sodu (40 g/l) i uzupełniono wodą. Absorbancję roztworu zmierzono przy długości fali 490 nm. Ogólną zawartość fenolokwasów (X, w %) przeliczono na kwas kawowy wg wzoru: gdzie: A absorbancja roztworu badanego, k przelicznik dla kwasu kawowego k = 1,7544, m odwaŝka surowca [g]. Odczynnik Arnova: 10 g molibdenianu sodowego 10 g azotynu sodowego 100 ml wody 96

97 1.2. Oznaczanie zawartości związków biologicznie czynnych przy uŝyciu analiz chromatograficznych (HPLC, TLC) Przygotowanie próbek 1 g suchej masy surowca ekstrahowano 100 ml metanolu w uniwersalnym urządzeniu ekstrakcyjnym B-811 firmy Büchi będącym zmodyfikowanym aparatem Soxhleta przez 25 cykli (ok. 4 h). Ekstrakt odparowano do sucha równieŝ w tym urządzeniu. Pozostałość rozpuszczano w 10ml metanolu i filtrowano przez strzykawkowy filtr celulozowy 0,20mm (Supelco IsoDisc 25mmm). Tak przygotowany ekstrakt nanoszono na kolumnę w ilości 1 l za pomocą automatycznego podajnika próbek SIL-20A firmy Shimadzu. Fot. 75. Uniwersalne urządzenie ekstrakcyjne B-811 firmy Büchi. 97

98 A. Ocena surowców zielarskich przy uŝyciu chromatografii cienkowarstwowej (TLC) W celu potwierdzenia toŝsamości korzeni oraz kwiatów pierwiosnki lekarskiej zastosowano metodę chromatografii cienkowarstwowej, opisaną w Farmakopei Europejskiej 5.0 i Farmakopei Polskiej VIII. Podczas analizy korzeni na płytki nanoszono metanolowe ekstrakty roślinne oraz roztwory metanolowe substancji wzorcowych: kwasu prymulowego I, kwasu prymulowego II, prymweryny, prymulaweryny, a takŝe mieszaninę wszystkich wymienionych wzorców. Podobnie przeprowadzono analizę kwiatów, przy czym jako substancji wzorcowych uŝyto: rutynozyd, kwercetynę, izokwercetynę, 3-rutynozyd izoramnetyny oraz kwas chlorogenowy. Objętość nanoszonych próbek wynosiła w przypadku kwiatów 3 µl, natomiast korzeni -5µl. Pojedyncze wzorce nanoszono w ilości 10 µl, natomiast mieszaninę wszystkich wzorców w ilości 40 µl. Ekstrakty rozdzielano na płytce HPTLC silica gel 60 F 254 GLP 10x20 cm, w obecności fazy ruchomej. Jako fazę ruchomą stosowano mieszaninę rozpuszczalników: butanol + kwas octowy + woda (4:1:5 v/v). Po rozwinięciu chromatogramu płytkę ogrzewano w temperaturze 105 C przez 10 min. Do derywatyzacji (upochodnienia) uŝyto aldehydu anyŝowego rozpuszczonego w kwasie siarkowym, po czym ponownie ogrzano płytkę (w 105 C przez 5 min.). Wizualizacja w świetle UV 366 nm po upochodnieniu potwierdziła obecność związków saponinowych. Plamki o intensywnie niebieskiej barwie były charakterystyczne dla prymweryny i prymulaweryny (R f =0,5-0,6), natomiast czerwono-ŝółte odzwierciedlały kwas prymulowy I i kwas prymulowy II (R f =0,3-0,4). Uzyskane pasma porównano z pasmami substancji wzorcowych. Przy uŝyciu TLC określono równieŝ zawartość kwasu prymulowego I w korzeniach pierwiosnki. W celu uzyskania krzywej wzorcowej na płytki naniesiono:20µl, 30 µl, 40 µl, 50 µl i60 µl substancji wzorcowej. Objętość nanoszonych ekstraktów z korzeni pierwiosnki wynosiła 3 µl. Na podstawie powierzchni uzyskanych plam substancji wzorcowej wyznaczono krzywą wzorcową, według której określono zawartości kwasu prym ulowego I w poszczególnych ekstraktach. Zawartości tego związku w kwiatach okazały się zbyt małe do oznaczenia ilościowego. 98

