Metody analizy flawonoidów w materiale roœlinnym

Transkrypt

1 PRACE PRZEGL DOWE Metody analizy flawonoidów w materiale roœlinnym Dorota Muth 1, Piotr Kachlicki 2 1 Instytut Chemii Bioorganicznej, Polska Akademia Nauk, Poznañ 2 Instytut Genetyki Roœlin, Polska Akademia Nauk, Poznañ Methods of flavonoids analysis in plant material Summary Flavonoids form a group of secondary metabolites ubiquitous in the plant kingdom. These compounds are synthesized in plant tissues on the phenylalanine lyase pathway and may be divided into several groups, differing in their skeleton: flavones, flavonols, isoflavons, flavanons, flavan-3-ols (catechins), anthocyanidins, aurons, and chalcons. All these compounds occurring in plant tissues may be hydroxylated, methylated or sulphated and are substituted with different groups such as sugars or acyls. More than 6000 compounds differing in their chemical and biological properties belong to this group. Fast and precise methods of identification and quantitative analysis of all these plant constituents are necessary because of their important biological functions and different applications of plant products. Instrumental analytical methods used in this purpose are described in the paper. Special concern is directed to particularly useful hyphenated chromatographic techniques such as HPLC/MS, HPLC/NMR, GC/MS, and CE/MS. Key words: flavonoids, glycoconjugates, instrumental methods, gas chromatography, liquid chromatography, mass spectrometry. Adres do korespondencji Piotr Kachlicki, Instytut Genetyki Roœlin, Polska Akademia Nauk, ul. Strzeszyñska 34, Poznañ. 2 (85) Wystêpowanie i rola flawonoidów Flawonoidy stanowi¹ liczn¹ grupê metabolitów wtórnych wystêpuj¹cych w królestwie roœlin. W ostatnich latach liczba publikacji na temat tej grupy zwi¹zków wzrasta ze wzglêdu na ich rolê w przebiegu procesów fizjologicznych i biochemicznych

2 Dorota Muth, Piotr Kachlicki w komórkach roœlinnych (1-4) oraz ró norodn¹ aktywnoœæ wobec organizmów ywych (roœlin, mikroorganizmów, owadów oraz zwierz¹t krêgowych) (5,6). Ze wzglêdu na znaczenie biologiczne i fizjologiczne flawonoidów poœwiêca siê im wiele uwagi w ró nych dziedzinach nauki. Szlak syntezy flawonoidów w roœlinach, chocia stosunkowo dobrze poznany, w dalszym ci¹gu jest przedmiotem wielu badañ w zwi¹zku z mo liwoœciami podniesienia poziomu flawonoidów w roœlinach metodami biotechnologicznymi (7,8) oraz ich istotn¹ rol¹ w regulacji wielu procesów rozwojowych oraz biochemicznych, czy te w podejœciach opieraj¹cych siê na koncepcjach biologii systemów (9,10). Ta grupa produktów naturalnych odgrywa w procesach patogenezy i symbiozy u roœlin rolê cz¹steczek obronnych lub sygnalnych, jednak e ich g³ówn¹ funkcj¹ jest ochrona komórek roœlinnych przed szkodliwym promieniowaniem UV-B (1,11,12). Ze wzglêdu na swój gorzki smak flawonoidy stanowi¹ substancje chroni¹ce roœliny przed atakiem zwierz¹t roœlino- ernych (13,14). Izoflawony odgrywaj¹ wa n¹ rolê podczas oddzia³ywañ symbiotycznych pomiêdzy roœlinami rodziny Fabaceae (bobowate, dawniej Papilionaceae motylkowate) a bakteriami glebowymi z rodzaju Rhizobium w procesie tworzenia brodawek korzeniowych, w których odbywa siê wi¹zanie azotu atmosferycznego (15). Flawonoidy bior¹ równie udzia³ w nawi¹zywaniu oddzia³ywañ symbiotycznych pomiêdzy korzeniami wiêkszoœci gatunków roœlin a grzybami mikoryzowymi (16). Antocyjany oraz niektóre flawony i ich pochodne s¹ odpowiedzialne za barwê kwiatów oraz owoców (17). Szereg glikozylowanych pochodnych flawonoidów odgrywa rolê repelentów lub atraktantów owadów podczas procesów zapylania roœlin (18,19). W³aœciwoœci antyutleniaj¹ce oraz estrogenowe sprawiaj¹, e flawonoidy s¹ po ¹danym sk³adnikiem diety (20). Ponadto znane s¹ z dzia³ania antybiotycznego oraz innych typów aktywnoœci farmakologicznej (21). Flawonoidy mog¹ równie modyfikowaæ dzia³anie enzymów przekazuj¹cych sygna³y miêdzy komórkami, szczególnym przyk³adem tego typu oddzia³ywañ jest efekt wywo³ywany przez flawonoidy na kinazy, które bezpoœrednio wp³ywaj¹ na uk³ad odpornoœciowy gospodarza (22). Wykazano równie, e pochodne flawonoli uczestnicz¹ w transporcie auksyn w roœlinach (23). Transformacja roœlin pod k¹tem zwiêkszenia poziomu syntezy tej klasy produktów naturalnych jest niezwykle wa nym kierunkiem badañ naukowych ze wzglêdu na istotn¹ rolê jak¹ odgrywaj¹ fenolowe metabolity wtórne w biochemii oraz fizjologii roœlin oraz ich aktywnoœæ biologiczn¹ w stosunku do innych organizmów ywych. Osi¹gniêcie tak postawionego celu wymaga jednak intensywnych badañ na wszystkich poziomach molekularnych od genomu, poprzez transkryptom, proteom do metabolomu i analizy transportu ró nych grup substancji pomiêdzy komórkami lub ich kompartmentami (24-27). Jednym z narzêdzi koniecznych do osi¹gniêcia tych e celów s¹ metody instrumentalne umo liwiaj¹ce obiektywn¹ identyfikacjê oraz analizê iloœciow¹ roœlinnych metabolitów wtórnych na poziomie metabolomu lub wybranych klas produktów naturalnych. 66 PRACE PRZEGL DOWE

