Analityka Przemysłowa i Środowiskowa. Zakres wykładu: Adam Grochowalski

Transkrypt

1 Analityka Przemysłowa i Środowiskowa I Adam Grochowalski Zakres wykładu: 1. Kryteria wyboru metod analitycznych - proces pomiarowy 2. Metody zapewnienia jakości pomiarów analitycznych 3. Związki szkodliwe w środowisku (związki aktywne w środowisku) 3. Przedmiot badań rodzaje próbek 4. Techniki pobierania próbek 5. Metody przygotowania próbek do analiz 6. Podstawy analityczne oznaczania analitu

2 Przygotowanie próbek z analitycznego punktu widzenia Proces pomiarowy Analiza jakościowa czy ilościowa Metody obliczenia wyniku KRYTERIA WYBORU METODY ANALITYCZNEJ Sprawność metody analitycznej proces walidacji dokładność, poprawność precyzja, czułość, granica oznaczalności, zakres oznaczania, selektywność, przepływność - wydajność metody analitycznej (throughput), stopień zautomatyzowania, elastyczność - uniwersalność (ruggedness), mobilność metody (portability), uciążliwość dla środowiska (greenness), koszt jednostkowego oznaczenia.

3

4 POBIERANIE PRÓBEK Wybranie miejsca pobrania próbki reprezentatywnej Wybranie metody pobierania właściwej dla charakteru próbki oraz miejsca pobierania Wybór odpowiednich naczyń do pobierania próbek Utrwalenie próbki: zabezpieczenie przed utratą lotnych analitów oraz wskutek adsorpcji lub absorpcji składników trudnolotnych Kontrolowanie zmian fizycznych i chemicznych składników próbki Metody utrwalania próbek nietrwałych Warunki dostarczania próbek do laboratorium Przechowywanie warunki i czas Wstępne czynności postępowania z próbkami do badań Ekstrakcja analitu z próbek Wzbogacanie ekstraktu Podstawy procesów ekstrakcji Analiza związków organicznych Ekstrakcja substancji trudnolotnych z próbek ciekłych Ekstrakcja substancji trudnolotnych z próbek stałych Ekstrakcja substancji lotnych i wysokolotnych z próbek ciekłych i stałych Analiza związków nieorganicznych Przygotowanie próbek do oznaczania zawartości metali Metody przygotowania próbek do oznaczania zawartości DNA Technika PCR Pobieranie próbki Przygotowanie próbek do oznaczania dioksyn w żywności Utrwalenie próbki Transport, przechowanie, wstępna obróbka, Homogenizacja, suszenie Ekstrakcja analitu Wzbogacanie Frakcjonowanie i izolowanie analitu Analiza

5 DDT Dichloro difenylo trochloroetan 4,4'-(2,2,2-trichloroethane-1,1-diyl)bis(chlorobenzene) Użyty w walce z malarią Tabun N,N-dimetyloaminoetoksycyjanofosfina O CH 3 CH 2 O P CN N H 3 C CH 3 Tabun został otrzymany przypadkowo w 1936 r. przez niemieckiego chemika Gerharda Schradera Stężenie śmiertelne (LC 50 ) wynosi dla ludzi 150 mg/m 3. Zatrutego tabunem człowieka można odratować pod warunkiem, że szybko poda mu się atropinę lub diazepam. Dioksyny Polichlorowane dibenzo-p-dioksyny 3,3,4,4,4,4,5-pentachlorobifenyl Cl Cl Cl Cl O O Cl Cl (75 kongenerów) Cl Cl Polichlorowane dibenzofurany Cl Cl Cl O Cl (135 kongenerów) Cl PCB 126 (IUPAC)

6 Nazwy handlowe mieszanin PCBs stosowanych jako modyfikatory olejów w elektroizolacyjnych w kondensatorach i transformatorach średnio i wysokonapięciowych tzw. ASKARELI Aroclor, Pyranol USA Kanechlor Japonia Clophen Francja Delor Czechosłowacja owacja Phenoclor - Niemcy Sovol, Sovocol ZSRR Tarnol, Chlorofen Polska Źródłem dioksyn są procesy termiczne Meksyk Chlorakna użycie nieintencjonalne - katastrofa

7 Br Br Br HBCDD Br Br Br Br Br Br Br O O Bezwodnik tetrabromoftalimidu O Bromowane antypireny (BFR) Firemaster BP-6, Firemaster-1, Flammex-B Wyroby włókiennicze Tworzywa sztuczne Produkty elektroniczne i elektryczne Br Br HO Br CH 3 CH 3 Br OH Szkodliwe antypireny Tetrabromobisfenol A Odpady elektroniczne zawierają BFR Styrofoam (EPS) contains 0.7% HBCD

8 TRICLOSAN O H Cl O Cl Cl Schemat nowoczesnej spalarni odpadów z rusztem ruchomym i oczyszczaniem spalin z zastosowaniem katalizatorów Ruchomy ruszt Katalizator deno x TiO 2 + V 2 O 5

9 Reakcja katalityczna deno x Katalityczny rozkład dioksyn kat NO x + NH 3 N 2 + H 2 O kat 6NO + 4NH 3 5N 2 + 6H 2 O katalizator V 2 O 5 + TiO 2, temp C redukcja dioksyn i PCBs o 90% Katalityczny rozkład prowadzony jest na katalizatorze wanadowym, lub wolframowo-wanadowym naniesionym na monolityczny nośnik z TiO 2. Skuteczność metody ok %, temperatura o C. Próbki gazowe Spaliny z kominów paleniska domowe i energetyczne Spaliny ze spalarni odpadów komunalnych, szpitalnych i niebezpiecznych Spaliny z pojazdów mechanicznych (źródła ruchome) Gazy z instalacji przemysłowych w tym z zamkniętych obiegów technologicznych Powietrze na stanowisku pracy Powietrze atmosferyczne Powietrze z górnych warstw atmosfery

10 Cel wzbogacania próbek Wzbogacenie próbki w mikroskładniki usunięcie matrycy próbki uzyskanie granicy oznaczalności Podstawowe czynności przygotowania próbki do analizy GC Próbki gazowe nie wzbogacone osuszenie Próbki gazowe wzbogacone ekstrakcja rozpuszczalnikowa usunięcie H 2 O zatężenie ekstraktu* * o ile możliwe lub konieczne termiczna desorpcja wzbogacenie przez wymrożenie (pułapki kriogeniczne) Próbki ciekłe nie wzbogacone substancje trudno lotne (POP, TZO) bezpośrednie wprowadzenie do GC (woda i czyste rozpuszczalnki organiczne) wzbogacenie przez ekstrakcję ciecz/ciecz, osuszenie i zatężenie wzbogacenie przez ekstrakcję SPE, ekstrakcja rozpuszczalnikiem i zatężenie substancje lotne (VOC) bezpośrednie wprowadzenie do GC analiza fazy nadpowierzchniowej (head-space) analiza przez rugowanie gazem obojętnym i wyłapanie (purge & trap) Próbki ciekłe wzbogacone do fazy stałej ekstrakcja rozpuszczalnikiem usunięcie H 2 O odparowanie nadmiaru rozpuszczalnika (zatężenie)

11 Próbki stałe ekstrakcja rozpuszczalnikowa (aparat Soxhleta, ASE, USE, MWAE, SFE) usunięcie H 2 O usunięcie matrycy techniką wielostopniowej chromatografii kolumnowej, HPLC, HPTLC lub SFC odparowanie nadmiaru rozpuszczalnika (zatężenie) Cele i zadania analityki i monitoringu środowiska Identyfikacja źródeł i oszacowanie wielkości i zasięgu oddziaływania emisji, Oszacowanie poziomu imisji, Badania losu środowiskowego ksenobiotyków, Ocena skuteczności zabiegów sozotechnicznych, Ocena toksyczności i ekotoksyczności zanieczyszczeń, Badania procesów bioakumulacji zanieczyszczeń przez organizmy żywe. Związki podlegające uregulowaniom prawnym Zanieczyszczenia środowiska Związki nie podlegające uregulowaniom prawnym Klasyfikacja zanieczyszczeń środowiska Tendencje zmian stężenia związków cynoorganicznych w środowisku i wzrost świadomości o ich wpływie na organizmy żywe Wzrost czułości i selektywność INFORMACJE ANALITYCZNE GFAAS CT / QFAAS CGC / FPD AED CGC / ICP-MS Dioksyny (PCDD+PCDF) Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne Polichlorowane bifenyle Pestycydy chloroorganiczne Związki wywołujące zakłócenia równowagi hormonalnej w organizmach żywych (związki endokrynne) Kompleksy metali Estrogeny Fitoestrogeny Bisfenol A Bromowane uniepalniacze Surfuktanty niejonowe i produkty ich rozkładu i metabolizmu Alkilofenole Pozostałości farmaceutyków Pochodne ftalanów Syntetyczne związki zapachowe Środki higieny osobistej Zmiana stężenia związków cynoorganicznych w wodach przybrzeżnych (jednostki umowne) Zakaz stosowania TBT w farbach służących do malowania statków o długości poniżej 25 m Zatrucia ostryg i wpływ na życie biologiczne w środowisku Występowanie związków cynoorganicznych w wodach morskich i akumulacja w tkankach Oddz ssaków morskich iaływ anie związ ków Występowanie związków cynoorganicznych w systemach wody wodociągowej i produktach używanych w gospodarstwach domowych Zjawisko maskulinizacji/feminizacji (ang. imposex) u organizmów żyjących w wodach przybrzeżnych i otwartym oceanie CZAS cynoo rgani cznyc h na organ izmy żywe

