Justyna Gornowicz-Porowska

Transkrypt

1 Justyna Gornowicz-Porowska EKSPRESJA ELASTAZY NEUTROFILÓW A AUTOIMMUNIZACJA WOBEC TRANSGLUTAMINAZY NASKÓRKOWEJ, BP180, BP230 ORAZ DESMOGLEIN 1 I 3 W AUTOIMMUNIZACYJNYCH DERMATOZACH PĘCHERZOWYCH Rozprawa doktorska Promotor: dr hab. n. med. Marian Dmochowski prof. UM Pracownia Histopatologii i Immunopatologii Skóry Katedra i Klinika Dermatologii Uniwersytetu Medycznego im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu Poznań 2012

2 WYKAZ CZĘŚCIEJ UŻYWANYCH OZNACZEŃ APC komórka prezentująca antygen (antigen-presenting cell) BP pemfigoid pęcherzowy (bullous pemphigoid) BP180 antygen pemfigoidu pęcherzowego o m.cz. 180 kda (BPAG2; kolagen typu XVII) BP230 antygen pemfigoidu pęcherzowego o m.cz. 230 kda (BPAG1) C3 składowa C3 dopełniacza CD celiakia (celiac disease) DEJ połączenie skórno-naskórkowe (dermal-epidermal junction) Dg. rozpoznanie DH opryszczkowate zapalenie skóry (dermatitisherpetiformis) DIF metoda immunofluorescencyjna bezpośrednia (direct immunofluorescence) DIFh metoda immunofluorescencyjna bezpośrednia we włosie (direct immunofluorescence of plucked hair) DSG1/DSG3 desmogleina 1/3 EDN neurotoksyna eozynofilowa (eosinophil-derivedneurotoxin) ELISA metoda immunoenzymatyczna (enzyme-linked immunosorbent assay) ES rozprzestrzenianie się epitopów (epitopespreading) etg transglutaminaza naskórkowa (epidermaltransglutaminase) FcR receptor dla fragmentu Fc FITC izotiocyjanian fluoresceiny (fluorescein isothiocynate) GSE glutenozależna enteropatia (gluten sensitive entheropathy) HD półdesmosom (hemidesmosome) H+E rutynowe badanie histologiczne hematoksyliną i eozyną HLA ludzkie antygeny leukocytarne (human leukocyte antigens) IgA immunoglobulina A IgG immunoglobulina G IIF metoda immunofluorescencyjna pośrednia (indirect immunofluorescence) Max. maksimum MBP główne białko zasadowe (major basic protein) MHC główny układ zgodności tkankowej (majorhistocompatibilitycomplex) Min. minimum Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 2

3 MMP metaloproteinaza macierzy (matrixmetalloproteinase) n liczba badanych NE elastaza neutrofilów (neutrophilelastase) npg nonapeptydy gliadyny (nonapeptidesofgliadin) PBS bufor fosforanowy (phosphate buffered saline) PF pęcherzyca liściasta (pemphigusfoliaceus) PV pęcherzyca zwykła (pemphigusvulgaris) r współczynnik korelacji rang Spearmana (Spearman s rank correlation coefficient) ROC charakterystyka operacyjna odbiornika (receiveroperatingcharacteristic) Ryc. rycina SD odchylenie standardowe (standarddeviation) ttg transglutaminaza tkankowa (tissuetransglutaminase) średnia Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 3

4 Spis treści 1. WSTĘP Opryszczkowate zapalenie skóry (DH) na tle choroby trzewnej (CD) Podobieństwa między DH i CD; teorie patogenetyczne Różnice między DH i CD Zagadnienia nozologiczne DH w obrębie CD Patogeneza pemfigoidu pęcherzowego (BP) w kontekście budowy połączenia skórno-naskórkowego Wzbudzanie patologicznej autoimmunizacji w chorobach kręgu pęcherzycy Zaangażowanie mechanizmów centralnej tolerancji w patogenezie pęcherzycy Rola czynników środowiskowych i predyspozycji genetycznych w patogenezie pęcherzycy CEL PRACY MATERIAŁY I METODY Materiał Grupy badane Surowice Płyn pęcherzowy Wycinki skórne Włosy Metody Metody diagnostyczne Metody diagnostyczno-badawcze Metody badawcze Ocena mikroskopowa i dokumentacja fotograficzna Analiza statystyczna WYNIKI Czynność neutrofilów w skórze pęcherzowo zmienionej badana barwieniem immunohistochemicznym i analizą drobnowidową złogów NE w tkankach pacjentów z DH, BP i pęcherzycą Przeciwciała krążące IgA przeciwko etg, ttg i npg w DH, IgG przeciwko BP180 i BP230 w BP, IgG przeciwko DSG1 i DSG3 u chorych z pęcherzycą badane techniką ELISA Zależność pomiędzy poziomem przeciwciał krążących (anty-etg, anty-ttg i anty-npg IgA w DH; anty-bp180 i anty-bp230 IgG w BP, anty-dsg1 i anty- DSG3 IgG w PV/PF) a nasileniem skórnych złogów NE Przydatność testów immunoenzymatycznych ELISA wykrywających antyetg, anty-ttg i anty-npg IgA do diagnostyki różnicowej chorych z DH Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 4

