Hydroliza lipidów mleka lub śmietany z wykorzystaniem lipaz

Transkrypt

1

2 CEL ĆWICZENIA Celem ćwiczenia jest oznaczenie aktywności lipazy trzustkowej w handlowo dostępnym preparacie oraz oznaczenie aktywności enzymów zawartych w preparacie otrzymanym z wątroby wieprzowej poprzez określenie ilości uwalnianych kwasów tłuszczowych. PDSTAWY TERETYCZNE 1. Lipazy Definicja i występowanie Lipazy, czyli hydrolazy acyloglicerolowe (EC ) to enzymy zaliczane do klasy hydrolaz wykazujące zdolność do hydrolizy wiązań estrowych. W celu odróżnienia ich od pozostałych esteraz przyjmuje się, że enzymy które wykazują zdolność do hydrolizy estrów na granicy faz woda/lipid, posiadają w obrębie cząsteczki białka tzw. wieczko oraz wykazują zdolność do hydrolizy estrów kwasów tłuszczowych o długości łańcucha węglowego powyżej 10 atomów to lipazy, zaś enzymy wykazujące zdolność do hydrolizy estrów kwasów tłuszczowych o długości łańcucha węglowego poniżej 10 atomów, zaliczamy do esteraz. Należy jednak pamiętać, że istnieją wyjątki od tej definicji. Lipazy są enzymami, których synteza występuje w świecie roślin, zwierząt oraz mikroorganizmów. W organizmach ludzkich i zwierzęcych enzymy te występują w przewodzie pokarmowym m.in. w wątrobie, żołądku trzustce oraz jelitach, gdzie zaangażowane są w proces trawienia, wchłaniania, rozpuszczania i metabolizmu lipoprotein. W świecie mikroorganizmów największymi producentami tych enzymów są bakterie, grzyby oraz drożdże. W zależności od źródła pochodzenia enzymy te różnią się między sobą specyficznością, selektywnością oraz optymalną do ich działania temperaturą i ph. Poniższa tabela zawiera przykładowe mikroorganizmy zdolne do produkcji lipaz. Źródło Rodzaj Gatunek Bacillus B. megaterium, B. cereus, B. subtilis Bakterie gram dodatnie Staphylococcus S. canosus, S. aureus, S. epidermidis Lactobacillus Lactobacillus sp Streptococcus Streptococcus lactis Pseudomonas P. aeruginosa, P. fragi, P. cepacia Bakterie gram-ujemne Chromobacterium Ch. viscosum Acinetobacter Aci. pseudoalcaligenes Aeromonas Ae. hydrophila Rhizopus Rhizop. oryzae, Rhizop. niveus Aspergillus A. Niger, A. oryzae Grzyby Penicillium Pe. cyclopium, Pe. citrinum Mucor Mucor miehei Rhizomucor R. miehei Fusarium Fusarium oxysporum Candida C. rugosa, C. tropicalis, C. antarctica Drożdże Yarrowia Y. lipolytica Rhodotorula Rho. glutinis Saccharomyces Sa. lipolytica, Sa. crataegenesis Tabela 1. Mikroorganizmy zdolne do produkcji lipaz.

3 Budowa Lipazy zaliczane są do glikoprotein, których masa cząsteczkowa mieści się w granicach 0-60kDa. Pomimo różnic w ich sekwencji aminokwasowej enzymy te wykazują podobieństwo w strukturze przestrzennej. Posiadają one w swojej budowie charakterystyczny wzór sfałdowania zwany fałdowanie / hydrolaz w którym można wyróżnić osiem, równolegle ułożonych struktur -fałdowych, otoczonych z obu stron przez 6 - helis (Rys. 1.). NH 1 3 Rys. 1. Kanoniczne / fałdowanie hydrolaz, strzałki oznaczają pasma, cylindry helisy, czarne punkty topologiczne pozycje reszt katalitycznych miejsca aktywnego, 1 nukleofilowa reszta serynowa, reszta kwasowa, 3 - reszta histydynowa W centrum aktywnym lipaz wyróżnia się triadę aminokwasów katalitycznych składającą się z seryny, histydyny, kwasu asparaginowego lub glutaminowego (Rys..). Ser H N N H Asp His Reakcje katalizowane przez lipazy Rys.. Triada katalityczna lipaz Przebieg reakcji katalizowanych przez lipazy uzależniony jest w dużej mierze od źródła pochodzenia lipazy, jej specyficzności, rodzaju stubstratów, stężenia wody, składu fazy organicznej, czasu trwania reakcji oraz temperatury prowadzenia procesu. Przykładem wpływu środowiska reakcji na rodzaj katalizowanej przez lipazę rekcji jest obecność wody w środowisku reakcyjnym, w przypadku dużego stężenia wody enzymy te wykazują zdolność do przeprowadzania reakcji hydrolizy, zaś jej niskie stężenie sprzyja reakcji syntezy. pisana 3