12 Oddziaływanie zanieczyszczeń na część nieożywioną i ożywioną środowiska Podstawowe właściwości ksenobiotyku Właściwości układu (zmienność, złożoność) Los chemiczny emisja Środowisko nieożywione rozmieszczenia Woda powierzchniowa przemiany Osady denne Los środowiskowy Ekspozycja woda gruntowa powietrze gleba Zanieczyszczenia (ksenobiotyki) pobieranie Biodostępność Biota metabolizm rozmieszczenie Toksykokinetyka i dynamika Ekspozycja wewnętrzna Skutki Toksyczność ostra/chroniczna Rakotwórczość Mutagenność Ekotoksykologia Zakłócenia lub zanik sygnałów chemicznych Ocena ryzyka ekologicznego Interferencje pomiędzy indywiduami chemicznymi Specjacja chemiczna Parametry grupowe Parametry sumaryczne Specyficzność Ocena ryzyka środowiskowego Informacja analityczna ANALIZA ŚRODOWISKOWA Bioakumulacja g/l Podział międzyfazowy g/l 10-9 g/l 10-6 g/l Degradacja Czułość Transport Związki endokrynne (Endocrine Disrupting Compounds EDC s) Efekty biologiczne działania dioksyn (PCDD+PCDF) An exogenous agent that interfaces with synthesis, secretion, transport, binding, action or elimination of natural hormones in the body that is responsible for the maintenance of homeostasis, reproduction or behavior. U.S. EPA Special Report on Environmental Endocrine Disruption: An effect assessment and analysis. EPA/630/R-96/012 (1997) Efekty hormonalne (działanie endokrynne), Indukcja enzymu (cytochrom P4501A), Działanie rakotwórcze, Zakłócenia w reprodukcji. Czynnik zewnętrzny (pozaustrojowy), który wpływa na: Syntezę, Wydzielanie, Transport, Wiązanie, Działanie, Eliminacje naturalnych hormonów w organizmie, które są odpowiedzialne za utrzymanie homeostazy, zachowanie organizmu i jego reprodukcję.

13 Potencjał endokrynny Potencjał endokrynny różnych ksenobiotyków może być porównywany poprzez określenie stężenia równoważnikowego endokrynności (ang. Estrogen equivalent concetration -EEQ) EEQi = Ci EEFi EEQt = Σ EEQi gdzie: Ci stężenie danego ksenobiotyku EEF współczynnik endokrynności Wartości liczbowe współczynnika EEF wyrażają wzgledną endokrynność danego ksenobiotyku w stosunku do endokrynności estradiolu lub 17 ß-estradiolu. Właściwości endokrynne są określane za pomocą różnych biotestów (ER-CALUX, YES, E-screen transgenic zebrafish). Los środowiskowy związków endokrynnych Ścieki komunalne i przemysłowe Sorpcja Sedymentacja Pobieranie przez rośliny Depozycja atmosferyczna Rozkład Uzdatnianie wody do picia Odparowywanie Pobieranie przez organizmy żywe i biowzbogacanie Frakcja rozpuszczalna Remobilizacja i depozycja Frakcja osadu Rozkład (mineralizacja) Obszarowe źródła wód spływnych Ch. G. Campbell, S. E. Borglin, F. B. Green, A. Grayson, E. Wozei, W. T. Stringfellow, Chemosphere, 65, (2006) Transport do wód gruntowych Budowa strukturalna naturalnych i syntetycznych związków endokrynnych Naturalne 17β-estradiol (E2) MM α-estradiol (α-e2) MM Estron (E1) MM Estriol (E3) MM Testosteron (Test) MM Progesteron (Pg) MM Kortyzon (Cor) MM Dehydroepiandrosteron (DHEA) MM Syntetyczne Noretyndron (Nore) MM Lewonorgestrol (LNor) 17α-etynyloestradiol (EE2) MM MM E. Vulliet, J. B. Baugros, M. M. Prednizon (Pd) MM Flament-Waton, M. F. Grenier- Loustalot, Anal. Bioanal. Chem., 387, (2007)

14 Przykłady związków endokrynnych ZWIĄZEK SKRÓT /AKRONIM UWAGI 17β-estradiol i 17 α-estradiol Β-E2 i α-e2 Estrogeny naturalne Estron E1 Estrogen, metabolit E2 Estriol E3 Estrogen naturalny 17 α-etynyloestradiol EE2 Syntetyczny estrogen ogólnie stosowany w łączonej profilaktyce antykoncepcyjnej Testosteron Test Naturalny androgen Progesteron Pg Naturalny hormon luteinizujący Dehydroepiandrosteron DHEA Androgen, precursor hormonów płciowych Lewonorgestrol LNor Syntetyczny progestagen powszechnie stosowany w antykoncepcji z zastosowaniem wyłącznie progestagenów Noretyndron Nore Syntetyczny progestagen powszechnie stosowany w antykoncepcji z zastosowaniem wyłącznie progestagenów Kortyzon Cor Glukokortykoid syntetyczny homolog kortyzonu Prednizon Pd Glukokortykoid syntetyczny homolog kortyzonu Przykłady organizmów wykorzystywanych jako wskaźniki ekspozycji na związki endokrynne GATUNEK NAZWA ZWYCZAJOWA Rana pipiens Żaba lamparcia Anomalie gonad ZMIANY WYWOŁYWANE PRZEZ ZWIĄZKI Chrysemys picta Żółw malowany Indukcja witellogeniny (glikolipoproteina prekursor żółtka) Oncorhynchus mykiss Pstrąg tęczowy Zakłócenia w rozrodzie, indukcja witellogeniny Primephales promelas Ciernik promienisty Anomalie gonad, zakłócenia w rozrodzie, indukcja witellogeniny Cyprinodon variegates Karpieniec zwyczajny Indukcja witellogeniny Danio rerio Brachydanio rerio Danio pręgowany Anomalie gonad, zakłócenia w rozwoju fizjologicznym, indukcja witellogeniny i lucyferyny Oryzias latipes Ryżówka japońska Anomalie gonad, Zakłócenia w reprodukcji Platichthys flesus Stornia (flądra) Anomalie gonad, zakłócenia w rozwoju fizjologicznym, indukcja witellogeniny Salmo salar Łosoś atlantycki Zmiany białek warstwy promienistej, indukcja witellogeniny Haliaeetus leucocephala Bielik amerykański Skutki teratogenne i zakłócenia w reprodukcji Coturnix japonica Colinus virginianus Przepiórka japońska Przepiórka błękitna Zmiany zachowań seksualnych, zakłócenia w rozwoju embrionu, zmiany w grubości skorupek jaj Gallus domesticus Kura domowa Zakłócenia w rozwoju embrionu, zmiany w grubości skorupek jaj Daphnia magna Rozwielitka Zakłócenia fizjologiczne i biochemiczne Tisbe battagliai Skorupiak morski Zmiany w płodności i zakłócenia w szybkości rozwoju Przykłady niekomórkowych biotestów i bioczujników wykorzystywanych do wykrywania związków endokrynnych Przykłady testów komórkowych przeznaczonych do wykrywania związków endokrynnych NAZWA BIOTESTU MIERZONY SYGNAŁ DETEKTOR ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assays) ELRA (Enzyme-linked receptor assay) Endotect TM RIANA (River analysis) Biacore TM Bioczujniki (elektrochemiczne) SCCoR (Single cell coactivator recruitment) RBA (Microarray relative binding assay) Natężenie promieniowania świetlnego Natężenie promieniowania świetlnego Fluorescencja Fluorescencja Rezonans powierzchni plazmonu Wskaźnik fluorescencyjny Wskaźnik fluorescencyjny Spektrofotometr Spektrofotometr Fluorometr Fluorometr Detekcja promieniowania laserowego Multimetr Fluorometr Fluorometr Nazwa zwyczajowa (handlowa) Rodzaj komórki E-SCREEN MCF-7 komórki raka piersi proliferacja Yeast Estrogen Screen (YES) - łącznie z wariantami LYES i BLYES Analiza ER-lucyferazy z komórkami HEK 293 Różnorakie (Sachcaromyces spp., Cryptococcus spp., Candida spp.) Ludzka nerka embrionalna (HEK) Efekt wywoływany przez związki endokrynne luminescencja kolorymetria luminescencja NA E. coli luminescencja Ekspresja czułej na estrogen lucyferazy chemicznie aktywowanej (ER- CALUX ) T47D Komórka raka gruczołu piersiowego luminescencja IR-bio-amplifikacja Komórki ssaków Funkcja komórkowa

15 Wektor YAC. Sztuczny chromosom drożdżowy czyli Yeast artificial chromosome (YAC) jest wektorem używanym do klonowania dużych fragmentów DNA (od 100 kb i do 3000 kb). To jest sztucznie skonstruowany chromosom i zawiera sekwencje telomerowe, centromer i inne potrzebne do replikacji w komórkach drożdży. Wektory YAC często używane są równocześnie do sekwencjonowania i mapowania genomów. kawałki DNA danego organizmu, o długości nawet do miliona par zasad, ulegają insercji do wektora YAC. Wektor ten wprowadza się do komórki drożdży, gdzie ulega powieleniu. YES - yeast estrogen screen - measure of estrogenic activity of compounds. Pink = estrogenic activity, Yellow = negative. Następnie YAC izoluje się z tej komórki i poddaje mapowaniu oraz sekwencjonowaniu. Wektor BAC. Sztuczny chromosom drożdżowy, bacterial artificial chromosome (BAC), podobnie jak wyżej opisany YAC jest wektorem. W przeciwnieństwe jednak do niego, służy do klonowania sekwencji DNA w komórkach bakteryjnych (np, E.coli). BACs często używany jest do łączenia przy sekwencjonowaniu DNA. Fragmenty DNA, o wielkości w przedziale od 100,000 do 300,000 par zasad podlegają insercji do wektora BAC, który z kolei jest wprowadzany do komórki bakteryjnej. Stamtąd, po wzroście, podziałach i namnożeniu jest izolowany i sekwencjonowany, podobnie jak YAC.