5 4.5. Czynność eozynofilów badana stężeniem EDN/RNAzy 2 a autoprzeciwciała IgA przeciwko etg u chorych na DH Zależność między nasileniem ekspresji etg w skórze w sąsiedztwie DEJ u chorych na DH a poziomem przeciwciał krążących IgA wobec etg Czynność eozynofilów w skórze pęcherzowo zmienionej badana barwieniem immunohistochemicznym i analizą drobnowidową złogów MBP w tkankach pacjentów z BP oraz zależność pomiędzy nasileniem skórnych złogów MBP a poziomem przeciwciał krążących IgG wobec BP180 i BP230 oraz nasileniem skórnych złogów NE w BP Przeciwciała IgG przeciwko BP180 i BP230 w surowicy i płynie pęcherzowym u chorych na BP Przeciwciała IgG przeciwko DSG1 i DSG3 w surowicy i złogi IgG, IgG1, IgG4 i C3 w zewnętrznej pochewce mieszka włosowego bezobjawowych krewnych chorych z pęcherzycą DYSKUSJA Uczynnienie neutrofilów mierzone intensywnością ekspresji NE a wzbudzenie procesu zapalnego w autoimmunizacyjnych dermatozach pęcherzowych Uczynnienie neutrofilów mierzone intensywnością ekspresji NE i uczynnienie eozynofilów mierzone surowiczym stężeniem EDN a autoimmunizacja wobec etg, ttg, npg u chorych z DH Uczynnienie neutrofilów mierzone intensywnością ekspresji NE i eozynofilów mierzone intensywnością ekspresji MBP a autoimmunizacja wobec BP180 i BP230 u chorych z BP Uczynnienie neutrofilów mierzone intensywnością ekspresji NE a autoimmunizacja wobec DSG1 i DSG3 u chorych z pęcherzycą Przydatność testów immunoenzymatycznych ELISA wykrywających antyetg, anty-ttg i anty-npg IgA do diagnostyki różnicowej chorych z DH Zależność między nasileniem ekspresji etg w skórze u chorych na DH a poziomem przeciwciał krążących IgA wobec etg Przeciwciała IgG przeciwko BP180 i BP230 w surowicy i płynie pęcherzowym u chorych z BP Analiza genetycznego występowania pęcherzycy na podstawie badań bezobjawowych krewnych chorych z pęcherzycą WNIOSKI STRESZCZENIE ABSTRACT PIŚMIENNICTWO Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 5

6 Część zagadnień poruszanych w poniższej pracy doktorskiej przedstawiono w następujących doniesieniach: I. Prace opublikowane Bowszyc-Dmochowska M., Seraszek A., Kaczmarek E., Gornowicz J., Dmochowski M.: Low strength of correlation between the intensity of neutrophil elastase expression in lesional skin and the level of serum IgA antibodies to epidermal transglutaminase in dermatitis herpetiformis. The Open Autoimmunity Journal, 2009, 1, 1-4. Gornowicz J., Bowszyc-Dmochowska M.,Dmochowski M.: Od autoprzeciwciał do powstania pęcherza przewodzenie sygnałów w pęcherzycy zwykłej i liściastej. Dermatol. Klin., 2010, 12 (2), Gornowicz J., Bowszyc-Dmochowska M., Dmochowski M.: Przeciwciała IgA przeciwko białku fuzyjnemu zawierającemu zmodyfikowany nonapeptyd gliadyny w opryszczkowatym zapaleniu skóry. Dermatol. Klin., 2010, 12 (4), Gornowicz-Porowska J., Bowszyc-Dmochowska M., Dmochowski M.: Autoimmunitydriven enzymatic remodeling of the dermal epidermal junction in bullous pemphigoid and dermatitis herpetiformis. Autoimmunity, 2012, 45 (1), (epub 14 września 2011). Pietkiewicz P., Gornowicz-Porowska J., Bowszyc-Dmochowska M., Dmochowski M.:Pemphigoid gestationis in a female with progressive facial hemiatrophy: microchimerism as a speculative shared background is disputable.pol. J. Pathol., 1/2012 (przyjęta do druku). II. Streszczenia zjazdowe Kowalczyk M.J., Gornowicz J., Szramka-Pawlak B., Dmochowski M., Żaba R.: Transcription of three HERV sequences in pemphigus vulgaris. 8th Congress of the Baltic Association of Dermatovenereologists, września, 2009, Wilno, Litwa. Dmochowski M., Gornowicz J., Seraszek A., Kaczmarek A., Bowszyc-Dmochowska M.: Neutrophil elastase, eosinophil major basic protein and autoantibodies to BP230 in human bullous pemphigoid lesions. JC Bystryn Pemphigus & Pemphigoid Meeting: from the bench to the bedside. 5-6 listopada, 2010, Bethesda, Maryland, USA. Dmochowski M., Gornowicz J., Seraszek A., Kaczmarek E., Bowszyc-Dmochowska M.: Cutaneous expression of neutrophil elastase in relation to IgA autoantibodies to nonapeptides of gliadin and tissue transglutaminase in dermatitis herpetiformis.annual Meeting of the Society for Investigative Dermatology. 7-4 maja, 2011, Phoenix, USA. J Invest Dermatol 2011, 131, Suppl. 1,s. S2. Gornowicz J., Bowszyc-Dmochowska M., Seraszek A., Karczmarek E., Dmochowski M.:Expressions of neutrophil elastase and eosinophil major basic protein, evaluated with quantitative digital morphometry, in relation to blister fluid and serum IgG antibodies to BP230 in human bullous pemphigoid. 22 nd World Congress of Dermatology, maja, Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 6

