Wyznaczenie wartości współczynnika van t Hoffa - Q10

Transkrypt

1 Wyznaczenie wartości wsółczynnika van t Hoffa - Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest wyznaczenie wartości wsółczynnika van t Hoffa ( dla rocesów: fizycznego (dyfuzja, chemicznego (inwersja sacharozy i enzymatycznego. Aby wyliczyć wartości wsółczynników należy wyznaczyć doświadczalnie stosunek szybkości oisanych niżej trzech rocesów w dwóch temeraturach: okojowej oraz okojowej + K. Zakres wymaganych wiadomości: Zjawisko dyfuzji, I i II rawo Ficka, światło solaryzowane, substancje otycznie czynne, skręcalność właściwa, rawo Lamberta Beera, absorbancja (ekstynkcja, szybkość rocesu, inwersja sacharozy, trysyna (własności i znaczenie Tabela wyników omiarów Temeratura [K] T Dyfuzja Inwersja sacharozy Reakcja enzymatyczna A A 3 α 20 α 50 A 20 A 35 T + / / / Pierwszą czynnością jest omiar temeratury okojowej T oraz ustawienie termostatu łaźni wodnej na temeraturę wyższą o stoni (T P+ DYFUZJA Materiały: Roztwór błękitu bromofenolowego Roztwór HCl Aaratura: Sekol Łaźnia wodna Termometr Cylinder miarowy Piety Naczynie z rzegrodą ze sieku szklanego Obserwacja dyfuzji w temeraturze okojowej. Przebieg ćwiczenia:. Do zlewki z wklejoną ionową rzegrodą ze sieku szklanego wlać do jednej części (komory9 ml wody destylowanej a do drugiej komory 20 ml wody destylowanej.

2 2. Do obu komór wlać o 0,5 ml roztworu błękitu bromofenolowego. 3. Do robówki wlać 20 ml wody destylowanej oraz 0,5 ml roztworu błękitu bromofenolowego. Po wymieszaniu naełnić tym roztworem jedną z kuwetek omiarowych (około 2 ml - będzie to roztwór odniesienia w stosunku do którego należy kalibrować Sekol 4. Do komory zawierającej 9ml wody dodać ml roztworu HCl. Od tego momentu należy mierzyć czas. 5. Po uływie minuty (mieszając roztwór zabarwiony oczątkowo na niebiesko obrać 2ml roztworu wlać do kuwetki omiarowej i odczytać absorbancję dla λ 430 nm (względem roztworu błękitu bromofenolowego unkt 3 UWAGA rzed każdym omiarem srawdzić ustawienie λ ze względu na inne ustawienia konieczne w innych omiarach. 6. Po dokonaniu omiaru wlać z owrotem obrane 2ml roztworu do tej samej komory. Po czasie 3 minut (od momentu wlania HCl owtórnie obrać 2 ml roztworu z tej samej komory i owtórzyć omiar. Obserwacja dyfuzji w temeraturze okojowej + stoni.. Odmierzyć 9 i 20 ml wody destylowanej do dwóch robówek i umieścić je w łaźni wodnej utrzymującej temeraturę o stoni wyższą od temeratury otoczenia. 2. Po minutowej inkubacji owtórzyć czynności z unktu trzymając zlewkę z komorami w łaźni wodnej. Uwaga - rzygotowany wcześniej roztwór odniesienia błękitu bromofenolowego (. 3 rzechowywany w temeraturze okojowej może być stosowany do omiarów w temeraturze o stoni wyższej (dlaczego? Oracowanie wyników. Ze względu na rawo Lamberta-Beera wartość arametru dla badanego rocesu może być wyrażona za omocą odowiednich wartości ekstynkcji (absorbancji: A A A 3 A 3 gdzie: - A (T + absorbancja o czasie minuty w temeraturze okojowej (T + K, - A 3 (T +, A (T, A 3 (T absorbancje o 3, i 3 minutach w temeraturach T +, T INWERSJA SACHAROZY Materiały: Sacharoza Roztwór HCl Aaratura: Waga Sacharymetr Łaźnia wodna Termometr Cylinder miarowy Kolby stożkowe Probówki

