Autoreferat. 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej

Transkrypt

1 1. Imię i nazwisko Magdalena Narajczyk Autoreferat 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej Tytuł magistra biologii Wydział Biologii, Geografii i Oceanologii, Uniwersytet Gdański, czerwiec 2002 r. Stopień doktora nauk biologicznych w zakresie biologii - Wydział Biologii, Geografii i Oceanologii, Uniwersytet Gdański, lipiec 2007 r. Tytuł rozprawy doktorskiej: Mechanizm jednokierunkowej i dwukierunkowej inicjacji replikacji DNA w rejonie oriλ. 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych asystent, Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii, Katedra Biologii Molekularnej adiunkt, Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii, Katedra Biologii Molekularnej chwila obecna adiunkt, Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii, Laboratorium Mikroskopii Elektronowej chwila obecna kierownik Laboratorium Mikroskopii Elektronowej, Wydział Biologii, Uniwersytet Gdański 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): a) tytuł osiągnięcia naukowego Użycie metod mikroskopii elektronowej w analizie biomarkerów lizosomalnych chorób spichrzeniowych z grupy mukopolisacharydoz b) (autor/autorzy, tytuł/tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa) [1] Malinova V., Węgrzyn G., Narajczyk M. (2011) The use of elevated doses of genistein-rich soy extract in the gene expression-targeted isoflavone therapy for Sanfilippo disease patients. Journal of Inherited Metabolic Disease Reports, 5: (IF 2011 = 3,577, MNiSW = 25)

2 [2] de Ruijter J., Valstar M.J., Narajczyk M., Węgrzyn G., Kulik W., Ijlst L., Wagemans T., van der Wal W.M., Wijburg F.A. (2012) Genistein in Sanfilippo disease: a randomized controlled cross-over trial. Annals of Neurology, 71: (IF 2011 = 11,089, MNiSW = 50) [3] Narajczyk M., Tylki-Szymańska A., Węgrzyn G. (2012) Changes in hair morphology as a biomarker in gene expression-targeted isoflavone therapy for Sanfilippo disease. Gene, 504: (IF 2011 = 2,341, MNiSW = 25) [4] Kloska A., Narajczyk M., Jakóbkiewicz-Banecka J., Grynkiewicz G., Szeja W., Gabig-Cimińska M., Węgrzyn G. (2012) Synthetic genistein derivatives as modulators of glycosaminoglycan storage. Journal of Translational Medicine, 10: 153 (IF 2011 = 3,47, MNiSW = 35) [5] Narajczyk M., Moskot M., Konieczna A. (2012) Quantitative estimation of lysosomal storage in mucopolysaccharidoses by electron microscopy studies. Acta Biochimica Polonica, 59: (IF 2011 = 1,491, MNiSW = 15) c) omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania Celem naukowym powyższych prac było oszacowanie skuteczności metod mikroskopii elektronowej w analizie biomarkerów w chorobach spichrzeniowych, zwłaszcza w mukopolisacharydozach. Lizosomalne choroby spichrzeniowe to grupa genetycznie uwarunkowanych chorób metabolicznych. Mutacja jednego z genów kodujących kwaśną hydrolazę powoduje defekt genetyczny, który objawia się zahamowaniem rozkładu związków organicznych, a w rezultacie ich kumulacją w komórce, prowadzącą do jej dysfunkcji. Pomimo dużej różnorodności w obrębie tychże chorób, można wyróżnić cechy wspólne. Są nimi wielonarządowe zmiany patologiczne, postępujący i ciężki przebieg choroby, a także przedwczesna śmierć. Mukopolisacharydozy (MPS) stanowią grupę lizosomalnych chorób spichrzeniowych. Wrodzone defekty metabolizmu glikozoaminoglikanów (GAG) powodują nagromadzenie się niezdegradowanych specyficznych związków organicznych. Glikozoaminoglikany są związkami występującymi w wielu tkankach organizmu ssaczego. Obecne są w przestrzeni pozakomórkowej oraz w połączeniu z błonami komórkowymi, uczestniczą w rozwoju łożyska, biorą udział w szlakach sygnałowych komórki, ograniczając zdolność