4 reakcja jest reakcją odwracalną, ponieważ różnica energii swobodnej związana ze zmianą kierunku reakcji hydroliza synteza jest dla lipaz niewielka i wynosi ok. 16 kj mol -1. W warunkach fizjologicznych lipazy katalizują hydrolizę triacylogliceroli (TAG), w wyniku której powstają diacyloglicerole (DAG), monoacyloglicerole (MAG), wolne kwasy tłuszczowe oraz glicerol (Rys.3.). C R 1 C R 1 C R + H, lipaza C R + H C R 3 C R 3 - H H TAG DAG wolny kwas tłuszczowy C R 1 H C R + H, lipaza C R + H C R 1 H - H H DAG MAG wolny kwas tłuszczowy H H C R + H, lipaza H + H C R H - H H MAG glicerol wolny kwas tłuszczowy Rys. 3. Schemat hydrolizy kwasów tłuszczowych W środowisku bezwodnym lipazy mogą katalizować reakcję estryfikacji, interestryfikacji oraz transestryfikacji, wykazują także zdolność do katalizowania reakcji syntezy lub hydrolizy estrów tiolowych, amidów i wodoronadtlenków kwasów karboksylowych. 4

5 W zależności od środowiska reakcji lipazy katalizują reakcję: hydrolizy estrów: R 1 CR + H R 1 + R H estryfikacji: R 1 + R H R 1 CR + H transestryfikacji: - interestryfikacji: R 1 CR + R 3 CR 4 R 3 CR + R 1 CR 4 - acydolizy: R 1 CR + R 3 R 3 CR + R 1 - alkoholizy: R 1 CR + R 3 H R 1 CR 3 + R H aminolizy: R 1 CR + R 3 NH R 1 CNHR 3 + R H hydrolizy amidów: R 1 CNHR + H R 1 + R NH syntezy amidów: R 1 + R NH R 1 CNHR + H hydrolizy estrów tiolowych: R 1 CSR + H R 1 + R SH syntezy estrów tiolowych: R 1 + R SH R 1 CSR + H syntezy wodoronadtlenków kwasów karboksylowych: R + H RC - H + H Specyficzność lipaz w reakcjach przemian tłuszczów prostych Ważnym czynnikiem wpływającym na uzyskanie określonych produktów przemian tłuszczów prostych jest regioselektywność lipaz w stosunku do położenia hydrolizowanych wiązań estrowych w triacyloglicerolach. Uwzględniając regioselektywność lipazy dzielimy na: hydrolizujące wiązanie estrowe w dowolnym położeniu triacyloglicerolu (niespecyficzne) hydrolizujące wiązania estrowe w pozycji R 1 lub R 3 triacyloglicerolu (sn 1,3-specyficzne) specyficzne w stosunku do R triacyloglicerolu (sn -specyficzne). Jednakże większość lipaz katalizuje hydrolizę wiązania estrowego w pozycji sn-1 oraz sn-3, tylko nieliczne wykazują zdolność do hydrolizy wiązania estrowego w pozycji sn-. Lipazy wykazują również specyficzność w stosunku do budowy reszty acylowej acyloglicerolu. W przypadku nasyconych kwasów tłuszczowych, lipazy tylko w nieznacznym stopniu wykazują zdolność do rozróżniania ich długości, tym samym hydrolizują one lub estryfikują, ze zbliżoną szybkością, nasycone kwasy tłuszczowe o długości łańcucha węglowego zawartego pomiędzy C a C 18. Znacznie wyższą specyficzność wykazują lipazy wobec nienasyconych kwasów tłuszczowych. Przemysłowe zastosowanie lipaz. W przemyśle znalazły zastosowanie głównie lipazy wydzielanie zewnątrzkomórkowo przez mikroorganizmy, ze względu na ich prostsze i tańsze wydzielanie z cieczy pohodowlanej. Enzymy te stosuje się w następujących gałęziach przemysłu : 5