7 2011, Seul, Korea Południowa. Gornowicz-Porowska J., Bowszyc-Dmochowska M., Seraszek-Jaros A, Kaczmarek E, Dmochowski M.:Human dermatitis herpetiformis: IgA autoantibodies to gliadin nonapeptides, tissue and epidermal transglutaminases are linked, but unrelated to cutaneous neutrophil elastase. 8 th International Congress on Autoimmunity, 9-13 maja, 2012, Granada, Hiszpania Dmochowski M., Gornowicz-Porowska J., Seraszek-Jaros A., Kaczmarek E. Pietkiewicz P., Bowszyc-Dmochowska M.:Cutaneous expression of neutrophil elastase in relation to IgG autoantibodies to desmoglein 1 and 3 in pemphigus foliaceus and pemphigus vulgaris. Annual Meeting of the Society for Investigative Dermatology, 9-12 maja, 2012, Raleigh, USA. Realizując poniższą pracę doktorską, uzyskano następujące wsparcia finansowe: Projekt badawczy promotorski MNiSW/NCN N N Ekspresja elastazy neutrofilów a autoimmunizacja wobec transglutaminazy naskórkowej, BP180, BP230 oraz desmoglein 1 i 3 w autoimmunizacyjnych dermatozach pęcherzowych. Stypendium w ramach projektu Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski - projekt własny Wojewódzkiego Urzędu Pracy w Poznaniu, realizowany w ramach Poddziałania Regionalne Strategie Innowacji Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki, współfinansowany ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego. Stypendium dla najlepszych doktorantów UM w Poznaniu przyznawane przez Komisję Stypendialną. Grant uczelniany dla młodych naukowców i uczestników studiów doktoranckich ( ). Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 7