3 Metody analizy flawonoidów w materiale roœlinnym 2. Struktura chemiczna flawonoidów oraz ich pochodnych Flawonoidy s¹ zwi¹zkami, których budowa jest oparta na szkielecie wêglowym C 6 -C 3 -C 6. Tê grupê produktów naturalnych mo na podzieliæ na szereg podstawowych klas: flawony, flawonole, izoflawony, flawanony, flawan-3-ole (katechiny), antocyjanidyny, aurony i chalkony (schemat) (28). Poszczególne klasy zwi¹zków ró ni¹ siê stopniem utlenienia pierœcienia C, z kolei w przypadku izoflawonów odmienne jest miejsce podstawienia pierœcienia fenylowego B. Najbardziej powszechn¹ modyfikacj¹ szkieletu flawonoidów jest hydroksylacja najczêœciej wystêpuj¹ca w pozycjach 3,5,7,3,4 oraz 5. Grupy hydroksylowe mog¹ byæ z kolei metylowane, sulfonowane, acylowane kwasami arylowymi b¹dÿ alifatycznymi oraz glikozylowane. Tak e podstawniki cukrowe mog¹ ulegaæ podobnym modyfikacjom. Flawonoidy magazynowane s¹ w komórkach w wakuoli, gdzie s¹ przechowywane w lepiej rozpuszczalnej w œrodowisku wodnym formie glikozydów, zarówno O-glikozydów oraz rzadziej w postaci C-glikozydów. Pozycjami podstawienia cukrów w wyniku utworzenia wi¹zania O-glikozydowego s¹ najczêœciej atomy wêgla C-3 i C-7, natomiast wi¹zania C-glikozydowe usytuowane s¹ w pozycjach C-6 oraz C-8. Najczêœciej przy³¹czanymi cukrami w pochodnych glikozydowych s¹ ramnoza, glukoza, galaktoza, arabinoza, czasami apioza oraz kwas glukuronowy. Glikozydy tworzone przez kwas glukuronowy z flawonoidami (glukuroniany) s¹ znane u ró nych rodzajów roœlin, ale tworzone s¹ tak e w w¹trobie zwierz¹t w wyniku dzia³ania UDP-glukuronylotransferaz na flawonoidy przyjmowane w po ywieniu (29). Glikozylowane pochodne flawonoidów mog¹ zawieraæ nawet do czterech reszt cukrowych przy³¹czonych do jednej lub dwóch grup hydroksylowych na aglikonie, znane s¹ równie mieszane glikozydy C- oraz O-podstawione (30,31). Powszechnie wystêpuj¹ce pochodne flawonoidów zawieraj¹ mono- di- (bardzo czêsto neohesperozydy, rutynozydy), tri- oraz tetrasacharydy, w których mo na rozró niæ wi¹zania glikozydowe 1-6, 1-2 oraz rzadziej 1-4, z kolei konfiguracja wi¹zania glikozydowego mo e przybieraæ formê lub. Cz¹steczki cukrów przy³¹czone do aglikonów mog¹ byæ nastêpnie acylowane, np. kwasem malonowym lub octowym, a tak e kwasami fenylopropenowymi (kumarowy, ferulowy, synapinowy). Miejsce podstawienia grupy acylowej na pierœcieniu cukrowym to zazwyczaj atomy wêgla C-2, C-4 lub C-6. Szacuje siê, e liczba znanych struktur pochodnych flawonoidów przekracza obecnie 6000 (30,32), jednak z ka - dym miesi¹cem powiêksza siê ona o nowo odkryte i opisane zwi¹zki. Ró norodnoœæ strukturalna tej klasy metabolitów wtórnych wynika z wielu mo liwoœci podstawienia grup modyfikuj¹cych szkielet cz¹steczki flawonoidu oraz cukrów podczas tworzenia glikozydów. W konsekwencji rozdzia³, identyfikacja oraz oznaczanie iloœciowe tych zwi¹zków stanowi du e wyzwanie. Kompletna analiza strukturalna glikopochodnych flawonoidów wymaga wyizolowania w stanie czystym wybranych po³¹czeñ z materia³u biologicznego w iloœci wystarczaj¹cej do równoleg³ego u ycia szeregu metod analitycznych, takich jak zw³aszcza spektroskopia j¹drowego rezonansu magnetycznego NMR, spektrometria mas oraz spektrofotometria UV. BIOTECHNOLOGIA 2 (85)

4 Dorota Muth, Piotr Kachlicki Schemat. Typy strukturalne flawonoidów. 68 PRACE PRZEGL DOWE

5 Metody analizy flawonoidów w materiale roœlinnym Niejednokrotnie celem badañ próbek ekstraktów uzyskiwanych z tkanek roœlinnych, kultur komórkowych lub tkankowych jest okreœlenie zmian jakoœciowych oraz iloœciowych cukrowych po³¹czeñ flawonoidów oraz wolnych aglikonów na przyk³ad pod wp³ywem stresu œrodowiskowego. W takich sytuacjach nie zawsze jest mo liwe precyzyjne okreœlenie wszystkich ró nic strukturalnych i rozró nienie wszystkich izomerów badanych produktów naturalnych. Liczba danych o budowie zwi¹zków uzyskiwanych w trakcie analiz jest zale na od rodzaju detektora sprzê onego z systemem rozdzia³u próbek. Analizy jakoœciowe oraz iloœciowe po³¹czeñ flawonoidów i innych metabolitów wtórnych o wa nej roli biologicznej s¹ niezwykle istotne w wielu projektach badawczych w ró nych dziedzinach nauki. Coraz czêœciej stosowanym podejœciem badawczym w naukach biologicznych jest analiza metabolomów lub wybranych klas metabolitów wtórnych (33-35) zarówno u organizmów zwierzêcych (w tym cz³owieka w ramach Human Metabolome Project (36)) jak i roœlinnych: (rzodkiewnik Arabidopsis thaliana (35,37-40), ziemniak Solanum tuberosum (41), pomidor Lycopersicon esculentum (42,43), ry Oryza sativa (44)). W zwi¹zku z prowadzeniem prac badawczych w tym zakresie w wielu laboratoriach na ca³ym œwiecie powsta³a pilna koniecznoœæ umo liwienia porównywalnoœci wyników uzyskanych przez ró ne grupy. W tym celu Metabolomic Society (Towarzystwo Metabolomiczne) utworzy³o grupê dyskusyjn¹ Metabolomics Standards Initiative (MSI), której celem jest zaproponowanie standardowych procedur analitycznych (45). Sk³ad metabolomów roœlinnych jest niezwykle skomplikowany szacuje siê, e w roœlinach jednego gatunku jest syntetyzowanych od 5 do 25 tysiêcy ró nych metabolitów pierwotnych i wtórnych (46), aczkolwiek nie jest wykluczone, e ten szacunek jest zani ony. Obecnie nie istniej¹ metody instrumentalne umo liwiaj¹ce jednoczesn¹ analizê wszystkich metabolitów danego organizmu czy nawet wybranej tkanki. Z tego te wzglêdu w badaniach pochodnych flawonoidowych wykorzystuje siê podejœcie metodyczne zwane analiz¹ celowan¹ (ang. targeted analysis), w której uwaga badacza jest skoncentrowana na wybranej klasie zwi¹zków (47). 3. Metody instrumentalne stosowane do identyfikacji oraz profilowania pochodnych flawonoidów Podejœcia analityczne stosowane do izolacji oraz identyfikacji i oznaczania flawonoidów by³y przedmiotem wielu prac przegl¹dowych (30,48-52). Najczêœciej stosowanymi technikami rozdzia³u mieszanin podczas profilowania zwi¹zków fenolowych s¹ chromatografia cieczowa lub elektroforeza kapilarna sprzê ona z detektorami UV i/lub spektrometrem mas (MS) ewentualnie spektrometrem NMR. Ponadto stosuje siê równie chromatografy gazowe sprzê one z systemami MS jednak e ten sposób wymaga dodatkowego etapu przeprowadzenia analizowanych zwi¹zków w bardziej lotne pochodne (48). BIOTECHNOLOGIA 2 (85)