16 Metoda PCR. Reakcja łańcuchowej polimeryzacji, inaczej Polymerase chain reaction (PCR) jest powszechnie dziś stosowaną techniką laboratoryjną, która służy namnażaniu u powieleniu określonego fragmentu DNA. Metoda PCR polega na wykorzystaniu krótkich sekwencji DNA zwanych starterami, które oznaczają tą cześć genomu, które ma ulec powieleniu. Po wielokrotnych cyklach ogrzewania i oziębiania próbki, następuje powielenie sekwencji docelowej w tempie geometrycznym. Stąd technika ta może przynieść miliardy kopii sekwencji w ciągu zaledwie kilku godzin. E-Screen ER-CALUX YES ELISA LC-MS/MS GC-MS GC-MS/MS SPME-HPLC Granice wykrywalności związków z grupy związków endokrynnych HPLC/ESI MS/MS MEKC Technika Granica wykrywalności (ng/l) ER-CALUX: estrogen responsive chemically activated luciferase expression YES: yeast estrogen screen ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay LC-MS/MS: liquid chromatography tandem mass spectrometer GC-MS: gas chromatography mass spectrometer GC-MS/MS: gas chromatography tandem mass spectrometer SPME-HPLC: solid-phase microextraction high performance liquid chromatography HPLC/ESi-MS/MS: high-performance liquid chromatography with positive electrospray ionization and tandem mass spectrometry MEKC: micellar electrokinetic chromatography Sources: Wozei (2004), Fan et al. (2005), Huang and Sedlak (2001), heisterkamp et al. (2004), Zhang et al. (2004), Voulvoulis (2003, Table 3.5) Note: See Petrovic and Barcelo (2004, Table 1) for analytical methods and detection limits for sediment and sludge. Ch. G. Campbell, S. E. Borglin, F. B. Green, A. Grayson, E. Wozei, W. T. Stringfellow, Chemosphere, 65, (2006) Granice wykrywalności technik bioanalitycznych [pg/ml] CALUX Micro-EROD CEH-EROD EIA-2 EIA-DF1 GRAB AhR Ah-l

17 Występowanie wybranych steroidowych hormonów płciowych w strumieniu ścieków oczyszczonych w dwóch różnych oczyszczalniach w ng/l Parametry walidacyjne metodyki oznaczania związków endokrynnych w próbkach wody Odnośnik literaturowy Data pobierania próbek Analit E1 E2 α- E2 EE2 E3 DHEA Test Pg Nore LNor Pd Cor ,4 14,8 12,6 n.w. n.w. 4,8 10,0 16,9 13,0 17,6 n.w. <LOD n.w. nie wykryto < LOD poniżej granicy oznaczalności ,7 n.w. <LOD <LOD n.w. n.w. 30,3 9,7 41,0 12,5 n.w. n.w Pieree-Benite ,8 9,4 <LOD n.w. n.w. n.w. 11,8 12,0 28,7 17,9 n.w. n.w ,7 6,1 6,4 n.w. n.w. 4,6 8,4 9,2 20,9 10,8 <LOD n.w ,1 28,1 n.w. 5,6 n.w. 7,8 3,0 8,6 5,2 11,4 10,00 95, ,9 <LOD 9,7 <LOD n.w. n.w. 1,3 8,0 5,9 0,9 n.w. 13,7 St. Fons ,4 42,6 9,1 Zanieczyszczenia <LOD 4,5 7,6 8,6 23,1 17,2 n.w. 88,5 Analit Parametr walidacyjny Granica wykrywalności (S/N =3) Granica oznaczalności (S/N =10) Estron 17 ß-estradiol Estriol Etynyloestradiol 0,03 pg 0,02 pg 0,05 pg 0,24 pg 0,04 ng/l ppq 0,04 ng/l ppq 0,08 ng/l ppq 0,32 ng/l ppq ETAPY PROCEDURY ANALITYCZNEJ FILTRACJA EKSTRACJA (SPE) ELUCJA ODPAROWANIE NADMIARU ROZPUSZCALNIKA DERYWATYZACJA (PFPA) GC-MS A. Mounatassim-Souali, S. L. Tamisier-Karolak, D. Perdiz, M. Cargouet, Y. Levi, J. Sep. Sci, 26, 105 (2003) POZOSTAŁOŚCI FARMACEUTYKÓW (Pharmaceutical residue) Myśl przewodnia Pollution from pharmaceuticals in surface and groundwater is becoming recognized as an environmental concern in many countries leading to the area of study labelled PIE Pozostałości farmaceutyków w środowisku Pharmaceutical Products Pharmaceutical and Personal Care Products Endocrine Disrupting Compounds PP s PPCP s EDC s PHARMACEUTICALS IN THE ENVIRONMENT S.K. Khetan, T.J. Collins, Chem. Rev., 107, (2007) Non steroidal Anti-inflammatory Drugs Active Pharmaceutical Ingredients Pharmaceutical in the Environment NSAID s API s PIE

18 Pozostałości farmaceutyków w środowisku kamienie milowe 1981 Stwierdzenie obecności oraz ilościowe oznaczenie kwasu klofibrowego w próbkach środowiskowych (USA) 1997 Oznaczanie pozostałości farmaceutyków w ściekach szpitalnych (Niemcy) 1997 Badania dotyczące toksyczności antybiotyków w środowisku wodnym (Dania) 1998 Monitorowanie wód rzecznych i ścieków w Niemczech na obecność pozostałości farmaceutyków (Niemcy) 1998 Oznaczanie związków z grupy antybiotyków w różnych próbkach wody (Niemcy) 1999 Opracowanie metodyki analitycznej umożliwiającej stwierdzenie obecności estrogenów w wodach powierzchniowych (USA) 2002 Pierwsza metodyka jednoczesnego oznaczania pozostałości wielu farmaceutyków w próbkach środowiskowych (Dania) Oznaczanie pozostałości farmaceutyków w wodach pitnych (Niemcy) 2003 Opracowanie odpowiednich modeli matematycznych do przewidywania stężenia i losu poszczególnych farmaceutyków w środowisku (Belgia) 2005 Oznaczanie pozostałości farmaceutyków próbkach stałych (Hiszpania) Liczba opakowań leków rocznie kupowanych przez statystycznego mieszkańca Francja, 2. Polska 3. Niemcy, 4. USA, 5. Japonia Klasyfikacja farmaceutyków Parametr klasyfikujący Grupy związków Charakter chemiczny Kwasowe Zasadowe Neutralne Powinowactwo Hydrofilowe Lipofilowe Przeznaczenie Antybiotyki Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) Regulatory tłuszczów Hormony (estrogeny) Leki przeciwdrgawkowe Beta-blokery Środki cieniujące (kontrastujące) Leki uspakające Antybiotyki Erytromicyn Ofloxacin Chlortetracycline Oxytetracycline Streptomycin Flumequine Ciprofloxacin Trimetoprim Sulfamethoxazole Lincomycin Penicillin Lincomycin Amoxicillin Spiramycin Sterydy i hormony pokrewne 17-β-estradiol Estrone 17 α-ethinyl estradiol Dietylstilbestrol Dietylstilbestrol aceton Leki przeciwzapalne Kwas acetylosalicylowy (Aspiryna) Diklofenak Ibuprofen Acetaminofen Metamizol Codeina Indometacina Naproxen Fenazon Najpopularniejsze farmaceutyki występujące w środowisku Leki przeciwrakowe Cyclofosfamid Ifosfamid Środki moczopędne Furosemid Leki przeciwpadaczkowe Carbamazepin Leki antydepresyjne Mianserin Typowe przykłady związków biologicznie aktywnych środowisku Leki hipolipemizujące Bezafibrat Gemfibrozil Kwas klofibrowy Fenofibrat Beta-blokery Metoprolol Propranolol Nadolol Atenolol Sotalol Betaxolol Leki uspakajające Diazepam A. Nikolaou, S. Meric, D. Fatta, Anal. Bioanal. Chem., 387, 1225 (2007)