8 1. WSTĘP 1.1. Opryszczkowate zapalenie skóry (DH) na tle choroby trzewnej (CD) DH jest przewlekłą dermatozą z intensywnym świądem i charakterystycznymi polimorficznymi wykwitami skórnymi (Dmochowski 2006b), w przebiegu której istnieją różne etapy rozwoju choroby, zależne od czasowo-przestrzennej ewolucji wykwitów (Gornowicz i wsp. 2010a). Zaliczane jest do schorzeń pęcherzowych z autoimmunizacji wobec enzymów (Dmochowski 2006a), a u chorych można też wykryć przeciwciała o niższej specyficzności: (m.in. przeciwgliadynowe i przeciw śródmięsnej mięśni gładkich) (Kárpáti 2004). Coraz częściej poruszana jestrola transglutaminazytkankowej (ttg) i transglutaminazy naskórkowej (etg)jako autoantygenów w DH oraz ich znaczenia w procesach różnicowania keratynocytów i stabilizacji połączenia skórno-naskórkowego (DEJ) w brodawkach skórnych (Lorand i wsp. 1984, Aeschliman i wsp. 1995, Marietta i wsp. 2008). Rola transglutaminaz w patomechanizmie DH polega zapewne na katalizie zależnej od jonów wapnia reakcji tworzenia kowalencyjnyuch wiązań γ-glutamylolizynowych (Lorand i wsp. 1984, Aeschliman i wsp. 1995). Sugeruje się, że w patogenezie DH ważnym czynnikiem może być proces apoptozy, który współgra z innymi mechanizmami patogenetycznymi (Caproni i wsp. 2005). Należy pamiętać, że w porównaniu do innych autoimmunizacyjnych dermatoz pęcherzowych mechanizmy immunogenetyczne DH są najmniej poznane, mimo iż zapewne posiadają najbardziej złożone uwarunkowania (Gornowicz-Porowska i wsp. 2011). DH zdaje się być blisko powiązane z CD (celiakią). Pierwsza obserwacja wiążąca te dwie choroby pochodzi od Marksa i wsp. (Marks i wsp. 1966). Rozwój tych chorób jest wynikiem odpowiedzi immunologicznej na antygen glutenu, który stanowi substrat dla transglutaminaz. Najistotniejsze białko uwrażliwiające stanowi gliadyna (Gornowicz i wsp. 2010a). Wyzwalacz odpowiedzi immunologicznej wobec transglutaminaz i wywołania progresjiz CD do DH pozostaje niejasny Podobieństwa między DH i CD; teorie patogenetyczne Zarówno CD, jak i DH to wieloczynnikowe choroby, w których rolę odgrywają zarówno czynniki genetyczne, jak i środowiskowe, prowadzące do charakterystycznych zmian, odpowiednio, w jelicie cienkim i skórze. Za punkty styczne między tymi dwoma chorobami uznaje się: odpowiedź enteropatii na bezglutenową dietę, immunogenetykę (powszechne występowanie fenotypu HLA B8 i DR3), występowanie hiposplenizmu Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 8

9 i predyspozycji do rozwoju chłoniaków (Gawkrodner i wsp. 1984, Collin i wsp. 1996, Humbert i wsp. 2006). Uważa się, że wystąpienie obu chorób z typowymi dla nich objawami jest wynikiem wypadkowej czterech czynników: predyspozycji genetycznych, spożycia glutenu, zmian w jelicie cienkim i ewentualnych czynników demaskujących (Sárdy 2002a,b). Obydwie choroby dotykają zazwyczaj populację rasy białej, gdzie pszenica, żyto czy jęczmień są ważnymi składnikami pożywienia (Europa, część Ameryki, Australia, Azja Zachodnia i Północna) (Corazza i wsp. 1995). Sporadycznie występują natomiast w rejonach Afryki, Azji Wschodniej i Południowej (Sárdy 2002b, Zone 2004). Patomechanizm DH i CD wydaje się być podobny. Jak podają dane piśmiennicze obydwie choroby są silnie powiązane z haplotypamihla DQ2 i DQ8 (Hervonen i wsp. 2000, Marietta i wsp. 2004), prawdopodobnie ok. 90% pacjentów DH i CD ma DQ2- a większość z pozostałych 10% DQ8 (Balas i wsp. 1997, Holopainen i wsp. 2001, Collin i wsp. 2003, Caproni i wsp. 2009). Obie choroby szczególnie manifestują allele klasy II HLA (Reunala 2001, Collin i wsp. 2003), a podatność na nie jawi się być powiązana głównie z allelami HLA- DQA1*0501, DQB1*02 (kodującymi heterodimer HLA klasy II HLADQ2) i w mniejszym stopniu z genami HLA-DQA1*03, DQB1*0302 (kodującymi molekułę DQ8) (Sollid 2000, Sárdy 2002b). Pomimo silnego powiązania ze specyficznymi haplotypami HLA, same czynniki genetyczne nie decydują o klinicznym ujawnieniu choroby. Niektórzy badacze donoszą o znaczeniu w DH i CD genów niepowiązanych z HLA(Holopainen i wsp. 2001). Bliskie genetyczne tło DH i CD ujawniają także badania rodzin (Hervonen i wsp. 2002). Wiadomo, że obydwa schorzenia wykazują tendencję do skupiania się w rodzinach udowodniono, że ok. 18% pacjentów DH i ok. 19% pacjentów CD ma krewnych pierwszego stopnia cierpiących na tę samą chorobę (Hervonen i wsp. 2002). Podobnie jak w CD segregacja choroby u rodzin DH związana jest z ryzykiem haplotypu HLA, a liczba dotkniętych rodziców, rodzeństwa i dzieci pasuje do modelu dominującego dziedziczenia mendlowskiego. Model dziedziczenia autosomalnego dominującego CD sugerował McDonald (McDonald i wsp. 1965), jednak późniejsze badania wykazały, że jest przekazywana w sposób recesywny (Greenberg i wsp. 1982). Analizując to zagadnienie przeprowadzono badania monozygotycznych bliźniąt (Hervonen i wsp. 2000). Monozygotyczne bliźnięta mogą wykazywać każdą kombinację ujawniania CD, DH lub klinicznie cichej wrażliwości na gluten, udowadniając znaczenia czynników środowiskowych. Dowiedziono również występowania obu dolegliwości u poszczególnego z bliźniąt - u jednego DH, a u drugiego CD - co jest silnym dowodem na ich wspólne Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 9