6 Przemysł spożywczy Dzięki zdolności lipaz do przeprowadzania reakcji interestryfikacji enzymy te znalazły zastosowanie w produkcji preparatów do żywienia niemowląt. Podczas produkcji tego typu preparatów lipazy wykorzystywane są do modyfikacji tłuszczy roślinnych, stanowiących ich główny składnik, tak aby w jak największym stopniu przypominały one mleko matki. Główna modyfikacja polega na zastąpieniu nienasyconej reszty acylowej w pozycji sn- resztą kwasu palmitynowego. Podczas procesu trawienia, lipazy trzustkowe hydrolizując TAG w pozycji sn-1,3 tworząc monoacyloglicerole z kwasem palmitynowym w pozycji sn- co zapewnia lepsze wchłanianie kwasu palmitynowego w porównaniu do wolnego kwasu palmitynowego. Zdolność lipaz do przeprowadzania reakcji interestryfikacji przyczyniła się również do zastosowania tych enzymów w produkcji tłuszczy o zmniejszonej kaloryczności. Przykładem takiego procesu jest produkcja oleju, który swoim smakiem przypomina olej słonecznikowy, jednakże w porównaniu do oleju słonecznikowego jest on mniej kaloryczny. Podczas produkcji tego typu oleju lipazy wykorzystywane są do zastępowania reszt acylowych kwasu oleinowego występujących w pozycji sn-1 i sn-3 glicerolu resztami kwasu behenowego. Enzymy te znalazły również zastosowanie do produkcji tańszych substytutów masła kakaowego. Zastosowanie odpowiednich lipaz oraz tańszych tłuszczy m.in. wykorzystywanych w przemyśle kosmetycznym np. masło shea pozwoliło na uzyskanie substytutów masła kakaowego, które charakteryzują się zbliżonymi właściwościami fizycznymi i sensorycznymi (rozpływanie się w ustach) do naturalnego masła kakaowego stosowanego m.in. przy wyrobie czekolad. Ponadto w przemyśle spożywczym enzymy te są stosowane w celu przyspieszania dojrzewania serów np. serów typu Cheedar. Przemysł farmaceutyczny Lipazy znalazły także zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym ze względu na ich zdolność do produkcji enancjomerycznie czystych związków: amidów, alkoholi, estrów czy kwasów karboksylowych. Przykładami zastosowania lipaz w przemyśle farmaceutyczny jest produkcja izomerów S-Ibuprofenu. Ibuprofen jest lekiem przeciwzapalnym występującym w postaci mieszaniny recemicznej. Jednak jak wykazują badania enancjomer S tego związku wykazuje ok. 160 razy większą zdolność do hamowania syntezy prostaglandyn (odpowiedzialnych za procesy zapalne) w porównaniu do izomeru R. Dlatego w procesie produkcji dąży się do uzyskania tylko enancjomeru S-Ibuprofenu. W tym celu wykorzystywane są lipazy, które wykazują zdolność do selektywnej estryfikacji metanolu lub butanolu tylko z enancjomerem S obecnym w mieszaninie racemicznej. Kolejny etap otrzymania enancjomeru S polega na oddzieleniu nieprzereagowanego enancjomeru R oraz hydrolizie estru prowadzącej do otrzymania czystego enancjomeru S. Druga metoda otrzymania S-Ibuprofenu polega na wykorzystaniu zdolności lipaz do selektywnej reakcji z estrem metylowym S-ibuprofenu. Przebieg tego procesu przedstawiono na poniższym schemacie (Rys. 4.). 6

