(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: , ( 5 1 ) IntCl5: A61K 6/00 A61K 35/32 (22) Data zgłoszenia: (54) Sposób wytwarzania frakcji białkowej matrycy szkliwa o niskiej masie cząsteczkowej (30) Pierwszeństwo: ,SE, (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 22/89 (73) Uprawniony z patentu: Bioventures N.V., Curacao, AN (72) Twórcy wynalazku: Lars Hammarstrm, Djurshoim, SE Leif Blomlf, Liding, SE Sven Lindskog, Varby, SE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 03/93 (74) Pełnomocnik: PHZ "Polservice", Warszawa, PL PL B1 (57) 1. Sposób wytwarzania frakcji białkowej matrycy szkliwa o niskiej masie cząsteczkowej przez odzyskanie frakcji z zawiązków zębów, znamienny tym, że izoluje się zawiązki zębów ze szczęk ssaka, usuwa się z tych zawiązków narząd szkliwny, z tych wolnych od narządu szkliwnego zawiązków wyodrębnia się matrycę szkliwa, poddaje się ją homogenizacji w kwasie octowym i wyodrębnia się frakcję białkową o niskiej masie cząsteczkowej przy ph wynoszącym około 4 przez oddzielenie nierozpuszczalnej substancji i odzyskuje się frakcję białkową o masie cząsteczkowej od 5000 do

2 SPOSÓB WYTWARZANIA FRAKCJI BIAŁKOWEJ MATRYCY SZKLIWA O NISKIEJ MASIE CZĄSTECZKOWEJ Z a s t r z e ż e n i a p a t e n t o w e 1. Sposób wytwarzania frak cji białkowej matrycy szkliwa o niskiej masie cząsteczkowej przez odzyskanie frak cji z zawiązków zębów, z n a m i e n n y t y m, że izoluje się zawiązki zębów ze szczęk ssaka, usuwa się z tych zawiązków narząd szkliwny, z tych wolnych od narządu szkliwnego zawiązków wyodrębnia się matrycę szkliwa, poddaje s ię ją homogenizacji w kwasie octowym i wyodrębnia się frakcję białkową o niskiej masie cząsteczkowej przy ph wynoszącym około 4 przez oddzielenie nierozpuszczalnej substancji i odzyskuje się frakcję białkową o masie cząsteczkowej od 5000 do Sposób według zastrz. 1, z n a m i e n n y tym, że stosuje się zęby bydła lub trzody chlewnej. 3. Sposób według zastrz. 1, z n a m i e n n y tym, że wyodrębnia się ekstrahowalną kwasem octowym frakcję amelogeninową. 4. Sposób według zastrz. 3, z n a m i e n n y tym, że wyodrębnia się frakcję białkową o masie cząsteczkowej od około 5OOO do 25OOO. 5. Sposób według zastrz. 4, z n a m i e n n y tym, ze wyodrębnia się frakcję amelogeninową o wysokiej masie cząsteczkowej. * * * Przedmiotem wynalazku je s t sposób wytwarzania fra k c ji białkowej matrycy szkliwa o niskiej masie cząsteczkowej. Frakcja białkowa matrycy szkliwa wytwarzana sposobem według wynalazku znajduje zastosowanie w metodach terapeutycznych polegających na wywoływaniu powstawania wiązania między częściami zmineralizowanej tkanki, np. zębami i kością. Frakcja białkowa matrycy szkliwa służy do wytwarzania preparatów do leczenia rozchwianych zębów /zapalenie ozębnej czyli p erio d o n titis/. Dla umożliwienia pełnego zrozumienia wynalazku przedstawiono poniżej kilka in fo r- macji na temat budowy zębów i chorób przyzębia. Zdrowe zęby są zamocowane w specjalnych wnękach, tak zwanych zębodołach, znajdujących się w szczęce górnej lub szczęce dolnej /żuchwie/. Między korzeniami zębów i szczęką je s t umiejscowiona tak zwana ozębna. Korzenie zęba są zbudowane głównie z m ateriału zwanego zębiną. Zębina ta jest otoczona cienką warstwą cementu o grubości około 0,01-1 mm. W cemencie występują między innymi włókna kolagenowe ciągnące się od cementu poprzez ozębną i są zamocowane w szczęce. Tak więc cement je st niezwykle ważny dla zamocowania zęba w szczęce. Grubość ozębnej wynosi około 0,2 mm, a sama ozębna składa się z wyżej wspomnianych włókien kolagenowych oraz naczyń i nerwów lezących między tymi włóknami. Szczęka nie sięga korony zęba i w części korzenia nie pokrytej szczęką włókna z cementu korzenia rozciągają się ku dziąsłu otaczającemu ząb. Włókna te wspomagają zamocowanie zęba, a ponadto sta b iliz u ją dziąsło. Dziąsło, podobnie jak cała jama ustna, je s t pokryte cienką warstwą nabłonka. Nabłonek ten tworzy wokół zęba gruby kołnierz, czy tez rękaw. W sąsiedztwie zębów je st utworzona płytka bruzda oddzielająca zęby od nabłonka. Stany zapalne tkanek łączących zęby ze szczęką występują bardzo często i cierp i na nie, w różnym stopniu, większość ludzi na świecie. Stosowane dotychczas metody leczenia miały na celu głównie hamowanie procesu chorobotwórczego i zapobieganie, w maksymalnym stopniu, rozchwianiu zębów. Obecnie nie je st znana jakakolwiek praktycznie uzyteczna metoda kliniczna pozwalająca na uzyskanie zamocowania zębów w szczęce w wyniku procesu zdrowienia.