6 Dorota Muth, Piotr Kachlicki 3.1. Stosowane techniki chromatograficzne rozdzia³ produktów naturalnych Zwi¹zki fenolowe nale ¹ do grupy zwi¹zków doœæ polarnych dlatego powszechnie stosowan¹ metod¹ ich rozdzia³u jest chromatografia cieczowa. Najczêœciej stosuje siê kolumny z odwrócona faz¹ C-18 lub C-8, w których noœnikiem jest el krzemionkowy modyfikowany ³añcuchowymi pochodnymi alkilowymi o odpowiedniej d³ugoœci. Dobór eluentów, czasu analizy, gradientu czy temperatury kolumny s¹ ustalane przez eksperymentatora w zale noœci od z³o onoœci rozdzielanej mieszaniny flawonoidów. W wiêkszoœci prac analitycznych wykorzystuje siê acetonitryl i wodê z dodatkiem kwasów fosforowego, mrówkowego, octowego b¹dÿ trójfluorooctowego. Rozdzia³ chromatograficzny mo e byæ przeprowadzany w temperaturze pokojowej jednak e jej podwy szenie mo e zapewniæ lepsz¹ rozdzielczoœæ i powtarzalnoœæ czasów retencji oraz przyspieszyæ czas analizy. Znane s¹ równie przyk³ady zastosowania kolumn monolitycznych do analizy flawonoidów (53,54). Wype³nienie kolumny stanowi pojedynczy prêt monolitycznej odpowiednio modyfikowanej krzemionki o wysokiej czystoœci. Dziêki takiej konstrukcji fazy stacjonarnej mo liwe jest zwiêkszenie prêdkoœci przep³ywu eluenta skutkuj¹ce skróceniem czasu analizy z zachowaniem wysokiej rozdzielczoœci, przy czym nie zwiêksza siê ciœnienie roztworów w porównaniu do kolumn o wype³nieniu ziarnistym (55). Zdolnoœæ rozdzielcza systemu chromatograficznego odgrywa ogromn¹ rolê w identyfikacji izomerów flawonoidów. W ostatnich latach pojawi³a siê nowa generacja systemów chromatograficznych, ultrawysokosprawna chromatografia cieczowa, w których stosuje siê kolumny wype³nione z³o em o œrednicy ziaren poni ej 2 m. Analizy wykonywane s¹ pod wysokim ciœnieniem ( barów) i przy zwiêkszonych przep³ywach fazy ruchomej co znacznie podwy sza ich czu³oœæ i rozdzielczoœæ oraz skraca czas w porównaniu do tradycyjnej HPLC (56,57). Zastosowanie tej techniki umo liwi³o na przyk³ad rozró nienie 5 izomerycznych malonylowanych glikozydów chryzoeriolu w liœciach ³ubinu w¹skolistnego, których prawid³owy rozdzia³ na kolumnie HPLC nie by³ mo liwy (58) Systemy chromatograficzne i detektory stosowane w analizach flawonoidów Detektor UV Wszystkie flawonoidy absorbuj¹ œwiat³o w zakresie UV, a niektóre z nich (antocyjany) tak e œwiat³o widzialne, w zwi¹zku z tym detektory UV doœæ dobrze nadaj¹ siê do analiz tej grupy zwi¹zków i ich iloœciowego oznaczania na drodze chromatografii cieczowej. Widma absorpcyjne flawonoidów w UV zawieraj¹ kilka maksimów i na podstawie ich analizy mo na rozró niæ poszczególne grupy strukturalne w obrêbie tej kategorii metabolitów. Maksimum rejestrowane w zakresie nm 70 PRACE PRZEGL DOWE

7 Metody analizy flawonoidów w materiale roœlinnym pochodzi od absorpcji pierœcienia A, absorpcja œwiat³a w zakresie nm zale- y od sposobu podstawienia pierœcienia C oraz miejsca przy³¹czenia do niego pierœcienia B (59). Nale y jednak pamiêtaæ, e ph roztworu ma du y wp³yw na widmo UV zwi¹zków fenolowych i podwy szanie ph skutkuje przesuwaniem maksimów absorpcji ku wy szym d³ugoœciom fali. D³ugoœci fal charakterystyczne dla absorpcji poszczególnych klas flawonoidów mo na ograniczyæ do kilku maksimów mieszcz¹cych siê w zakresie od 250 do 400 nm (60). W instrumentach HPLC mo na stosowaæ monochromatyczne detektory UV mierz¹ce absorpcjê przy jednej b¹dÿ dwóch d³ugoœciach fali, b¹dÿ detektory diodowe (DAD) lub skanuj¹ce, które s¹ przystosowane do pomiaru absorpcji promieniowania w szerszym zakresie oraz rejestracji widm absorpcyjnych poszczególnych zwi¹zków. Przy stosowaniu detektorów monochromatycznych oznaczenie iloœciowe z³o onych mieszanin flawonoidów i izoflawonoidów podczas jednej analizy jest bardzo trudne lub wrêcz niemo liwe. W detektorach DAD mo na dokonywaæ pomiarów przy d³ugoœciach fali charakterystycznych dla analizowanych klas zwi¹zków fenolowych i poprawnie rozró niaæ ich typy strukturalne. Jednak e urz¹dzenia tego typu charakteryzuj¹ siê nieco ni sz¹ czu³oœci¹ ni detektory monochromatyczne. Wykorzystanie detektorów absorbuj¹cych promieniowanie UV mo e byæ wystarczaj¹cym narzêdziem w analizie ekstraktów wczeœniej zidentyfikowanych zwi¹zków fenolowych (61,62). Jednak e w przypadku analizy bardziej z³o onych mieszanin bardzo czêsto mamy do czynienia z koelucj¹, czyli jednoczesnym wymywaniem ró nych zwi¹zków, uniemo liwiaj¹c¹ jednoznaczne iloœciowe oznaczenie zawartoœci poszczególnych zwi¹zków. W takich sytuacjach konieczne jest zastosowanie dodatkowego detektora, na przyk³ad spektrometru mas (63) Spektrometry mas Do identyfikacji oraz profilowania produktów naturalnych s¹ wykorzystywane spektrometry mas o ró norodnej budowie, stopniu z³o onoœci i precyzji oznaczania mas badanych jonów. W przypadku analiz z³o onych mieszanin substancji stosuje siê spektrometr mas po³¹czony z aparatem do chromatografii gazowej (GC, ang. gas chromatography), cieczowej (LC, ang. liquid chromatography) lub aparatem do elektroforezy kapilarnej (CE, ang. capillary electrophoresis). Postêp w rozwoju technik wzbudzania (jonizacji) analizowanych substancji, rozdzia³u jonów (rozdzielczoœæ) i czu- ³oœci spektrometrów mas umo liwia coraz dok³adniejsze oznaczanie nawet œladowych iloœci zwi¹zków (64). Rozwój technik spektrometrii mas wi¹ e siê równie z postêpem metod bioinformatycznych. Programy pozwalaj¹ce na wyci¹gniêcie wa nych informacji z wielkich zestawów danych, licz¹cych w niektórych przypadkach setki próbek, wygenerowanych podczas doœwiadczeñ GC/MS i LC/MS s¹ niezwykle istotnym narzêdziem do analizy metabolomu i zachodz¹cych w nim zmian (65). BIOTECHNOLOGIA 2 (85)

