Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych - ćwiczenie nr 5

Transkrypt

1 Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych - ćwiczenie nr 5 przedmiot: Techniki Rozdzielania Mieszanin kierunek studiów: Biotechnologia, 3-ci rok Opracowali : Zatwierdził : mgr inż. Mariusz Jaszczołt mgr inż. Anita Skrzypczak prof. dr hab. inż. Marian Kamiński Sprawdzenie i korekty : mgr inż. Grzegorz Boczkaj Gdańsk, 2011

2 Spis treści Wstęp... 2 Wprowadzenie... 2 Podstawowe informacje i zależności Chromatografia wykluczania / Chromatografia żelowa (Size Exclusion Chromatography SEC/Gel Permeation Chromatography GPC) Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (Hydrophobic Interaction Chromatography HIC) Chromatografia jonowa i jonowymienna (Ion Chromatography - IC, Ion Exchange Chromatography - IEC)... 8 Wymagania do kolokwium wejściowego Literatura Opis przykładowych zadań laboratoryjnych w tematyce ćwiczenia Oznaczenie zawartości α-laktoalbuminy w serwatce przy zastosowaniu chromatografii oddziaływań hydrofobowych (HIC) Wyznaczenie rozkłady masy molekularnej biopolimerów zawartych w serwatce z wykorzystaniem chromatografii wykluczania (SEC) w warunkach hydrofilowych Sprawozdanie Wstęp Ćwiczenia laboratoryjne z przedmiotu Techniki Rozdzielania Mieszanin odbywają się w trybie 5-cio tygodniowym, podczas którego studenci mają za zadanie wyizolować z mleka krowiego białko serwatkowe α-laktoalbuminę i/albo laktozę, poznając przy tym różne techniki rozdzielania, pozwalające na rozdzielenie, identyfikację i oznaczenie wybranych składników serwatki mleka. Wprowadzenie Chromatografia jest przede wszystkim techniką rozdzielania substancji. Po zastosowaniu detektora, spełniającego rolę przepływowego instrumentu pomiarowego staje się techniką analityczną. Oznaczanie zawartości substancji w mieszaninie jest często trudne, albo niemożliwe, a po ich rozdzieleniu problem analityczny z reguły staje się zasadniczo prostszy. Szczególna zaletą chromatografii cieczowej jest ogromnie szeroki zakres uniwersalności tej techniki rozdzielania. Można ją zastosować do analizy mieszanin prawie 2

3 wszystkich substancji, zarówno lotnych, jak i nielotnych, trwałych i nietrwałych termicznie itd., pod warunkiem istnienia jakiegokolwiek ich rozpuszczalnika. Podstawowe informacje i zależności 1. Chromatografia wykluczania / Chromatografia żelowa (Size Exclusion Chromatography SEC/Gel Permeation Chromatography GPC) Mechanizm rozdzielania substancji w chromatografii wykluczania (żelowej) Sorbent (faza stacjonarna) składa się z porowatych ziaren, co powoduje powstanie wewnątrz złoża sorbentu powstanie przestrzeni między- i wewnątrz-ziarnowych. W przypadku, natomiast, tzw. kolumn monolitycznych, wypełnienie posiada mezopory o dużych rozmiarach- w miejsce porów międzyziarnowych (kolumny wypełnione) i mikropory wewnątrz litego szkieletu. Pory wewnątrz ziaren wypełnienia kolumny, albo mikropory w kolumnach monolitycznych, zawsze mają w pewnym stopniu zróżnicowane średnice, a więc charakteryzują się określonym rozkładem wartości promieni hydrodynamicznych. W kolumnach do chromatografii wykluczania wartość przeciętna i charakter rozkładu średnic porów są tak dobrane, aby ich rozmiary były dostosowane do wielkości średnic hydrodynamicznych rozdzielanych cząsteczek. 3