3 Dodatkowy problem w te j dziedzinie wiąże się z przypadkami wrodzonych wad zamocowania zębów. U takich pacjentów objawy zapalenia ozębnej /p e rio d o n titis / pojawiają się juz we wczesnym wieku /ta k zwane młodzieńcze zapalenie ozębnej/. Leczenie często polega na usunięciu zęba i zastąpieniu go jakąś konstrukcją mostkową, bardzo kosztowną. Bakterie na powierzchni zębów powodują przewlekłe stany zapalne dziąseł wokół zębów. Komórki w stanie zapalnym wydzielają powodujące rozkład enzymy, których rolą je st niszczenie b a k te rii, lecz jednocześnie enzymy te atakują także włókna kolagenowe przytwierdzające ząb do dziąsła i szczęki. Komórki na powierzchni korzenia zęba, czyli cement, ulegają zniszczeniu, a nabłonek ze śluzówki jamy ustnej wzrasta w dół, wzdłuż zęba, tworząc tak zwaną szczelinę dziąsłową. Wszczelinie tej nowe bakterie znajdują środowisko sprzyjające ich rozmnazaniu. W tym właśnie obszarze gromadzą się nowe komórki w stanie zapalnym i rozkład ozębnej pogłębia się. Komórki cementu poddają się i kość zębodołu ulega zniszczeniu. Proces ten zachodzi z reguły bardzo powoli, lecz okresowo jego przebieg może ulegać znacznemu przyspieszeniu. Po pewnym czasie zaatakowane zęby tracą całkowicie zamocowanie w szczęce. Obecne metody leczenia polegają głównie na usuwaniu b ak te rii z powierzchni zębów. Gdy usunie się bakterie stan zapalny dziąsła i ozębnej znika i proces rozkładu zatrzymuje s ię. Leczenie ma także na celu zapobieganie osadzaniu się b ak terii na powierzchni zębów. Tak więc wynikiem leczenia je s t zakończenie procesu niszczenia zamocowania zębów w szczęce, ale w procesie zdrowienia nie tworzy się ani ozębna, ani nowy cement. W trakcie prac badawczych, których rezultatem sta ł się nin iejszy wynalazek, wykorzystano znajomość faktu, iż tworzenie się cementu je st inicjowane przez cienką warstwę prekursora szkliwa, która w trakcie rozwoju korzenia powstaje wzdłuż całej powierzchni korzenia. Fakt ten nie został podany do publicznej wiadomości i jak dotąd został jedynie przedstawiony w będących w trakcie równoległego badania zgłoszeniach patentowych, np. w europejskim zgłoszeniu patentowym nr Dalsze badania i doświadczenia dotyczące mechanizmu powstawania cementu nieoczekiwanie ujawniły, ze prekursor szkliwa, zwany tu dalej matrycą szkliwa, zawiera jako substancję czynną frak cję białkową, którą można otrzymać z części organicznej te j matrycy szkliwa. Odkrycie to je s t tym bardziej nieoczekiwane, że uważa s ię, iż biologiczna funkcja białek tworzących tę frakcję białkową polega na tworzeniu, a zwłaszcza na mineralizowaniu szkliwa /p atrz L. Fischer i D.Termine, C linical Orthopadics 200, 1985, /. Białka matrycy szkliwa zawierają część o wysokiej masie cząsteczkowej i część o niskiej masie cząsteczkowej. Odkryto, ze substancją aktywną je s t część o nisk iej masie cząsteczkowej, jakkolwiek może nią być także aktywna determinanta te j części. Część o niskiej masie cząsteczkowej zawartą w białkach matrycy szkliwa tworzą białka ekstrahowalne kwasem octowym, zwane zwykle amelogeninami, których masa cząsteczkowa wynosi do około 40000, a zwykle wynosi około Określenia "prekursor szkliwa" i "matryca szkliwa" stosowane w niniejszym opisie wyjaśniono dokładnie w dwu publikacjach, a mianowicie w A.R. Ten Cate, Oral Histology, Development, Structure and Function, The V.C.Mosby Co., St. Louis, St. Zjedn.Ameryki /1980/, s t r oraz w J.A. Mjör, O.Fejerskov, Human Oral Embryology and Histology, Munksgaard, Kopenhaga /1986/, s tr Publikacje te zostały tu przytoczone jako źródła literaturow e. W związku z niniejszym wynalazkiem stwierdzono, że gdy zębinę wystawi się na działanie komórek ozębnej, np. po wywierceniu otworu w powierzchni korzenia, następuje proces zdrowienia, polegający na tym, ze wytwarza się tkanka kostnopodobna, która nie zawiera włókien mocujących ząb do otaczających go tkanek. J e śli jednak wytworzony otwór pokryje się aktywną frakcją białkową otrzymaną z matrycy szkliwa, następuje rozwój normalnej mocującej tkanki cementowej. Według wynalazku, sposób wytwarzania frak cji białkowej matrycy szkliwa o niskiej masie cząsteczkowej polega na tym, ze izoluje się związki zębów ze szczęk ssaka, usuwa się z tych związków narząd szkliwny, z tych wolnych od narządu szkliwnego związków wyodrębnia się matrycę szkliwa, poddaje się ją homogenizacji w kwasie octowym i wyodrębnia