8 Dorota Muth, Piotr Kachlicki Spektrometria mas jest metod¹ umo liwiaj¹c¹ okreœlenie masy cz¹steczkowej oraz sk³adu elementarnego zwi¹zku na podstawie pomiaru stosunku masy (m) do ³adunku (z) m/z zjonizowanych cz¹steczek (M + w przypadku jonizacji elektronami oraz [M+H] + /[M-H] - w przypadku jonizacji poprzez elekrorozpraszanie) dokonywanego z du ¹ dok³adnoœci¹, do kilku miejsc znacz¹cych po przecinku. W wielu przypadkach mo na wnioskowaæ o strukturze zwi¹zku na podstawie zarejestrowanych w widmie masowym wartoœci m/z jonów fragmentacyjnych powstaj¹cych w wyniku rozpadu jonów molekularnych (M + ) oraz protonowanych lub deprotonowanych cz¹steczek ([M+H] + /[M-H] - ). Dziêki mo liwoœci stosowania ró - nych metod jonizacji substancji badanych oraz ró nego rodzaju typów analizatorów, metoda spektrometrii mas jest jedn¹ z technik najpowszechniej wykorzystywanych do analizy ich sk³adu. Do spektrometru mas mo na wprowadzaæ próbki za pomoc¹ chromatografu gazowego lub chromatografu cieczowego i stosuje siê wtedy odpowiednio jonizacjê elektronami (EI) lub chemiczn¹ (CI) albo metody jonizacji pod ciœnieniem atmosferycznym cz¹steczek znajduj¹cych siê w roztworach (jonizacja) poprzez elektrorozpraszanie ESI lub jonizacja chemiczna pod ciœnieniem atmosferycznym APCI. W Ÿród³ach jonów mo na uzyskiwaæ jony dodatnie lub ujemne i w zale noœci od chemicznego charakteru badanych zwi¹zków dokonuje siê analizy odpowiednio wybranych jonów i produktów ich fragmentacji. Widma zarejestrowane dla jonów ujemnych charakteryzuj¹ siê z regu³y wiêksz¹ czu³oœci¹ ni dla dodatnich, jednak e w wielu przypadkach widma wykonane w obydwu trybach dostarczaj¹ uzupe³niaj¹cych siê informacji na temat struktury analizowanych zwi¹zków (66). Interesuj¹ce s¹ mo liwoœci zastosowania innej techniki jonizacji substancji jak¹ jest laserowa desorpcja-jonizacja wspomagana matryc¹ (MALDI, ang. Matrix Assisted Laser Desorption Ionization). Nie jest to typowa technika jonizacji stosowana w analizie ma³ocz¹steczkowych zwi¹zków, zosta³a ona stworzona do wzbudzania biomoleku³ o masie wiêkszej ni 500 Da. Polega ona na naœwietlaniu laserem wykrystalizowanej na p³ytce stalowej substancji badanej zmieszanej z matryc¹. Matryca jest zwi¹zkiem, którego zadaniem jest przyjêcie fotonów i przekazanie energii analizowanym cz¹steczkom w celu ich zjonizowania i przeniesienia w stan gazowy. Technika MALDI-ToF jest technik¹ wysokorozdzielcz¹ co umo liwia precyzyjne okreœlenie masy zwi¹zku, a na jej podstawie sk³adu elementarnego. Zastosowanie MALDI-ToF w analizie metabolitów pozwala na pominiêcie rozdzia³u chromatograficznego, jednak wymaga precyzyjnego doboru matrycy oraz warunków eksperymentalnych (67). Dziêki zastosowaniu techniki jonizacji MALDI zidentyfikowano oraz oznaczono iloœciowo cztery glikozydy wyizolowane z ³upiny migda³ów (68), a tak e stwierdzono zachodzenie zmian iloœciowych w sk³adzie antocyjanów w liœciach Arabidopsis thaliana zachodz¹cych pod wp³ywem stresu ch³odu (69). Poszukiwanie dogodnych warunków analizy ekstraktów za pomoc¹ tej techniki jest po ¹dane ze wzglêdu na znacznie skrócony czas oznaczania jednej próbki oraz zwiêkszenie wydajnoœci przeprowadzonych analiz. 72 PRACE PRZEGL DOWE