19 Przykłady substancji farmaceutycznych wykrywanych w ściekach Główne przyczyny pojawiania się w środowisku różnorodnych związków leczniczych: Zastosowanie Antybiotyki Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) Regulatory tłuszczu Estrogeny Leki przeciwdrgawkowe Beta-blokery Środki cieniujące Leki uspakajające Przykładowe substancje Sulfametoksazol, trimetoprim, klarytromycyna Roksyromycyna, erytromycyna Diklofenak, ibuprofen, naproksen, ketoprofen Bezafibrat, gemfibrozil, kwas klofibrowy Estron, 17b-estradiol, 17a-etynyloestradiol Carbmazepina, primidon Metaprolol, propranolol Lopromid, lopamidol, diatrizoat Diazepam Produkcja odpowiednich preparatów i oddziaływanie na środowisko zakładów przemysłu farmaceutycznego i weterynaryjnego, Zrzucanie do środowiska dużej ilości przeterminowanych środków (bez ich utylizacji) zarówno z gospodarstw domowych (na małą skalę), jak i ściekami i odpadami szpitalnymi (na znacznie większą skalę) Wydalanie pozostałości leków i ich metabolitów przez ludzi zwierzęta. Źródła emisji i los środowiskowy związków o znaczeniu farmaceutycznym STOSOWANIE Wykorzystanie przez człowieka metabolizm TOALETA FARMY HODOWLANE GOSPODARSTWA WIEJSKIE metabolizm Ścieki/ gromadzenie i rozprowadzanie nawozu i gnojowicy GLEBA OCZYSZCZALNIA ŚCIEKOW WODY POWIERZCHNIOWE Degradacja chemiczna i biologiczna APTEKI Pojemniki/ Toalety SKŁADOWANIE Degradacja chemiczna i biologiczna ODPADY Z GOSPODARSTW DOMOWYCH Składowiska odpadów Wody powierzchniowe Oczyszczalnia odcieków A. Nikolaou, S. Meric, D. Fatta, Anal. Bioanal. Chem., 387, 1225 (2007) Wybrane związki włączone do listy substancji priorytetowych (Holandia) Związki endokrynnie czynne Substancje medyczne Związki 17 α-ethinyl estradiol Bisfenol A Estron Ibuprofen Anhydroerytromecyna Sulfometoksazol Karbamazepina Sotalol Obecność w wodach odpływowych z oczyszczalni ścieków (WWTP) n.d nie wykryto + wykryto od 5% do 50% w badanych próbek z oczyszczalni ścieków ++ wykryto od 50% do 95% w badanych próbek z oczyszczalni ścieków +++ wykryto więcej niż 95% badanych próbek z oczyszczalni ścieków Min [µg l-1 ] n.d Stężenie P. De Jong, J. F. Kramer, W. F. Slotema, K. A. Third, STOWA REPORT , ISBN Max [µg l-1 ] <

20 Antybiotyki Wybrane grupy farmaceutyków i ich wskaźniki ryzyka środowiskowego Lek Leki przeciwbólowe Beta blokery i leki przeciwpadaczkowe Leki hipolipemizujące Leki przeciwdepresyjne Hormony Leki przeciwhistaminowe Przykłady Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NSLPZ np.. Ibuprofen): inne leki przeciwbólowe (np.. Acetaminofen) Penicylina, sulfametoksazol Propanolol, metoprolol Karbamazepina, fenobarbital Statyny (np.. Atorvastin, Klofibrat) Fluoksetyna, Risperidon Tabletki antykoncepcyjne 17 -etinyloestradiol Loratadyna, Cymetydyna Wskaźnik ryzyka Bardzo często stosowane : wykrywane w środowisku Duże ilości Wykrywane w środowisku Dotyczy toksyczności i oporu antybakteryjnego Duże ilości: wykrywane w środowisku Duże ilości Długoterminowe stosowanie Trwałe Długoterminowe stosowanie Często wykrywane Przedmiot testów toksyczności Zakrojone na szeroką skalę badania Właściwości toksyczne Często wykrywane Często stosowany lek bez recepty Skuteczność usuwania farmaceutyków w procesach oczyszczania ścieków Farmaceutki Konwencjonale oczyszczanie ścieków Osad czynny SBR Technologie oczyszczania ścieków MBR Ozonowanie Zaawansowane procesy utleniania UV/ O 3 (lub H 2 O 2 ) O 3 / H 2 O 2 Odczynnik Fentona TiO 2 / H 2 O 2 Antybiotyki ** *** ** *** *** *** *** *** NLPZ* ** ** ** ** NPX, IBP ** ** ** ** DCL * * * *** *** *** *** *** Regulatory tłuszczu ** ** *** *** *** *** *** *** Estrogeny *** ** ** *** *** *** *** *** Leki przeciwdrgawkowe * * bu ** *** *** *** *** Beta-blokery ** bd ** *** *** *** *** *** Środki cieniujące ** ** ** ** ** *** *** *** Środki uspakajające * * * ** *** *** *** *** S. K. Kethan, T. J. Collins, Chem. Rev., 107, (2007) Stopień usuwania ze ścieków: * <39% ** < 40-79% *** >80% bu nie stwierdzono usunięcia ze ścieków bd brak danych SBR Reaktor Sekwencyjny (Sequencing Batch Reactor) MBR Membranowy Reaktor Biologiczny (Membrane Biological Reactor) Badania własne Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NSLPZ) W Katedrze Chemii Analitycznej Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej od kilku już lat prowadzone są prace ukierunkowane na: OPRACOWANIE NOWYCH PROCEDUR PRZEZNACZONYCH DO OZNACZANIA ZWIĄZKÓW AKTYWNIE BIOLOGICZNYCH W PRÓBKACH ŚRODOWISKOWYCH F F COOH OH Diflunisal CH 3 O COOH Fenoprofen HOOC H N Cl Diklofenak H 3 C H 3 C Cl NSLPZ CH 3 COOH O H 3 C HO O CH 3 Naproxen CH 3 O N Tolmetin COOH CH 3 Ibuprofen

21 intensywność sygnału Intensywność sygnału Zastosowanie technik chromatograficznych t r i t r i+1 t r i+2 Czas Identyfikacja odbywa się na podstawie czasu retencji. ALE TO JUŻ DZISIAJ NIE WYSTARCZY! Analiza dwuwymiarowa Problem 1 - nakładanie się pików Rozwiązanie Powtórzyć analizę przy użyciu kolumny z innym typem wypełnienia. Charakter oddziaływań pomiędzy analitem a fazą stacjonarną musi być inny niż w przypadku pierwszej kolumny. Zalety: - łatwość wykonania - niski koszt Wady: - czasochłonność!! Analiza dwuwymiarowa Problem 2 - identyfikacja nieznanych substancji Rozwiązanie Zastosować detektor umożliwiający uzyskanie informacji o strukturze analitu. Techniki łączone Dzięki wykorzystaniu technik łączonych informacja analityczna zyskuje dodatkowy wymiar (struktura) Innymi słowy zastosowaćtechniki łączone Zalety: - możliwość identyfikacji nieznanych związków - informacja o ich masie cząsteczkowej i/lub strukturze - szybsze uzyskanie wyniku końcowego - łatwe wykrywanie faktu nakładania się pików Wady: - wysokie koszty inwestycyjne - wysokie wymagania co do kwalifikacji personelu m/z czas

22 Zakres zastosowań różnych typów technik łączonych (GC-MS i LC-MS) Masa cząsteczkowa analitu APCI GC/MS niepolarne TERMOROZPYLANIE PBI ESI (elektrojonizacja) Polarność analitu FAB bardzo polarne Problemy analityczne w zależności od składu matrycy próbki Wody pitne Wody powierzchni owe Poziom zawartości Poziom zawartości Poziom zawartości pg/l - ng/l ng/l- µg/l µg/l-mg/l prosty skład matrycy próbki prosty ale zróżnicowany złożony i zróżnicowany skład skład matrycy próbki Wody ściekowe matrycy próbki Procedury analityczne dla różnych obiektów materialnych SPE w układzie off-line SPE w układzie off-line MeOH H 2 O Próbka H 2 O MeOH Pasywne techniki pobierania próbek analitów SPE SPE w układzie on-line naniesienie próbki (sorpcja) przemycie złoża sorbentu odparowanie rozpuszczalnika do sucha w strumieniu azotu elucja analitów (desorpcja) rozpuszczenie suchej pozostałości w fazie ruchomej oznaczenie końcowe za pomocą techniki HPLC/DAD/MS

23 SPE w układzie on-line Kolumna analityczna Detektory Kolumna SPE DAD MS Pompa 2 Porównanie etapu ekstrakcji (SPE) w układzie off-line i on-line SPE (w układzie off-line) Objętość próbki 1000 ml Wstępne przygotowanie próbki t= 2 min Przygotowanie kolumienek t= 18 min EKSTRAKCJA SPE t= 70 min Objętość próbki 100 ml Wstępne przygotowanie próbki t= 2 min Przygotowanie kolumienek t= 8 min EKSTRAKCJA SPE t= 35 min SPE (w układzie on-line) Suszenie złoża kolumienki SPE t= 5 min Przełączenie zaworu PRÓBKA Ściek ETAP 1- izolacja i wzbogacanie analitów z próbek wody Elucja analitów t= 20 min Odparowanie rozpuszczalnika t= 200 min ANALIZA HPLC-DAD-MS t= 25 min Czas całkowity 70 minut Rozpuszczenie pozostałości t= 30 min Czas całkowity 370 minut PORÓWNANIE TECHNIKI SPE- HPLC-DAD DAD-MS W UKŁADZIE ON- LINE WZGLĘDEM UKŁADU OFF- LINE: PORÓWNANIE TECHNIKI SPE- HPLC-DAD DAD-MS W UKŁADZIE OFF-LINE WZGLĘDEM UKŁADU ON-LINE : Technika SPE-HPLC-DAD-MS umożliwia wykrywanie śladowych ilości (na poziomie ppt) rożnych farmaceutyków w próbkach wody Bardzo dobra odtwarzalność wyników Mała objętość próbek do analizy Krótszy czas analizy Możliwość automatyzacji procesu Wysoki koszt wyposażenia efekty pamięci złoża, brak możliwości powtórzenia danej analizy, brak możliwości wzbogacania analitów z kilku próbek równocześnie (w przypadku układu of-line jest możliwe prowadzenie kilku operacji ekstrakcji równocześnie) Ekstrakcja (SPE) w układzie: Off-line On-line RSD % <11 <7 Odtwarzalność % Granica wykrywalności ng/l ,7-50