3 Inwersja sacharozy jest reakcją hydrolizy dwucukru na dwa monocukry: glukozę i fruktozę: C 2 H 22 O + H 2 O C 6 H 2 O 6 + C 6 H 2 O 6 Katalizatorem tej reakcji są rotony. Wszystkie wymienione cukry są otycznie czynne. Skręcalności właściwe wynoszą: Sacharoza 66,5 o glukoza 52,5 o fruktoza -9,9 o. Podczas tej reakcji zmiana kąta skręcania łaszczyzny olaryzacji światła jest miarą ostęu reakcji. Przebieg ćwiczenia:. Odważyć 5g sacharozy i rozuścić w 20ml H 2 0 destylowanej. 2. Po rozuszczeniu roztwór sacharozy odzielić na dwie równe objętości o ml (w oisanych robówkach 3. Jedną robówkę z ml roztworu sacharozy umieścić w łaźni wodnej. 4. Do drugiej robówki z ml roztworu sacharozy (w temeraturze okojowej dodać ml HCl - wymieszać i od tego momentu mierzyć czas. 5. Tak rzygotowany roztwór rzelać do jednej z rurek sacharymetru, tak aby nie było w niej ęcherzyków owietrza. (naełnianie rurki należy wcześniej rzećwiczyć naełniając ją wodą. 6. Naełnioną rawidłowo rurkę sacharymetru roztworem sacharozy należy ostrożnie zakręcić nakrętkami dociskającymi okrągłe łytki szklane (z wyczuciem aby nie uszkodzić łytek szklanych 7. Przed umieszczeniem naełnionej rurki do sacharymetru należy ją ołukać wodą i osuszyć ręcznikiem aierowym. 8. Umieścić rurkę w sacharymetrze i odczytywać kąt skręcenia łaszczyzny olaryzacji światła solaryzowanego rzechodzącego rzez rurkę z sacharozą o 20 oraz 50 minutach od momentu dodania HCl. 9. Po ierwszym omiarze można dodać ml HCl (rzechowywanego w łaźni wodnej do drugiej robówki z ml roztworu sacharozy ( w łaźni wodnej. Po wymieszaniu naełnić drugą rurkę sacharymetru ostęując analogicznie jak wcześniej (dla każdej rurki należy mierzyć czas oddzielnie.. Po 20 i 50 minutach od momentu dodania HCl należy dokonać odczytu kąta skręcenia analogicznie jak w.8. W czasie między omiarami rurka ta owinna być umieszczona w łaźni wodnej. Pomiar kąta skręcenia łaszczyzny olaryzacji światła za omocą sacharymetru. Przed rzystąieniem do omiaru należy odowiednio ustawić lusterko sacharymetru tak aby dobrze oświetlić ole widzenia obserwowane rzez lunetę. Po umieszczeniu w rurce badanego roztworu z substancją otycznie czynną należy obracać tarczę analizatora o taki kąt aby uzyskać równomierne (jak najsłabsze oświetlenie trzech części obserwowanego rzez lunetkę ola. Kąt skręcenia należy odczytać na skali kątowej (20 działek dodatnich na lewo od zera oraz 20 działek ujemnych na rawo do zera. Posługując się skalą noniusza dziesiętnego możemy odczytać kąt z dokładnością do 0, stonia.

4 Oracowanie wyników Kąt skręcenia łaszczyzny olaryzacji światła rzechodzącego rzez rurkę wyełnioną roztworem sacharozy zakwaszonej kwasem solnym jest miarą ostęu reakcji inwersji sacharozy. Zatem arametr dla tej reakcji można zaisać w ostaci wzoru: α t α t α α t 2 t 2 gdzie: - α t (T + kąt skręcenia łaszczyzny światła rzez rozwór sacharozy inkubowanej w łaźni wodnej o temeraturze T + (temeraturze okojowej + K o czasie t od momentu dodania kwasu solnego - α t2 (T +, α t (T, α t2 (T analogiczne kąty skręcenia o czasie (t2,t oraz t2 w temeraturach: T + oraz T REAKCJA ENZYMATYCZNA Materiały: Trysyna BAPNA TRIS-HCl HCl 0,0M Aaratura: Sekol Łaźnia wodna Pehametr Termometr Probówki Piety Przygotowanie roztworu enzymu (sorządzić świeży roztwór. Odważyć mg trysyny i rozuścić w ml 0,0M HCl (rzechowywać w robówce. Przygotowanie roztworu substratu (trwałość około 2 tygodni. Odważyć 50mg BAPNA i rozuścić w 50 ml wody destylowanej ogrzewając do ok. 90 o C. Po rozuszczeniu schłodzić od temeratury okojowej. Przygotowanie buforu TRIS-HCl H 7,8. Odważyć 8,6 g TRIS-HCl i rozuścić w 450 ml wody destylowanej.