3 wiązania się fibroblastowego czynnika wzrostu do receptorów. Większość GAG występuje w postaci peptydoglikanów, kowalencyjnie związanych z odpowiednim białkiem. Degradacja glikozoaminoglikanów odbywa się w lizosomach przy udziale kilkunastu enzymów. Zaburzenie rozkładu GAG, które spowodowane jest brakiem lub obniżeniem aktywności jednego z enzymów, skutkuje nagromadzeniem się tego związku w lizosomach jak i przestrzeni międzykomórkowej. Następstwem tego procesu są zaburzenia w strukturze i funkcjonowaniu komórki prowadzące do jej zniszczenia, a w konsekwencji do charakterystycznych objawów klinicznych obejmujących wszystkie układy i narządy organizmu. Wyróżnia się jedenaście typów i podtypów mukopolisacharydoz, w zależności od brakującego enzymu w komórkach chorego. Ze względu na upośledzenie funkcji praktycznie wszystkich narządów i postępujący charakter choroby, średni czas życia wynosi kilkanaście lat. Ponadto w większości przypadków diagnoza stawiana jest dopiero w wieku kilku lat, gdyż mukopolisacharydozy ujawniają się klinicznie nieco później niż większość chorób o podłożu genetycznym. W związku z rozwojem nauki i technologii możliwe stało się wprowadzenie enzymatycznej terapii zastępczej dla MPS typu I, typu II i VI. Leczenie to polega na dożylnym podawaniu pacjentowi rekombinowanego enzymu ludzkiego, który transportowany jest do wnętrza komórek i lokalizowany w lizosomach. Takie uzupełnienie braku lub niedoboru enzymu pozwala na degradację zakumulowanych glikozoaminoglikanów, a w rezultacie poprawę kliniczną pacjentów. Niestety ze względu na barierę krew-mózg terapia ta jest nieefektywna w mukopolisacharydozach z zajętym centralnym układem nerwowym, między innymi dla MPS typu I (zespół Hurler) oraz typu III (zespół Sanfilippo). Potencjalnym sposobem leczenia tego typu schorzeń jest terapia oparta na redukcji syntezy substratu. Związkiem, który może zostać wykorzystany podczas takiej terapii jest genisteina (4,5,7- trihydroksy-3-fenylochromen-4-on) związek z grupy izoflawonów. Genisteina może pośrednio regulować ekspresję genów działając jako inhibitor aktywności kinazy tyrozynowej receptora EGF. Wcześniej wykazano, że dodanie genisteiny do hodowli fibroblastów obniża efektywność produkcji GAG. Dodatkowo stwierdzono iż ten izoflawon pośrednio hamuje syntezę GAG dzięki blokowaniu fosforylacji EGFR, co powoduje obniżenie wydajności ekspresji genów kodujących niektóre enzymy szlaku biosyntezy GAG. Ponadto dodanie genisteiny do hodowli fibroblastów pobranych od osób chorych na MPS powodowało zanikanie nieprawidłowych struktur wewnątrzkomórkowych. Co więcej ten izoflawon może przekraczać barierę krew-mózg, a jego stosowanie jest bezpieczne dla organizmu. Ze względu na wysokie koszty

4 enzymatycznej terapii zastępczej oraz wciąż ograniczonego dostępu tejże terapii dla wszystkich typów mukopolisacharydoz niezwykle istotne jest poszukiwanie innych metod leczenia MPS. Należy przy tym stwierdzić, że ze względu na różnorodność objawów chorobowych oraz zróżnicowany przebieg danego typu MPS u różnych pacjentów, precyzyjne określenie skuteczności testowanej metody terapeutycznej jest w przypadku tych chorób niezwykle trudne. Z drugiej strony, oszacowanie skuteczności danej metody leczenia poprzez zastosowanie analizy odpowiednich biomarkerów jest bardzo ważne, szczególnie biorąc pod uwagę niewielką liczbę pacjentów mogących uczestniczyć w badaniach. W związku z doniesieniami o pozytywnym działaniu genisteiny na organizm chorych na MPS, wraz z naukowcami z Holandii brałam udział w próbie klinicznej, badającej wpływ genisteiny na pacjentów z zespołem Sanfilippo (praca 2). Próba kliniczna z podwójnie ślepą próbą, kontrolą placebo oraz zamianą okresu podawania leku i placebo obejmowała 30 pacjentów, podzielonych na dwie 15 osobowe grupy, którym podawano doustnie przez okres 6 miesięcy zamiennie placebo albo genisteinę w stężeniu 10 mg/kg masy ciała/dzień. W trakcie trwania badania przeprowadziłam analizę struktury włosów z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej w trzech odstępach czasowych: przed rozpoczęciem podawania genisteiny, po 6 miesiącach badania oraz po 13 miesiącach od rozpoczęcia testu (po 6 miesiącach badania następował miesięczny okres, w którym pacjenci nie otrzymywali ani genisteiny ani placebo). W trakcie przeprowadzania analizy mikroskopowej próby były zakodowane, co pozwoliło mi na zachowanie obiektywności w trakcie wykonywania pomiarów. Pomimo przebadania znacznej ilości włosów, analiza statystyczna nie wykazała znaczącej różnicy pomiędzy próbą kontrolną a poddawaną leczeniu genisteiną. Możliwe jest jednak, że czas przyjmowania genisteiny był zbyt krótki lub też dawka 10 mg/kg masy ciała/dzień była zbyt niska aby można było zaobserwować znaczące efekty terapeutyczne. W trakcie trwania próby klinicznej w Holandii nawiązałam współpracę z dr Verą Malinovą z Uniwersytetu Karola w Pradze (Republika Czeska). W ramach tej współpracy wykonywałam analizę pobranych od pacjentów z mukopolisacharydozą typu III (zespół Sanfilippo) włosów z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej (praca 1). Pacjenci dr V. Malinowej przyjmowali na początku genisteinę w stężeniu 5 mg/ kg masy ciała/ dzień, jednakże mając na uwadze informacje uzyskane w trakcie badania u