4 Rys..1. Ilustracja zależności logarytmu masy cząsteczkowej od objętości elucji (log Mw = f(ve), otrzymywanej podczas kalibracji metody oznaczania rozkładu masy cząsteczkowej z zastosowaniem chromatografii wykluczania. W warunkach chromatografii wykluczania (SEC- Size Exclusin Chromatography albo GPC -Gel Permeation Chromatography) dąży się o ile to tylko możliwe, do całkowitego wyeliminowania oddziaływań sorpcyjnych między powierzchnią wypełnienia kolumny i cząsteczkami rozdzielanych substancji. Wówczas mechanizm rozdzielania jest termodynamicznie prosty. Wykorzystuje się zróżnicowanie drogi i czasu dyfuzji cząsteczek o zróżnicowanej wielkości i masie cząsteczkowej, w przestrzeni porów wewnątrz ziaren wypełnienia kolumny, albo w mikroporach kolumny monolitycznej. W konsekwencji uzyskuje się określoną zależność funkcyjną między wartością logarytmu masy molekularnej rozdzielanych cząsteczek i objętością ich elucji z kolumny (rys. 1). Składniki próbki o największych wymiarach cząsteczek lub cząstek, a więc o największej masie cząsteczkowej, albo penetrują najmniejszą część porów, tzn. tylko pory o największych średnicach, do których są w stanie wniknąć, albo płyną między ziarnami (w przestrzeni makro i mezoporów). Tym samym względnie szybko opuszczają kolumnę (pomimo najniższej wartości współczynnika dyfuzji - co jest okolicznością niekorzystną). Natomiast, cząsteczki o najmniejszych wymiarach, a więc o najmniejszej masie cząsteczkowej i o największej wartości współczynnika dyfuzji, penetrują wszystkie pory, stąd ich retencja jest największa. Substancje o pośrednich rozmiarach, a więc o pośrednich masach cząsteczkowych i pośrednich wartościach współczynnika dyfuzji, wnikają do tych porów, które są dostatecznie dużych rozmiarów, stąd ich retencja jest pośrednia. Chromatografia wykluczania jest wykonywana w dwóch głównych alternatywnych układach separacyjnych: w warunkach nie wodnych, tzn. w warunkach, nazywanych lipofilowymi, z zastosowaniem takich eluentów, jak: THF, dichlorometan, dioksan, chlorobenzen, dichlorobenzen, ksylen i tym podobne oraz kopolimeru styren-diwinylobenzen (najczęściej), albo poliestrów, lub innego typu polimerów, jako fazy stacjonarnej. Jest wtedy wykorzystywana do badań rozkładu masy cząsteczkowej polimerów nisko i 4

5 średnio polarnych, rozpuszczalnych w rozpuszczalnikach niepolarnych, a także lipidów, fosfolipidów itp. niskopolarnych substancji pochodzenia naturalnego; w warunkach wodnych, z wykorzystaniem buforów albo z zastosowaniem rozpuszczalników, takich jak dimetyloformamid, metanol, acetonitryl i ich mieszaniny z wodą; z zastosowaniem wypełnień kolumn o ziarnach wykonanych z polarnych polimerów, takich jak polidekstrany i inne policukry, poliwęglany, szkła porowate, silanizowany żel krzemionkowy i tym podobnych materiałów. Jest wykorzystywana do rozdzielania, a także do charakteryzowania rozkładu masy cząsteczkowej polimerów polarnych, a szczególnie biopolimerów, takich jak polisacharydyy, białka, nukleotydy i tym podobne, niekiedy w połączeniach z substancjami o niższej polarności. 2. Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (Hydrophobic Interaction Chromatography HIC) Należy zwrócić też uwagę na duże znaczenie chromatografii oddziaływań hydrofobowych (HIC), zarówno do wstępnego monitorowania składu białkowego badanego materiału biologicznego, jak i do zastosowań preparatywnych. Proces rozdzielania opiera się na hydrofobowych oddziaływaniach pomiędzy hydrofobowym ligandem związanym z fazą stacjonarną a niepolarnym regionem na powierzchni biomolekuły. Te hydrofobowe oddziaływania są zwiększane przez obecność soli w eluencie, powoduje ona odsłonięcie hydrofobowej części białka przez zakłócenie ułożenia cząsteczek wody wokół białka. Fazy stacjonarne stosowane w chromatografii oddziaływań hydrofobowych to sorbenty typu C 3, C 4, C 5, albo C 6 lub fenyl wiązane najczęściej z sieciowaną agarozą lub syntetycznym kopolimerem o odpowiednim zakresie wielkości porów (300 A, albo większe). Proces rozdzielania wykonuje się przy malejącym gradiencie stężenia soli podczas elucji (rys. 2). Rodzaj soli i jej stężenie znacząco wpływa na oddziaływania hydrofobowe pomiędzy białkiem a hydrofobowym adsorbentem. Jednakże, stężenie soli stosowane podczas rozdzielenia powinno być nieznacznie niższe od punktu wysalania cząsteczki białka. Co więcej szereg Hofmeistera zestawia sole według zdolności wysalania białka: (NH 4 ) 2 SO 4 > KH 2 PO 4 > Na 2 HPO 4 > Na 2 SO 4 > CH 3 COOK> CH 3 COONa> NaCl. 5