10 genetyczne tło oraz wspiera hipotezę, że wystąpienie DH zapewne nie wymaga dodatkowych genów, niż te usposabiające do CD (Reunala 2001). Ponieważ zauważono, że występowanie CD jest wyższe u krewnych pacjentów DH /CD (Neuhausen i wsp. 2008, Duś i wsp. 2009), niektórzy autorzy sugerują u nich badania przesiewowe krewnych pierwszego stopnia (Caproni i wsp. 2009). O ile użyteczność testów dla CD u objawowych pierwszorzędowych krewnych jest oczywista, o tyle obecnie jest niewiele dowodów wspierających takie badania u bezobjawowych krewnych (Rostomi wsp. 2006, Caproni i wsp. 2009). Za potencjalne mechanizmy zaangażowane w wywołanie obu chorób uważane są zmiany w przepuszczalności jelita i międzykomórkowych obwódek zamykających (tightjunction) (Green i wsp. 2003). Odpowiedź immunologiczna na cząsteczki gliadyny ma miejsce w dwóch przedziałach organizmu blaszce właściwej (laminapropria) i nabłonku jelita cienkiego. W patomechanizmie udowodniono rolę CD4+ limfocytów T, natomiast kwestią kontrowersyjną wydaje się rozważana rola CD8limfocytów T (Abenavoli i wsp. 2006). Głównym czynnikiem środowiskowym jest spożycie glutenu, którego najbardziej istotną patogenetycznie frakcję stanowi gliadyna. Hipoteza autoimmunizacyjnej patogenezy CD głosi deamidację frakcji gliadyny pszenicznej przez ttg, wiązania do HLA DQ2 i rozpoznawania przez jelitowe limfocyty T z konsekwentnym produkowaniem cytokin powodujących uszkodzenia nabłonka, enzymów degradujących macierz i przeciwciał IgA przeciwko ttg (Reunala 2001). Gliadyna jest prolaminą i zawiera wysokie ilości glutaminy, proliny i hydrofobowych aminokwasów (Field i wsp. 1982, Cornell i wsp. 1992, Sárdy 2002b).Aminokwasy te tworzą kilka epitopów w prolaminiowym białku (gliadynie), z których niektóre są immunodominujące. Jednakże szczególną cechą glutenu jest fakt, że deamidacja pewnych polipeptydowych reszt (zarówno prolamin, jak i glutein) może doprowadzać do identyfikowania ich jako antygenów z rozpoznawaniem przez limfocyty T pewnych deamidowanych białek dużo bardziej skutecznie niż tych niezmodyfikowanych (Lundin i wsp. 1997, Sjöström i wsp. 1998, Van der Wal i wsp. 1998, Sárdy 2002b). W związku z powyższym, większość antygenowych białek gliadynowych nie jest rozpoznawanych w swojej natywnej formie. Wyjaśnieniem tego zjawiska może być charakterystyczna właściwość DQ2 i DQ8 wiążą one motywy które preferencyjnie wiążą białka posiadające ładunek ujemny. Chociaż białka glutenu nie są bogate w reszty naładowane ujemne, po procesie deamidacji powstaje kwas glutaminowy, zatem w konsekwencji gluten może się stać bogatym źródłem epitopów dla DQ2 i DQ8 (Sárdy Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 10