5 pacjentów z Holandii, podnieśliśmy stężenie genisteiny do 15 mg/ kg masy ciała/ dzień. Próby pobierane były w całkowitym okresie od 16 do 22 miesięcy (u różnych pacjentów) w czasowych odstępach od 3 do 6 miesięcy. Zaobserwowałam znaczącą poprawę morfologii włosów obserwowanych w mikroskopie elektronowym po podwyższeniu stężenia genisteiny. Jednocześnie należy zaznaczyć, że przebadana grupa to zaledwie 6 pacjentów i należałoby przeprowadzić próbę z większą liczbą pacjentów. W związku z wyżej wymienionymi sugestiami wykonałam analizę mikroskopową włosów pobranych od 35 pacjentów, którzy przyjmowali genisteinę w stężeniu 5 oraz 15 mg/ kg masy ciała/ dzień przez okres 12 miesięcy (praca 3). Dzięki badaniom z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej wykazałam, że u 26 spośród 35 pacjentów nastąpiła poprawa morfologii włosów. U 8 pacjentów nie zauważyłam poprawy morfologii włosa, a jedynie u 1 pacjenta stan ten się pogorszył (zaobserwowałam pojawienie się niewielkich bruzd w strukturze włosa). Poprawa morfologii włosów nastąpiła u wszystkich pacjentów przyjmujących wyższe stężenie genisteiny. Badania te dowodzą o skuteczności zastosowania analizy mikroskopowej struktury włosów jako biomarkera w trakcie leczenia pacjentów z mukopolisacharydozą typu III. Podkreślić należy fakt iż jest to metoda całkowicie nieinwazyjna. Niezwykle zainteresowała mnie możliwość połączenia dwóch możliwości leczenia mukopolisacharydoz, a mianowicie enzymatycznej terapii zastępczej oraz terapii redukcji substratu. Połączenie obu tych terapii umożliwiłoby zmniejszenie kosztów leczenia pacjentów, a także z racji właściwości genisteiny, zmniejszenie neurodegeneracji. Ze względu na wczesny etap doświadczeń, zdecydowałam się przeprowadzić analizę mikroskopową z wykorzystaniem linii komórkowych wyhodowanych z fibroblastów pobranych od pacjentów z mukopolisacharydozą typu I (praca 5). Do moich badań zastosowałam linię komórkową pacjenta z MPS I z uwagi na dostępność i stosowanie w tej chorobie enzymatycznej terapii zastępczej - enzymu α- L- iduronidazy. Założyłam obniżenie stężenia enzymu do 50% (w stosunku do aktualnie stosowanej dawki w terapii) oraz dodanie genisteiny w stężeniu 30 μm. Jako kontrolę zastosowałam hodowane jedynie w pożywce (DMEM) fibroblasty ludzkie (HDFa) oraz komórki MPS I. Dzięki technikom transmisyjnej mikroskopii elektronowej, w komórkach poddanych łączonemu działaniu genisteiny i enzymu zaobserwowałam prawie czterokrotnie mniejsze ilości glikozoaminoglikanów w stosunku do kontrolnych komórek MPS