9 Metody analizy flawonoidów w materiale roœlinnym Systemy GC/MS Chromatografia gazowa jest mniej popularn¹ metod¹ jeœli chodzi o analizê flawonoidów ze wzglêdu na w³aœciwoœci fizykochemiczne ich cz¹steczek. Wspomniano ju, e zwi¹zki te w tkankach roœlin wystêpuj¹ w doœæ z³o onej formie wielokrotnie podstawianych glikozydów. Charakteryzuj¹ siê one wysok¹ niestabilnoœci¹ termiczn¹ oraz nisk¹ lotnoœci¹, co powoduje koniecznoœæ chemicznej modyfikacji cz¹steczek przed analiz¹. Reakcje blokowania grup polarnych powoduj¹ bardzo du y wzrost masy cz¹steczkowej do wartoœci ponad 1000 Da, co przekracza zakres detekcji wiêkszoœci instrumentów GC/MS. Ponadto zmodyfikowane pochodne flawonoidów ulegaj¹ czêstokroæ rozk³adowi termicznemu podczas nastrzyku na kolumnê chromatograficzn¹ lub podczas rozdzia³u w kolumnie. Chromatografia gazowa jest wykorzystywana od lat 60. ubieg³ego wieku do analiz aglikonów flawonoidów, jednak po wprowadzeniu i usprawnieniu metod chromatografii cieczowej oraz opracowaniu metod jonizacji pod ciœnieniem atmosferycznym ESI i APCI straci³a na znaczeniu. Jonizacja elektronami jest podstawow¹ metod¹ stosowan¹ w systemach GC/MS poniewa próbka wprowadzana do Ÿród³a jonów znajduje siê w postaci gazowej. Jest to tzw. twarda metoda jonizacji, gdy podczas procesu wzbudzania cz¹steczek nastêpuje du y wzrost ich energii wewnêtrznej. Prowadzi to do znacznej fragmentacji analizowanych zwi¹zków w Ÿródle jonów i czêsto jony molekularne obserwowane w widmie masowym s¹ bardzo ma³o intensywne lub ulegaj¹ ca³kowitemu rozpadowi na jony fragmentacyjne. Obecnie analizy GC/MS wykorzystywane s¹ g³ównie do badania zawartoœci metabolitów pierwotnych oraz niezbyt polarnych, stabilnych termicznie metabolitów wtórnych. Mo liwa jest analiza szerokiej gamy zwi¹zków takich jak aminokwasy, cukry oraz szereg ich pochodnych, kwasy t³uszczowe, metabolity cyklu Krebsa, steroidy i sterole, niektóre alkaloidy i zwi¹zki fenolowe. W i- dentyfikacji rozdzielanych zwi¹zków bardzo pomocne s¹ powszechnie dostêpne bazy danych widm masowych oraz ci¹gle doskonalone programy do dekonwolucji pików (70). Po³¹czenia flawonoidów s¹ zwi¹zkami stosunkowo polarnymi i labilnymi termicznie, dlatego warunkiem wykonania analizy GC/MS jest hydroliza po³¹czeñ glikozydowych oraz przekszta³cenie aglikonów w substancje bardziej lotne i stabilne w wysokiej temperaturze (71). Istnieje szeroka gama odczynników przeprowadzaj¹cych grupy hydroksylowe w pochodne eterowe b¹dÿ estrowe. Grupy hydroksylowe przeprowadza siê w mniej polarne poprzez podstawienie ich grupami metylowymi, lub trialkilosililowymi TMS (poprzez blokowanie N-(trimetylosililo)-N-metylotrifluoroacetamidem lub N-(tert-butylodimetylosililo)-N-metylotrifluoroacetamidem). Porównanie analizy sililowanych oraz metylowanych pochodnych izoflawonów z ekstraktów korzeni ³ubinu metod¹ GC-MS dostarczy³o ciekawych wniosków strukturalnych (72). Zastosowanie odczynnika CD 3 I zosta³o zaprezentowane jako sposób na okreœlenie pozycji podstawienia natywnej grupy metylowej w cz¹steczce flawonoidu (73). Podczas fragmentacji pochodnych sililowych mo emy zaobserwowaæ eli- BIOTECHNOLOGIA 2 (85)

10 Dorota Muth, Piotr Kachlicki minacjê rodników metylowych, grup trimetylosilanowych lub te jednoczesn¹ eliminacjê dwóch grup metylowych, z których powstaj¹ fragmenty specyficzne dla danego zwi¹zku (74). Trzeba równie wzi¹æ pod uwagê, e podczas procesu syntezy pochodnych sililowych mog¹ tworzyæ siê produkty uboczne, które mog¹ utrudniæ analizê iloœciow¹ badanych zwi¹zków. Dodatkowym problemem jest koniecznoœæ przechowywania pochodnych TMS w warunkach bezwodnych gdy ³atwo ulegaj¹ one hydrolizie Systemy LC/MS Strategi¹ powszechnie stosowan¹ w analizie metabolitów wtórnych jest profilowanie metabolitów, które polega na analizie tylko wybranej grupy zwi¹zków, np. alkaloidów lub flawonoidów. Podczas analizy produktów biosyntezy szlaku fenylopropanoidowego istotne s¹ formy glikozylacji b¹dÿ acylacji pochodnych flawonoidów oraz ich zmiany iloœciowe w okreœlonych punktach czasowych ró nego rodzaju doœwiadczeñ biologicznych. Jonizacja pod ciœnieniem atmosferycznym, któr¹ stosuje siê gdy wprowadzana próbka jest w roztworze, prowadzi do powstania jonów pseudomolekularnych protonowanych lub deprotonowanych cz¹steczek [M+H] + /[M-H] -. Procesem krytycznym dla przeprowadzenia analizy HPLC/MS jest odparowanie du- ej iloœci wycieku z kolumny w Ÿródle jonów. Podczas jonizacji analizowanym zwi¹zkom dostarczane s¹ bardzo niewielkie iloœci energii, dlatego na widmie obserwujemy tylko jon pochodz¹cy od niefragmentowanej cz¹steczki. Tandemowe spektrometry mas umo liwiaj¹ wykonanie fragmentacji (rozpadu) jonów [M+H] + /[M-H] - w celu uzyskania informacji o budowie zwi¹zku. Proces ten zachodzi na drodze kolizyjnie indukowanej dysocjacji (CID, ang. Collision Induced Dissociation), prowadzonej w analizatorze lub jego czêœci, w której jony poddawane s¹ fragmentacji poprzez zderzenia z atomami gazu szlachetnego, np. helu lub argonu. Analizatory wykorzystywane do tego rodzaju eksperymentów zazwyczaj s¹ doœæ z³o one konstrukcyjnie. Najczêœciej stosowane w instrumentach HPLC/MS s¹ potrójny analizator kwadrupolowy QQQ, pu³apka jonowa IT, analizator cyklotronowego rezonansu jonowego wykorzystuj¹cy transformacjê Fouriera FTICR, lub te analizatory hybrydowe takie jak kwadrupol sprzê ony z analizatorem czasu przelotu QToF, oraz wysokorozdzielczy analizator dzia³aj¹cy na zasadzie pu³apki jonowej OrbiTrap. W zale noœci od zastosowanego analizatora uzyskiwane s¹ widma o niskiej lub wysokiej rozdzielczoœci. Wysoka rozdzielczoœæ pozwala na wyznaczenie masy i okreœlenie sk³adu elementarnego zwi¹zku na podstawie wartoœci m/z jonów rejestrowanych w widmie masowym z dok³adnoœci¹, w zale noœci od typu analizatora ~ 2-5 ppm. Nale y zdawaæ sobie sprawê, e precyzja okreœlania masy zale y od typu spektrometru, a analiza porównawcza rozdzielczoœci detektorów klasyfikuje najwy ej FTICR (75). Trzeba tu podkreœliæ, e jedynie dziêki zastosowaniu spektrometrów mas rejestruj¹cych widma CID MS/MS mo na wykryæ oraz iloœciowo oznaczyæ koeluuj¹ce z kolumny 74 PRACE PRZEGL DOWE