6 Rys 2. Rozdzielanie 1. Cytochromu c, 2. Mioglobiny, 3. β-laktoglobuliny, 4. Rybonukleazy A, 5. Lizozymu, 6. α-chymotrypsyny, 7. ChymotrypsynogenuA; na kolumnie YMC-Pack HIC 4,6x250 mm; Eluent: A 2.0 M (NH4)2SO M KH 2 PO 4 ph 6,8; B 0.1M KH 2 PO 4 ph 6,8; Program elucji: 0-100%B w 30 min.; v=1.0 ml/min. Detekcja UV 254 nm; Aminokwasy budujące białka wykazują właściwości kwasowo zasadowe (amfoteryczne), które w roztworach wodnych tworzą roztwory koloidalne, których faza rozproszona stanowią cząstki o wymiarach do 100nm, natomiast masa cząsteczkowa wynosić może nawet do 10 6 Da. Rozpuszczalność białek wodzie jest często niska. Rośnie wraz z niewielkim wzrostem siły jonowej rozpuszczalnika. Spowodowane jest to tworzeniem otoczki złożonej z jonów obecnych w roztworze. Tym samym zapobiega to agregacji fragmentów białka (wsalanie białka). Zmniejszenie otoczki hydratacyjnej obecnej na powierzchni białka przez dodatek znacznej ilości soli nieorganicznej jest nazywane procesem wysalania. Można osiągnąć takie stężenie soli nieorganicznej w roztworze, że określone białko ulegnie wytrąceniu z roztworu. Jest to jednak proces odwracalny, którego cofnięcie następuje przez dodatek rozpuszczalnika (obniżenie stężenia soli). Zdolność kationów i anionów nieorganicznych do wysalania zależy od ich charakteru fizyko chemicznego. Ze względu na siłę wysalania jony można uszeregować tworząc tzw. szereg Hofmeistera. Przykładowo, fibrynogen ulega wysoleniu przy stężeniu chlorku sodu równym 0.8 M. Poniżej przedstawiono schemat procesu wsalania i wysalania. 6

7 Rys.3 Wsalanie iwysalanie w warunkach rosnącej siły jonowej roztworu (Koolman i Röhm 2005) Temperatura i ph buforu również wpływają na oddziaływania białek z fazą stacjonarną. Ze wzrostem temperatury wzrasta retencja białka, wpływ ph na białko jest bardziej złożony. Przypuszczalnie oddziaływania hydrofobowe są silniejsze, gdy ph buforu znajduje się blisko punktu izoelektrycznego białka. Główną zaletą chromatografii oddziaływań hydrofobowych (HIC) do rozdzielania białek i peptydów jest zachowanie aktywności biologicznej cząsteczek, przez co rozdzielanie jest mniej destrukcyjne niż w przypadku układu faz odwróconych (RP-HPLC). Jednakże, nie wszystkie białka obecne w badanej próbce zawsze zostają rozdzielone, zatem nie można metody HIC traktować, jako panaceum separacyjne. Należy zawsze ją brać pod uwagę, gdy konieczne jest rozdzielanie białek i peptydów o wysokich masach molekularnych (powyżej 50kDa). Na efektywność rozdzielania w chromatografii oddziaływań na wpływ szereg czynników, m.in.: typ liganda i jego gęstość na powierzchni sorbentu, rodzaj nośnika, rodzaj soli i jej stężenie,,skład eluentu, ph i temperatura. W chromatografii oddziaływań hydrofobowych stosuje się dwa rodzaje ligandów immobilizowanych do nośnika, grupy alkilowe oddziałują z cząsteczka analitu tylko wykorzystując oddziaływania hydrofobowe, natomiast grupy arylowe dodatkowo wykorzystują wiązania π-π. Pojemność złoża oraz siła wiązania z molekułami rośnie wraz z długością łańcucha alkilowego. Wybór liganda częstokroć opiera się na metodzie prób i błędów. Pojemność złoża rośnie wraz z gęstością liganda, aż do stanu nasycenia. Jednak zbyt 7