6 typu I, oraz jedynie dwukrotnie większe ilości GAG w stosunku do komórek MPS typu I traktowanych stężeniem enzymu odpowiadającymi aktualnie stosowanej w terapii dawce. Eksperymenty te wykazały, że zastosowanie obu terapii jednocześnie wydaje się być kolejnym krokiem w możliwościach leczenia MPS. Ponadto doświadczenia mikroskopii elektronowej dowodzą słuszności stosowania tych metod na równi z badaniami biochemicznymi w oszacowaniu zmian w komórce pacjenta. Z uwagi na możliwości terapeutyczne genisteiny zaciekawiła mnie ewentualność zastosowania syntetycznych pochodnych tego izoflawonu (praca 4). Przeprowadziłam analizę mikroskopową komórek pobranych od pacjentów z MPS typu III, podtyp A oraz B, traktowanych siedmioma pochodnymi. W ultrastrukturze komórek zauważyłam znaczące obniżenie ilości glikozoaminoglikanów w stosunku do zastosowanej kontroli. Badanie mikroskopowe pokazało zmiany w morfologii komórek, obniżenie ilości pojedynczych lamellarnych struktur lizosomalnych, jak również wielu struktur otoczonych wspólną błoną. Przeprowadzona analiza statystyczna wykazała istotne różnice w przypadku większości użytych pochodnych. Doświadczenia te pokazują możliwości zamiany genisteiny na inny syntetyczny izoflawon. Podsumowując, moje osiągnięcie naukowe, przedstawione w postępowaniu habilitacyjnym, polega w głównej mierze na stwierdzeniu, że: analiza włosów z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej może być wykorzystywana jako nieinwazyjna metoda monitorowania skuteczności terapii w leczeniu MPS; analiza ultrastruktury komórek z wykorzystaniem transmisyjnej mikroskopii elektronowej może być stosowana jako biomarker na równi z badaniami biochemicznymi w przypadku MPS; obniżenie ilości GAG w komórkach traktowanych enzymem oraz genisteiną sugeruje możliwość połączenia obu terapii w leczeniu MPS; obniżenie ilości GAG w komórkach traktowanych syntetycznymi pochodnymi genisteiny umożliwia ich dalsze zastosowanie w leczeniu MPS. 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych Studia magisterskie rozpoczęłam w Instytucie Biologii na Wydziale Biologii, Geografii i Oceanologii Uniwersytetu Gdańskiego w 1997 roku.

7 Badania stanowiące moją pracę magisterską wykonywałam w Katedrze Biologii Molekularnej pod kierunkiem dr Sylwii Barańskiej i prof. dr hab. Grzegorza Węgrzyna. Wówczas to zainteresowałam się replikacją DNA, a zwłaszcza kierunkowością tego procesu. Do moich badań wykorzystałam naturalny plazmid pigrk-1 wyizolowany z klinicznego szczepu Klebsiella pneumoniae. Eksperymenty umożliwiające poznanie kierunku replikacji DNA, które zastosowałam to dwukierunkowa elektroforeza agarozowa DNA oraz techniki mikroskopii elektronowej. Dzięki tym badaniom wyznaczyłam drugie miejsce startu replikacji DNA (tzw. miejsce origin) plazmidu pigrk-1 oraz określiłam kierunek ruchu widełek replikacyjnych. Wyniki tych badań stanowiły podstawę mojej pracy magisterskiej, którą obroniłam w czerwcu 2002 roku. Po ukończeniu studiów, w latach byłam słuchaczem Środowiskowego Studium Doktoranckiego z Biologii i Oceanologii Uniwersytetu Gdańskiego. Nadal kontynuowałam prace związane z replikacją DNA oraz jej kierunkowością. Powszechnie uznawany model przejścia od replikacji θ do replikacji σ zakłada, że replikacja σ jest poprzedzona jedną rundą jednokierunkowej replikacji θ zainicjowanej w oriλ. Dlatego też moje zainteresowania skupiły się na czynnikach, które mogły potencjalnie uczestniczyć w regulacji zmiany typu replikacji DNA podczas rozwoju litycznego bakteriofaga λ. Efektem tych badań były prace z punktu IIA-1,2 (załącznik 3). Dzięki metodom dwukierunkowej elektroforezy agarozowej DNA oraz przesunięcia gęstościowego wykazałam, że proteaza ClpPX nie ma wpływu na zmianę modelu replikacji, jak było wcześniej zakładane przez zespół prof. Macieja Żylicza. Wyniki te potwierdziłam również wykorzystując techniki mikroskopii elektronowej (praca IIA-1). Pokazałam także, że bakteryjne białko SeqA ma wpływ na zmianę modelu replikacji (praca IIA-2). Ponadto wykazałam, że białko to bierze udział w regulacji replikacji DNA plazmidów pochodzących od faga λ poprzez kontrolę stabilności dziedziczonego kompleksu replikacyjnego. Badania te wykonywałam używając szczepów ΔrelA i prowadząc hodowlę w warunkach głodu aminokwasowego. Dzięki eksperymentom określającym stabilność białka λo wykazałam również, że białko SeqA ma wpływ na formowanie w komórkach E. coli stabilnego kompleksu replikacyjnego faga λ. Powyższe wyniki weszły w skład mojej pracy doktorskiej, którą wykonywałam pod opieką prof. dr hab. Grzegorza Węgrzyna. Pracę pt. Mechanizm jednokierunkowej i dwukierunkowej inicjacji replikacji DNA w rejonie oriλ obroniłam w lipcu 2007 roku. Ze względu na moje zainteresowania i znajomości technik mikroskopii elektronowej w maju 2007 roku zostałam zatrudniona w Pracowni Mikroskopii Elektronowej Katedry Biologii Molekularnej Uniwersytetu Gdańskiego.