99 B. Ocena surowców zielarskich przy uŝyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) Wzorce (pierwiosnka lekarska i turówka leśna) Standardy zakupiono w firmie ChromaDex. Zastosowano metodę krzywej kalibracyjnej wykreślanej na podstawie powierzchni pików substancji wzorcowych w programie CLASS VP 7.3. Sporządzono metanolowe roztwory poszczególnych substancji, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Roztwory nanoszono następnie na kolumnę w objętości 0,5, 1, 2, 5 i 10 ml za pomocą automatycznego podajnika próbek SIL-20A firmy Shimadzu i chromatografowano w opisanych niŝej warunkach. Utworzono tabelę czasów retencji oraz bibliotekę elektronowych widm absorbcyjnych poszczególnych związków w zakresie nm. Wzorce (róŝeniec górski) Standardy zakupiono w firmach Chromadex (rozawina, rozaryna, rozyna, tyrozol, salidrozyd), Fluka (alkohol trans-cynamonowy, kwas cynamonowy) i Sigma (pozostałe kwasy fenolowe). Zastosowano metodę krzywej kalibracyjnej wykreślanej na podstawie powierzchni pików substancji wzorcowych w programie CLASS VP 7.3. Sporządzono metanolowe roztwory poszczególnych substancji w 5 rozcieńczeniach (1 mg ml -1 ; 0,5 mg ml -1 ; 0,25 mg ml -1 ; 0,13 mg ml -1 ; 0,07 mg ml -1 ), które następnie nanoszono na kolumnę i chromatografowano w opisanych niŝej warunkach. Utworzono bibliotekę widm poszczególnych związków w zakresie nm. 99

100 Parametry rozdziału chromatograficznego (pierwiosnka lekarska i turówka leśna) Analizę ilościową i jakościową otrzymanych ekstraktów prowadzono za pomocą chromatografu cieczowego firmy Shimadzu z detektorem diodowym SPD-M10A VP. Rozdział związków czynnych otrzymano stosując gradient: woda zakwaszona kwasem fosforowym 0,1% (A) acetonitryl zakwaszony kwasem fosforowym 0,1% (B), przy przepływie 1,2 ml min -1 w temperaturze 35 C na kolumnie Kinetex 2,6Mm C18 100A 100mm 4,6mm firmy Phenomenex (tab. 34 i 35). Tab. 34. Gradient rozpuszczalników w analizie surowca pierwiosnki lekarskiej Minuta analizy % A (H 2 O) % B (ACN) 0, , , , , ,00 stop stop Tab. 35. Gradient rozpuszczalników w analizie surowca turówki leśnej Minuta analizy % A (H 2 O) % B (ACN) 0, , , , ,00 stop stop 100

101 Parametry rozdziału chromatograficznego (róŝeniec górski) Analizę ilościową i jakościową otrzymanych ekstraktów prowadzono za pomocą chromatografu cieczowego firmy Shimadzu z detektorem diodowym SPD-M10A VP. Rozdział związków czynnych otrzymano stosując gradient 0,2% kwas fosforowy (A) - acetonitryl (B), przy przepływie 1,2 ml min -1 w temperaturze 26 C, na kolumnie Luna C18(2) 5µm 250mm 4,6mm firmy Phenomenex (tab. 36). Czas analizy wynosił 60min. Tab. 36. Gradient rozpuszczalników w analizie surowca róŝeńca górskiego Minuta analizy % A (woda + 0,2% H 3 PO 4 ) % B (ACN) 0, stop stop 101

102 Parametry integracji uzyskanych wyników W przypadku analizy ekstraktów z pierwiosnki lekarskiej i turówki leśnej sygnał z detektora diodowego rejestrowano w postaci serii chromatogramów w zakresie długości fali nm. Wyniki zintegrowano przy następujących długościach fali: dla pierwiosnki lekarskiej (+)-katechina - 206nm orientyna, rutozyd, 3-rutynozyd izoramnetyny, 3-glukozyd izoramnetyny prymweryna - 254nm 3-O-glukozyd kempferolu - 264nm prymulaweryna - 300nm kwas rozmarynowy i chlorogenowy - 330nm dla turówki leśnej 3,4-dihydrokumaryna 273 nm kwas o-kumarowy i kumaryna 276 nm witeksyna 337nm w programie CLASS VP 7.3 firmy Shimadzu. Zawartość poszczególnych związków biologicznie czynnych podano w mg na 100g bezwzględnie suchego surowca. W przypadku analizy ekstraktów z róŝeńca górskiego sygnał z detektora diodowego rejestrowano w postaci serii chromatogramów w zakresie długości fali nm. Wyniki zintegrowano w programie CLASS VP 7.3 firmy Shimadzu, przy długości fali 275 nm. Zawartość poszczególnych związków biologicznie czynnych podano w mg na 100g bezwzględnie suchego surowca. 102