11 2002b). Wówczas są one prezentowane przez komórki prezentujące antygen poprzez molekuły HLA DQ2 lub DQ8. Komórki te skutecznie uczynniają zarówno CD4+ Th1- limfocyty co prowadzi do stanu zapalnego i przebudowy tkanki, jak i Th2-limfocyty, co inicjuje produkcję przeciwciał przeciwko białkom glutenu. Dzięki wysokiej zawartości glutaminy i proliny, prolaminy są preferowanymi substratami dla transglutaminaz (Bruce i wsp. 1985, Sárdy 2002b). Deamidowane polipeptydy gliadyny wiążą się krzyżowo z pewnymi białkami transglutaminazowymi mogąc osiągać powierzchnie podstawnoboczną enterocytów. Taki kompleks może funkcjonować jako neoantygen będący rozpoznawanym zarówno przez gluteno-swoiste i transglutaminazo-swoiste limfocyty B (Sárdy 2002b). Dane doświadczalne sugerują, że przeciwciała pojawiają się w wyniku uszkodzenia błony śluzowej jelit u pacjentów DH (Marietta i wsp. 2008), co pasowałoby do ogólnie akceptowanej teorii, że wszyscy pacjenci DH posiadają w jakimś stopniu immunopatologiczną jelitową odpowiedź na gluten, która jest manifestowana na skórze. Uwaga badaczy skoncentrowana jest na wyjaśnieniu z jakiego powodu i w jaki sposób przeciwciała anty-tgs są generowane zarówno w DH jak CD. Możliwym jest, że katalizator(y)/wyzwalacz(e) produkcji przeciwciał znajdują się w jelicie i jest/są powiązane z jego uszkodzeniami. Dalsze prace powinny skoncentrować się na odnalezieniu tych katalizatorów (innych niż spożycie glutenu, np. w postaci pszenicy). Istotnym jest także określenie, czy produkcja tych transglutaminazo-swoistych przeciwciał jest niezbędna do rozwoju patologii autoimmunizacyjnej w jelicie cienkim i skórze czy też stanowią one jedynie konsekwencje patologii jelitowej (Marietta i wsp. 2008). Jest możliwym, że nadmiar anty-ttg IgA może być deponowany także w skórze poprzez reakcje krzyżowe ze skórnymi transglutaminazami. Co ciekawe, ttg jest także zaangażowana w międzycząsteczkowe krzyżowe wiązanie kolagenu VII, co się dzieje niedaleko miejsca gdzie występują złogi IgA w skórze DH (Dieterich i wsp. 1999). Dalsze badania powinny ujawnić czy istnieje skórny autoantygen DH związany z ttg, jednak możliwość istnienia unikalnej determinanty antygenowej w skórze pacjentów DH, lecz nie CD, pozostaje zagadkowe (Reunala 2001). Możliwym jest, że kompleks ttg-gluten inicjuje odpowiedź przeciwciał IgA (Sollid i wsp. 1997), ale nie jest w stanie produkować immunoglobulin anty-ttg wysokiego powinowactwa, co skutkuje początkowo cichą formą CD. Przeciwciała te krzyżowo reagują z etg poprzez ich wysokie podobieństwo aminokwasowe, ale mają w stosunku do nich niską awidność. Po dłuższej prowokacji gliadynowej (pacjenci DH zwykle ukazują objawy później niż pacjenci CD), specyficzna krzyżowo reagująca populacja przeciwciał rozwija się u tych pacjentów którzy nabędą DH. Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 11

12 Przeciwciała te wykazują niskie powinowactwo do ttg, ale niezmiernie duże do etg (Sárdy i wsp. 2002a,b). Kwestia czy wzrastają one przeciwko etg jako głównemu antygenowi, czy są wynikiem rozprzestrzeniania epitopów (epitopespreading ES) pozostaje nieznana, jak również zagadnienie dlaczego jedynie część pacjentów rozwija specyficzne przeciwciała przeciwko etg i dlaczego ta grupa pacjentów ma tylko bardzo ograniczony proces enteropatii również pozostaje do zbadania. Patologia skórna może być wywołana przez skórne złogi krążących immunokompleksów zawierających IgA i etg (Sárdy i wsp. 2002a). Prawdopodobnie enzym ten jest w stanie aktywnym, co skutkuje krzyżowym wiązaniem kowalencyjnym kompleksu do pewnych strukturalnych elementów skórnych. To może poniekąd tłumaczyć, dlaczego nie jest możliwym wydobycie/wyekstrahowanie IgA immunokompleksów ze skóry pacjentów DH. Stany zapalne skóry mogą eliminować kowalencyjnie związane immunokompleksy. W rzeczywistości, często IgA są obecne w okołowykwitowej i/lub klinicznie niezmienionej skórze a nie w obszarze powstawania pęcherza (Sárdy 2002a,b, Marietta i wsp. 2004). W przeciwieństwie do wielu innych autoimmunizacyjnych dermatoz pęcherzowych, jak pęcherzyca, BP, linijna IgA dermatoza pęcherzowa (LABD), gdzie nastąpił postęp w scharakteryzowaniu głównych autoantygenów, w przypadku DH wciąż należy rozwiązać zagadkę złogów IgA w skórze, kwestie konkretnego autoantygenu i fakt czy przeciwciała IgA odgrywają sprecyzowaną rolę w procesie powstawania pęcherza (Reunala 2001) Różnice między DH i CD Powiązania DH i CD nie wywołują raczej szerszej dyskusji, kontrowersje nasilają się wobec różnic między tymi dwiema chorobami. Należy jednak pamiętać, że między DH a CD istnieją istotne rozbieżności, których nie sposób ignorować. Pierwsza, zasadnicza niezgodność, wynikająca z definicji obu chorób, ukazuje odmienną kliniczną ekspresję wrażliwości na gluten. Klasyczna manifestacja nadwrażliwości na gluten to CD, która jest chorobą żołądkowo-jelitową (jej kliniczna ekspresja tyczy głównie jelita cienkiego), natomiast DH jest dermatozą pęcherzową (skórne ujawnienie choroby) (Hervonen i wsp. 2000). Jednak występowanie zmian skórnych charakterystycznych dla DH stało się powodem dyskusji. Niektórzy badacze zauważają, że po wyłączeniu z diety glutenu następują remisje choroby (Reunala i wsp. 1997) inni natomiast nie zaobserwowali takiej zależności (Shuster i wsp. 1968). Uważa się, że większość pacjentów DH nie rozwija objawów trawiennych. Jednak dane doświadczalne wskazują, że wśród przebadanych Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 12

