BIOLOGIA OSADU CZYNNEGO biotechnologia środowiska Analiza mikroskopowa osadu czynnego

Transkrypt

1 Osad czynny to nie tylko bakterie w skład mikrofauny wchodzi całe mnóstwo pierwotniaków oraz organizmy tkankowe. Częste obserwacje tego samego osadu umożliwiają wychwycenie bardzo istotnych zmian związanych z aktywnością, sposobem poruszania, obecnością form przetrwalnikowych itp. Wśród pierwotniaków w osadzie spotykane są wiciowce, korzenionóżki oraz orzęski o bardzo zróżnicowanym kształcie oraz budowie. Najliczniej spotykane są orzęski, w tym formy pływające (Tetrahymena, Colpidium, Paramecium), pełzające (Litonotus, Chilodonella, Aspidisca) oraz osiadłe (Vorticella, Epistilis, Opercularia, Podophrya). Wśród nich obserwujemy gatunki bardzo wrażliwe na czynniki środowiska, i to właśnie one są bioindykatorami pracy osadu. Wśród organizmów tkankowych najczęściej spotykane są: wrotki, nicienie, czasami brzuchorzęski lub niesporczaki. Oprócz wrotek, na które możemy natrafić przez cały rok, organizmy te występują sezonowo. Obserwacja ich zachowania jest cenna przy opisywaniu pracy osadu. Ich obecność świadczy o jego dobrej pracy i wysokim stopniu oczyszczania ścieków; są one wskaźnikiem dobrego osadu. Obserwując osad za pomocą mikroskopu, można otrzymać wyczerpujące informacje na temat funkcjonowania oczyszczalni. Rozmiary, stopień skupienia oraz kształt kłaczków osadu są związane z warunkami, w których przebiega proces, a ponadto mają podstawowe znaczenie dla właściwości sedymentacyjnych osadu. Obecność specyficznych cząstek (materiałów) w kłaczkach informuje o charakterze dopływającego ścieku; z kolei zmiany w ilości oraz przestrzennym rozmieszczeniu organizmów nitkowatych informują o potencjalnym zagrożeniu z powodu puchnięcia osadu. Prowadząc regularne obserwacje, mamy szansę zauważyć wzrost znaczenia organizmów nitkowatych, zanim jeszcze właściwości sedymentacyjne osadu ulegną pogorszeniu. W przypadku puchnięcia postawienie właściwej diagnozy i podjęcie odpowiednich środków zaradczych wymaga zidentyfikowania organizmów nitkowatych. Szczególną rolę w tym zakresie funkcjonowania oczyszczalni zawsze odgrywały pierwotniaki. Pierwotniaki są bardzo zróżnicowane pod względem rozmiarów, kształtów oraz sposobów poruszania się. Obserwacja pierwotniaków dostarcza dużo informacji na temat całej biocenozy. Zmiany w składzie gatunkowym czy modyfikacje proporcji ilościowych mogą zwracać uwagę na przekształcenia zachodzące w procesie, ostrzegać przed potencjalnymi zagrożeniami lub wskazywać na wadliwe funkcjonowanie systemu. Na przykład obserwacja mikrofauny to z pewnością najszybszy i najtańszy sposób, żeby stwierdzić zatrucie osadu substancjami toksycznymi. Ograniczona ruchliwość oraz modyfikacje morfologiczne, takie jak skurczenie lub zniekształcenie komórek, to wyraźne oznaki niedawnego zatrucia. Poszczególne gatunki i całe kategorie pierwotniaków wykazują zróżnicowaną wrażliwość na działanie substancji toksycznych. Gatunki wrażliwe zanikają, a gatunki odporne, korzystając ze zmniejszonej konkurencji, zwiększają swoją liczebność. Warto pamiętać, że obserwowanie pierwotniaków jest pożyteczne nie tylko w sytuacjach awaryjnych. Ich skład gatunkowy oraz proporcje ilościowe zależą w dużym stopniu od obciążenia substratowego i wieku osadu, czyli głównych parametrów określających funkcjonowanie całego systemu. Kontrola obciążenia staje się coraz ważniejszym elementem sterowania we współczesnych oczyszczalniach na przykład pogodzenie wymogów nitryfikacji z jednoczesną kontrolą bakterii nitkowatych wymaga precyzyjnej kontroli obciążenia. Osiągnięcie pełnej wydajności procesu w nowo uruchamianym systemie