4 się frakcję białkową o n isk iej masie cząsteczkowej przy ph wynoszącym około 4 przez oddzielenie nierozpuszczalnej substancji i odzyskuje się frakcję białkową o masie cząsteczkowej od 5000 do Korzystnym źródłem białek matrycy szkliwa są zęby ssaków, takich jak bydło lub świn ie. Wdoświadczeniach na małpach i ludziach stwierdzono, że pokrycie otworu wywierconego w powierzchni korzenia frak cją białkową otrzymaną z matrycy szkliwa pochodzącej od innego gatunku, np. od świni, powoduje tworzenie się cementu. Frakcja białkowa matrycy szkliwa wytworzona sposobem według wynalazku znajduje zastosowanie w nowych technikach polegających na wywoływaniu powstawania wiązania między częściami żyjącej, zmineralizowanej tkanki poprzez utworzenie świeżej zmineralizowanej tkanki na co najmniej jednej z tych części. Techniki te charakteryzuje właśnie stosowanie frak cji białkowej matrycy szkliw a, ewentualnie w postaci środka zawierającego jako substancję aktywną tę frakcję białkową matrycy szkliwa lub jej aktywną determinantę. Jak już wspomniano, techniki takie są szczególnie przydatne w stom atologii, np. w leczeniu p erio d o n titis, to je s t rozchwiania zębów, przy tran sp lan ta cji zębów, względnie przy mocowaniu zębów wybitych w wypadku. Jednak i frakcję białkową matrycy szkliwa i zawierający ją środek, można stosować także dla ułatwienia przyjmowania się sztucznych wszczepów, np. zębów lub sztucznych s tawów biodrowych. Można Je także wykorzystywać do wywoływania powstawania zmineralizowanej tkanki w miejscu wszczepienia takich sztucznych wszczepów, w przypadku których pożądane je st wytworzenie nowego zaczepu ścięgnowego. Frakcję białkową stosowaną w wyżej opisanych technikach otrzymuje się z matrycy szkliwa pochodzącej z zębów ssaków będących w stadium rozwoju. Odpowiednim źródłem matrycy szkliwa są uśmiercone zwierzęta rzeźne, np. świnie i cie lę ta, których ubój następuje bardzo często w okresie rozwoju zębów, np. w przypadku świń w wieku około pół roku. Korzystnymi zwierzętami są bydło i świnie, lecz można wykorzystywać także inne gatunki, np. owce i gryzonie, których zęby ciągle rosną. Alternatywnym źródłem fra k c ji białkowej są hodowle komórek lub bakterie modyfikowane techniką rekombinantową DNA /patrz np. opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr /. Środek wytworzony z zastosowaniem frak cji białkowej może zawierać wyłącznie frakcję białkową lub jej aktywną determinantę, ewentualnie zmieszane z wodą, względnie obok fra - k cji białkowej środek może zawierać nośnik, rozcieńczalnik lub nadające się do tego lepiszcze, np. zmodyflikowaną celulozę, agar, alginian lub żelatynę. W zastosowaniach stomatologicznych należy stosować nośniki i rozcieńczalniki dopuszczalne w takich zastosowaniach. Obecnie jako nośnik stosuje się rozpuszczalne w wodzie polimery. Przykładami, lecz nie jedynymi, takich nośników są sól sodowa karboksymetylocelulozy, celuloza m ikrokrystaliczna, hydroksyetyloceluloza, hydroksypropyloceluloza, metyloceluloza, kwas poliakrylowy o wysokiej masie cząsteczkowej, alginian sodu, alginian glikolu propylenowego, żywice ksantenowe, żywica guarowa, żywica z nasion grochodrzewu, zmodyfikowana skrobia, żelatyna i pektyna, a także ich połączenia. Po wprowadzeniu do tych rozpuszczalnych w wodzie polimerów aktywnej frak cji białkowej można Je ewentualnie przeprowadzić w postać zelu lub f o l i i. W ten sposób uzyskuje się postać środka, którą łatwo je st nakładać ze względu na jej korzystne właściwości fizyczne. Środek może ewentualnie zawierać s ta b iliz a to ry lub konserwanty, dzięki czemu jego trwałość przy przechowywaniu wzrasta. Frakcja białkowa matrycy szkliwa wytworzona sposobem według wynalazku znajduje zastosowanie w leczeniu p erio d o n titis, polegającym na odtworzeniu zamocowania zęba w szczęce przez wywołanie powstawania cementu korzenia i wytworzenie fizjologicznego połączenia włóknami kolagenowymi. W sposobie tym nabłonek, o ile je st obecny, usuwa się z korzenia zęba, po czym ząb i korzeń pokrywa się warstwą odpowiedniej frak cji białkowej otrzymanej z matrycy szkliwa. Korzystnie tkankę kolagenową /d z ią sło / przylegającą do powierzchni zęba zaatakowanej chorobą nacina się dla obnażenia powierzchni korzenia. Nabłonek, o ile je s t obecny, usuwa się, po czym czystą powierzchnię korzenia powleka się

