Organizmy modelowe - drożdże. Saccharomyces cerevisiae i nie tylko

Transkrypt

1 Organizmy modelowe - drożdże Saccharomyces cerevisiae i nie tylko

2 Co można badać na drożdżach? } Praktycznie wszystkie podstawowe aspekty biologii molekularnej, biologii komórki, genetyki 2

3 Transdukcja sygnału

4 To czego nie można badać na drożdżach } Różnicowanie i rozwój } Neurobiologia } Regulacja przez małe niekodujące RNA (sirna, mirna) } Alternatywny splicing 4

5 Drożdże i cykl komórkowy Nobel dla drożdży 5

6 Drożdże i cykl komórkowy Nobel

7 Cykl komórkowy 7

8 Mutanty cdc S. cerevisiae } Cykl komórkowy podobny do wyższych Eukaryota } Fazy G1, S, G2, M i wrzeciono podziałowe } Lee Hartwell zastosowanie genetyki drożdży do badania cyklu komórkowego ( ) } Mutanty temperaturowrażliwe (ts), analizowane za pomocą mikroskopii (zdjęcia poklatkowe) } populacja zatrzymuje się w tej fazie, której dotyka mutacja } stwierdzenie, której fazy cyklu dotyczy defekt w mutancie 8

9 Mutanty cdc S. cerevisiae 9

10 Mutanty wee i cdc u S. pombe } Podziały komórki skoordynowane z wzrostem komórek } Mutant wee komórki zaczynają się dzielić, kiedy są jeszcze małe zaburzona kontrola startu cyklu 10

11 Regulacja cyklu } wee1 inhibitor cyklu; } cdc25, cdc2 aktywatory } mutant typu wee dominujący (konstytutywna aktywność) } utrata funkcji duże komórki 11

12 Regulacja cyklu komórkowego 12

13 Od drożdży do człowieka } mutację cdc2 S. pombe można odwrócić wprowadzając na plazmidzie ludzki gen CDK1 (Cyclin Dependent Kinase) 13

14 Drożdże i transkrypcja Kolejny Nobel dla drożdży 14

15 Drożdże i transkrypcja 15

16 Drożdże i transkrypcja 16

17 Drożdże i transkrypcja 17

18 Drożdże i transkrypcja Łatwość hodowli przydatne w projektach oczyszczania i krystalizacji białek 18

19 19 Drożdże i mitochondria

20 Profil metaboliczny S. cerevisiae } Fakultatywne aeroby } Efekt Pasteura tlen hamuje fermentację, ale } Efekt Crabtree w obecności glukozy (C 6 ) fermentacja anaerobowa nawet w obecności tlenu } Glukoza hamuje oddychanie } Etanol jest następnie wykorzystywany (jeżeli nadal jest tlen) } Strategia akumulacja i konsumpcja 20

21 S. cerevisiae i mitochondria co szczególnego? } Przeżywa bez funkcji oddechowej (fakultatywny tlenowiec, fermentacja) } Mutanty z defektywnym oddychanie, petite (lata 1960.) } Przeżywa bez genomu mitochondrialnego ( petite positive ) glukoza (fermentacja) glicerol (oddychanie) 21

22 Fenotyp petite u S. cerevisiae } Zmiany w mtdna } ρ 0 całkowita utrata mtdna } ρ - częściowa utrata mtdna, znaczne delecje i reamplifikacja } mit - - mutacje punktowe, prawidłowa struktura genomu } Zmiany w ndna mutanty pet 22

23 Oddziaływania jądrowo mitochondrialne nucleus mitochondrion Unidirectional gene transfer and adaptation Development of evolutionary novelties Gene loss as a result of redundancy with the nuclear genome or functional substitution } Proteom mitochondrium ~ białek } 8-9 kodowane w mtdna } Ponad 150 genów jądrowych niezbędnych do utrzymania mitochondrialnego systemu genetycznego 23

24 Ekspresja genomu mitochondrialnego S. cerevisiae Inner membrane Matrix III IV V Cox1 Cox2 Cox3 Atp6 Atp8 Atp9 RNA polymerase Cob Rpo4 1 Mtf1 24 trnas Translation mtdna Transcription 21S rrna Cob, Cox1, Cox2, Cox3, Atp6, Atp8, Atp9, Var1 LSU SSU Translation 15S rrna Var1 24 9S RNA + Rpm2 RNase P Mitochondrial ribosome Slide by Bartosz Zapisek, 2011.