wymaga czasu. Dojrzewanie osadu to okres intensywnych transformacji jakościowych i ilościowych. Przebudowa mikrofauny dotyczy nie tylko pojawiania się i zanikania konkretnych gatunków, ale widoczna jest także w zmianach dotyczących całych grup organizmów. Stopniowy przyrost masy osadu prowadzi do daleko idących zmian warunków pokarmowych. W pierwszym okresie dopływający do reaktora ładunek substancji ściekowych napotyka tylko znikomą masę osadu (obfitość dostępnych substratów pokarmowych, bardzo wysoka aktywność bakterii). Gwałtowny przyrost populacji bakteryjnych prowadzi do szybkiego rozwoju żywiących się nimi pierwotniaków. W pierwszym etapie pojawiają się te, które potrafią najszybciej rozmnażać się w warunkach obfitości pokarmu bakteryjnego są to przede wszystkim najdrobniejsze wiciowce heterotroficzne. W ślad za nimi pojawiają się pływające bakteriożerne orzęski. Rozwój wiciowców oraz pływających orzęsków przyczynia się do wyraźnego spadku zagęszczenia bakterii rozproszonych. Jednocześnie ciągły przyrost masy osadu w reaktorze sprawia, że bakterie mają do dyspozycji coraz mniej substratów pokarmowych. Ładunek dopływających substratów rozkłada się bowiem na coraz większą masę organizmów i dostępne zasoby stają się coraz mniejsze. Swobodnie pływające orzęski są zastępowane przez formy osiadłe i pełzające, które pobierają pokarm w sposób wydajniejszy i potrafią przeżyć przy znacznie niższych zagęszczeniach bakterii niż gatunki pływające. Formy pełzające żerują także na bakteriach tworzących kłaczki. Ameby oskorupione (Testacea) stają się ważnym składnikiem osadu dopiero w późniejszej fazie. Także wrotki, nicienie, niesporczaki oraz inne zwierzęta, mające z reguły dużo dłuższy czas generacji niż większość pierwotniaków, pojawiają się dopiero w późniejszych etapach sukcesji. Zmiany w dojrzewającym osadzie czynnym wynikają głownie ze stopniowych zmian w dostępności pokarmu bakteryjnego, umiejętności korzystania z rożnych jego rodzajów przez poszczególne gatunki lub kategorie bakteriożerców oraz z ich zróżnicowanego tempa wzrostu. Skład gatunkowy orzęsków w osadzie wykazuje wyraźny związek z jakością oczyszczonego ścieku. Curds i Cockburn stworzyli ranking gatunków orzęsków powiązanych z określonymi zakresami BZT 5 w odpływie. Wykazali, że znajomość orzęsków w osadzie czynnym pozwala w pewnym zakresie przewidywać jakość odpływu. Skuteczność systemu potwierdzono, stosując go w oczyszczalniach, z których nie pobierano wcześniej danych. Polską modyfikację tej procedury postępowania zaproponował Klimowicz (1983). Przedstawione metody powstały na bazie danych uzyskanych z dużej liczby oczyszczalni, reprezentujących bardzo szeroki zakres warunków. Zaobserwowano istnienie wyraźnego związku między składem gatunkowym mikrofauny osadu czynnego a warunkami procesowymi i jakością odpływu. Z praktycznego punktu widzenia zasadniczą wadą w stosowaniu tych procedur jest jednak konieczność identyfikowania gatunków. Oznaczanie gatunków jest trudne, wymaga dużej wiedzy i pokaźnego zbioru literatury. Madoni (1994) zaproponował uproszczone podejście do oceny osadu czynnego na podstawie występujących w nim pierwotniaków. Metoda jest podobna do indeksów biotycznych stosowanych do oceny jakości rzek za pomocą makrobezkręgowców. Ocenę osadu czynnego przeprowadza się bez konieczności identyfikacji gatunków (z małym tylko wyjątkiem). Założono, że same proporcje ilościowe dużych i łatwych do rozpoznania kategorii pierwotniaków pozwalają ocenić kondycję osadu i funkcjonowanie systemu. Wiciowce heterotroficzne Drobne wiciowce o rozmiarach < 10 μm są stałym składnikiem osadu czynnego. Stanowią także najliczniejszą