11 Metody analizy flawonoidów w materiale roœlinnym Rys. Widma MS n jonów [M-H] - trzech ró nych dwuglikozydów flawonoli Arabidopsis thaliana wymywanych w jednym wierzcho³ku chromatograficznym podczas analizy HPLC/MS (38). A 3-O-glukozyd-7-O-ramnozyd kempferolu; B 3-O-ramnozyd-7-O-ramnozyd kwercetyny; C 3-O-glukozyd-7-O-ramnozyd izoramnetyny. BIOTECHNOLOGIA 2 (85)

12 Dorota Muth, Piotr Kachlicki chromatograficznej ró ne zwi¹zki wystêpuj¹ce w bardzo ró nych iloœciach. Przyk³ad takiej analizy pokazano na rysunku przedstawiaj¹cym widma trzech ró nych dwuglikozydów flawonoli z liœci Arabidopsis thaliana, które s¹ wymywane w jednym wierzcho³ku chromatograficznym w systemie HPLC (38). Badania strukturalne zmierzaj¹ce do rozró nienia izomerów C- i O- glikozydów oraz O-diglikozydów flawonoidów technik¹ HPLC/MS prowadzono ju w latach 90. XX w. przy u yciu nie stosowanej ju metody jonizacji FAB (76-79). Wraz z udoskonalaniem metod analitycznych badano mo liwoœci okreœlenia pozycji podstawienia reszty cukrowej do aglikonu na podstawie widm fragmentacyjnych deprotonowanych cz¹steczek (80,81). Scharakteryzowano równie wi¹zania interglikozydowe di-, tri-, tetra- i pentaglikozylowanych flawonoidów na podstawie intensywnoœci jonów fragmentacyjnych (82). Mo liwe jest równie okreœlenie jakie cz¹steczki cukrów wchodz¹ w sk³ad glikozydu. Analizê strukturaln¹ glikozydów flawonoidów mo na przeprowadziæ wykorzystuj¹c modyfikacjê mechanizmów fragmentacji przez tworzenie jonów sodowanych [M+Na] +, b¹dÿ te z dodatkami dwuwartoœciowych kationów metali. Obydwie metody prowadz¹ do uzyskania informacji o sposobie podstawienia cz¹steczek cukrowych i pozycjach ich przy³¹czenia do cz¹steczki aglikonu (80,83,84). Podczas wykonywania analiz zw³aszcza przy zastosowaniu jonizacji ESI nale y zwróciæ uwagê na parametry napiêciowe w Ÿródle jonów oraz w komorze kolizyjnej (energia kolizji), które maj¹ wp³yw na stopieñ fragmentacji zwi¹zków. Przy³o enie wiêkszej ró nicy potencja³ów w Ÿródle jonów powoduje fragmentacjê zwi¹zku ju na tym etapie analizy. Zabieg ten bywa stosowany w przypadku flawonoidów w celu rozerwania wi¹zañ glikozydowych jeszcze w Ÿródle jonów i identyfikacji aglikonów na podstawie ich fragmentacji w wyniku procesu CID. Diagnostyczne jony fragmentacyjne aglikonów flawonoidów powstaj¹ podczas reakcji retro Dielsa Aldera, (RDA) zachodz¹cej w pierœcieniu C (38,85,86) Systemy CE/MS Elektroforeza kapilarna jest stosunkowo now¹ metod¹ rozdzia³u zwi¹zków chemicznych, wprowadzon¹ na szersz¹ skalê pod koniec lat 80. XX w. wraz z dostêpnoœci¹ komercyjnych instrumentów analitycznych. Rozdzia³ komponentów próbki nastêpuje w wyniku zró nicowanej szybkoœci migracji cz¹steczek w roztworze elektrolitu wewn¹trz kapilary o œrednicy m i d³ugoœci kilkudziesiêciu centymetrów, do której przy³o ono napiêcie elektryczne rzêdu kilkunastu kv. Klasyczn¹ technikê tego typu rozdzia³ów strefow¹ elektroforezê kapilarn¹ (CZE, ang. Capillary Zone Electrophoresis) stosuje siê najczêœciej do analizy substancji obdarzonych ³adunkiem lub takich, które mo na zjonizowaæ w odpowiednim ph. Rozdzia³ niepolarnych zwi¹zków niena³adowanych elektrycznie mo na osi¹gn¹æ dodaj¹c do buforu elektrolitycznego detergenty jonowe tworz¹ce na³adowane micele migruj¹ce w po- 76 PRACE PRZEGL DOWE