13 pacjentów tylko 13% miało objawy jelitowe (Alonso-Llamazares i wsp. 2007), a u 87% glutenozalezną enteropatię stwierdzono po biopsji jelita. Z kolei Zone (Zone 2004) podaje, że ok. 20% pacjentów DH ma objawy jelitowe. Istnieje również niezgodność w sprawie zaniku kosmków jelitowych w DH, który wykazuje różny stopień zaawansowania. Niektórzy obserwują normalny nabłonek jelita cienkiego u ok. 1/3 pacjentów DH (Fry i wsp. 1974), inni demonstrują że enteropatia występuje praktyczniew każdym przypadku DH (Brow i wsp. 1971). Ponieważ DH bywa rozważana jako CD skóry, badacze podnoszą istotność znaczenia skórnego wykładnika jako diagnostycznego narzędzia dla rozpoznawania uszkodzeń jelita (Caproni i wsp. 2009), sugerując, że udowodnienie DH eliminuje potrzebę biopsji jelita cienkiego (Caproni i wsp. 2009).Już wcześniej sugerowało się, że CD może być diagnozowana poprzez inne manifestacje niż żołądkowo-jelitowe (Green 2003), co obejmuje DH. Druga różnica sugerująca niejednorodność pomiędzy chorobami to różnice genetyczne pomiędzy jelitową a skórną manifestacją wrażliwości na gluten. Ostatnio pewne regiony chromosomowe zostały zidentyfikowane, jako możliwie zaangażowane w genetyczne różnice pomiędzy CD i DH (Holopainen i wsp. 2001). Badania przeprowadzone przy użyciumetody nieparametrycznych sprzężeń pomiędzy markerami mikrosatelitarnymi a daną chorobą ujawniły, że rodziny tylko z jelitową manifestacją wykazywały sprzężenie głównie z 2q33, podczas gdy rodziny z DH wykazywały sprzężenie z 11q i 5q, ale nie z 2q33 (Holopainen i wsp. 2001). Udowodniono też, że HLA DQ2 wykazuje ekspresję zależną od płci i przekazuje silniejszą podatność kobietom niż mężczyznom (Holopainen i wsp. 2001).Analiza ta miała również na celu wykazanie jak bardzo czynniki genetyczne determinują skórną (DH) i jelitową (CD) manifestację nadwrażliwości na gluten. Wskazują one, co wspomniano również wyżej, że manifestacja nadwrażliwości na gluten może znacznie się różnić u genetycznie identycznych osobników, niektórzy mogą mieć tylko schorzenie jelit CD, inni głównie chorobę skóry DH. Dane te mogą sygnalizować zjawisko plastyczności genotypowej umożliwiającej fakt, że genetycznie identyczne osobniki mają wyraźnie rozróżnialne fenotypy, CD lub DH, co sugeruje, że czynniki środowiskowe determinują konkretny fenotyp tej wieloczynnikowej choroby (Hervonen i wsp. 2000). Kolejne różnice tyczą samej odpowiedzi immunologicznej organizmu. Pomimo iż CD i DH mają elementy komórkowej i humoralnej odpowiedzi, wydaje się, że CD jest mediowana głównie przez Th1, a DH przez Th2 (Caproni i wsp. 1998, Salvati i wsp. 2002, Marietta i wsp. 2004, Dmochowski 2006b). Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 13