kategorię wśród pierwotniaków w dopływających ściekach. Zawsze dominują w pierwszej fazie rozruchu nowej oczyszczalni, a także w systemach wysoko obciążonych. Żywią się głownie bakteriami rozproszonymi. Niektóre z nich są osiadłe lub czasowo przytwierdzają się do powierzchni. Przy niższych obciążeniach liczebność wiciowców ulega wyraźnej redukcji. Powodem jest silna konkurencja ze strony orzęsków oraz drapieżnictwo wiciowce są preferowanym pokarmem wielu drapieżnych pierwotniaków. Stwierdzenie wysokiej liczebności wiciowców w dojrzałym osadzie świadczy o złym funkcjonowaniu systemu. Może to być rezultat nadmiernego obciążenia substratowego, braku tlenu lub

2 dopływu ścieków zagniwających. Wiciowce wykazują generalnie większą odporność niż orzęski na niedobory tlenu i obecność substancji toksycznych. Z powodu swojej odporności i szybkiego tempa wzrostu, spośród wszystkich pierwotniaków wiciowce najwcześniej odradzają się po różnego rodzaju szokowych zaburzeniach. Orzęski swobodnie pływające Pływające bakteriożerne orzęski to kategoria również charakterystyczna dla wysokich obciążeń substratowych i wczesnych etapów sukcesji w nowo uruchamianych systemach. Zwłaszcza gatunki o drobnych rozmiarach z grupy Hymenostomata: Cyclidium, Tetrahymena, Uronema, Colpidium, to organizmy dominujące w warunkach wysokiego obciążenia. Orzęski te są zdolne do bardzo szybkiego wzrostu, ale wymagają przy tym dużego zagęszczenia bakterii w środowisku. Przy niższych zagęszczeniach bakterii są konkurencyjnie wypierane przez inne grupy o wydajniejszych strukturach filtrujących, np. przez osiadłe czy pełzające Hypotrichida. Osiadłe orzęski bakteriożerne Osiadłe orzęski z grupy Peritrichidia (np. Carchesium, Vorticella, Epistylis czy Opercularia) posiadają bardzo charakterystyczne wydajne aparaty filtrujące. Przytwierdzają się do powierzchni kłaczków osadu za pomocą sztywnych lub kurczliwych stylików. Przedstawiciele tej grupy orzęsków to najbardziej charakterystyczny składnik osadu czynnego. Występują w szerokim zakresie obciążeń. Czasami obserwuje się ich masowy rozwój, kiedy stanowią ponad 80% całej mikrofauny osadu. Przypuszczalnie świadczy to o niestabilnych warunkach będących efektem nagłego wzrostu obciążenia lub jego znacznych wahań. Orzęski pełzające Pełzające bakteriożerne orzęski (np. Aspidisca, Euplotes, Chilodonella, Trochilia) występują przede wszystkim w warunkach niskich i średnich obciążeń. Liczne gatunki pełzające potrafią korzystać z bakterii związanych z kłaczkami osadu, niektóre specjalizują się w połykaniu bakterii nitkowatych. Według niektórych autorów, stosunek ilościowy form pełzających do osiadłych ma związek z wydajnością oczyszczalni. Kiedy jego wartość przekracza 0,5, odpływ jest lepszej jakości. Zaobserwowano także odwrotną zależność form pełzających i indeksu objętościowego osadu. Bardzo wysokie zagęszczenia form pełzających (powyżej osobników ml -1 ) towarzyszą niskim wartościom SVI (poniżej 200). Natomiast przy wartościach SVI powyżej 400 liczebność orzęsków pełzających szybko spada (Madoni, 1994). Ameby oskorupione (Testacea) W osadzie czynnym występują najczęściej przedstawiciele rodzajów: Arcella, Euglypha i Diflugia. Ich występowanie jest związane z długim wiekiem osadu, niskim obciążeniem, dobrym natlenieniem oraz bardzo niskim stężeniem azotu amonowego czyli z warunkami towarzyszącymi pełnej nitryfikacji. Dlatego właśnie Testacea w osadzie czynnym są uważane za wskaźnik dobrze przebiegającej nitryfikacji. Opanowują tylko osady nisko obciążone, ponieważ ich tempo wzrostu jest bardzo powolne. Liczebność Testacea zwykle rośnie latem w wyższych temperaturach. W miarę upływu