8 Po obronie pracy doktorskiej moje zainteresowania naukowe skupiły się wokół lizosomalnych chorób spichrzeniowych, a zwłaszcza mukopolisacharydoz (MPS). Oprócz prac wymienionych w pierwszej części autoreferatu zajęłam się również analizą ultrastruktury komórek fibroblastów pobranych od pacjentów z MPS typu III traktowanych flawonoidami (genisteiną, daidzeiną, kempferolem i innymi) (prace IIA- 3,7). Dzięki badaniom mikroskopii elektronowej zobrazowałam i potwierdziłam wyniki otrzymane w trakcie badań biochemicznych. Zaobserwowałam znaczący spadek ilości glikozoaminoglikanów (GAG) w komórkach traktowanych genisteiną w stosunku do doświadczeń kontrolnych. Ponadto analiza mikroskopowa potwierdziła, że genisteina hamuje syntezę GAG dzięki blokowaniu fosforylacji EGFR (praca IIA-3). Dane te stanowiły podstawę do moich dalszych badań z wykorzystaniem genisteiny jako potencjalnego leku w MPS. W kolejnych badaniach przeprowadziłam analizę mikroskopową komórek traktowanych innymi flawonoidami: naringeniną, daidzeiną, kempferolem, apigeniną (praca IIA-7). W ultrastrukturze badanych komórek zaobserwowałam znaczące zmiany morfologiczne, zwłaszcza w przypadku komórek traktowanych daidzeiną i kempferolem. Doświadczenia te mogą zostać wykorzystane do dalszych eksperymentów, a badane flawonoidy stanowić kolejny czynnik leczniczy w terapii redukcji substratu. Analogiczne doświadczenia przeprowadziłam podczas badań, których wyniki zostały opublikowane w pracy z punktu IIA-10, gdzie analizowałam komórki MPS typu I oraz typu III, które były inkubowane jednocześnie z dwoma specyficznymi sirna w celu inhibicji ekspresji genów odpowiedzialnych za syntezę glikozoaminoglikanów. Zastosowanie takiej procedury było zaproponowane jako jedna z potencjalnych możliwości terapeutycznych. Jednakże chociaż badanie mikroskopowe wykazało zmniejszenie ilości glikozoaminoglikanów w komórkach, nie były to zmiany statystycznie istotne. Brałam także udział we współredagowaniu prac dotyczących potencjalnych możliwości leczenia MPS w oparciu o terapię redukcji substratu z wykorzystaniem genisteiny (prace IIA-5,6,8). Dodatkowo wciąż zajmuję się badaniem morfologii bakteriofagów izolowanych z różnych środowisk. Analiza budowy badanych bakteriofagów została przedstawiona w pracach IIA-4,9. Ze względu na znajomość licznych technik mikroskopii elektronowej zarówno transmisyjnej jak i skaningowej dwa lata temu została mi powierzona funkcja kierownika Laboratorium Mikroskopii Elektronowej, samodzielnej jednostki Wydziału Biologii Uniwersytetu Gdańskiego. W najbliższej przyszłości zamierzam zbadać wpływ łączonej terapii enzymatycznej oraz redukcji substratu na kumulację