5 warstwą fra k c ji białkowej lub warstwą środka zawierającego frakcję białkową lub je j aktywną determinantę, a następnie tkankę kolagenową umieszcza się na poprzednim miejscu i ewentualnie przyszywa. Następuje wtedy proces zdrowienia. Jak j uż wspomniano, frakcję białkową matrycy szkliwa lub zawierający ją środek można także stosować w rein p lan tacji lub tran sp lan ta cji zębów. Stosunkowo często n asto letn ia młodzież ulega wypadkom, pociągającym za sobą wybicie jednego lub kilku zębów, szczególnie przednich. Gdy wybity ząb umieści się szybko z powrotem w zębodole, proces zdrowienia przebiega często z utworzeniem normalnego zamocowania w szczęce. Wwielu przypadkach zabieg ponownego umieszczenia zęba nie Jest możliwy natychmiast i ząb je s t przytrzymywany w nieodpowiednim środowisku poza jamą ustną, np. na powierzchni. Komórki ozębnej na powierzchni korzenia ulegają wówczas zniszczeniu i ząb, po włożeniu go w zębodół, nie odzyskuje fizjologicznego zamocowania, a po pewnym czasie ulega rozchwianiu. Do chwili obecnej nie znano sposobu uzyskiwania zamocowania zęba na sta łe poprzez regenerację przyległej doń tkanki. Obecnie możliwy jest zabieg, w myśl którego ozębną usuwa się z wybitego zęba, mechanicznie lub chemicznie, po czym na odkrytą powierzchnię korzenia nanosi się środek w postaci frak cji białkowej szkliwa lub zawierający frakcję białkową. Następnie ząb umieszcza się w zębodole i zamocowuje w nim lekko na kilka tygodni. Dzięki działaniu fra k c ji białkowej matrycy szkliwa na powierzchni korzenia tworzy się nowa warstwa cementu, a zatem powstaje nowe zamocowanie. Stwierdzono, że w przypadku tran sp lan ta cji zębów, to je s t wszczepiania zęba jednego osobnika drugiemu, tkanki przeszczepionego zęba zostają zaatakowane przez układ immunologiczny biorcy i w bardzo krótkim czasie ulegają zniszczeniu. Próbowano prowadzić przeszczepy między osobnikami o zgodności immunologicznej, jednak wyniki tych prób nie były zachęcające. Nie można też uznać za rozsądne podejmowanie ryzyka długotrwałego prowadzenia kuracji immunosupresorami dla utrzymania przeszczepu jednego lub kilku zębów. Nie is tn ia ła zatem dotąd metoda tran sp lan tacji dająca korzystne, długoterminowe rokowania. Dzięki zastosowaniu fra k c ji białkowej matrycy szkliwa lub zawierającego ją środka problem ten został rozwiązany. Przeznaczony do tran sp lan tacji ząb pobiera się od dawcy, usuwa się miazgę zębową, oczyszcza komorę, z której usunięto miazgę i wypełnia ją środkiem do wypełniania korzeni. Ozębną usuwa s ię mechanicznie lub chemicznie, po czym korzeń zęba pokrywa się środkiem zawierającym aktywną frakcję białkową. Tak przygotowany ząb umieszcza się, w jamie ustnej biorcy i utrzymuje się go w ustalonej pozycji przez pewien okres czasu. Frakcja białkowa matrycy szkliwa powoduje odtworzenie endogennej tkanki zmineralizowanej, która pokrywa przeszczepiony ząb i wytwarza zamocowanie. Środek zawierający frakcję białkową matrycy szkliwa otrzymaną sposobem według wynalazku może zawierać lepiszcze na osnowie fibrynogenu, czynnika XIII /substancja otrzymana z osocza, biorąca udział w krzepnięciu krwi/ i trombiny. Sporządza się wówczas przedmieszkę złożoną z frak cji białkowej matrycy szkliwa, fibrynogenu i czynnika X III, a następnie dodaje się do tej przedmieszki trombinę na chwilę przed zastosowaniem w zabiegu chirurgicznym. Do przedmieszki można ewentualnie wprowadzić aprotyninę, w celu obniżenia szybkości rozkładu. Korzystnym handlowym produktem do stosowania w takiej postaci je s t T isseel, dwuskładnikowy uszczelniacz fibrynowy, wytwarzany i sprzedawany przez Immuno AG, Wiedeń, A ustria. Przedmieszkę frak cji białkowej matrycy szkliwa, fibrynogen, czynnik XIII i ewentualnie aprotyniny miesza się z roztworem trombiny, a następnie szybko nanosi na operowane n iejsce. W przypadku leczenia p erio d o n titis technika ta bardzo ułatwia zabieg ch iru r- giczny. Przyleganie środka do korzenia je s t wówczas siln ie js z e, krwawienie u staje, a umiejscowienie płatu śluzówkowo-ozębnego je s t znacznie łatw iejsze i nie wymaga zakładania szwów. Dodatkowymi składnikami środka zawierającego matrycę szkliwa wytwarzaną sposobem według wynalazku są pochodne celulozy i alginiany, takie jak karboksymetyloceluloza oraz alginian sodu i alginian glikolu propylenowego.