czasu pod wpływem soli żelaza domki Arcella nabierają coraz bardziej intensywnego, brązowożółtego zabarwienia. Niektórzy traktują intensywność tej barwy jako dodatkową informację wskazującą na wiek osadu. Niektóre z pierwotniaków są gatunkami wskaźnikowymi przede wszystkim są to gatunki zdolne do życia w warunkach ekstremalnych, a więc wskazują na złą kondycję osadu. Do tej grupy należą orzęski z rodzaju Opercularia. W osadzie czynnym najczęściej występują trzy gatunki: Opercularia coarctata, Opercularia microdiscus i Opercularia minima. Dość popularne, ale występujące raczej w niewielkich ilościach, są charakterystyczne dla wysokich obciążeń i wysokich wartości BZT 5 w odpływie. Jeśli jednak pojawiają się w dużych ilościach w systemach, które powinny pracować przy średnich lub niskich obciążeniach, to świadczą zdecydowanie o złych warunkach. Poza tym gatunki te wykazują stosunkowo dużą odporność na rożne substancje toksyczne, zwłaszcza na metale. W oczyszczalniach, które mają dużą domieszkę ścieków przemysłowych zawierających substancje toksyczne, Opercularia występują często w znacznych ilościach. Opercularia coarctata bywa jedynym składnikiem mikrofauny w oczyszczalniach przemysłowych zasilanych ściekami bogatymi w metale. Orzęskom z rodzaju Opercularia często towarzyszy Vorticella microstoma, również charakterystyczna dla wysokiego obciążenia. Ten gatunek jest zwykle obecny we wczesnej fazie rozwijającego się osadu czynnego i z czasem zostaje zastępowany przez Vorticella convallaria, która dominuje w stabilnych warunkach. Przy spadkach stężenia tlenu obserwowano powrót Vorticella microstoma, uważanej za dobry wskaźnik niedoborów tlenowych. Orzęski z rodzaju Opercularia oraz Vorticella microstoma to jedyne gatunki, których rozpoznawanie jest konieczne przy wyznaczaniu Biotycznego Indeksu Osadu. Świetnymi wskaźnikami są gatunki beztlenowe, np. orzęski z rodzajów Plagiopyla, Metopus czy Caenomorpha. Dzięki osobliwej morfologii można je łatwo rozpoznać pod mikroskopem. W warunkach naturalnych żyją w makrosiedliskach pozbawionych tlenu, takich jak muł sapropelowy. Żywią się bakteriami siarkowymi i uważane są za wskaźniki siarkowodoru. Gdy pojawiają się w osadzie czynnym, wskazują wyraźnie na wadliwe działanie systemu, np. istnienie martwych stref, w których osad zalega i zagniwa. Za wskaźniki dobrych warunków panujących w osadzie czynnym uważa się ameby domkowe: Arcella sp., Euglypha sp. oraz takie orzęski, jak: Plagicampa metabolica, Coleps hirtus czy Vaginicola. Organizmy te związane są z niskim obciążeniem, długim wiekiem oraz dobrymi warunkami tlenowymi z warunkami sprzyjającymi nitryfikacji. W literaturze można spotkać listę organizmów wskaźnikowych (Salvado). Kolejność na liście odpowiada rosnącej jakości odpływu: im więcej organizmów z dalszych pozycji listy zawiera osad i równocześnie im większa jest ich liczebność, tym lepsza jest przewidywana jakość odpływu: 1. Drobne wiciowce 2. Drobne ameby nagie (<50μm) 3. Vorticella microstoma 4. Uronema nigricans 5. Opercularia coarctata 6. Aspidisca cicada 7. Acineria uncinata 8. Vorticella convallaria 9. Epistylis plicatilis 10. Duże ameby nagie (> 50 μm)