9

10 1. Name and surname Magdalena Narajczyk Autoreferat 2. Diplomas, degrees with the name, place and year of acquisition and the title of doctoral dissertation Master of Science Faculty of Biology, Geography, Oceanology, University of Gdańsk, June 2002 The degree of doctor of biological sciences in the field of biology - Faculty of Biology, Geography, Oceanology, University of Gdańsk, July Title of PhD thesis: The mechanism of unidirectional and bidirectional initiation of DNA replication at the oriλ region. 3. Academic carrieer assistant, University of Gdańsk, Faculty of Biology, Department of Molecular Biology lecturer, University of Gdańsk, Faculty of Biology, Department of Molecular Biology now lecturer, University of Gdańsk, Faculty of Biology, Laboratory of Electron Microscopy now headmaster of Laboratory of Electron Microscopy, Faculty of Biology, University of Gdańsk 4. Indication of achievement under art. 16 paragraph 2 of the act of 14 March 2003 on academic degrees and titles and art degrees and titles: a) title of scientific achievement Electron microscopy methods used in biomarker analysis of mucopolysaccharidoses a group of lysosomal storage disorders b) (autor/autors, title/titles of publications, year, name of publishers) [1] Malinova V., Węgrzyn G., Narajczyk M. (2011) The use of elevated doses of genistein-rich soy extract in the gene expression-targeted isoflavone therapy for Sanfilippo disease patients. Journal of Inherited Metabolic Disease Reports, 5: (IF 2011 = 3,577, MS&HE = 25)

11 [2] de Ruijter J., Valstar M.J., Narajczyk M., Węgrzyn G., Kulik W., Ijlst L., Wagemans T., van der Wal W.M., Wijburg F.A. (2012) Genistein in Sanfilippo disease: a randomized controlled cross-over trial. Annals of Neurology, 71: (IF 2011 = 11,089, MS&HE = 50) [3] Narajczyk M., Tylki-Szymańska A., Węgrzyn G. (2012) Changes in hair morphology as a biomarker in gene expression-targeted isoflavone therapy for Sanfilippo disease. Gene, 504: (IF 2011 = 2,341, MS&HE = 25) [4] Kloska A., Narajczyk M., Jakóbkiewicz-Banecka J., Grynkiewicz G., Szeja W., Gabig-Cimińska M., Węgrzyn G. (2012) Synthetic genistein derivatives as modulators of glycosaminoglycan storage. Journal of Translational Medicine, 10: 153 (IF 2011 = 3,47, MS&HE = 35) [5] Narajczyk M., Moskot M., Konieczna A. (2012) Quantitative estimation of lysosomal storage in mucopolysaccharidoses by electron microscopy studies. Acta Biochimica Polonica, 59: (IF 2011 = 1,491, MS&HE = 15) c) Discussion of research aims of above mentioned publications and achieved results with discussion on their possible use Scientific objective of these publications was to estimate the effectiveness of electron microscopy methods in biomarker analysis of storage diseases, especially in mucopolysaccharidoses. Lysosomal storage disorders are the group of genetically - determined metabolic diseases. Mutation in one of genes coding acid hydrolase leads to a genetic defect, which revealed in inhibition of decomposition of organic compounds. Results of their accumulation in cells lead to dysfunction of cells. Despite wide variety of these disorders, there are features in common. There are multi-organ pathological change, progressive and serve disease, and also premature death. Mucopolysaccharidoses (MPS) are rare lysosomal storage disorders. Inherited defects of glycosaminoglycans (GAG) metabolism cause accumulation of undegraded specific organic compounds. Glycosaminoglycans are compounds, which occur in many tissues of mammalian organism. They are present in extracellular space and combined with cell membrane, they are involved in development of the placenta, participate in cell signaling pathways, limit the ability of fibroblast grow factor to bind to receptors. Most of GAGs occur as peptidoglycan, covalently bind with proper protein. Degradation of