24 Techniki pasywne pobierania próbek analitów Konstrukcja próbnika typu CHEMCATCHER SPMD paski MESCO POCIS LDPE Pobieranie analitów następuje na drodze swobodnego transportu masy przez membranę do medium zatrzymującego, na skutek różnicy potencjałów chemicznych związków w medium zatrzymującym i środowiskiem wodnym, w którym umieszczany jest próbnik. Konstrukcja próbnika typu CHEMCATCHER Konfiguracja próbnika typu CHEMCATCHER użyte w badaniach Budowa próbnika: - obudowa - membrana - medium zatrzymujące Próbnik typu Chemcatcher został zaprojektowany na University of Portsmouth, UK. STAMPS = Standardised Aquatic Monitoring of Priority Pollutants by Passive Sampling Typ próbnika Medium zatrzymujące Membrana Analiza Chemcatcher typ 1 krążek ekstrakcyjny C18 polieterosulfo- nowa LC-DAD DAD-MS Chemcatcher typ 2 krążek ekstrakcyjny C18 - LC-DAD DAD-MS Chemcatcher typ 3 krążek ekstrakcyjny SDB-RPS - LC-DAD DAD-MS Chemcatcher typ 4 krążek ekstrakcyjny SDB-XC - LC-DAD -MS

25 Kalibracja próbnika typu CHEMCATCHER wzorce Zużyta woda mieszadło Próbniki woda Produkty farmaceutyczne (PP s) w środowisku (podejście zintegrowane) Cykl życia produktów farmaceutycznych Typ dostępnych danych Wytwórcy Dystrybutorzy Konsumenci Farmakologiczne Fizyko-chemiczne Konsumpcja Lista PPs i ich metabolitów Wody odpływowe z oczyszczalni ścieków (WWTP) Skuteczność terapii Emisja PPs i produktów ich przemian Receptory środowiskowe MECs (naturalna i pitna woda, osady i gleba) Los środowiskowy (biodostępność, trwałość) Narażenie organizmów Toksyczność Bioakumulacja Inne efekty pompa 100 µl/min Komora ekspozycyjna pompa 30 ml/min Podejście zintegrowane Działania W celu zmniejszenia występowania i niekorzystne oddziaływanie PPs (zapobieganie emisji, nowe sposoby oczyszczania scieków ) Analityka i monitoring środowiska Problemy i wyzwania Niskie i bardzo niskie poziomy stężeń analitów w próbkach charakteryzujących się złożonym składem matrycy Możliwość fluktuacji czasowych i przestrzennych stężeń ksenobiotyków Niebezpieczeństwo interferencji związanych z występowaniem składników o zbliżonych właściwościach fizykochemicznych Nieznajomość szlaków przemian poszczególnych ksenobiotyków Konieczność oznaczania nie tylko zanieczyszczeń pierwotnych ale także i produktów przemian i metabolizmu Brak odpowiednich wzorców i materiałów odniesienia Problemy z wykorzystaniem informacji o środowisku WYTWARZANIE INFORMACJI Wytwarzane informacje są tak poszatkowane (fragmentacyjne) i niespójne, że różne a czasem nawet i przeciwstawne wnioski mogą być wyciągnięte w oparciu o dostępne zbiory danych. DYLEMAT Z DANYMI (Data dilemma) PROBLEM ORIENTACJI (wykorzystania dostępnych danych) Mogą stanowić podstawę do udzielenia różnych odpowiedzi na następujące cztery pytania: 1 Jakie są luki w dostępnych informacjach i jaki typ danych jest potrzebny? 2 Jaka jest możliwość wykorzystania uzyskanych wyników? 3 Jaki jest konkretny cel podjętych badań? 4 Jakie są właściwe metody do przeprowadzenia badań określonego obiektu w celu uzyskania zamierzonego celu. ZAPOTRZEBOWANIE NA INFORMACJE Brak jest naukowych informacji, które mogłyby ułatwić ocenę istniejących zagrożeń środowiskowych i alternatywnych rozwiązań danego problemu

26 Podstawowe grupy organicznych zanieczyszczeń środowiska oznaczanych techniką GC Lotne związki organiczne (VOC, VVOC) Przemysł, transport, energetyka, źródła naturalne Chlorofluorowęglowodory (CFCs, freony) Rozpuszczalniki organiczne, ciecze ekstrakcyjne i chłodzące Węglowodory alifatyczne - C 5 -C 24 Przemysł, transport, energetyka Węglowodory aromatyczne (BETX) - benzen, etylobenzen, toluen i ksyleny. Niepełne spalanie energetyka, komunikacja, metalurgia, koksochemia Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA, PAHs) Niepełne spalanie energetyka, komunikacja, metalurgia, koksochemia Pestycydy oraz herbicydy chloroorganiczne i fosforoorganiczne Agrochemia Chlorowane bifenyle (PCBs) Energetyka i elektrotechnika (kondensatory i transformatory przemysłowe) Chlorowane dioksyny i furany (PCDDs/PCDFs) Niekontrolowane spalanie odpadów, przepracowane oleje kondensatorowe Coriolis MS Coriolis MS offer flexibility with a choice of operating modes: Autonomous Sampling: This mode, triggered by the operator wearing Individual Protective Equipment (IPE), can be used by recon teams or first responders to rapidly collect a sample that can be used by an Identifier to identify the biological threat. Biological Sentry Mode: For long term surveillance, the Coriolis MS can function in a standby mode and, when triggered by the Detector, will collect a sample that can be used by the Identifier to identify the biological threat. This mode has already been tested successfully with the warning system, MAB of Proengin. Long Time Collection: for the surveillance of a critical event, the long time collection mode (several hours) can be used to continuously collect a sample that is fully representative of a given period of time. In this mode of operation, an external power source is required.

27 Pobieranie próbek ciekłych Bez wzbogacania Ze wzbogacaniem Pobieranie próbek stałych Metody wzbogacania próbek ciekłych: Metody pasywne dyfuzja przez membranę (SPM, SPMD Semipermeable Membrane Device) Metody dynamiczne adsorpcja na powierzchni ciała stałego (adsorpcja) ekstrakcja do ciała stałego (SPE Solid Phase Extraction) mikroekstrakcja do fazy stałej (SPME Solid Phase MicroExtraction) Bez wzbogacania Konserwowanie próbek przed analizą Próbka musi być reprezentatywna Zmianie mogą ulegać własności fizyczne, chemiczne i biologiczne powodujące zmiany składu chemicznego badanej próbki Zmiany fizyczne mogą być spowodowane 1. parowaniem (desorpcją) analitu, 2. sorpcją do powierzchni naczynia, Konserwowanie próbek przed analizą Zmiany chemiczne mogą być spowodowane: 1. reakcjami fotodegradacji i/lub fotosyntezy 2. utlenianiem tlenem atmosferycznym 3. wytracaniem analitu wskutek tworzenia się nierozpuszczalnych soli (związków) 4. Zmianą ph środowiska próbki (pochłanianie CO 2 ) 3. dyfuzją przez jego ścianki 4. Separacja faz, zmiany w zakresie specjacji

28 Konserwowanie próbek przed analizą Zmiany biologiczne mogą być spowodowane: 1. Biodegradacja aerobowa lub anaerobowa i reakcje enzymatyczne Utrata analitu wskutek parowania / desorpcji (lotność) Substancje o wysokiej prężności pary nad roztworem lub ciałem stałym mogą być utracone wskutek ich lotności. Naczynia z próbkami ciekłymi należy napełniać do pełna, lub przestrzeń wolną wypełnić argonem (azotem). Ciała stałe należy przykryć warstwą obojętnej chemicznie cieczy (woda, heksan). Przechowywanie próbek w temperaturze nie wyższej niż 4ºC, ale nie zamrożonej (woda, gleba). Zamrażać należy próbki biologiczne Wybranie odpowiedniego pojemnika na próbki Ze względu na możliwość zarówno utraty analitu, jak i jego niekontrolowanego wprowadzenia do badanej próbki, a także zmiany jego własności fizycznych i chemicznych naczynie do pobierania próbek musi być właściwie dobrane. Sposób przechowywania i transportu próbki musi zapewnić utrzymanie jej reprezentatywności. Pobieranie próbek gazowych Bez wzbogacania Ze wzbogacaniem Metody wzbogacania próbek gazowych: Metody pasywne dyfuzja przez membranę Metody dynamiczne sorpcja w rozpuszczalnikach (absorpcja, chemisorpcja) adsorpcja na powierzchni ciała stałego (adsorpcja) wymrożenie (pułapki kriogeniczne)

29 Apparatus for dioxin and PCB sampling from stack gas Zestaw urządzeń do pobierania dioksyn i PCB ze spalin Schemat aparatury do poboru próbek spalin do oznaczania dioksyn i PCBs wg normy UE EN-1948 spaliny Pyły, kondensat i nasycony adsorbent są przedmiotem oznaczania dioksyn i PCBs w spalinach V, p,t,h 2 O wg. T. Hudyma EMIO Sp. z o.o Wrocław. Poland Pomiary dioksyn - Blachownia S.A., Kędzierzyn Pobór próbek do oznaczania dioksyn cementownia Rejowiec S.A. 2002r.