3 11. Trochilia minuta 12. Euplotes aediculatus 13. Carchesium polypinum 14. Zoothamnium sp. 15. Thuricola kellicotiana 16. Vorticella campanula Dawno już zauważono, że dobrze pracujące osady, o dobrej jakości odpływu mają na ogół bardzo urozmaicony skład gatunkowy pierwotniaków. Z drugiej strony ograniczona liczba gatunków lub silna dominacja pojedynczej grupy świadczy najczęściej o zakłóconym funkcjonowaniu systemu. Indeks Biotyczny Osadu uwzględnia informację o różnorodności pierwotniaków, przyznając wyższą liczbę punktów osadom o większej różnorodności. Występowanie określonych gatunków wskaźnikowych tłumaczy się zwykle ich wrażliwością na konkretne czynniki środowiskowe, takie jak np. temperatura, tlen, ph czy określone substancje toksyczne. Podstawowe znaczenie mają przedstawione wcześniej warunki pokarmowe związane z wielkością obciążenia substratowego oraz wiek osadu. Należy jednak pamiętać, że w kształtowaniu struktury każdego systemu ekologicznego wielką rolę odgrywają interakcje międzygatunkowe przede wszystkim konkurencja i drapieżnictwo. Ich efekty pośrednie mogą być trudne do przewidzenia. Na przykład zanik konkretnego gatunku wrażliwego na dany czynnik może doprowadzić do znaczących zmian w innym miejscu sieci troficznej. W każdej oczyszczalni powstaje osad czynny o swoistych właściwościach. Prowadząc regularne obserwacje, operator ma szansę poznać i zanalizować osad, nauczyć się odróżniać zmiany nieistotne od tych bardzo ważnych dla przebiegu procesu. Bardzo często zdarza się, że wynik analizy osadu czynnego ogranicza się do przedstawienia składu gatunkowego. Należałoby jednak pamiętać, iż sam skład gatunkowy w wielu przypadkach nie jest przydatny. Technolog oczyszczalni oczekuje informacji dotyczących jakości osadu, jego kondycji związanej z ilością pokarmu, tlenu, wieku osadu, stwierdzenia ewentualnych zaburzeń, ustalenia przyczyn złej pracy. Informacje takie uzyskamy tylko i wyłącznie podczas współpracy biologów ze specjalistami w zakresie technologii oczyszczania ścieków. Kompleksowa analiza osadu czynnego Jak przygotować próbę do badań Przed pobraniem próby należy delikatnie wymieszać osad. Przygotowujemy preparaty przyżyciowe, nanosimy na szkiełko podstawowe dwie krople osadu i przykrywamy je osobnymi szkiełkami nakrywkowymi tak by nie stykały się ze sobą i stanowiły dwie niezależne próby. Jak prowadzić obserwacje Do obserwacji najlepiej użyć mikroskopu kontrastowo-fazowego ukazuje on wyraźnie elementy przeźroczyste, często prawie niewidoczne w jasnym polu. Obserwacje mikroskopowe prowadzimy w sposób systematyczny, poziomymi lub pionowymi pasami, tak aby stopniowo obejrzeć całą próbę znajdująca się pod szkiełkiem nakrywkowym. Używamy kolejnych powiększeń mikroskopu, rozpoczynając od najmniejszych powiększeń: 1. Obiektywy 10x i 20x służą do oceny kształtu, budowy i wielkości kłaczków, szacowania zagęszczenia bakterii nitkowatych, zagęszczenia grup Protozoa i Metazoa. 2. Obiektyw 40x służy do identyfikacji pierwotniaków w oparciu o ich budowę, wielkość i ruch, oceny spójności kłaczków, zagęszczenie bakterii wolnożyjących : śrubowce (Spirillae), krętki (Spirochaetae). 3. Obiektyw 100x obiektyw immersyjny (używany tylko z olejkiem) Jak ocenić morfologie kłaczków (rysunek 107) Obserwując kształt, budowę i wielkość kłaczków, możemy ocenić, w jakim stopniu ich cechy morfologiczne wpływają na właściwości sedymentacyjne osadu. Kłaczki zwarte mają większy ciężar właściwy niż kłaczki luźne szybciej sedymentują. Podobnie kłaczki duże i mocne będą łatwiej opadać niż kłaczki słabe i drobne, lub bardzo drobne. Jeżeli drobnym kłaczkom towarzyszą kłaczki o nieregularnym kształcie najczęściej dochodzi do połączeń między nimi w czasie osadzanie, co sprzyja klarowaniu odpływu. Z drugiej strony kłaczki o regularnym kształcie (zaokrąglone) łatwiej upakowują się blisko siebie w czasie osadzania niż kłaczki nieregularne. Cechy charakterystyczne poszczególnych grup mikroorganizmów Aby prawidłowo dokonać oceny ogólnej jakości osadu czynnego powinniśmy wziąć pod uwagę udziały poszczególnych grup mikroorganizmów, które są wskaźnikami jakości odpływu i warunków