103 Oznaczanie straty masy po suszeniu Wszystkie uzyskane wyniki obliczono na bezwględnie suchą masę surowca. Badanie straty masy po suszeniu wykonano przy uŝyciu metody suszarkowo-wagowej, opisanej w Farmakopei Polskiej VI, na surowcu stabilizowanym przez suszenie konwekcyjne w temperaturze 40 C. W tym celu pobierano po 1 g sproszkowanego surowca w dwóch powtórzeniach, umieszczano w wypraŝonych i zwaŝonych uprzednio naczynkach wagowych, a następnie suszono w temperaturze 105 C. Po upływie 3 godzin naczynka przenoszono do eksykatora do momentu ostygnięcia, a następnie waŝono na wadze analitycznej (dokładność 0,0001g). Po pierwszym waŝeniu naczynka z surowcem ponownie suszono przez 0,5 godziny, po czym waŝono, powtarzając suszenia do momentu, kiedy róŝnica pomiędzy dwoma waŝeniami nie była większa niŝ 0,0005 g. 103

104 2. OCENA WARTOŚCI SEWNEJ NASION 2.1. Wilgotność nasion Wilgotność nasion oznaczono metodą suszarkową stałej wysokiej temperatury. Badanie wykonano na dwóch niezaleŝnych próbkach (ISTA 2011). Nasiona suszono w naczynkach wagowych, w temperaturze 130ºC w czasie 1 godziny. Zawartość wody w nasionach obliczono z dokładnością do jednego miejsca po przecinku, wg poniŝszego wzoru: ( M 2 M ) x ( M M 2 1 ) gdzie: M 1 masa, w gramach, naczynka z przykrywką M masa, w gramach, naczynka z przykrywką i zawartością przed suszeniem M masa, w gramach, naczynka z przykrywką i zawartością po suszeniu (ISTA 2011) Masa 1000 nasion Z próbki analitycznej wydzielono ręcznie 8 powtórzeń po 100 nasion w kaŝdym. Próbki zwaŝono z dokładnością do trzech miejsc po przecinku. Następnie obliczono wariancję, odchylenie standardowe i współczynnik zmienności (ISTA 2011). PoniewaŜ współczynnik zmienności nie przekroczył 4,0 masę 1000 nasion obliczono dla 8 powtórzeń. Wyniki zostały podane w gramach z tą samą dokładnością z którą waŝono próbki (ISTA 2011) Zdolność kiełkowania W celu wykonania testu, z frakcji nasion czystych wydzielono losowo 4 próby po 50 nasion. Nasiona umieszczano na szlakach Petriego wyłoŝonych wilgotną bibułą filtracyjną. Doświadczenie prowadzono w kontrolowanych warunkach świetlnych i temperaturowych w kiełkowniku (komorze klimatycznej firmy Sanyo) przy fotoperiodzie 16/8, w temperaturze 20/30 C. NatęŜenie światła wynosiło 150 µmol m - 2 s -1. Za kiełkowanie nasion uznano moment ukazywania się kiełka oraz rozwój siewki do stadium, w którym jej budowa wskazuje na to, czy jest moŝliwy dalszy rozwój 104

105 siewki w prawidłowo rozwiniętą roślinę. Pierwsze liczenie skiełkowanych nasion wykonano po 7, a drugie po 21 dniach od momentu załoŝenia testu. Wynik testu wyraŝono jako procent siewek normalnych. Siewki sklasyfikowano jako normalne, jeśli odpowiadały jednemu z kryteriów: siewki nieuszkodzone: siewki z dobrze rozwiniętymi wszystkimi podstawowymi elementami budowy, kompletne, proporcjonalne i zdrowe; siewki z małymi uszkodzeniami: siewki, wykazujące pewne drobne uszkodzenia podstawowych struktur, pod warunkiem, Ŝe wykazują zadowalający i wyrównany rozwój porównywalny do rozwoju siewek nieuszkodzonych, ocenianych w tym samym teście; siewki z wtórną infekcją: siewki, które odpowiadałyby punktom powyŝej, ale są zainfekowane przez grzyby lub bakterie z innego źródła niŝ własne nasienie (ISTA 2011). Fot. 76 Fot. 77 Fot. 76 i 77. Komory klimatyzacyjne uŝywane w teście zdolności kiełkowania 105