6 Wynalazek ilu s tru ją poniższe przykłady, odnoszące się do doświadczeń stomatologicznych na małpach i ludziach. W przykładach powołano się na rysunek przedstawiający wykresy przebiegu procesu rozdzielania elektroforetycznego na żelu poliakryloamidowym /SDS-Page/. Proces elektroforezy zaczynano przy Y = 36, kończono przy Y = 58, stosując przesunięcie Y co 20 μm. Amin wynosiła 0,19, a Αmax wynosiła 0,79 /oś A 0, 00-1,00 A.U./. Dwie główne części frak cji białkowej otrzymanej z matrycy szkliwa, różniące się masą cząsteczkową, nazwano amelogeniną /niska masa cząsteczkowa/ i enameliną /wysoka masa cząsteczkowa/. P r z y k ł a d I. Wytwarzanie ekstraktów stosowanych w próbach na zwierzętach. Wcelu ustalenia który ze składników matrycy szkliwa wykazuje aktywność w przypadku modeli zwierzęcych, sporządzono następujące substancje testowe, wszystkie pochodzące z matrycy szkliwa świni. E1. 0,3 g matrycy /zawartość białek 27% + 4% ro ztarto w 3 ml 0,9% NaCl i w trakcie chłodzenia lodem poddano homogenizacji z użyciem Polythrone w ciągu 1 minuty, w odstępach co 10 sekund. Homogenizat zliofilizowano. Otrzymano 199 mg produktu o zawartości białej 47% + 2% według Lowry'ego. E2. 0,3 g matrycy ro ztarto i zhomogenizowano jak powyżej, a potem ogrzewano na łaźni wodnej przez 4 minuty. Po lio f iliz a c ji otrzymano 199 mg produktu o zawartości białek 13% + 3%. E3. 0,3 g substancji ro ztarto w 3 ml 0,5 m kwasu octowego /c z.d.a./, zhomogenizowano jak powyżej i przez 24 godziny mieszano w temperaturze 4 C dla wyekstrahowania białek. Następnie przez 10 minut prowadzono wirowanie z prędkością obrotów/minutę, wytrąconą substancję wyodrębniono i zamrożono, a ciecz z nad osadu zliofilizow ano. Otrzymano 68 mg lio f iliz a tu o zawartości białek 29% + 3%. E4. 0,3 g matrycy ro ztarto w 3 ml 10% EDTA w 0, 03 m buforu Tris /ph 7,4/ i w trakcie chłodzenia przeprowadzono homogenizację jak powyżej. Przez 24 godziny prowadzono mieszanie w niskiej temperaturze w celu uzyskania ek strak cji, po czym homogenizat odwirowano w ochłodzonej wirówce. Ciecz z nad osadu poddano d ia liz ie wobec wody destylowanej i z lio - filizowano. Otrzymano 11 mg produktu o zawartości białek 33% + 2%. E5. Substancję wytrąconą po wirowaniu w procesie otrzymywania E4 wyekstrahowano około 10 objętościami 0,5 m kwasu octowego, stosując podczas ekstrakcji mieszanie w niskiej temperaturze przez 24 godziny. Po odwirowaniu zliofilizow ano ciecz znad osadu. Otrzymano 109 mg produktu o zawartości białek 15% + 3%. E6. Substancję odwirowaną w procesie otrzymywania E5 zliofilizow ano. Otrzymano 37 mg produktu o zawartości białek 18% + 4%. E7. 0,3 g matrycy ro ztarto w 3 ml 10% EDTA w 0, 03 m buforze T ris /ph 7,4/ wraz z 0,4 mmola inhibitora proteinazy PMSF /fluorek fenylometylosulfonylu/, po czym przeprowadzono homogenizację i ekstrakcję tak samo jak w przypadku E4. Po odwirowaniu i d ia lizie cieczy znad osadu zliofilizow ano ją i otrzymano 11 mg produktu o zawartości białek 41% + 2%. E8. Substancję odwirowaną, opisaną w E7 ekstrahowano 0,5M kwasem octowym w ciągu 48 godzin w niskiej temperaturze, odwirowano i przezroczysty roztwór suszono przez zamrażanie. Otrzymano 101 mg produktu o zawartości białka 17% + 1%. E9. Substancję odwirowaną przy otrzymywaniu E8 zliofilizow ano i otrzymano 40 mg produktu o zawartości białek 30% + 3%. Substancje otrzymane jako E1 - E9 scharakteryzowano pod względem zawartości białek, rozruchu masy cząsteczkowej białek /SDS-Page z P hast/, punktów izoelektrycznych białek i zawartości węglowodanów. Pozorny rozrzut masy cząsteczkowej ekstraktów świńskiej matrycy szkliwa przedstawiono na rysunku. Po elektroforezie z użyciem zelu poliakryloamidowego SDS /SDS 8-25%, Phast, Pharmacia/ pasma białek poddano transform acji w piki przy użyciu skannera laserowego /LKB Ultrascan XL/. Masę cząsteczkową oszacowano na podstawie k alib racji przy użyciu