13 Metody analizy flawonoidów w materiale roœlinnym lu elektrycznym, w których wnêtrzu przenoszone s¹ substancje analizowane. Ten wariant elektroforezy kapilarnej, nazywany micelarn¹ elektrokinetyczn¹ chromatografi¹ kapilarn¹ (MEKC, ang. Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography), jest szczególnie przydatny w badaniach metabolitów wtórnych. Metoda ta w po³¹czeniu ze spektrometrem mas (CE/MS) jest jednak rzadziej stosowana do analizy flawonoidów, aczkolwiek jej u ycie pozwoli³o na rozdzielenie i zidentyfikowanie 18 ró - nych flawonoidów i ich glikozydów, podczas gdy wczeœniej stosowane metody oparte na HPLC ujawni³y obecnoœæ tylko 5 zwi¹zków tej kategorii w tej samej próbce (86) Systemy HPLC/NMR Spektroskopia NMR jest metod¹ analityczn¹ dostarczaj¹c¹ jednoznaczne informacje o strukturze badanych zwi¹zków na podstawie widm rezonansowych j¹der atomów 1 H oraz 13 C. Opracowano ró norodne techniki umo liwiaj¹ce rejestracjê dwuwymiarowych widm odzwierciedlaj¹cych interakcje pobliskich atomów np. homonuklearne techniki COSY (ang. Correlation Spectroscopy) i NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) lub heteronuklearne HSQC (ang. Heteronuclear Single Quantum Correlation) i HMBC (ang. Heteronuclear Multiple Bond Correlation). Wad¹ spektrometrii NMR jest stosunkowo niska czu³oœæ, jednak postêp technologiczny ostatnich lat umo liwi³ stworzenie systemów HPLC-NMR jako w pe³ni funkcjonalnej metody analitycznej, stosowanej równie do analizy flawonoidów izolowanych z tkanek roœlin (88-91). Zastosowanie takich systemów eliminuje koniecznoœæ izolacji i oczyszczania poszczególnych zwi¹zków w celu ich identyfikacji, jednak konieczne jest pokonanie przeszkód wynikaj¹cych z niskiej czu³oœci NMR (92). Obecnie mo liwe jest instalowanie w spektrometrach NMR sprzê onych z instrumentami HPLC magnesów o wysokim polu przynajmniej 500, a nawet MHz. Innym rozwi¹zaniem pozwalaj¹cym na rejestracjê widm kolejnych zwi¹zków wymywanych z kolumny jest zatrzymywanie przep³ywu eluenta na czas niezbêdny do akwizycji widm. Dziêki temu mo na przeprowadziæ ró ne eksperymenty NMR, w³¹cznie z dwuwymiarowymi pomiarami widm interakcji 1 H- 13 C jak HSQC i HMBC u ywaj¹c nawet tylko 10 g próbki (92). Alternatyw¹ do stosowania akwizycji widm NMR przez spektrometr liniowo sprzê ony z HPLC jest wykonywanie pomiarów off line, w których kolejne zwi¹zki s¹ zbierane w wycieku z kolumny i ich widma s¹ uzyskiwane po zakoñczeniu eksperymentu chromatograficznego. W wiêkszoœci przypadków analizy HPLC/NMR u ywane s¹ jako wsparcie i uzupe³nienie wyników doœwiadczeñ HPLC/MS/MS, które zazwyczaj przeprowadza siê w pierwszej kolejnoœci. Wykazano np., e u dziurawca zwyczajnego (Hypericum perforatum L.) wystêpuj¹ dwa ró ne glikozydy kwercetyny, które koeluuj¹ z kolumny RP C-18 i maj¹ identyczne widma MS/MS, jednak na podstawie widm NMR mo na by³o stwierdziæ, e s¹ to 3- -D-glukozyd i 3- -D-galaktozyd (89). Innym problemem nierozwi¹zywalnym zazwyczaj przy zastosowaniu wy- BIOTECHNOLOGIA 2 (85)

14 Dorota Muth, Piotr Kachlicki ³¹cznie technik HPLC/MS jest lokalizacja miejsc malonylacji u glikokoniugatów flawonoidów. Jednak u ycie HPLC/NMR umo liwi³o zidentyfikowanie izomerycznych 7-O- -D-glukozydów izoflawonów formononetyny i bioczaniny A jako zestryfikowanych przez kwas malonowy w pozycjach 4 lub 6 cz¹steczki glukozy (90). Publikacja zosta³a przygotowana dziêki finansowaniu przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wy - szego, projekt badawczy nr 2 P06A Literatura 1. Dixon R. A., Paiva N. L., (1995), Plant Cell, 7, Taylor L. P., Grotewold E., (2005), Curr. Opin. Plant Biol., 8, Peer W. A., Murphy A. S., (2007), Trends Plant Sci., 12, Treutter D., (2005), Plant Biol., 7, Walle T., (2004), Free Radical Biol. Medicine, 36, Moon Y. J., (2006), Toxicology in Vitro, 20, Winkel-Shirley B., (2001), Plant Physiol., 126, Dixon R. A., Steel C. L., (1999), Trends Plant Sci., 4, Fernie A. R., Trethewey R. N., Krotzky A. J. Willmitzer L., (2004), Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 5, Dixon R. A., Strack D., (2003), Phytochemistry, 62, Olsson L. C., Veit M., Weissenböck G., Bornman J. F., (1998), Phytochemistry, 49, Reuber S., Bornman J. F., Weissenböck G., (1996), Physiol. Plant., 97, Lahtinen M., Salminen J., Kapari L., Lempa K., Ossipov V., Sinkkonen J., Valkama E., Haukioja E., Pihlaja K., (2004), J. Chem. Ecol., 30, Arimura G., Tashiro K., Kuhara S., Nishioka T., Ozawa R. T., Akabayashi J., (2000), Biochem. Biophys. Res. Com., 277, Garg N., Geetanjali, (2007), Agron. Sustain. Dev., 27, Shaw L. J., Morris P., Hooker J. E., (2006), Environ. Microbiol., 8, Goto T., Kondo T., (1991), Angew. Chem. Intern., ed. 30, Clegg M. T., Durbin M. L., (2000), Proc. Nat. Acad. Sci., 97, Jones K. N., Riethel J. S., (2001), Am. J. Bot., 88, Dixon R. A., Steel C. L., (1999), Trends Plant Sci., 4, Weidenborner M., Jha H. C., (1994), Mycol. Res., 98, Middleton E. M., Teramura A. H., (1993), Plant Physiol., 103, Peer W. A., Murphy A. S., (2007), Trends Plant Sci., 12, Weckwerth W., (2003), Annu. Rev. Plant Biol., 54, Trethewey R. N., (2004), Curr. Opin. Plant Biol., 7, Lange B. M., (2006), Curr. Opin. Plant Biol., 9, Oksman-Caldentey K. M., Saito K., (2005), Curr. Opin. Plant Biol., 16, Stafford H. A., (1990), Flavonoid metabolism, CRC Press, Boca Raton. 29. Zhang L., Zuo Z., Lin G., (2007), Molecular Pharmaceutics, 4, FLAVONOIDS Chemistry, Biochemistry and Applications, (2006), Eds. Andersen Ø. M., Markham K. R., CRC Press Taylor & Francis Group, Boca Raton, USA. 31. Harborne J. B., Williams C. A., (2000), Phytochemistry, 55, Rauha J. P., Vuorela H., Kostiainen R., (2001), J. Mass Spectrom., 36, Fernie A. R., Trethewey R. N., Krotzky A. J., Willmitzer L., (2004), Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 5, Hall R. D., (2006), New Phytologist., 169, PRACE PRZEGL DOWE