panujących w komorach. Bakterie nitkowate występujące w osadzie Bakterie nitkowate (rysunek 108) (skala referencyjnych obrazów FI 0-5) Uznaje się, że nadmierny rozwój bakterii nitkowatych jest jedną z głównych przyczyn puchnięcia osadu czynnego. Ponieważ określenie bezwzględnej liczebności jest trudne i bardzo czasochłonne, opracowano system szacowania udziału bakterii nitkowatych (FI w skali 0-5) poprzez porównanie z obrazami referencyjnymi określającymi konkretną wartość skali. Ważne jest, by przed porównaniem z obrazem referencyjnym obejrzeć cały preparat, w wyniku czego w naszej pamięci powstaje niejako uśredniony obraz pozwalający na bardziej obiektywne porównanie ze zdjęciem referencyjnym. Actinomycetes (Nocardiopodobne) (rysunek 86)

4 Cechy charakterystyczne: brak ruchu, krzaczkowate kolonie głównie wewnątrz lub wokół kłaczków, brak granul siarki, Gram-dodatnie, Neisserujemne (często są obserwowane Neisser-dodatnie granule polifosforanów), Czynnik sprzyjające rozwojowi: szeroki zakres wieku osadu, wysoka zawartość tłuszczów, lotnych kwasów tłuszczowych, substancji powierzchniowo czynnych, stosunkowo wysoka temperatura (dominują głównie latem) Microthrix parvicella (rysunek 91) Cechy charakterystyczne: brak ruchu, nici skłębione w kłaczkach lub pomiędzy kłaczkami, Gram-dodatnia, Neisser-dodatnia wybarwione na czarno granule poli-p. Czynnik sprzyjające rozwojowi: niskie obciążenie osadu, długi i średni wiek osadu, wysoka zawartość kwasów tłuszczowych i ich estrów, niski poziom tlenu w komorze napowietrzania, wysoka zawartość azotu amonowego, Sphaerotilus natans (rysunek 94) Cechy charakterystyczne: brak ruchu, nici proste lub lekko wygięte, komórki pałeczkowate lub prostokątne, Gram-ujemne, Neisser-ujemne. Czynniki sprzyjające rozwojowi: niedobór tlenu, wysoki stosunek węgla do azotu i węgla do fosforu, dopływ ścieków zagniwających, przeciążenie ładunkiem przy niedoborze tlenu. Bakterie swobodnie pływające Śrubowce (Spirillae) (rysunek 114) (skala: 0 brak, 1 kilka, 2 kilkanaście, 3 kilkadziesiąt w polu widzenia; obiektyw 40x) Śrubowce swobodnie pływające przypominające korkociąg bakterie, które najczęściej poruszają się bardzo szybko, często zmieniając kierunek. Są uważane za wskaźnik niedoboru tlenu w osadzie czynnym. Krętki (Spirochaetae) (rysunek 115) (skala: 0 brak, 1 kilka, 2 kilkanaście, 3 kilkadziesiąt w polu widzenia obiektyw 40x) Występują głównie w oczyszczalniach z systemem usuwania nutrietów. Monokolonie (rysunek 116, 117) (skala: 0 brak, 1 mniej niż pięć w preparacie, 2 od pięciu do dwudziestu w preparacie, 3 widoczne w prawie każdym polu widzenia; obiektyw 20x) Monokoloniami nazywamy występujące w kłaczkach lub pomiędzy kłaczkami skupiska bakterii tego samego typu, często obudowane śluzowatymi otoczkami. W kontraście fazowym są widoczne jako opalizujące, niebieskawe twory o kulistym kształcie. Wśród bakterii tworzących tego typu monokolonie wyróżniamy bakterie kumulujące polifosforany (poli-p). Ich obecność świadczy o dobrych warunkach defosfatacji. Monokolonie mogą tworzyć jeszcze bakterie denitryfikacyjne, zooglearne. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie się ze strukturą i funkcjonowaniem osadu czynnego. 