12 glycosaminoglycans proceeds in lysosomes, which is mediated by specific enzymes. Deficiency or lack in an activity of one of enzymes leads to accumulation of GAGs in lysosomes as well as outside of cells. This process leads to disorder in the structure and functioning of cells and consequently to characteristic clinical symptoms. There are eleven types and subtypes of mucopolysaccharidoses, according to deficiency of enzyme in patients cells. Due to impairment in function of most of organs and progressive character of this disease, the average life span is only several years. Moreover, in most cases diagnosis is made in age of few years, because mucopolysaccharidoses reveal a bit later than most genetic diseases. Since the development of science and technology, enzyme replacement therapy can be used in treatment of MPS type I, type II and VI. This treatment is based on intravenous administration of human recombinant enzyme to the patient, which is then transported into cells and localized in lysosomes. Such an addition of enzyme, results in degradation of accumulated glycosaminoglycans, and in result clinical improvement of patients. Unfortunately, due to the blood-brain barrier this therapy in ineffective in mucopolysaccharidoses with affected central nervous system, for example for MPS type I (Hurler disease) and type III (Sanfilippo disease). Substrate reduction therapy is one of the alternative methods for MPS treatment. A compound which could be used in such therapy is genistein (4,5,7-trihydroxy-3-fenylochromen-4-on) compound from a group of isoflavones. Genistein can indirectly regulate the expression of genes acting as an inhibitor of activity of EGF receptor kinase. It was shown previously that genistein added to fibroblast cell culture decreases efficiency of GAG production. Additionally, this isoflavone indirectly inhibits GAG synthesis by blocking EGFR phosphorylation, which causes a decrease in gene expression of GAG biosynthesis enzymes. Adding genistein to MPS fibroblast cell culture resulted in disappearance of abnormal intracellular structures. Moreover, this isoflavone can cross the blood-brain barrier, and what is important, genistein is safe to use. Due to high costs of enzyme replacement therapy and limited availability of treatment for all types of mucopolysaccharidoses, it is very important to find other treatments for MPS. Due to variety of symptoms and different progress of illness in MPS patients, precise determine the effectiveness of therapeutic method is very difficult. On the other hand, estimation the effectiveness of treatment due to analysis of proper biomarkers is very important, especially considering small group of patients involved in the study. Due to reports of positive effect of genistein on MPS patients, I participated in the clinical trial with scientists from the Netherlands. In this trial, we studied the influence of genistein on Sanfilippo patients

13 (publication 2). Randomize, crossover, double blinded, placebo-controlled clinical trial with 30 patients - divided on two groups, each consisting of 15, was performed. Patients were treated with first genistein (10 mg/kg/day) and then placebo, and vice versa. During the study, I analysed hair morphology by scanning electron microscopy in three periods of time: at the beginning of the trial, after 6 months and 13 months of trial (after 6 months of trial it was 1 month of washout, with neither genistein nor placebo given to patients). During the microscopic analysis, probes were blinded, which allowed me to maintain objectivity. Despite the significant amount of hair, statistical analysis did not show any significant differences between control and genistein groups of patients. It is possible that time of genistein administration was too short or the dose of 10 mg/kg/day was too low to observe significant therapeutical effects. During the clinical trial in the Netherlands I have started cooperation with Dr Vera Malinova from Charles University in Praha (Czech Republic). In this cooperation, I analysed, with the use of scanning electron microscopy, hair morphology from MPS type III patients (Sanfilippo disease) (publication 1). At the beginning of our cooperation, Dr Malinova s patients had taken genistein at concentration of 5 mg/kg/day, however, considering information obtained during the trial with patients from the Netherlands, we have increased the dose of genistein to 15 mg/kg/day. Hair samples were taken in total periods of months (in different patients) in intervals between 3 to 6 months. I have observed a significant improvement in hair morphology analysed in electron microscopy after increasing genistein concentration. Nevertheless, it should be noted that only 6 patients were examined, and studies with larger number of patients are desirable. Considering suggestions mentioned above, I performed microscopy analysis of hair taken from 35 patients, which were treated with genistein at the dose of 5 and 15 mg/kg/day for 12 months (publication 3). Through studies using scanning electron microscopy, I indicated that improvement of hair morphology was noted in 26 out of 35 patients. I did not observe any changes in hair morphology in 8 patients and I noticed worsening only in 1 patient (I spotted slight abnormal changes in the hair structure). I observed improvement in hair morphology in all patients for which the dose of genistein was higher. These studies demonstrated the effectiveness of microscopy analysis of hair morphology as a biomarker during treatment of MPS type III patients. It is very important, because this assay has a non-invasive character. I was interested in possibility of combining two mucopolysaccharidose treatment, namely enzyme replacement therapy and substrate reduction therapy. Combination of these two therapies allows reducing the cost of treatment, and also due to properties of