7 R-S IbuMe S IbuMe R-S Ibu 3 E R Ibu S Ibu + MeH S Ibu R-S Ibu S Ibu Rys. 4. Produkcja S-Ibuprofenu (S-Ibu) przez kinetyczny rozdział estrów racematu (R-S IbuME) z wykorzystaniem lipazy (L). Reakcja przebiega w środowisku organicznym w bioereaktorze membranowym (1), z wyodrębnieniem produktu () i racemizacji (3) nieprzereagowanego estru metylowego R-ibuprofenu (R-Ibu Me). W przemyśle farmaceutycznym lipazy znalazły również zastosowanie w produkcji innych leków np. leków przeciwnowotworowych (Taksol), czy leków stosowanych w nadciśnieniu tętniczym: antagonistów wapnia, blokujących kanały wapniowe typu L (Diltiazem) oraz inhibitorów konwetazy angiotensyny (Kaptopryl, Enalapryl). Produkcja detergentów Ze względu na zdolność do hydrolizy tłuszczy, lipazy znalazły również zastosowanie w produkcji preparatów do usuwania tłustych plam. Enzymy te wykorzystywane są w tego typu preparatach głównie ze względu na ich zdolność do reakcji z wieloma substratami, opornością na działanie wysokich temperatur, obecność enzymów proteolitycznych oraz surfaktantów dodawanych do preparatów piorących. Inne prócz wyżej wymienionych gałęzi przemysłu enzymy te stosuje się w procesie produkcji papieru, barwników i dodatków smakowych do żywności, w przemyśle kosmetycznym, skórzanym, tekstylnym, w przemyśle tłuszczowym, w oczyszczaniu ścieków, w produkcji biopaliw, surfaktantów, insektycydów oraz w bioremediacji.. Analiza miareczkowa podstawowe pojęcia Punkt końcowy miareczkowania- punktem końcowym miareczkowania nazywamy punkt miareczkowania, w którym jakaś własność np. barwa roztworu spowodowana dodaniem wskaźnika wykazuje wyraźną zmianę. Punkt końcowy wskazuje na koniec miareczkowania, powinien on pokrywać się z punktem równoważności. 7

8 Punkt równoważności odpowiada takiemu punktowi miareczkowania, w którym ilość dodanego odczynnika miareczkującego jest chemicznie równoważna ilości substancji miareczkowanej, tzn. dodana jest teoretyczna ilość odczynniki wynikająca ze stechiometrii reakcji. Roztwór mianowany roztworem mianowanym nazywany roztwór przeznaczony do miareczkowania o dokładnie znanym stężeniu określonego składnika. Alkacymetria (miareczkowanie alkacymetryczne) dział analizy miareczkowej obejmujący zarówno alkalimetrię (oznaczanie substancji przez miareczkowanie mianowanym roztworem zasady) jak i acydymetrię (oznaczanie substancji przez miareczkowanie mianowanym roztworem kwasu). Podstawowymi reakcjami zachodzącymi w alkacymetrii są reakcja: dysocjacji, zobojętniania oraz hydrolizy. Ze względu na własności miareczkowanego związku i titranta (roztworu mianowanego), wyróżniamy następujące warianty miareczkowania alkacymetrycznego: miareczkowanie mocnego kwasu mocną zasadą miareczkowanie mocnej zasady mocnym kwasem miareczkowanie słabego kwasu mocną zasadą miareczkowanie słabej zasady mocnym kwasem miareczkowanie słabego kwasu słabą zasadą W celu wyznaczenia punktu końcowego miareczkowania alkacymetrycznego w analizie miareczkowej stosowane są wskaźniki (przeważnie związki organiczne, które wykazują zdolność do zmiany barwy w określonym zakresie ph). Wskaźniki miareczkowania dobierane są w taki sposób, aby zmiana barwy wskaźnika następowała wewnątrz skoku miareczkowania (skok miareczkowania - gwałtowna zmiana ph w pobliżu punktu równoważności) lub częściowo pokrywała się ze skokiem miareczkowania. Zgodnie z powyższą regułą w zależności od wariantu miareczkowania stosuję się odpowiednie wskaźniki np. podczas miareczkowania mocnego kwasu mocną zasadą jako wskaźniki stosuje się oranż metylowy, czerwień metylową, fenoloftaleinę, miareczkując słaby kwas mocną zasadą jako wskaźnik ph stosuje się fenoloftaleinę, zaś miareczkując słabą zasadę mocnym kwasem punk końcowy miareczkowania obserwuje się poprzez zastosowania jako wskaźników oranżu metylowego oraz czerwieni metylowej. 8