7 wzorców białkowych /14-90 kda/ i polipeptydowych /2-14 kda/ produkcji Pharmacia. Na f ig. 1 i 2 przedstawiono wykresy dla ekstraktów E4 i E5, zaś dane dla tych i pozostały ch ekstraktów zestawiono w ta b e li 1. T a b e l a 1 E kstrakt Masa cząsteczkowa /SDS-Page/ składników białkowych /kda/ 5/12" / 6/14" / 10/ 15"/ E1 X X X X X X X E3 X X X X /x/ E4 X X X E5 X X X / x/ E7 X X X E8 X X X /x / w/ Niskie wartości masy cząsteczkowej uzyskuje s ię stosując polipeptydowy zestaw do k a lib ra c ji, zaś wysokie w artości masy cząsteczkowej uzyskuje się stosując białkowy zestaw do k alib racji. X - duża ilo ść x - mała ilo ść /x / - nieznaczna ilo ść. W niniejszym przykładzie wykazano wpływ substancji E1 - E9 otrzymanych drogą wieloetapowej ekstrakcji tkanki prekursorowej szkliwa /matrycy szkliwa/ na gojenie się doświadczalnie wywołanych brzeżnych okaleczeń ozębnej. Okaleczenia brzeźne na obrzeżach ozębnej zębów małpy wytworzono przez usunięcie cementu, ozębnej i obrzeża kości zębodołu na odcinku od szyjki do szczytu korzenia, około 5 mm, przy użyciu świdra dentystycznego. Następnie na doświadczalne okaleczenia nałożono badane substancje i pozostawiono je do zagojenia. Wytworzono także okaleczenia kontrolne, które pozostawiono do zagojenia bez nakładania jakiejkolw iek substancji. Po okresie gojenia trwającym 8 tygodni przeprowadzono histomorfometryczną ocenę wyników. W tab e li 2 rezultaty procesu gojenia podano procentowo w odniesieniu do wyjściowego poziomu pokrycia cementem i kością. Proces gojenia obejmował tworzenie się przylegającej warstwy nowego cementu, ozębnej i kości zębodołowej /nowe zamocowanie/. T a b e l a 2 Badana substancja Próba kontrolna E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 Wygojenie procentowe /%/ Tak więc zamocowanie wytworzyło się po zastosowaniu substancji E1, E3, E5 i E8. Zamocowanie nie powstało w próbie kontrolnej i przy zastosowaniu substancji E2, E4, E6, E7 i E9, w przypadku których uszkodzenie utrzymało się, a zęby pokryły się wyłącznie nabłonkiem. Wyniki te wskazują na fak t, iż stosowanie frak cji białkowej o niskiej masie cząsteczkowej, pochodzącej z matrycy szkliwa, wywołuje powstanie połączenia między tkankami w leczeniu periodontitis.

8 P r z y k ł a d I I. Wytwarzanie odsolonego kwasowego ekstraktu matrycy szkliwa. Zliofilizowany preparat, podobny do preparatu E3 z przykładu I, rozpuszczono w 0, 1 m kwasie octowym /144 mg/12 ml/ i umieszczono w kolumnie /15 x 540 mm/ z drobnoziarnistą żywicą Sephadex G-25 w 0, 1 m kwasie octowym. Pierwszą bogatą w białka frakcję /E10/ zebrano i zliofilizow ano. Otrzymano 34 mg m ateriału o zawartości białek około 72%, co odpowiada zawartości białek około 85% w materiale wyjściowym. Resztkowe białka znaleziono we frak cji so li /63 mg zliofilizowanego m ateriału zawierało około 7% b iałek /. Z liofilizow a- ną frakcję białkową otrzymaną w ten sposób napełniono 10 ml fio lk i /po 20 mg w fio lc e / i wyjałowiono promieniowaniem /35 kgy/ przed próbami na zwierzętach. Substancję E10 poddano próbie opisanej w przykładzie I. Wygojenie procentowe dla E10 wyniosło 72%, zaś wartość wygojenia procentowego w próbie kontrolnej wyniosła 4%. P r z y k ł a d I I I. Wytwarzanie oczyszczonych fra k c ji 10 białkowych. W 20 ml 0,1m kwasu octowego rozpuszczono 200 mg zliofilizowanego preparatu E3 /identycznego jak użyty w przykładzie I I / i całość umieszczono w kolumnie /25 x 780 mm/ z żywicą Sephadex G-75 w 0,1 m kwasie octowym, w temperaturze 4 C. Kolumnę eluowano z prędkością 55 ml/godzinę i odbierano próbki o objętości 4 ml. Eluat monitorowano przy 280 nm /Uvicord/. Frakcje zawierające główną część eluowanego materiału