8 duża gęstość powierzchniowa liganda nie jest oczekiwana, zwarzywszy na fakt, wzrostu siły wiązania ligand-analit. Stosowane nośniki (agarowa, poliakrylamidy i syntetyczne silikony) różnią się właściwościami hydrofobowymi, co przekłada się na retencję rozdzielanych molekuł, dlatego wybór rodzaju nośnika, często wpływa na warunki adsorpcji i elucji. Rodzaj i stężenie soli w zasadniczy sposób wpływa na rozdzielanie molekuł. W szczególności polipeptydów i białek. Wraz ze wzrostem stężenia soli rośnie udział oddziaływań hydrofobowych w procesie separacji molekuł, tym samym retencja również rośnie. W pewnym zakresie stężenia soli wzrost ilości białka sorbowane na powierzchni fazy stacjonarnej rośnie liniowo. Po uzyskaniu stężenia soli powodującego wysalanie białka wzrost ilości białka sorbowanego na fazie stacjonarnej rośnie wykładniczo, co ma niekorzystny wpływ na selektywność rozdzielania. Szereg Hofmeistera przedstawia sole ułożone wraz z malejącą zdolnością do wysalania białek. Sole silnie wysalające zwiększają z znaczny sposób silę oddziaływania miedzy analitem, a sorbentem, co jak już było wspomniane ma niekorzystny wpływ na selektywność rozdzielnia. Zarówno temperatur, jak i wartość wpływają na siłę oddziaływań hydrofobowych. Wraz ze wzrostem temperatury siła oddziaływań hydrofobowych fragmentów makromolekuł i liganda związanego z fazą stacjonarna rosną. Inaczej jest w przypadku stężenia jonów wodorowych, których wzrost stężenia wpływa na wzrost retencji rozdzielanej molekuły, przez wzrost siły oddziaływań składników sorbentu, a fragmentami molekuły. 3. Chromatografia jonowa i jonowymienna (Ion Chromatography - IC, Ion Exchange Chromatography - IEC) Metoda rozdzielania opiera się na sorpcji i desorpcji obdarzonych ładunkiem elektrycznym cząsteczek analitu oraz przeciwnie naładowanymi fragmentami fazy stacjonarnej. Rozdzielanie i oznaczanie nieorganicznych, albo organicznych kationów, albo/i anionów, a także aminokwasów, peptydów, białek, nukleotydów, sacharydów, amin i innych wysoce polarnych i obdarzonych ładunkiem jonizowalnych, albo trwale spolaryzowanych oraz silnie polaryzowalnych substancji. Obecnie technika chromatografii jonowymiennej jest stosowana do preparatywnego rozdzielania peptydów i białek. Mechanizm rozdzielania w chromatografii jonowymiennej, zgodnie z nazwą metody, polega na wykorzystaniu procesów wymiany jonów, lub tylko na wykorzystaniu oddziaływań jon indukowany - jon indukowany między powierzchnią fazy stacjonarnej, a fazą ruchomą i 8