30 Pobieranie próbek powietrza Sampling train for dioxin. PCB and HCB determination in stack gas from sinter plant Mittal Steel, Kraków Rurki adsorpcyjne do metod dynamicznych i pasywnych tzw. rurki Dräger a Umieszczenie bezpośrednie próbek w rurkach

31 NAFION Nafion jest kopolimerem kwasu nadfluoro-3,6-dioxa-4-metylo-7oktenosulfonowego i tetrafluoroetylenu (Teflonu ), otrzymany w 1960r przez Walthera Grot a. Nafion zawiera szkielet teflonowy do którego dołączone są łańcuchy innego polimeru fluorowęglowego. Łańcuch fluorowęglowy zakończony jest kwaśną grupą sulfonową (-SO 3 H). Nafion bardzo łatwo absorbuje wodę, zarówno z fazy gazowej jak i ciekłej. Każda z grup sulfonowych jest w stanie koordynować do 13 cząsteczek wody. Wewnątrz hydrofobowego polimeru kwasowe grupy sulfonowe tworzą kanały jonowe, co umożliwia szybki transport wody. W stosunku do pary wodnej Nafion spełnia rolę bardzo selektywnej membrany półprzepuszczalnej. Nafion nie jest materiałem mikroporowatym, który rozdziela związki na podstawie wielkości ich cząsteczek. Na przykład, osuszacze nafionowe mogą usunąć wodę ze strumienia wodoru, mimo że cząsteczka H 2 jest dużo mniejsza od cząsteczki wody. Siłą napędową procesu nie jest ciśnienie, a prężność cząstkowa pary wodnej. Naczynie próżniowe powlekane tantalem do pobierania próbek powietrza Wysokoobjętościowy próbnik do oznaczania zanieczyszczeń powietrza

32 Pipeta gazowa Próbniki po ekspozycji ok m 3 powietrza Wysokoobjętościowy próbnik do oznaczania zanieczyszczeń powietrza Wysokoobjętościowy próbnik do oznaczania zanieczyszczeń powietrza Airpointer automatyczny analizator zanieczyszczeń powietrza

33 Analizator VOC w powietrzu Airpointer automatyczny analizator zanieczyszczeń powietrza Analizator zanieczyszczeń biologicznych w powietrzu Aktywne pobieranie próbek powietrza Sadza zatrzymana na filtrze

34 Pasywne pobieranie próbek powietrza PUF-Disk PAS Zastosowanie w terenie Obejma stalowa Próbnik Polietylen PUF PUF disk POG -Próbniki zaprojektowane do tygodniowej, miesięcznej i rocznej ekspozycji SPMDs Cyrkulacja powietrza Nie wpływają na pomiar: słońce opady zmiany kierunku wiatru zapylenie Pobieranie próbek wody i ścieków Zabezpieczenie przed fotodegradacją szkło oranżowe

35 Próbki wody do oznaczania zawartości metali konserwuje się za pomocą HNO 3. Próbki pobiera się do naczyń z polietylenu lub polipropylenu. Nie wolno pobierać w tym celu próbek do naczyń szklanych. Próbki wody do oznaczania związków organicznych konserwuje się za pomocą metanolu lub chloroformu. Próbki pobiera się do naczyń z silanizowanego szkła lub ze szkła borokrzemianowego zamykanego z teflonowym uszczelnieniem Nie wolno pobierać w tym celu próbek do naczyń z tworzyw sztucznych Próbnik do pobierania dioksyn i PCBs z wód w d i scieków Membrana z polietylenu wypełniona trioleiną Szkło borokrzemianowe (Pyrex, Simax, Termisil )

36 Próbniki SPMD przygotowane do ekspozycji w ścieku Próbnik SPMD zanurzony w ścieku Techniki pasywne pobierania próbek analitów Konstrukcja próbnika typu CHEMCATCHER SPMD paski LDPE MESCO POCIS Pobieranie analitów następuje na drodze swobodnego transportu masy przez membranę do medium zatrzymującego, na skutek różnicy potencjałów chemicznych związków w medium zatrzymującym i środowiskiem wodnym, w którym umieszczany jest próbnik.

37 Konstrukcja próbnika typu CHEMCATCHER Budowa próbnika: - obudowa - membrana - medium zatrzymujące Próbnik typu Chemcatcher został zaprojektowany na University of Portsmouth, UK. STAMPS = Standardised Aquatic Monitoring of Priority Pollutants by Passive Sampling U c0 t t = M = A D L Równanie (pierwsze prawo dyfuzji Fick a) opisuje masę substancji przenoszoną na drodze dyfuzji w określonym czasie ekspozycji, gdzie: U dyfuzja, szybkość przenoszenia [mg/min], t czas ekspozycji [min], M masa substancji w medium zatrzymującym próbnika pasywnego [mg], A przekrój poprzeczny strefy dyfuzji [cm -2 ], D współczynnik dyfuzji substancji wzbogacanej [cm 2 /min], c 0 stężenie substancji w badanym środowisku [mg/cm 3 ], L długość strefy dyfuzji [cm]. gdzie: L M S M = S A c t 0 L M grubość membrany [cm], współczynnik permeacji substancji wzbogacanej W przypadku stosowania membran SPMD, równanie 2 ulega pewnym modyfikacjom. Zakładając, że temperatura badanego środowiska jest stała, a stan równowagi nie został osiągnięty (C L /C W << K OW ), wówczas pobieranie analitów można opisać następująco: gdzie: C L D A K OW C W t V L M C L D = A K V L OW M C W t stężenie analitu w trioleinie, współczynnik dyfuzji analitu, pole powierzchni membrany, współczynnik podziału Kow analitu (trioleina/woda), stężenie analitu w wodzie, czas ekspozycji, objętość trioleiny w ml grubość membrany.

38 Pobieranie próbek gleby Surowa membrana SPMD przed ekspozycją w wodzie w próbniku pasywnym Zakres analizy zanieczyszczenia gleb i osadów : Pozostałość chloroorganicznych pestycydów (OCP) Związki ropopochodne (PC) Związki halogenoorganiczne (TOX) Lotne związki organiczne (VOC) Lotne związki aromatyczne (BTEX) Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (PAH) Metale (analiza specjacyjna) Pozostałości farmaceutyków (osady ściekowe)

39 Urządzenie do pobierania próbek gleby Metody ekstrakcji w przygotowaniu próbek do analiz chromatograficznych

40 Tworzenie się emulsji dyskwalifikuje metodę ekstrakcji L/L

41 Aparat Soxhlet a

42 SPE SPE Ektrskacja do pojedynczej kropli - SDE ZESTAW SDE

43 Mikroekstrakcja MEPS MEPS Product What is MEPS? MEPS Micro Extraction by Packed Sorbent MEPS is a technique which combines sample preparation by solid phase extraction with syringe based sample injection. Jade Antonio SGE Europe Ltd

44 Objectives of Sample Preparation History of Sample Preparation Make sure the analytes of interest are in solution Remove any interferences found in the sample matrix Concentrate the analytes to a level which can be detected 1941 First use of Liquid:Liquid extraction 1966 First paper on HPLC 1974 First reported use of SPE 1993 Solid Phase Micro Extraction (SPME) 2007 MEPS Impact of Sample Preparation An estimated 75% of labor time in an analytical labs are spent preparing and processing samples Any reduction in this time will have a big impact on a laboratory costs and increase profit. Liquid-Liquid Extraction (LLE) Liquid-liquid extraction is used to separate compounds based on how easily they dissolve in two different liquids that will not mix. These liquids are usually water and an organic solvent. The extraction moves the compound from one liquid phase to the other.

45 Liquid Liquid Extraction Solid Phase Extraction LLE has three main draw backs It requires large quantities of solvent It is not automated (labor intensive) Operator Inconsistency is enhanced Used to isolate analytes of interest from a wide variety of matrices, including urine, blood, water samples Separation is based on the affinity of the solutes with the stationary phase and impurities are washed away Analytes that are retained on the stationary phase are then eluted from the cartridge and analysed SPE advantages over LLE How Similar are SPE and MEPS? Smaller volumes of solvent and sample are required Processing times are much faster The process allows some steps to be automated but in most cases the entire process could not be automated. Requires a transfer step before sample introduction into analytical equipment MEPS and SPE function in the same manner and use the same phases MEPS and SPE are physically very similar Methods created for SPE simply require scaling down of the volumes used for use with MEPS

46 MEPS Advantages MEPS combines the sample preparation of SPE with the sample injection capability of autosamplers Uses x less solvent and sample Increases through put from 10 to 15 minutes per sample to 1 to 2 minutes Ability to concentrate the analytes onto the sorbent material MEPS Application benefits MEPS allows existing SPE methodology and applications to be applied to small sample volumes. Provides labs a method for priority handling for critical samples. Samples maybe concentrated by cycling multiple aliquots through the sorbent bed Ability to automate SPE without requiring expensive dedicated on-line systems MEPS Product MEPS Products available Volumes 100µL for CTC, Thermo, HTA, Varian 8400 Autosamplers 250µL for CTC, Thermo, HTA, Varian 8400 Autosamplers Phases C18 end capped, 45µm, 60Å C8, 45µm, 60Å C2, 45µm, 60Å C8/SCX (cation exchange), 45µm, 60Å Silica, 45µm, 60Å

47 MEPS operation MEPS Animation 186 Performance Performance

48 Calibration Curves ng/ml Carry Over Compound 1 name: Bus Coefficient of Determination: Calibration curve: e-8 * x^ * x Response type: Internal Std ( Ref 2 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: 2nd Order, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None 3.83 All classes of compound influence MEPS and conventional SPE chemistry in exactly the same way. Response Repeated 3x per/day The small quantity of sorbent used and incorporation of MEPS into automation provides for multiple washes of the bed that are not practical for full scale SPE. 0 ng Assay The coefficients of determination (R 2 ) Day Day Day One paper on this technique states washing 4 times with solvent followed by 4 washes with water reduced carry over to 0.02% Carry Over and Extraction Efficiency Comparing MEPS, SPE and SPME Factor MEPS SPE SPME Amount sorbent mg mg thickness 150 mm Sample prep. time 1-2 min min min Usage 100 extractions once extractions Recoveries good good low Sensitivety good good low