połączono i otrzymano 5 fra k c ji, które poddano analizie elektroforetycznej /SDS-Page/ pod kątem rozrzutu masy cząsteczkowej. Pięć pików z chromatogramu e lu c ji /0-1 A/ miało następujące znaczenie: /1 / 50-60: białka o wysokiej masie cząsteczkowej, "enameliny" /masa cząsteczkowa powyżej 40000/, /2 / 62-80: amelogenina o wysokiej masie cząsteczkowej /masa cząsteczkowa około / /3 / : amelogenina o średnio wysokiej masie cząsteczkowej /masa cząsteczkowa około / /4 / : amelogenina o n iskiej masie cząsteczkowej /masa cząsteczkowa około / /5 / : sole Po zlio filizo n an lu pików /2 /, /3 / i /4 / otrzymano 10 mg i 12 mg białek amelogeninowych o masie cząsteczkowej odpowiednio wysokiej, średnio wysokiej i niskiej /zawartość białek powyżej 90%/. Celem doświadczenia było wykazanie wpływu substancji amelogeninowych o wysokiej, średnio wysokiej lub n iskiej masie cząsteczkowej, wyekstrahowanych z tkanki prekursorowej szkliwa /matrycy szkliwa/ na gojenie się doświadczalnie wywołanych brzeźnych okaleczeń ozębnej. Okaleczenia brzeźne na obrzeżach ozębnej zębów małpy wytworzono przez usunięcie cementu, ozębnej i obrzeża kości zębodołu na odcinku od szyjki do szczytu korzenia, około 5 mm, przy użyciu świdra dentystycznego. Następnie na doświadczalne okaleczenia nałożono badane substancje i pozostawiono je do zagojenia. Wytworzono także okaleczenia kontrolne, które pozostawiono do zagojenia bez nakładania jakiejkolwiek substancji. Po okresie gojenia trwającym 8 tygodni przeprowadzono histomorfometryczną ocenę wyników. Rezultaty próby podano w tab eli 3. Badana suostancja Próba kontrolna T a b e l a 3 wysoka masa cząsteczkowa Amelogenina średnio wysoka masa cząsteczkowe niska masa cząsteczkowa Wygojenie procentowe /%/

9 Tak więc nowe zamocowanie powstało przy zastosowaniu amelogeniny o wysokiej masie cząsteczkowej, a w mniejszym stopniu przy zastosowaniu amelogenin o średnio wysokiej i niskiej masie cząsteczkowej. Rezultaty te wskazują na fak t, iz użycie frak cji amelogeninowej o wysokiej masie cząsteczkowej, pochodzącej z matrycy szkliwa, najskuteczniej wywołuje powstanie połączenia między tkankami w leczeniu p erio d o n titis. P r z y k ł a d IV. Wytwarzanie kwasowego ekstraktu matrycy szkliwa. Żuchwy uśmierconych świń /wiek około 6 miesięcy, waga rzeźna około 80 kg/ wycięto z miękkiej tkanki i zamrozono w rzeźni. Odpowiednie zawiązki zębów wycięto z połówek szczęk po częściowym rozmrozeniu i wyodrębniono matrycę sz k liwa. 38 g matrycy szkliwa roztarto w 780 ml 0,5 m kwasu octowego /ph 4,1 / i w trakcie chłodzenia lodem poddano homogenizacji /homogenizator Polytron PT 10-30/. Homogenizat mieszano w niskiej temperaturze przez 22 godziny dla wyekstrahowania białek rozpuszczalnych przy ph około 4. Nierozpuszczalny m ateriał odwirowano, a roztwór w kwasie octowym zliofilizow ano. Otrzymano 8,5 g lio filiz a tu o zawartości białek około 20%, co odpowiada wydajności odzyskiwania białek około 50%. Zliofllizowany ekstrakt poddano badaniom na zawartość wody, zawartość octanów, zawartość białek /metoda Lowry' ego/ i zawartość węglowodanów /odczynnik Antrona/, analiz ie składu aminokwasów, analizie elementarnej, analizie rozrzutu masy cząsteczkowej białek /SDS-Page/ i analizie punktów izoelektrycznych białek. Wyniki badań i analiz homogenizatu matrycy szkliwa i frak cji białkowych otrzymanych z tego homogenizatu przedstawiono w tab eli 4. Wyniki analizy Homogenizat matrycy szkliwa /E1/ T a b e l a 4 Ekstrakt kwasowy /E3/ Ekstrakt odsolony /E10/ Analiza elementarna /%/ Frakcja soli /przykład 11/ C 11, ,4 H 1.7 4,4 6,8 - N 3,9 4,5 15,5 0,7 0 9,4 27, S 0,2 0,35 1,3 0,1 C1 5,5 0,6 < 0,1 1,3 P 8,8 3,5 0,1 4,3 Ca < 0,1 31,6 K 0,2 0,4 < 0, 1 - Zawartość białek / %/ Analiza Lowry'e go < 4 Analiza aminokwasów < 23 < 90 - Zawartość węglowodanów /%/ Odczynnik Antrona 0,4 1,3 V Zawartość wody /%/ Miareczkowanie metodą Karla-Fischera <26