1. Materiały, aparatura, odczynniki: - osad czynny - mikroskop kontrastowo-fazowy (sala 5A) - barwnik A błękit metylenowy - barwnik B fiolet krystaliczny - barwnik C chryzoidyna 1% roztwór - fiolet krystaliczny - płyn Lugola - fuksyna - etanol - olejek immersyjny Wykonanie ćwiczenia 2. Ocena bakterii osadu czynnego 2.1. Wykrywanie materiałów zapasowych (poli-p) - barwienie metodą Neissera Barwienie pozwala na stwierdzenie obecności w komórkach bakterii materiałów zapasowych w postaci polifosforanów (od fioletu do koloru czarnego) Barwienie wykonujemy nad wanienką do barwienia, preparat umieszczamy na statywie, do płukania używamy wody destylowanej Przygotować suchy preparat osadu czynnego w tym celu na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanosimy pipetą kroplę osadu czynnego, drugim szkiełkiem wykonujemy jej rozmaz, suszymy preparat (do odparowania wody) i utrwalamy przesuwając nad płomieniem palnika. Przygotować świeży roztwór (A+B) składający się z dwóch części roztworu A i jednej części roztworu B w tym celu wprowadzamy do probówki pipetą 1 ml barwnika A i 0,5 ml barwnika B Nanieś na utrwalony preparat roztwór A+B po 15 sekundach spłukać wodą nad wanienką Nanieść roztwór C po 45 sekundach spłukać wodą nad wanienką

5 Pozostawić preparat do wyschnięcia na ręczniku papierowym/bibule Preparat oglądać w jasnym polu stosując powiększenie obiektywu 40x lub 100x z olejkiem immersyjnym W preparacie zaobserwować obecność ziaren poli-p (kolor fioletowy do czarnego) wewnątrz komórek bakterii. Barwienie to pozwala również na identyfikację bakterii nitkowatych: - Neisser-ujemne: Sphaerotilus natans, Nocardia, Thiotrix - Neisser-dodatnie: Micrithrix parvicella 2.2. Barwienie metodą Grama Metoda różnicująca mikroorganizmy na dwie grupy: Gram-dodatnie i Gram-ujemne ze względu na różnice w budowie ścian komórkowych. Barwienie wykonujemy nad wanienką do barwienia, preparat umieszczamy na statywie, do płukania używamy wody destylowanej Przygotować suchy preparat osadu czynnego w tym celu na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanosimy pipetą kroplę osadu czynnego, drugim szkiełkiem wykonujemy jej rozmaz, suszymy preparat (do odparowania wody) i utrwalamy przesuwając nad płomieniem palnika Na utrwalany preparat nanieść fiolet krystaliczny po 2 minutach spłukać wodą nad wanienką Zalać preparat płynem Lugola odczekać 2 minuty Preparat ostrożnie odbarwić w etanolu, przez sekund, następnie spłukać woda destylowaną Nanieść fuksynę zasadową spłukać po 30 sekundach Pozostawić preparat do wyschnięcia na ręczniku papierowym/bibule Preparat oglądać w jasnym polu stosując powiększenie obiektywu 40x lub 100x z olejkiem immersyjnym. Bakterie barwiące się na kolor ciemnofioletowy określamy jako Gram-dodatnie, bakterie barwiące się na kolor różowy określamy jako Gram-ujemne Analiza bakterii nitkowatych i swobodnie pływających Należy przygotować preparat przyżyciowy dokładnie wymieszanego osadu czynnego. W tym celu na szkiełko podstawowe nanosimy pipetą dwie krople osadu tak aby po przykryciu ich osobnymi szkiełkami nakrywkowymi, szkiełka nie stykały się Przy powiększeniu 10x należy określić zagęszczenie bakterii nitkowatych (indeks FI od 0 do 5) FI 0 występują pojedynczo w preparacie mikroskopowym FI 1 występują pospolicie, ale nie w każdym kłaczku FI 2 występują od 1-5 nici w każdym kłaczku (liczebność niska) FI 3 występują od 5-20 nici w każdym kłaczku (liczebność średnia) FI 4 występują powyżej 20 nici w każdym kłaczku (liczebność wysoka) FI 5 występują masowo w kłaczku i pomiędzy kłaczkami lub więcej nici niż kłaczków 2.4. Wyniki zestawić w tabeli 1 3. Opracowanie wyników Na podstawie wyników zestawionych w tabeli 1 ocenić cechy bakterii nitkowatych osadu czynnego. 4. Literatura 4.1. Fijałkowska E. i wsp., Osad czynny biologia i analiza mikroskopowa, Oficyna Wydawnicza IMPULS, Kraków Dymaczewski Z., Poradnik eksploatatora oczyszczalni ścieków. Polskie Zrzeszenie inż. i Tech. Sanitarnych, Poznań, Tabela 1 Cechy bakterii nitkowatych Obecność ziaren poli-p Barwienie Grama Barwienie Neisera Indeks FI Cecha Organizm nitkowaty