25 Problem analiz wysokoprzepustowych Geny pet (niezbędne do oddychania) Merz & Westermann,

26 Nie tylko S. cerevisiae } S. cerevisiae był od dziesiątków lat standardowym modelem genetyki mitochondrialnej } metabolizm fakultatywnie aerobowy } przeżywa bez mtdna (petite positive) } Pod wieloma względami jest nietypowy } przeżywa bez mtdna (petite positive) } nietypowa organizacja, ekspresja i replikacja mtdna } brak genów kompleksu I (dehydrogenaza NADH) w mtdna } genom po epizodzie duplikacji całego genomu (WGD) i utracie redundantnych paralogów 26

27 27 Drożdże jako model dla genetyki człowieka

28 Genomy S. cerevisiae H. sapiens ~1,2 x 10 7 bp ~3 x 10 9 bp ~6500 genów ~ genów ~1800 genów wykazuje homologie z genami H. sapiens (30%) ~ 4000 genów wykazuje homologie z genami S. cerevisiae (13%) Wiele podstawowych funkcji komórki jest zachowanych. Niekiedy możliwa wymienność białek drożdżowych i ludzkich (np. Ras, Oxa1) 28

29 Przykładowe drożdżowe modele chorób } Progerie Wernera i Blooma } Choroby związane z defektami naprawy DNA (HNPCC, ataksja-telangiektazja) } Ataksja Friedreicha } Zaburzenia komunikacji jądrowo - mitochondrialnej (PEO) } Choroby wywołane mutacjami w mtdna (NARP) } Poszukiwanie leków za pomocą drożdży 29

30 Zespół Wernera Przyczyna: mutacje genu WRN kodującego helikazę DNA z rodziny RecQ } } } Normalny rozwój w dzieciństwie. Przedwczesne starzenie rozpoczyna się wraz z wiekiem dojrzewania. Niski wzrost, owrzodzenia, zwapnienia, siwienie włosów. } Pacjenci dożywają średnio 47 lat. } Przyczyną śmierci z reguły choroba nowotworowa, albo schorzenia sercowonaczyniowe. 30

31 Zespół Blooma } } } Opóźniony wzrost, karłowatość. Zaburzenia pigmentacji skóry. Predyspozycje do wczesnego (ok. 25 r. ż.) występowania wielu różnych nowotworów. } Z reguły nie dożywają lat (1/3 nie dożywa 25 lat). Przyczyna: mutacje genu BLM kodującego kolejną helikazę DNA z rodziny RecQ 31

32 Zaburzenia w zespołach Wernera i Blooma } Utrata stabilności genomu } Zaburzenia w okolicach telomerów (WRN) } Zwiększona częstość wymiany chromatyd siostrzanych (BLM) } Zwiększona częstość zaburzeń kariotypowych } Zwiększona częstość mutacji genów 32

33 SGS1 model drożdżowy } Gen SGS1 jest drożdżowym homologiem genów WRN i BLM. } Fenotyp delecji SGS1: } } } zwiększona rekombinacja mitotyczna (zwłaszcza subtelomerowa) zaburzenia segregacji chromosomów zaburzenia mejozy } Białko Sgs1p jest zaangażowane w hamowanie nieuprawnionej rekombinacji i utrzymywanie stabilności genomu. } Ludzkie geny BLM i WRN częściowo komplementują fenotyp delecji SGS1 33

34 HNPCC (zespół Lyncha) } HNPCC - dziedziczny rak jelita grubego niezwiązany z polipowatością } Około 5% wszystkich raków jelita grubego } Mutacje w genach kodujących białka zaangażowane w naprawę niedopasowanych nukleotydów (mismatch repair) } Podwyższona częstość mutacji, zwłaszcza niestabilność traktów z powtórzeniami } Najczęściej mutacje genów hmsh2 i hmlh1 34

35 Drożdżowy model HNPCC W mutantach drożdżowych wzrost spontanicznej mutagenezy Alfred & Borts (2007) Biochem Soc Trans, 35: Dla dokładniejszego zbadania efektu konkretnych mutacji ludzkich stworzono hybrydowe geny, w których fragmenty genu S. cerevisiae zastępuje się pochodzącymi z genów człowieka tak, by zachować funkcję w drożdżach (tzw. humanizowanie drożdży). 35

36 Ataksja Friedreicha } Choroba układu nerwowego i mięśni } } } zaburzenia czucia obniżone napięcie mięśniowe kardiomiopatia, deformacje kręgosłupa i stóp } Autosomalna recesywna; 1/ } Mutacja dynamiczna w genie frataksyny } Akumulacja żelaza w mitochondriach: } } } Zaburzenia systemów naprawczych mtdna Zaburzenia w oddychaniu Stres oksydacyjny 36 Bramwell: Atlas of Clinical Medicine

37 YFH1 drożdżowy homolog frataksyny } Białko wiążące żelazo } Mitochondrialny magazyn żelaza } Detoksykacja nadmiaru żelaza } Włączanie żelaza do centrów Fe-S 37