10 c.d. Tab Zawartość octanów Metoda GC Analiza aminokwasów Pro - 18,0 19,0 - Glu - 17,8 19,0 - Leu - 9,0 9,1 - His - 8,7 9,2 - Ser - 4,8 4,6 - Gly - 3,2 2,8 - Tyr - 6,4 5,3 - Thr - 3,6 3,4 - Val - 3,6 3,5 - Met - 4,3 5,3 - Ile - 3,5 3,6 - Asp - 3,6 3,0 - Phe - 3,8 3,7 - Ala - 1,6 1,5 - Lys - 2,5 1,8 - Arg - 3,0 2,5 - Trp - 2,6 2,5 - Cys Przed próbami klinicznymi roztwór białek w kwasie octowym przesączono jałowo do jałowych 10 ml fiolek i zliofilizow ano w jałowych warunkach. Celem doświadczeń było wykazanie wpływu substancji E3 na gojenie się brzeźnych okaleczeń ozębnej u lu d zi. Pacjentów poddano operacji dla usunięcia kamienia nazębnego i ziarniny. Substancją E3 "pomalowano" obnażone powierzchnie korzenia, po czym przykryto je płatem śluzówkowo-ozębnowym. Przebieg procesu gojenia oceniono dokonując okresowych przeglądów klinicznych, mierząc głębokość kieszonek, stopień zamocowania i wskaźniki pokrycia dziąsłem, a także wykonując zdjęcia rentgenowskie jamy ustnej. Wyniki porównano z wynikami wcześniejszych badań ilościowych przeprowadzonych u tych samych pacjentów poddanych tradycyjnym zabiegom chirurgicznym na ozębnej i podobnej kontroli. Wyniki wykazały, iz substancja E3 spowodowała znaczny przyrost obrzeża kości zębodołowej /około 4-8 mm/ i zwiększenie stopnia zamocowania /5-9 mm/. Takiego procesu gojenia nie uzyskano nigdy w rezu ltacie tradycyjnego zabiegu chirurgicznego na ozębnej. Ogólnie proces gojenia wydawał się postępować szybciej, na co wskazywał zarówno wygląd miejsca zabiegu, jak i fakt zmniejszenia się głębokości kieszonek bocznych w porównaniu z wynikami badań przeprowadzonych w przypadku tradycyjnych zabiegów chirurgicznych na ozębnej. Wyniki te świadczą o tym, że pochodząca z matrycy szkliwa frakcja białkowa o niskiej masie cząsteczkowej wykazuje zdolność wywoływania powstawania nowego zamocowania ozębnowego u ludzi, a takiego efektu nie spotkano w przypadku tradycyjnego leczenia. P r z y k ł a d V. Wpływ na gojenie się kości. Wpływ pochodzącej z matrycy szkliwa frak cji białkowej o niskiej masie cząsteczkowej na gojenie się kości badano na doświadczalnych ubytkach w żuchwach i kościach udowych dorosłych szczurów. Dokonując pionowego nacięcia chirurgicznego skóry i mięśnia

11 żwacza odsłonięto kąt żuchwy. W kości żuchwy wywiercono pod osłoną sta le przepływającego roztworu soli fizjologicznej niewielki otwór o średnicy 2 mm. Wten sam sposób wywiercono otwory tej samej wielkości w kości zbitej kości udowej, na końcu dalszym. W otworach z prawej strony żuchwy i na prawej kości udowej zastosowano frakcję białkową o niskiej masie cząsteczkowej, zaś otwory z lewej strony żuchwy i na lewej kości udowej służyły jako otwory kontrolne. Frakcję białkową o n isk iej masie cząsteczkowej naniesiono albo w postaci gąbczastego m ateriału zliofilizowanego, albo w niewielkich żelatynowych cylindrach. Otwory kontrolne z lewej strony żuchwy i na lewej kości udowej wypełniono żelatynowymi cylindrami bez frak cji białkowej, zaś u szczurów, w przypadku których zastosowano gąbczasty l i o f i l i - zat, pozostawiono otwory kontrolne nie wypełnione. Szczury uśmiercono po 1-5 tygodniach od naniesienia badanej su b stan cji, obszary po zabiegu i obszary kontrolne wyizolowano i poddano je obserwacjom mikroskopowym. Już po upływie 1 tygodnia od naniesienia frak cji białkowej o niskiej masie cząsteczkowej wywiercony otwór całkowicie wypełnił się kością, a ponadto wystąpiło wyraźne pokrycie kości okostną. Na obszarach kontrolnych, również powstała nowe kość, lecz było je j wyraźnie mniej, a wywiercone otwory nie uległy zagojeniu.

12 FIG. 2 Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena zł