49 Correlation between MEPS & LLE Market Sectors ng/ml ng/ml (LLE) (PP) Bisulphan concentration ng/ml (MEPS) Good correlation between MEPS & LLE with patient sample, but 1 min vs. 45 min, plus automation with MEPS Environmental Pesticide Herbicides POP s Water screening Food (liquid), Flavors and Fragrances Trace Analysis POP s Essential Oils Market Sectors Market Sectors Pharmaceutical Bioanalysis Drug Metabolism & Pharmacokinetics (DMPK). High Through-put System Important: users in high throughput laboratories will require full support and specialist advice (hand holding) for adoption of MEPS as part of their procedure. Clinical Forensic Drugs of abuse (Human and Animal) SPE methods have been developed for many drugs of abuse. Amphetamine and Barbiturates Benzodiazepines (Valium ) Flunitrazepam (Rohypnol ) Tetrahydrocannabinol (THC) Cocaine Urine & Plasma Screening Drugs of Abuse

50 Who are users of MEPS? Which MEPS Sorbent? Anyone who is currently using any of the following techniques in their lab is a potential customer for MEPS: Solid Phase extraction (SPE) Solid Phase Micro Extraction (SPME) Liquid-Liquid Extraction (LLE) Protein Precipitation C18 BIN s are like 5% phenyl GC columns 70% or more of all analysis are made using a C18 packed bed cartridge. This is because most samples are water based and the analytes need to be transferred from the water matrix into a nonpolar solvent for analysis. 198 Which Sorbent? Miniaturising your method For aqueous based fluid, i.e. water, biological fluids, use a reversed phase BIN C18, C8 or C2 Sorbent SPE Method C18, (500mg sorbent - 6mL volume) Sorbent MEPS Method C18, (2mg sorbent 7µL bed volume) For non-polar organic solvent based samples, hexane, dichloromethane, chloroform, acetonitrile, use a normal phase BIN Silica For aqueous or polar organic eluent samples with basic analytes, i.e. some drugs and amines, use a cation ionexchange BIN M1 (C8/SCX) Conditioning 5mL Methanol, 5mL HPLC grade Water Conditioning 2 x 50µL Methanol, 2 x 50µL HPLC grade Water Sample 20mL (4mL/minute) Sample 50uL (10-20uL/sec) Wash 5mL of HPLC grade water Wash 2 x 50µL HPLC grade water Elution 1mL Methanol/Water 95:5 (v/v) Elution 25µL Methanol/Water 95:5 (v/v)

51 Benefits of MEPS Extraction and injection combined in one process On-Line and fully automated (for LC and GC). Reduce the time to prepare and inject samples from hours to minutes Sample volumes as small as 3.6µL Minimum solvent required is 15µL for elution 'BIN' maybe reused 40 to 100 times (or greater) SGE would like to acknowledge an agreement for the development and commercialisation of MEPS with: Mohamed Abdel-Rehim AstraZeneca Södertälje, Sweden Lars Blomberg Department of Chemistry Karlstad University Karlstad, Sweden 202 Porównanie metod SPE i MEPS PORÓWNANIE DWÓCH METOD MEPS I SPE Sorbent Kondycjonowanie Metoda SPE Kolumienka z C18, (500mg sorbent - 6mL) 5mL Metanol (>99.9%) 5mL HPLC grade water 3 zł Sorbent Kondycjonowanie Metoda MEPS MEPS C18 (2mg sorbent 7µL) 2 x 50µL Metanol, 2 x 50µL HPLC grade water Próbka 20mL (4mL/min) = 5min Próbka 50µL (25uL/s) = 2s 2,5 zł Mycie 5mL HPLC grade water Mycie 2 x 50µL HPLC grade water Elucja 1mL Metanol/Woda 95:5 (v/v) Elucja 25µL Metanol/Woda 95:5 (v/v)

52 Porównanie metod SPE i MEPS c.d. Metoda SPE ( zużycie całoroczne ekstrakcji) Metoda MEPS (zużycie całoroczne 300 ekstrakcji 1) 30 kolumienek C zł 1) 5 szt. MEPS C zł 2) 1 kolumienka 1 ekstrakcja 2) 1 szt. MEPS - średnio 60 ekstrakcji 3) Koszt 300 ekstrakcji 3000 zł 3) Koszt 300 ekstrakcji (1szt. MEPS starcza średnio na 60 razy, więc 5x60=300) 720 zł 4) Zużycie 99,9% metanolu (około 1.8L) 180 zł 4) Zużycie 99,9% metanolu (około 40mL) 4 zł 5) Koszt sumaryczny 300 ekstrakcji ) Koszt sumaryczny 300 ekstrakcji 724 zł

53

54

55 Polimery z nadrukiem molekularnym

56 The principle of affinity chromatography is as follows: 1) Inject a sample into an initially equilibrated affinity chromatography column(afpak). 2) Only the substances with affinity for the ligand are retained in the column. 3) Other substances with no affinity for the ligand are eluted from the column. 4) The substances retained in the column can be eluted from the column by changing ph or salt or organic solvent concentration of the eluent. Sorpcja powinowactwa Affinity adsorption Najpewniejszą metodą identyfikacji człowieka jest obecnie przebadanie próbek DNA, który tworzy genetyczny materiał wszystkich naszych komórek. Palmę pierwszeństwa w odkryciu faktu, iż każdy człowiek ma unikalny kod DNA przyznaje się brytyjskiemu uczonemu o nazwisku Alec Jeffreys. Był to rok Już rok później test DNA pozwolił skazać pierwszych przestępców (była to sprawa o morderstwo). Niewątpliwą zaletą tej metody jest to, że użyty do badań materiał biologiczny może być bardzo zniszczony i bardzo stary oraz wystarczają jego śladowe ilości, nawet pojedyncze komórki.

57 Pobranie i izolacja DNA DNA może być uzyskane niemal z każdej ludzkiej tkanki. Źródła DNA z miejsca przestępstwa mogą obejmować krew, nasienie, tkanki, włosy, a także ślinę. Uzyskane z materiałów dowodowych DNA jest porównywane z próbkami odniesienia. Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi Niektóre krótkie sekwencje DNA występują w specyficznych miejscach na chromosomie i powtarzają się w ludzkim genomie. Ilość takich powtórzeń waha się pomiędzy osobnikami. Enzymy restrykcyjne przecinają DNA w obszarach gdzie występują specyficzne sekwencje zasad. Dzięki temu możliwe jest wycięcie fragmentów chromosomu o powtarzających się sekwencjach (variable number of tandem repeats, VNTR's). Odkrycie specyficznych enzymów bakteryjnych, zwanych enzymami restrykcyjnymi, stanowiło ogromny przełom w rozwoju technologii sztucznej rekombinacji DNA. Bakterie używają tych enzymów do obrony przed infekcją przez bakteriofagi. Otrzymanie z bakterii oczyszczonych enzymów restrykcyjnych umożliwiło uczonym przecinanie chromosomowego DNA na mniejsze fragmenty w sposób kontrolowany. Najpowszechniej używany enzym w sprawach kryminalnych to Hae III, który rozcina DNA na sekwencje 5 -GGCC-3. Reakcja PCR składa się z wielokrotnie powtarzanego cyklu trzech etapów, które zachodzą w rożnych temperaturach. Można zatem wymuszać je bez ingerencji w skład mieszaniny, a jedynie przez zmianę temperatury mieszaniny reakcyjnej. Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) łańcuchowa reakcja polimerazy, metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Technika została wynaleziona w 1983 roku przez Kary'ego Mullisa z kalifornijskiej firmy Cetus, za co Mullis otrzymał w roku 1993 Nagrodę Nobla.

58 helisa DNA Do reakcji wprowadza się: 1. matrycowy DNA, 2. trifosforany deoksyrybonukleozydów, 3. startery (primery), czyli krótkie (najczęściej ok. 20 nukleotydów) fragmenty DNA komplementarne do fragmentów matrycy, znajdujących się na obu końcach interesującego nas genu. Wyróżniamy dwa typy starterów: starter przedni jego sekwencja musi być taka sama jak sekwencja powielana; starter wsteczny jego sekwencja musi być komplementarna do powielanej. 4. termostabilną polimerazę DNA.

59 Używanym do reakcji enzymem może być na przykład polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus lub polimeraza Pfu z archeowców Pyrococcus furiosis. Polimeraza Pfu charakteryzuje się większą progresywnością niż Taq, jednakże działa wolniej. Dostępne są także inne polimerazy, będące z reguły modyfikacjami wyżej wymienionych. Czasem dodaje się jeszcze innych składniki np. roztworu trna zapobiegającego adsorbcji innych składników mieszaniny na ściankach naczynia, barwniki i wskaźniki informujące o przebiegu reakcji (szczególnie w modyfikacjach PCR Real Time PCR) i inne. Reakcja PCR składa się z wielokrotnie powtarzanego cyklu trzech etapów, które zachodzą w rożnych temperaturach. Można zatem wymuszać je bez ingerencji w skład mieszaniny, a jedynie przez zmianę temperatury mieszaniny reakcyjnej. Denaturacja. Pierwszym etapem jest rozplecenie podwójnej helisy matrycowego DNA (lub mrna, jeśli stanowi matrycę). W wysokiej temperaturze (zwykle około 95 C) p ękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. W celu uzyskania tego efektu podnosi się temperaturę mieszaniny reakcyjnej do wymaganych 95 na 15 sekund. Annealing hybrydyzacja odcinków starterowych. Polega na tworzeniu odcinków dwuniciowych, składających się z przygotowanych starterów - cząsteczek DNA komplementarnych do sekwencji DNA oskrzydlających gen mający ulec namnożeniu - z matrycową cząsteczką DNA. Etap ten zachodzi w temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (pomiędzy C), przył ączają się one do matrycy. Ponieważ roztwory primerów są dodawane w dużym nadmiarze w stosunku do matrycy, jest bardzo mało prawdopodobne, żeby na tym etapie, zamiast hybryd startermatryca utworzyły się hybrydy połączonych się ze sobą dwóch nici matrycy. Elongacja Na tym etapie zachodzi właściwa synteza DNA i tym samym amplifikacja pożądanego genu. Podwyższenie temperatury do około 72 C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimerazą DNA, wskutek czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy. Reakcja ta trwa zwykle 30 sekund.