5 2. Dorowadzić do H 7,8 i uzuełnić wodą destylowaną do 500 ml Przebieg ćwiczenia:. Przygotować 5 robówek i oznaczyć numerami od do Pobrać do cylindra miarowego 5 ml buforu TRIS-HCl. (aby dalej nie obierać buforu bezośrednio z butelki. 3. Do robówek nr i 2 dodać o 3,8 ml buforu TRIS-HCl (obrać z cylindra -.2 oraz o 0,2ml roztworu trysyny. - robówkę nr umieścić w łaźni wodnej, - robówkę nr 2 ozostawić w temeraturze okojowej. 4. Do robówek nr 3, 4 i 5 dodać o,8ml buforu TRIS-HCl oraz o,0 ml roztworu substratu (BAPNA. - Probówkę nr 3 umieścić w łaźni wodnej. - Do robówki nr 4 dodać 0,2 ml wody destylowanej wymieszać i obrać ok. 2ml do kuwety omiarowej (kuweta odniesienia dla której należy kalibrować Sekol. - Do robówki nr 5 dodać 0,2ml (z robówki nr 2 roztworu trysyny rzechowywanej w temeraturze okojowej od tej ory jest to robówka z mieszaniną reakcyjną. Energicznie wymieszać i od tego momentu rozocząć omiar czasu zachodzącej reakcji. 5. Po uływie 20 minut obrać ok. 2 ml mieszaniny reakcyjnej (enzym+substrat robówka nr 5 do kuwety omiarowej i zmierzyć absorbancję rzy długości fali λ405nm względem roztworu samego substratu (. 4 UWAGA rzed każdym omiarem srawdzić ustawienie λ ze względu na inne ustawienia konieczne w innych omiarach. 6. Ze względu na to, że reakcja ta jest rowadzona w temeraturze okojowej, można ozostawić mieszaninę reakcyjną w kuwecie omiarowej i o 35 minutach, od chwili utworzenia mieszaniny reakcyjnej, owtórnie zmierzyć absorbancję. Uwaga kuwety omiarowe rzed użyciem należy rzemyć strumieniem wody destylowanej. Uwaga ta nie dotyczy kuwet, w których ozostawiamy roztwory do dalszych omiarów. Przerowadzenie reakcji w temeraturze łaźni wodnej (T +.. Postęować jak wcześniej, dodając do robówki nr 3 (z substratem 0,2ml (z robówki nr roztworu enzymu. Mieszaninę reakcyjną (robówka nr 3 należy także umieścić w łaźni wodnej. 2. Pomiary absorbancji mieszaniny reakcyjnej (robówka nr 3 wykonać o uływie 20 i 35 minut licząc od chwili wymieszania roztworów substratu i enzymu. 3. Ze względu na omiar absorbancji w temeraturze okojowej, o każdym omiarze rzelać zawartość kuwety omiarowej do robówki nr 3 z mieszaniną reakcyjną rzechowywaną w łaźni wodnej. Oracowanie wyników Wartość dla tej reakcji możemy obliczyć analogicznie jak dla rocesu dyfuzji.

6 RACHUNEK BŁĘDÓW We wszystkich wykonanych omiarach miarą szybkości badanych rocesów jest zmiana stężenia dzielona rzez czas tej zmiany (co ma sens tylko dla odowiednio dobranych czasów dla oszczególnych rocesów Dlaczego?. Zatem, ogólnie można wyrazić za omocą wzoru: c( T c t ' t Przyjmując: t t oraz taką samą nieewność omiaru obu rzedziałów czasowych tj. ( t i ( t a także taką samą nieewność omiarową zmian stężeń w obu temeraturach: ( c(t + ( c(t można wykazać, że błąd względny wyznaczenia wyraża się równaniem: ( c( T( + c( T c( T + ( t 2 t gdzie ( t to nieewność omiarowa rzedziału czasu t ( c(t to nieewność omiaru różnicy stężeń (odowiednich absorbancji w temeraturze okojowej T. Nieewność omiaru stężenia za omocą Sekola. Można rzyjąć dwukrotną różnicę wskazań wartości absorbancji dla róby odniesienia rzed omiarem (kalibracja rzyrządu rzed omiarem owinna się ojawić wartość oraz bezośrednio o omiarze róbki badanej. Nieewność omiarowa sacharymetru. Można rzyjąć dwukrotną wartość nieewności ojedynczego omiaru. Nieewność ojedynczego omiaru można wyznaczyć orzez kilkakrotny omiar kąta skręcenia tej samej róbki roztworu (ostę badanej reakcji jest na tyle wolny, że można go zaniedbać i rzyjąć różnicę omiędzy skrajnymi wartościami. W rzyadku odczytu identycznych wartości rzyjąć 0, o. Literatura: Podstawy biofizyki, odręcznik dla studentów medycyny, red. A. Pilawski, PZWL Oracował dr hab. Krystian Kubica

7 Zaotrzebowanie odczynników na cały semestr (x50 HCl 22ml x 500ml Tris-HCl 5ml x 50750ml Roztwór BAPNA 3ml/ćwiczenieX42ml /tydzień*224ml /2 tygodnie 0,0M HCl mlx50500ml