38 YFH1 drożdżowy homolog frataksyny } Fenotyp delecji: } defekt oddychania mitochondrialnego } zwiększona wrażliwość na stres oksydacyjny } akumulacja żelaza w mitochondriach: 10-krotnie większe stężenie od szczepu dzikiego } zależna od żelaza oksydacyjna degradacja centrów Fe-S } Ludzki gen kompensuje delecję genu drożdżowego 38 Cavadini i wsp., (2000), Hum Mol Genet, 9:

39 Zaburzenia komunikacji jądrowomitochondrialnej } Mutacje w genach kodujących białka odpowiedzialne za utrzymanie mtdna } ANT1 (transporter ADP/ATP) } POLG (polimeraza DNA) } Choroby dziedziczone autosomalnie, objawiają się delecjami w mtdna lub deplecją mtdna 39

40 PEO } PEO -postępująca zewnętrzna oftalmoplegia (porażenie mięśni gałki ocznej) } Postać dominująca (adpeo) lub recesywna (arpeo) } Objawy } opadanie powiek (ptosis), } niezdolność do poruszania gałkami oczu, } ogólne osłabienie mięśni, } zaburzenia neurologiczne, 40

41 Mutacje i modele drożdżowe } POLG (mitochondrialna polimeraza DNA) } drożdżowy homolog MIP1 } ANT1 (mitochondrialny transporter ATP/ADP } drożdżowy homolog AAC2 41

42 h"p://tools.niehs.nih.gov/polg

43 Homologia POLG i MIP1 } Mutacje w MIP1 powodują niestabilność genomu mitochondrialnego } } } spontaniczne delecje mutacje punktowe całkowita utrata mitochondrialnego DNA 43

44 Choroby wywołane mutacjami w mtdna } Np. NARP Neurogenic Ataxia Retinitis Pigmentosa } Mutacja w genie ATP6 } W komórkach 70-90% zmutowanego DNA } Obniżona aktywność syntezy ATP 44

45 Drożdżowe modele chorób mitochondrialnych S. cerevisiae jedyny organizm modelowy, u którego można wprowadzać DNA do mitochondriów ukierunkowana mutageneza mtdna 45 Rak, M. et al. J. Biol. Chem. 2007;282:

46 46 Długowieczność i starzenie

47 Długowieczność drożdży } Zastosowanie drożdży S. cerevisiae jako modelu zjawisk związanych ze starzeniem proponowano od lat 60. (Mortimer & Johnson) } Dwa mechanizmy } starzenie replikatywne limit podziałów komórki-matki (~30) } starzenie chronologiczne przeżywalność w fazie spoczynkowej hodowli (wyczerpane źródła energii) 47

48 Mechanizmy kontrolujące długowieczność mogą być konserwowane w ewolucji 48

49 Drożdże i biologia systemów Drożdże w XXI wieku 49

50 Poszukiwanie interakcji genetycznych } Oddziaływania łagodzące (np. supresja) } selekcja bezpośrednia } Oddziaływania syntetyczne } syntetyczna letalność: } pojedyncze mutacje gen1 i gen2 nie są letalne, ale podwójny mutant gen1, gen2 nie przeżywa } syntetyczne wzmocnienie } pojedyncze mutacje gen1 i gen2 słaby fenotyp, podwójny mutant gen1, gen2 silny fenotyp (np. spowolnienie wzrostu) 50

51 Ujęcie ilościowe Dixon et al. 2009, Annu Rev Genet 43:

52 SGA } } } } } Synthetic Gene Array Kolekcja delecji, krzyżowana z badanym genem Sporulacja, Selekcja haploidów MATa Selekcja pojedynczych i podwójnych mutantów 52 Boone et al. Nature Reviews Genetics, 2007 vol. 8 (6) pp. 437

53 SGA 53

54 dslam Diploid-based synthetic lethality analysis with microarrays (dslam) 54

55 Wyniki sieci interakcji genetycznych 55

56 56 Costanzo i wsp., (2010) Science 327, 425

57 57 Ewolucja eksperymentalna

58 Ewolucja eksperymentalna } Możliwość prowadzenia wielu hodowli równolegle przez wiele pokoleń 58

59 Ewolucja wielokomórkowości } Selekcja w hodowlach S. cerevisiae w kierunku szybkiego opadania osadu } Pojawiają się grupy komórek ( płatki śniegu ) 59

60 Ewolucja wielokomórkowości wyjściowe - jednokomórkowe po 14 pokoleniach selekcji po 60 pokoleniach selekcji 60

61 Ewolucja specjalizacji } Pod koniec w zgrupowaniach pojawił się podział funkcji niektóre komórki inicjują programowaną śmierć by ułatwić podział grupy przez fragmentację Evolution of programmed cell death in snow!ake yeast 61

62 Podział kolonii

63 Podział kolonii