60 Następnie cykl powtarza się i w kolejnym etapie annealingu i elongacji jako matryca mogą służyć wszystkie zsyntetyzowane dotychczas cząsteczki genu. W ten sposób reakcja, dopóki substraty i enzym są w wystarczającej ilości, zachodzi coraz szybciej, powodując coraz większy przyrost kopii genu na etapie elongacji. Gdyby wydajność metody była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać 2 n cząsteczek. W praktyce wydajność procesu jest mniejsza, co nie zmienia faktu, że metoda PCR pozwala na geometryczne zwielokrotnienie pożądanego łańcucha DNA. Konwencjonalna technika PCR pozwala na namnażanie łańcuchów DNA o maksymalnej długości ok. 10 kpz. Kpz (kbp) (kilo par zasad) = 1,000 pz PCR jest bardzo użytecznym narzędziem w różnego typu badaniach genetycznych ponieważ: Nie wymaga znajomości sekwencji badanego genu - wystarczy znajomość sekwencji nukleotydów w odcinkach oskrzydlających gen. Stosowane startery nie muszą być komplementarne do matrycy w 100%. Pozwala to na amplifikację wariantów tego samego genu, które różnią się od siebie niewielkimi zmianami w sekwencji. Jednocześnie jest to metoda specyficzna - przy doborze odpowiednich starterów, powielaniu ulega tylko jeden odcinek DNA jest to metoda bardzo czuła. Pozwala na wykrycie nawet pojedynczej cząsteczki DNA Izolowanie analitu (lub składnika matrycy) przy użyciu metody chromatografii wykluczenia GPC (chromatografia żelowa)

61 Wielostopniowy system mikroekstrakcji do oczyszczania próbki w układzie z wstrzykową analizą przepływową FIA MWAE MWAE

62 MWAE ASE 200 Accelerated Solvent Extractor ASE Accelerated Solvent Extraction ASE 300

63 Celka ekstrakcyjna ASE Schemat ekstraktora nadkrytycznego SFE Hollow Fibre separation

64 Wyparka obrotowa Büchi

65 Wyparka obrotowa Büchi Wyparka obrotowa Büchi Programowane podciśnienie Zestaw do odparowywania w analizie śladowej

66 Zestaw Flash Chromatography Odparowywacz Kuderna-Danisha

67 Metody analizy instrumentalnej Metody chromatograficzne Chromatografia gazowa Chromatografia cieczowa Chromatografia fluidalna Chromatografia elektromigracyjna Chromatografia planarna Dokładność Precyzja Granica oznaczalności Czułość Dokładność Precyzja Granica oznaczalności Czułość

68 Dokładność Precyzja Granica oznaczalności Czułość Dokładność Precyzja Granica oznaczalności Czułość Definicja chromatografii Chromatografia to tecchnika rozdzielania, która opiera się na wielokrotnym, powtarzającym się podziale rozdzielanych składników pomiędzy dwie nie mieszające się fazy: Fazę stacjonarną i fazę ruchomą. Types of Chromatography Adsorption chromatography a solid stationary phase and a liquid or gaseous mobile phase are used. Solute is adsorbed on the surface of the solid particles. The more strongly a solute is adsorbed, the slower it travels through the column. Partition chromatography A high boiling liquid stationary phase is bonded to a solid surface. Solute equilibrates between the stationary liquid and the mobile phase (a flowing gas). Faza stacjonarna jest nieruchoma Faza ruchoma przepływa w jednym kierunku Warunkiem rozdzielenia substancji jest ich różnica w oddziaływaniu fizycznym z fazą stacjonarną

69 Types of Chromatography Ion-exchange chromatography Anions or cations are covalently attached to the stationary solid phase. Solute ions of the opposite charge are attracted to the stationary phase by electrostatic force. Size exclusion chromatography Separates molecules by size, with the larger solutes passing through most quickly. Smaller molecules get trapped inside tiny pours. Types of Chromatography Affinity chromatography Employs specific interactions between one kind of solute molecule and a second molecule that is covalently attached to the stationary phase. For example, the immobilized molecule might be an antibody to a particular protein. When thousands of proteins pass through the column, only the protein that reacts with the antibody binds to the column, all the other proteins pass through. The desired protein is dislodged when desired by changing the ph or ionic strength. Rodzaje chromatografii Cieczowa - LC Kolumnowa CC Planarna (cienkowarstwowa) TLC, HPTLC Wysokosprawna cieczowa HPLC Jonowymienna IEC-HPLC Żelowa GPC Gazowa GC Fluidalna - SFC Elektromigracja EM Chromatografia gazowa Rozdzielanie mieszaniny w układzie gaz ciecz - chromatografia podziałowa Rozdzielanie mieszaniny w układzie gaz ciało stałe - chromatografia adsorpcyjna

70 Chromatografia cieczowa Rozdzielanie mieszaniny w układzie ciecz ciecz - chromatografia podziałowa Rozdzielanie mieszaniny w układzie ciecz ciało stałe - chromatografia adsorpcyjna Schemat działania HPLC Pompa dozownik D kolumna Detektor Teoria rozdzialania chromatograficznego Prędkość przemieszczania się związku chemicznego przez kolumnę zależy od jego powinowactwa do fazy stacjonarnej Powierzchnia pod krzywą jest de-facto masą związku zaadsorbowanego Rozp. A Rozp. B Odciek Gaz nośny Stężenie w fazie gazowej

71 Wrpt min Dyfuzja wirowa w wypełnionej kolumnie (eddy s diffusion) Chromatografia nie jest tylko metodą analityczną, ale coraz częściej wykorzystywaną techniką do otrzymywania substancji czystych w skali laboratoryjnej i przemysłowej chromatografia preparatywna - Przemysł farmaceutyczny - Przemysł kosmetyczny - Przemysł spożywczy Analiza ilościowa Metoda kalibracji jednopunktowej (porównanie z wzorcem) Metoda kalibracji wielopunktowej (równanie regresji) Metoda dodatku wzorca Metoda normalizacji wewnętrznej

72 Proces GC Detektor FID DOZOWNIKI Dozownik strzykawkowy Carrier gas (nitrogen or helium) Powietrze Wodór Kolumna (30 m) Dozowanie - strzykawki

73 KOLUMNY Dozownik do kolumn kapilarnych z podziałem strumienia gazu nośnego SSL split/splitless Kolumny kapilarne GC

74 Faza stacjonarna: dimetylopolisiloksan niepolarna Faza stacjonarna: metylo-fenylo polisiloksan umiarkowanie polarna Kolumna HPLC Podstawowe kolumny pakowane jakkolwiek kapilarne stają się coraz popularniejsze Faza stacjonarna: cyjanopropylo-metylopolisiloksan silnie polarna 5-30 cm długości 1-5 mm średnicy wewnetrznej Często stosowane wspólnie z tzw. prekolumną

75 Typowe kolumny HPLC Kolumny preparatywne HPLC Kolumna Zalety chromatografii jonowej Do podstawowych zalet chromatografii jonowej zaliczyć można: możliwość oznaczania kilkunastu anionów w próbce; stosunkowo krótki czas analizy; wykrywalność na poziomie ppb lub niższym; niewielka ilość próbki potrzebna do analizy; możliwość stosowania różnych detektorów; prosty sposób przygotowania próbki; możliwość jednoczesnego oznaczania kationów i anionów lub jonów nieorganicznych i organicznych; wysoka selektywność oznaczanych substancji w próbkach o złożonej matrycy.

76 Chromatografia gazowa DETEKTORY Detektory: Płomieniowo jonizacyjny Wychwytu elektronów Płomieniowo fotometryczny Termojonowy (TID) Fotojonizacyjny Cieplno przewodnościowy Spektrometrii mas FID ECD FPD NPD PID TCD MS, MS/MS, HRMS Detektor wychwytu elektronów ECD Detektor płomieniowo-jonizacyjny FID

77 Detektor foto-jonizacyjny PID Detektor cieplno-przewodnościowy Źródło jonu typu EI (Electron Ionization) ~70 Volt Pole elektryczne + Cząsteczki obojętne Filament e - + e - e - _ Kolektor elektronów Z kolumny _ elektrony Soczewka zbierająca jony Jony dodatnie + do analizatora Metody jonizacji: 1. Elektronami termicznymi Electron Ionisation EI 2. Chemiczna Chemical Ionisation CI 3. Chemiczna ujemna Negative Chemical Ionisation NCI 4. Jonizacja polem Field Ionisation FI 5. Desorpcja polem Field desorption FDI 6. Elektrohydrodynamiczna EHI 7. Termospray TSP 8. Elektrospray ESP 9. Jonosprej - ISP

78 Sektor kwadrupolowy detektora LRMS Sektor magnetyczny spektrometru HRMS Jon rezonansowy Jon nie rezonansowy Tor jonu rejestrowanego + _ Detektor Tor jonu nie rejestrowanego (jon za lekki) _ + S Źródło jonu Zasilanie DC/AC Źródło jonu N elektomagnes Detector Tor jonu nie rejestrowanego (jon zbyt ciężki)