14 genistein, neurodegeneration decrease. Due to the early stage of genistein, I decided to perform microscopy analysis with fibroblast cell culture from MPS type I patient (publication 5). For my research I used MPS type I cell culture because of the availability enzyme replacement therapy in this disease enzyme α-l-iduronidase. I reduced enzyme concentration to 50% (relative to current dose in the therapy) and added genistein at the dose of 30 µm. As a control, I used human dermal fibroblast adult line (HDFa) and MPS type I cells cultivated only in the medium (DMEM). Through transmission electron microscopy techniques, in cells with combination of treatment (genistein and enzyme), I observed almost four times reduction in the level of glycosaminoglycans relative to MPS type I cells control, and two times decrease in the level of GAG relative to MPS type I cells treated with the enzyme at concentration corresponding to current dose in the therapy. These experiments showed that the use of both therapies at the same time should be next step in MPS treatment. Moreover electron microscopy experiments prove the validity of these methods with biochemical research in estimation of changes in patient cells. Due to therapeutic possibilities of genistein, I was curious of properties of synthetic derivatives of this isoflavone (publication 4). I analysed, by using transmission microscope, cells from MPS type III patients, subtype A and B, treated with seven different genisteinderivatives. In ultrastructure of cells, I noticed significant decrease of glycosaminoglycans level relative to control. Microscopic examination showed changes in cells morphology, decrease of single lamellar lysosomal structures, as well as other complex lysosmal structures. Statistical analysis showed significant differences in most of the derivatives. These experiments demonstrated the possibility to use other synthetic derivatives of genistein in MPS treatment. In summary, my scientific achievement, showed in this habilitation, consist of following discoveries: hair morphology analysis with scanning electron microscopy could be used as a non-invasive method for monitoring of treatment for MPS; cell ultrastructure analysis with transmission electron microscopy might be used as a biomarker equally with biochemical methods in mucopolysaccharidoses; GAG level decrease in cells treated with enzyme and genistein suggests the possibility to combine both of treatments in MPS; GAG level decrease in cells treated with synthetic derivatives of genistein might have further use in MPS therapy.

15 5. Discussion of other scientific and research achievements I started my Master s degree studies in Institution of Biology of Faculty of Biology, Geography and Oceanology at University of Gdańsk in I performed research for my thesis at Department of Molecular Biology, and tutors of my work were Dr Sylwia Barańska and Prof. Grzegorz Węgrzyn. Then, I became interested in DNA replication, especially in directionality of this process. For my analyses, I used natural plasmid pigrk-1, which was isolated from clinical strain of Klebsiella pneumoniae. Experiments allowed determination of directionality of DNA replication, which I used, was DNA two dimensional agarose gel electrophoresis and electron microscopy techniques. According to these experiments, I showed second origin site for DNA replication of pigrk- 1 plasmid and I determined directionality of replication forks. These results were the basis of my thesis, which I defended in June After graduation, between , I became a PhD student at Environmental Doctoral Studies in Biology and Oceanology at University of Gdańsk. I still continued researches in DNA replication and its directionality. Generally known model assumes that initiation of the σ mode of bacteriophage λ DNA replication is preceded by one round of unidirectional θ replication initiated at oriλ. That is why my interests focused on factors, which potentially could be involved in regulations of DNA replication during the lytic cycle. The results of this research were included in publications from point IIA-1, 2 (appendix 3). According to 2D agarose gel electrophoresis of λ DNA and density shift experiments, I showed that ClpPX protease does not influence the replication mode of λ DNA, as was proposed by Prof. Żylicz. Using electron microscopy techniques I confirmed my results (publication IIA- 1). I also showed, that SeqA protein influences the replication mode of λ DNA (publication IIA-2). I proved that SeqA protein is involved in the stability of heritable λ replication complex. Experiments were performed using ΔrelA strains and in amino acid-starved bacteria. I estimated the stability of the λo protein and showed that the SeqA protein influences stability and function of the heritable complex. Above results were included in my dissertation Mechanism of unidirectional and bidirectional initiation of DNA replication at oriλ, which I performed under supervision of Prof. Grzegorz Węgrzyn. I received my Ph.D. degree in July Due to my interests and knowledge in electron microscopy techniques, I was hired in Laboratory of Electron Microscopy, Department of Molecular Biology at University of Gdańsk in May 2007.

16 dr Magdalena Narajczyk załącznik/appendix 2