9 jonowymi, lub jonizowanymi składnikami roztworu substancji rozdzielanych. Najczęściej wykorzystuje się w tym celu pakowane kolumny, a bardzo rzadko już dzisiaj cienkowarstwową fazę stacjonarną (np. w formie celulozowej bibuły, gdzie proces rozdzielania ma często także jonowymienny charakter, przy słabych oddziaływaniach jonowymiennych). Wymieniacze jonowe (jonity) stosowane w jonowymiennej chromatografii, to ciała stałe o rozwiniętej powierzchni, nierozpuszczalne w wodzie i w innych rozpuszczalnikach, posiadające zdolność wymiany jonów z roztworem. W zależności od rodzaju grup wymiennych dzielimy je na dwie grupy (tab. 1): kationity - jonity wymieniające kationy z roztworu w eluencie; anionity - jonity wymieniające aniony z roztworu w eluencie. Znane są też wymieniacze amfoteryczne, które w zależności od ph roztworu mają zdolność wymiany anionów lub kationów, a także wymieniacze bipolarne, które mogą jednocześnie wymieniać obydwa rodzaje jonów. Nie znalazły one dotychczas szerszego zastosowania w praktyce, chociaż ciągle trwają badania nad rozwojem ich zastosowań. Właściwości wymieniaczy jonowych są różne w zależności od pochodzenia jonitu. Według kryterium pochodzenia wymieniacze jonowe można podzielić na następujące grupy: Jonity naturalne Są to głównie kationity pochodzenia mineralnego czyli glinokrzemiany. Największe zastosowania znalazły zeolity o składzie Na 2 O CaO Al 2 O 3 nsio 2 mh 2 O. Jonity półsyntetyczne Najpopularniejsze z nich to tzw. węgle sulfonowane o nazwach handlowych Permutyt-H, Zeocarb HJ,Wofatit-X. Jonity syntetyczne Pierwszymi wymieniaczami z tej grupy były syntetyczne związki typu glinokrzemianów - żele i permutyty, jednak ze względu na znikomą zdolność wymiany jonów w środowisku kwaśnym oraz nietrwałość, nie znalazły szerszego zastosowania. Rozróżnia się mocne i słabe wymieniacze jonowe. Mocne kationity w postaci sprotonowanej, charakteryzujące się niską wartością ph (niższą od 2). Grupami aktywnymi są najczęściej grupy alkilo-, albo arylosulfonowe 9

10 związane wiązaniem zaniem kowalencyjnym z powierzchni powierzchnią polimerowego, albo krzemionkowego, lub innego typu nośnika. Mocne anionity w postaci ci hydroksylowej, hydroksylowej charakteryzujące sięę wysokim ph (wyższym (wy od 10). Grupą aktywnąą jest najczęściej najcz grupa tetraalkilo-,, albo tetraarylotetraarylo amoniowa związana wiązaniem iem kowalencyjnym z powierzchni powierzchnią polimerowego, albo krzemionkowego, lub innego typu nośnika. no Słabe kationity zawierają na powierzchni sorpcyjnej grupy karboksylowe. W postaci sprotonowanej charakteryzuj kteryzują się stosunkowo wysokimi wartościami ciami ph (2-7), (2 Słabe anionity zawierają aminy i ph ich hydroksylowej postaci wynosi Przy czym, słaby aby kationit jest tym mocniejszym kationitem, im wyżej wyżej rzędowa rzę jest amina związana na powierzchni nośnika. noś Należy także pamiętać ętać by dla wymieniaczy jonowych, związanych zanych kowalencyjnie z żelem krzemionkowym, nie przekraczać prze ph eluentu poza zakres 1,8 do 8.7, ponieważ poniewa może nastąpić hydroliza wiązania ązania Si-O-CSi i trwała utrata właściwości ci jonowymiennych sorbentu! Tab.1. Typy wymieniaczy jonowych stosowanych w IEC. Skład eluentu jest dobierany przede wszystkim w ten sposób, aby zapewnić zapewni dostateczne rozdzielenie oznaczanych jonów. Sterować Sterowa można na rodzajem przeciwjonu, ph i siłą jonową eluentu. Dla mocnych kationitów i anionitów można mo na stwierdzić, stwierdzić ogólnie, że im wyższa siła iła jonowa eluentu, tym wyższa wy sza jego siła elucyjna, natomiast ph winno być by stałe i tak dobrane, aby zapewniało dysocjację dysocjacj jonów rozdzielanych substancji i jonów związanych zwi z powierzchnią żywicy. ywicy. Rodzaj przeciwjonu winien by być dostosowany do stopnia powinowactwa twa jonów rozdzielanych do powierzchni wymieniacza jonowego. Dobierając Dobieraj 10