15 Metody analizy flawonoidów w materiale roœlinnym 35. Weckwerth W., (2003), Annu. Rev. Plant Biol., 54, Wishart D. S., (2007), Pharmacogenomics, 8, Tohge T., Nishiyama Y., Hirai M. Y., Yano M., Nakajima J-I., Awazuhara M., Inoue E., Takahashi H., Goodenowe D. B., Kitayama M., Noji M., Yamazaki M., Saito K., (2005), Plant J., 42, Stobiecki M., Skirycz A., Kerhoas L., Kachlicki P., Muth D., Einhorn J., Mueller-Roeber B., (2006), Metabolomics, 2, Pourcel L., Routaboul J-M., Kerhoas L., Caboche M., Lepiniec L., (2005), Plant Cell., 17, Routaboul J-M., Kerhoas L., Debeaujon I., Pourcel L., Caboche M., Einhorn J., Lepiniec L., (2006), Planta, 224, Roessner U., Willmitzer L., Fernie A. R., (2001), Plant Physiol., 127, Le Gall G., DuPont M. S., Mellon F. A., Davis A. L., Collins G. J., Verhoyen M. E., Colquhoun I. J., (2003), J. Agric. Food Chem., 51, Moco S. I. A., Bino R. J., Vorst O. F. J., Verhoeven H. A., de Groot J. C. W., van Beek T. A., Vervoort J. J. M., de Vos C. H., (2006), Plant Physiology, 141, Sato S., Soga T., Nishioka T., Tomita M., (2004), Plant J., 40, Fiehn O., Sumner L. W., Rhee S. Y., Ward J., Dickerson J., Lange B. M., Lane G., Roessner U., Last R., Nikolau B., (2007), Metabolomics, 3, Tretheway R. N., (2004), Current Oppin. Plant Biol., 7, Muth D., Kachlicki P., Stobiecki M., (2007), Biotechnologia, 1(76), de Rijke E., Out P., Niessen W., Ariese F., Gooijer C., Brinkman U., (2006), J. Chromatogr. A, 1112, Stalikas C., (2007), J. Sep. Sci., 30, Prasain J. K., Wang C-C., Barnes S., (2004), Free Radic. Res., 37, Stobiecki M., Kachlicki P., (2006), in: The Science of Flavonoids, Ed. Grotewold E., Springer Science and Business Media, New York, Cuyckens F., Claeys M., (2004), J. Mass Spectrom., 39, Maruska A., Kornysova O., (2006), J. Chromatogr. A., 1112, Tolstikov V., Fiehn O., Tanaka N., (2007), Metabolomics: Methods and Protocols, Humana Press. 55. Mistry K., Grinberg N., (2005), J. Chromatogr. Rel. Tech., 28, Plumb R., Castro-Perez J., Granger J., Beattie I., Joncour K., Wright A., (2004), Rapid Comm. Mass Spec., 18, Churchwell M., Twaddle N., Meeker L., Doerge D. R., (2005), J. Chromatogr. B, 825, Muth D., Marsden-Edwards E., Kachlicki P., Stobiecki M., (2008), Phytochem. Anal., 19, The Systematic Identification of Flavonoids, (1970), Eds. Mabry T. J., Markham K. R., Thomas M. B., Springer-Verlag, New York, NY, USA. 60. Merken H. M., Beecher G. R., (2000), J. Agric. Food Chem., 48, Carini M., Aldini G., Furlanetto S., Stefani R., Maffei F. R., (2001), J. Pharm. Biomed. Anal., 24, Luczkiewicz M., Glod D., Baczek T., Bucinski A., (2004), Chromatographia, 60, Kachlicki P., Marczak L., Kerhoas L., Einhorn J., Stobiecki M., (2005), J. Mass Spectrom., 40, Wilkins C., (2007), Trends Anal. Chem., 26, Smith C. A., Want E.,J., O Maille G., Abagyan R., Siuzdak G., (2006), Anal. Chem., 78, Fabre N., Rustan I., de Hoffmann E., Quetin-Leclercq J., (2001), J. Am. Soc. Mass Spectrom., 12, Vaidyanathan S., (2006), Rapid Comm. Mass Spectrom., 20, Frison-Norrie S., Sporns P., (2002), J. Agric. Food Chem., 50, Marczak., Kachlicki P., KoŸniewski P., Skirycz A., Krajewski P., Stobiecki M., (2008), Rapid Comm. Mass Spectrom., 22, Kopka J., Schauer N., Krueger S., Birkemeyer C., Usadel B., Bergmüller E., Dörmann P., Weckwerth W., Gibon Y., Stitt M., Willmitzer L., Fernie A.R., Steinhauser D., (2005), Bioinformatics, 21, Lisec J., Schauer N., Kopka J., Willmitzer L., Fernie A. R., (2006), Nature Protocols, 1, Stobiecki M., Wojtaszek P., (1990), J. Chromatogr., 508, BIOTECHNOLOGIA 2 (85)

16 Dorota Muth, Piotr Kachlicki 73. Bednarek P., Franski R., Kerhoas L., Einhorn J., Wojtaszek P., Stobiecki M., (2001), Phytochemistry, 56, Maul R., Schebb N. H., Kulling S. E., (2008), Anal. Bioanal. Chem., 391, Bristow A., Webb K., (2003), J. Am. Soc. Mass Spectrom., 14, Li Q. M., van den Heuvel H., Dillen L., Claeys M., (1992), Biol. Mass Spectrom., 21, Li Q. M., Claeys M., (1994), Biol. Mass Spectrom., 23, Ma Y. L., Vedernikova I., van den Heuvel H., Claeys M., (2000), J. Am. Soc. of Mass Spectrom., 11, Ma Y. L., Cuyckens F., van den Heuvel H., Claeys M., (2001), Phytochem. Anal., 12, Cuyckens F., Claeys M., (2005), J. Mass Spectrom., 40, Hvattum E., Ekeberg D., (2003), J. Mass Spectrom., 38, Ferreres F., Llorach R., Gil-Izquierdo A., (2004), J. Mass Spectrom., 39, Kachlicki P., Einhorn J., Muth D., Kerhoas L., Stobiecki M., (2008), J. Mass Spectrom., 43, Davis B. D., Brodbelt J. S., (2004), J. Am. Soc. Mass Spectrom., 15, Wolfender J. L., (2000), Analusis, 28, March R. E., Lewars E. G., Stadey C. J., Miao X-S., Zhao X., Metcalfe C. D., (2006), Int. J. Mass Spectrom., 248, Edwards E. L., Rodrigues J. A., Ferreira J., Goodall D. M., Rauter A. P., Justino J., Thomas-Oates J., (2006), Electrophoresis, 27, Wolfender J. L., Rodriguez S., Hostettmann K., Hiller W., (1997), Phytochem. Anal., 8, Hansen S. H., Jensen A. G., Cornett C., Bjørnsdottir I., Taylor S., Wright B., Wilson I. D., (1999), Anal. Chem., 71, de Rijke E., de Kanter F., Ariese F., Brinkman U. A. T., Gooijer C., (2004), J. Sep. Sci., 27, Waridel P., Wolfender J. L., Lachavanne J. B., Hostettmann K., (2004), Phytochemistry, 65, Wolfender J. L., Ndjoko K., Hostettmann K., (2001), Phytochem. Anal., 12, PRACE PRZEGL DOWE