9 PRZEBIEG ĆWICZENIA znaczanie aktywności enzymów dczynniki: wątróbka wieprzowa lipaza trzustkowa metanol lub skażony alkohol etylowy woda destylowana zimny aceton 0,1M KH 0,05M KH fenoloftaleina mleko sojowe mleko o 3,% zawartości tłuszczu śmietanka do kawy mleko odtłuszczone Szkło i inne materiały oraz potrzebny sprzęt laboratoryjny: nóż deska łyżeczka homogenizator waga laboratoryjna zlewka 0ml, 500ml, lejek ze spiekiem kolbka ssawkowa 150 ml bibuła filtracyjna cylinder miarowy 100ml, 500 ml pipety szklane 5 ml ( sztuki) 10 ml (4sztuki) papierki wskaźnikowe kolba stożkowa 50 ml (5 sztuk) kolba stożkowa 100 ml (16 sztuk) lejek szklany łaźnia wodna o temperaturze 38 C oraz 98 C zestaw do miareczkowania ( sztuki) Wykonanie ćwiczenia 1. Wydzielanie enzymu z materiału biologicznego (wątroby wieprzowej) Do zlewki odważyć 100g świeżej wątroby wieprzowej, drobno posiekać. Do pokrojonej wątroby dodać 00 ml zimnego acetonu i homogenizować w młynku (50 obr/s) przez 1 minutę. Uzyskaną zawiesinę przesączyć na lejku ze spiekiem. Przesącz odrzucić, do otrzymanego osadu dodać 00 ml zimnego acetonu i homogenizować (50 obr/s) przez kolejną minutę. trzymaną zawiesinę przesączyć na lejku ze spiekiem. Przesącz odrzucić, zaś uzyskany osad wysuszyć. Zawiesić 5g otrzymanego proszku w 40 ml wody, doprowadzić do ph 7 przy użyciu 0,1M KH wobec papierka wskaźnikowego.. znaczenie aktywności enzymu Do kolby stożkowej o pojemności 50 ml odmierzyć 100 ml odpowiedniego substratu (mleka o 3,% zawartości tłuszczu, mleka odtłuszczonego, mleka sojowego lub śmietanki do kawy). Kolbę umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 38 C, inkubować przez 10 minut. Po upływie 10 minut do kolby dodać 40 ml roztworu zawierającego otrzymany preparat enzymatyczny, wymieszać, wstawić do łaźni wodnej. Inkubować przez 10 minut od czasu do czasu mieszając. Po upływie czasu inkubacji z mieszaniny reakcyjnej do kolby stożkowej o pojemności 100 ml zawierającej 30 ml alkoholu metylowego (lub skażonego alkoholu 9

10 etylowego) odmierzyć 10 ml mieszaniny reakcyjnej, dodać kilka kropel fenoloftaleiny i miareczkować 0,05M KH do momentu uzyskania trwałego, lekko różowego zabarwienia. znaczenie powtarzać w 10 minutowych odstępach czasu przez godzinę, od momentu wstawienia kolby do łaźni wodnej, pamiętając o miareczkowaniu wszystkich prób do barwy o takiej samej intensywności. Powtórzyć oznaczenie aktywności enzymu (preparatu handlowego) według procedury opisanej powyżej, wykorzystując do analizy zawiesinę zawierającą 500 mg lipazy trzustkowej (preparat handlowy) zawieszonej w 40 ml wody. 3. Próba zerowa Zawiesić 1g preparatu z wątroby w 10 ml wody, wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 98 C (w celu inaktywacji enzymu), inkubować do momentu wrzenia roztworu. Wyjąć kolbę z łaźni wodnej, ostudzić, przesączyć. Do kolby stożkowej o pojemności 100 ml pobrać 10 ml substratu, dodać 30 ml metanolu oraz 4 ml uzyskanego przesączu. trzymaną mieszaninę miareczkować 0,05M roztworem KH wobec fenoloftaleiny do momentu uzyskania trwałego, lekko różowego zabarwienia. Czynności powtórzy dla preparatu handlowego, wykorzystując do analizy zawiesinę zawierającą 50mg lipazy trzustkowej ( w 10 ml wody. PRZYGTWANIE D ZAJĘĆ 1. Przeczytaj uważnie instrukcję i dokładnie przeanalizuj czynności oraz techniki laboratoryjne opisane w części eksperymentalnej.. Zapoznaj się z zagrożeniami związanymi z stosowanymi odczynnikami oraz poszczególnymi czynnościami wykonywanymi na zajęciach (karty charakterystyk) 3. Zwróć uwagę czy znasz następujące pojęcia: lipaza, regioselektywność, punkt końcowy miareczkowania, punkt równoważności, roztwór mianowany, skok miareczkowania 4. Zastanów się czy wiesz: a) jakie mikroorganizmy wykazują zdolność do produkcji lipaz b) jak zbudowane jest centrum aktywne lipaz c) od czego zależy przebieg reakcji katalizowanych przez lipazy oraz jakie typy reakcji mogą być katalizowane przez te enzymy d) w jaki sposób przebiega hydroliza kwasów tłuszczowych, katalizowana przez lipazy e) jakie jest przemysłowe zastosowanie lipaz f) na czym polega miareczkowanie alkacymetryczne oraz jakie wskaźniki są stosowane w alkacymetrii g) jak obliczyć aktywność preparatu enzymatycznego PRACWANIE WYNIKÓW Sprawozdanie powinno zawierać: opis przebiegu ćwiczenia tabelę zawierającą ilość 0,05M KH zużytą do miareczkowania poszczególnych prób wykres zależności ilość uwalnianych kwasów tłuszczowych od czasu inkubacji 10