11 stężenie składników eluentu, oprócz wymaganej siły elucji, należy, więc, brać pod uwagę ph eluentu, które, jak wspomniano, należy tak dobrać, aby wszystkie oznaczane substancje były zdysocjowane (ph(eluentu) > pka (najsłabiej dysocjującego kwaśnego składnika próbki), albo ph (eluentu) < pkb najsłabiej dysocjującego zasadowego składnika próbki)). Musi być ono jednocześnie zawarte w zakresie dopuszczalnego ph dla stosowanej fazy stacjonarnej! Należy też brać pod uwagę, opisaną powyżej, możliwość istnienia oddziaływań hydrofobowych z powierzchnią polimerowej fazy stacjonarnej. W wysokosprawnej chromatografii jonowymiennej (jonowej), oprócz detekcji konduktometrycznej, znaczenie mają następujące metody detekcji: detekcja potencjometryczna, woltamperometryczna, amperometryczna impulsowa lub integracyjna, fluoroscencyjna, refraktometryczna, pośrednia i bezpośrednia detekcja spektrofotometryczna w zakresie UV i VIS, a także spektrometria absorpcji atomowej (AAS), spektrometria emisyjna z indukcyjnie generowana plazmą (ICP) oraz (ICP-MS). Ponadto coraz bardziej popularne jest sprzężenie chromatografii jonowymiennej ze spektrometrem absorpcji atomowej (AAS), albo ze spektrometrem emisji atomowej z wzbudzeniem plazmowym (ICP-AES). Można w ten sposób oznaczać śladowe ilości pierwiastków (metali) w ogrodowisku naturalnym. Szczególnie wysokie czułości oznaczania można osiągnąć w połączeniu HPIC z ICP AES i ze spektrometrią mas (HPIC-ICP/AES-MS). W ten sposób można oznaczać metale w stężeniu od ok. 1 ppt do 10% zawartości w próbce dozowanej do kolumny chromatograficznej. Poniżej przedstawiono przykładowy chromatogram wraz z warunkami rozdzielania i detekcji dla próbki mieszaniny nukleotydów. 11

12 Rys 4.Chromatogram rozdzielania mieszaniny nukleotydów. Kolumna MonoQ HR 5/5, eluent : K2HPO410 mm, ph 8,0 (A), K2HPO4 50 mm + 0,25 M NaCl, ph 8,0 (B). program elucji: 0-3min 0 0% B, 3--30min 75% B. Linią przerywaną zaznaczona jest zmiana składu eluentu rejestrowana przy pomocy detektora konduktywności. konduktywno Detektor konduktometryczny, natężenie ężenie przepływu 1,5ml/min, obj. doz. 50µl 50 Wymagania agania do kolokwium wejściowego Szczegółowy wykaz zagadnień podano w harmonogramie ćwiczeńń laboratoryjnych. 1. Zakres wiadomości ści objęty obję niniejszą instrukcją 2. Chromatografia jonowa i jonowymienna * str Chromatografia hromatografia wykluczania (żelowa) ( * str Chromatografia romatografia oddziaływań oddziaływa hydrofobowych - wiadomości ci z instrukcji 5. Techniki echniki membranowe**: mikro-, ultra-,, nanofiltracja, zasady doboru membran, problem faulingu i sposoby przeciwdziałania jemu. 6. Techniki echniki elektromigracyjne: elektroforeza żelowa elowa (1D/2D), izoelektryczne, elektroforeza kapilarna Literatura Literatura podstawowa: *M.Kamiński (ed.) Chromatografia Cieczowa, CEEAM, CE Gdańsk, 2004; ** R. Rautenbach, Procesy membranowe, WNT-W-wa, WNT wyd ogniskowanmie

13 *** J. Cazes (ed) Encyclopedia of Chromatography, Marcel Dekker, New York, 2001 (w zakresie elektroforezy), Literatura dodatkowa: 1) Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, WNT-W-wa, wyd lub 2005; 2) M. Berek, M. Dressler, M. Kubin, K. Marcinka, Chromatografia żelowa, PWN, W-wa, 1989; 3) K. Hostettman, A. Morston, Preparative Chromatography Techniques Applications, Springer Verlag, 1998; 4) O. Mikes, HPLC of Biopolimers ond Biooligomers Elsevier, Amsterdam, 1988; 5) J. Weiss, Handbook of ion chromatography vol 1,2, Wiley-VCH Opis przykładowych zadań laboratoryjnych w tematyce ćwiczenia 1. Oznaczenie zawartości α-laktoalbuminy w serwatce przy zastosowaniu chromatografii oddziaływań hydrofobowych (HIC). Materiały i Sprzęt Laboratoryjny Wzorzec α-laktoalbuminy, roztwór serwatki oraz bufor fosforanowy o ph 5,8, bufor fosforanowy o ph5,8 z dodatkiem 0,8M Na 2 SO 4, woda ultraczysta do HPLC (Milipore, USA), o czystości do HPLC, woda dejonizowana, probówki i fiolki szklane, pipeta automatyczna, strzykawka do HPLC z płaską igłą, i tłokiem z PTFE, naczynie na ścieki; Aparatura Aparaty chromatograficzne typu HPLC: pompa, dozownik zaworowy, kolumna Phenyl, 120 x 4,6 mm, 3µm. detektor refraktometryczny RI, detektor UV-VIS lub UV typu DAD, integrator albo komputerowy system rejestracji i przetwarzania danych. Warunki rozdzielania i detekcji W trakcie analiz roztworów wzorcowych α-laktoalbuminy (otrzymanych od prowadzącego) jak i próbki serwatki warunki prowadzenia rozdzieleń powinny być stale i nie zmienne. Skład eluentu: A- bufor fosforanowy 0,1M, ph 5,8 + 1,5M (NH 4 ) 2 SO 4, B - bufor fosforanowy 0,1M, ph 5,8; program elucji 0min do 40 min 100% A 0% A, natężenie przepływu fazy ruchomej powinno wynosić 1ml/min., temperatura pokojowa, objętość próbki dozowanej do kolumny: 50 µl. Sposób wykonania: Warunki rozdzielania, i detekcji. 13

14 1) Ustawić skład eluentu: A- bufor fosforanowy 0,1M, ph 5,8 + 1,5M (NH 4 ) 2 SO 4, B - bufor fosforanowy 0,1M, ph 5,8; natężenie przepływu fazy ruchomej 1 ml/min 2) Ustabilizować warunki rozdzielania (stabilna linia podstawowa detektora RI oraz detektora UV-VIS typu DAD, powierzchnia sorpcyjna kolumny zrównoważona ze stosowanym eluentem). 3) Po ustabilizowaniu warunków rozdzielania wprowadzić do pętli zaworu dozującego o pojemności 1200µl, co najmniej 50µl próbki w położenie load zaworu. Po stwierdzeniu gotowości systemu rejestracji i przetwarzania danych (komunikat waiting for injection w przypadku stosowania komputerowego systemu rejestracji i przetwarzania danych), wprowadzić próbkę do kolumny ( zadozować wstrzyknąć próbkę, przekręcić zawór w pozycję inject ). Obserwować przebieg rozdzielania, kontrolować prawidłowość pracy aparatu, zanotować warunki rozdzielania i detekcji oraz naszkicować schemat aparatu, a także wyjaśnić z prowadzącym ewentualne wątpliwości. 4) Po zarejestrowaniu chromatogramu, odczytać wartość czasu retencji i powierzchnie poszczególnych pików z detektora UV-VIS (typ DAD). 5) W wyżej opisany sposób wykonać analizy chromatograficzne wszystkich sporządzonych roztworów wzbogaconych serwatki α-laktoalbuminą Zarejestrować chromatogramy i wyznaczyć powierzchnie pików α-laktoalbuminy dla poszczególnych roztworów kalibracyjnych. 6) W identycznych jak wcześniej warunkach, które stosowano podczas wzorcowania i w taki sam sposób, zadozować do kolumny roztwór próbki serwatki o nieznanym stężeniu α-laktoalbuminy 7) Zarejestrować chromatogram i odczytać powierzchnię piku oznaczanej α-laktoalbuminy w analizowanej próbce serwatki 8) Na postawie uzyskanej krzywej kalibracyjnej wyznaczyć zawartość laktozy w próbce serwatki wyrażonej w mg/l 2. Wyznaczenie rozkłady masy molekularnej biopolimerów zawartych w serwatce z wykorzystaniem chromatografii wykluczania (SEC) w warunkach hydrofilowych. Materiały i Sprzęt Laboratoryjny Wzorzec α-laktoalbuminy, roztwór serwatki oraz bufor fosforanowy o ph 5,8, woda ultraczysta do HPLC (Milipore, USA), o czystości do HPLC, woda dejonizowana, probówki i 14