11 obliczenia aktywności lipazy wątrobowej po 60 minutach reakcji przy założeniu że 1ml 0,05 M KH zobojętnia 50µmoli kwasów tłuszczowych wnioski Metodyka obliczeń bliczenia niezbędne do sporządzenia wykresu ilość uwalnianych kwasów tłuszczowych w zależności od czasu inkubacji: 1. bliczyć ilość roztworu KH potrzebną do zobojętnienia kwasów tłuszczowych w próbkach. d objętości zużytej do zobojętnienia badanej próbki odjąć objętość KH zużytą do zobojętnienia próby ślepej.. bliczyć ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych przy założeniu, że 1ml 0,05M KH zobojętnia 50µmoli kwasów tłuszczowych 3. Sporządzić wykres zależności ilości uwalnianych kwasów tłuszczowych od czasu inkubacji bliczenia potrzebne do określenia aktywności lipazy zawartej w 1g preparatu enzymatycznego otrzymanego z wątroby: 1. bliczyć ilość KH potrzebną do zobojętnienia wolnych kwasów tłuszczowych zawartych w próbce po 60 min inkubacji. bliczyć ilość wolnych kwasów tłuszczowych w miareczkowanej próbce. 3. bliczyć ilość wolnych kwasów tłuszczowych w mieszaninie reakcyjnej. 4. bliczyć ilość wolnych kwasów tłuszczowych uwalnianych przez 1 g preparatu 5. bliczyć ilość wolnych kwasów tłuszczowych uwalnianych przez 1 g preparatu w ciągu 1 minuty Wykres oraz obliczenia wykonać również dla zakupionego enzymu. LITERATURA R. Sharma, Y. Chisti, U.Ch. Banerjee, Production, purification, characterization and applications of lipase, Biotechnology Advances, 19, (001) 67-66, A. Houde, A. Kademi, D. Leblanc, Lipase and their industrial applications, Applied Biochemistry and Biotechnology, 188 (004) A. Illanes, Enzyme Biocatalysis. Principles and Applications, Springer, (008) D. Sharma, B. Sharma, A. K. Shukla, Biotechnological approach of microbial lipase: a review, Biotechnology, 10 (1) (011) 3-40 J.E. Jaeger, B.W. Dijkstra, M.T. Reetz, Bacterial biocatalysis: molecular biology, threedimensional structures and biotechnological applications of lipases, Annu. Rev. Microbiol., 53 (1999) T. Antczak, J. Graczyk, Lipazy: Źródła, struktura i właściwości katalityczne, Biotechnologia PI, (001) M.C. Flickinger, S.W. Drew, Encyclopedia of bioprocess technology: fermentation, biocatalysis andbioseparation, John Wiley & Sons, In., (1999) A. Cygański A., Chemiczne metody analizy ilościowej, WNT, Warszawa, (1999) Ch.W. Garner, L. Smith, Porcine pancreatic lipase, The journal of biological chemistry, 46 (197) , W. Bielawski, B. Zagdańska, Przewodnik do ćwiczeń z biochemii, Wydawnictwo SGGW, Warszawa (011) 11