15 fiolki szklane, pipeta automatyczna, strzykawka do HPLC z płaską igłą, i tłokiem z PTFE, naczynie na ścieki; Aparatura Aparaty chromatograficzne typu HPLC: pompa, dozownik zaworowy, kolumna GFC- 250, 150 x 4 mm, 100Å. detektor refraktometryczny RI, detektor UV-VIS i komputerowy system rejestracji i przetwarzania danych. Warunki rozdzielania i detekcji W trakcie analiz roztworów wzorcowych α-laktoalbuminy, b-laktoglobuliny oraz albuminy z surowicy wołowej - BSA (otrzymanych od prowadzącego) jak i próbki serwatki warunki prowadzenia rozdzieleń powinny być stale i nie zmienne. Skład eluentu bufor fosforanowy 0,1M ph 5,8 + 0,3M NaCl, natężenie przepływu fazy ruchomej powinno wynosić 0,5 ml/min., temperatura pokojowa, objętość próbki dozowanej do kolumny: 50 µl. Sposób wykonania: Warunki rozdzielania, i detekcji. Analogiczne jak przedstawione wyżej. Sprawozdanie Każda grupa przygotowuje odrębne sprawozdanie w formie odręcznego czytelnego manuskryptu, z odpowiednimi obliczeniami i wykresami oraz naszkicowanymi odręcznie i poprawnie opisanymi chromatogramami. Każde z pięciu ćwiczeń stanowi odrębną część sprawozdania końcowego i powinno zawierać następujące części oraz informacje: - Wprowadzenie - opis operacji przygotowawczych oraz separacyjnych i wykorzystywane zjawiska fizykochemiczne mające główny / drugorzędny wpływ na osiągane rezultaty rozdzielania, opis optymalnych warunków i ograniczeń utrudniających / uniemożliwiających osiągnięcie optymalnych warunków, opinię dotyczącą zalet i wad uwzględnionych operacji i procesów separacyjnych, a także technik detekcji oraz metod oznaczania; - Cel ćwiczenia; - Część doświadczalna - opis i warunki eksperymentów wykonanych podczas ćwiczenia, z podziałem, jak w publikacji naukowej, na: Materiały; Aparatura i wyposażenie; 15

16 Metodyka i sposób opracowania wyników (Proszę stosować tabelaryczne przedstawianie danych i warunków oraz zamieszczać schematy budowy stanowisk laboratoryjnych, aparatury, kolumn i sprzętu pomocniczego z odpowiednimi opisami w podpisie pod rysunkami - w sposób jak najkrótszy, jednak na tyle jednoznaczny, aby można było na tej podstawie zamieszczonych danych i informacji powtórzyć eksperymenty bez konsultowania się z wykonawcą, tzn., konieczne jest podanie nazw, typu, modelu, stopnia czystości, producenta, stężeń itp. danych, proszę w części metodyka zamieścić także przykłady wykonanych obliczeń wraz z jednostkami fizycznymi, po jednym przykładzie dla obliczania konkretnej wielkości) - Wyniki i dyskusja, zestawienie wyników w formie rysunków, tabel, fotografii, danych uzyskanych w rezultacie wykonanych obliczeń itp., wraz z opisem co one przedstawiają i jakie wnioski z nich wynikają; - Wnioski końcowe - zestawienie wniosków wynikających z całej serii pięciu ćwiczeń, jednak bez powtarzania wniosków zamieszczonych w poszczególnych częściach sprawozdania, natomiast kilka wniosków znajdujących się w różnych częściach sprawozdania może być podstawą do sformułowania odpowiedniego wniosku końcowego (w tym sensie powtórzenie jest dopuszczalne); - Spis literatury - proszę zamieścić w sposób zgodny z zasadami cytowania literatury stosowanymi w publikacjach naukowych tylko te pozycje, z których rzeczywiście korzystali autorzy sprawozdania. Nad przygotowaniem sprawozdania powinna pracować cała grupa wykonująca ćwiczenie. Na stronie czołowej powinny zostać wpisane czytelnie nazwiska osób wykonujących ćwiczenie oraz sprawozdanie wraz z podpisami. Podpis oznacza, że określona osoba brała udział w pracy nad przygotowaniem sprawozdania i współodpowiada za jego treść i zamieszczone wnioski. 16