14 Następna rozbieżność odnosi się do profilu autoantygenów obu chorób. Dominującym autoantygenem w CD jest ttg (Dieterich i wsp. 1997), natomiast zidentyfikowany główny autoantygen w immunokompleksie brodawek skórnych w DH to etg (Sárdy i wsp. 2002a). etg jest enzymem ulegającym ekspresji w naskórku i wykazuje wysoką homologię do ttg. Pacjenci z DH produkują dwie populacje przeciwciał IgA przeciwko etg. Pierwsza populacja wiąże wyłącznie etg, podczas gdy druga reaguje krzyżowo zarówno z etg i ttg. Krzyżowo reagujące etg-swoiste przeciwciała są znajdowane także w glutenozależnej enteropatii bez DH, lecz wykazują niższą awidność dla etg niż pacjenci DH (Sárdy i wsp. 2002a, Rose i wsp. 2009). Przeciwnie, etgswoiste przeciwciała nie reagujące krzyżowo z ttg są obecne tylko u pacjentów DH (Sárdy i wsp. 2002a). Co więcej, etg a nie ttg kolokalizuje ze złogami IgA w skórze pacjentów DH (Sárdy i wsp. 2002a,b, Donaldson i wsp. 2007) i poziom przeciwciał przeciwko etg koreluje z istnieniem enteropatii w DH lecz nie enteropatii bez DH (Marietta i wsp. 2008). Czynnikiem mogącym przyczyniać się do tego braku korelacji pomiedzy produkcją antyttg i anty-etg IgA a zaawansowaniem enteropatii może być fakt, że pacjenci CD będący na diecie zawierającej gluten zazwyczaj posiadają trzeci lub wyższy stopień zmian wg skali Marsha, podczas gdy wszystkie stopnie zaawansowania enteropatii mogą występować u pacjentów DH będących na diecie zawierającej gluten (Marietta i wsp. 2008). Niektórzy pacjenci CD mają etg IgA (Sárdy 2002a,b, Marietta i wsp. 2008), jednak nie są one skorelowane ze stopniem zaawansowania zaniku kosmków jelitowych, podobnie produkcja tym razem anty-ttg IgA u CD nie koreluje z zaawansowaniem enteropatii (Tursi i wsp. 2003, Marietta i wsp. 2008). Wprawdzie nie powinno być wątpliwości, że nietolerancja glutenu leży u podłoża zarówno CD, jak i DH, to jednak osobliwości DH, choroby z wykwitami skórnymi, powinno badać się na poziomie skórnym. O ile patomechanizm CD i DH wydaje się podobny, to w odróżnieniu od niego epidemiologia tych chorób jest istotnie różna. Zasadnicza różnica ma związek z częstością występowania (Sárdy 2002b): podczas gdy DH jest stosunkowo rzadką chorobą, CD jest dość powszechnym schorzeniem. Szacuje się, że DH występuje w naszej populacji ze średnią częstotliwością 11 na osób, co stanowi 1/5 z częstotliwości występowania CD (Gawkrodner i wsp. 1984). W przeciwieństwie do CD, którą diagnozuje się przeważnie w dzieciństwie (zazwyczaj przed ukończeniem 6 roku życia, a głównie w pierwszych dwóch latach życia), DH zazwyczaj ujawnia się w późnym okresie dojrzewania lub we wczesnym okresie dorosłości (15-40 rok życia) (Mobacken i wsp. 1984, Reunala i wsp. 1978, Gawkrodner i wsp. 1984). Ponadto stwierdza się, że mężczyźni częściej zapadają na Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 14

15 DH (mężczyzna:kobieta 3:2), odwrotnie jest w CD (kobieta: mężczyzna 2:1) (Reunala 2001, Bolotin i wsp. 2011) Zagadnienia nozologiczne DH w obrębie CD Nozologia stanowi dziedzinę nauk medycznych zajmującą się klasyfikacją chorób. Niektórzy badacze sugerują, że należy rozważać poszczególne jednostki chorobowe na poziomie nozologicznym i patologicznym, rozpoznając różnice pomiędzy tymi dwoma podejściami, nawet jeśli w praktyce są one często mieszane z powodu występujących niejasności znaczeniowych (Lagier 2001). W tym kontekście nozologia winna być traktowana jako badania i opis chorób, a patologia jako badanie zmian charakterystycznych dla tych chorób.już dawno temu Hertz i wsp. (Hertz i wsp. 1977) zauważyli, że nozologia chorób pęcherzowych jest niejasna, szczególnie zaś dotyczy to DH. Od kiedy w 1884 roku Duhring (Duhring1884) skierował uwagę badaczy na grupę wykwitów skórnych określanych jako dermatitis herpetiformis, ich zainteresowanie jednostkami chorobowymi z podobnymi zmianami wzrosło w celu znalezienia im właściwego miejsca nozologicznego w dermatologii (Ravogli 1890). Uprzednio wiele z tych przypadków było mylone z rumieniem wielopostaciowym, pęcherzycą czy liszajcem opryszczkowatym, pozostawiając te osobliwe wykwity poza jakąkolwiek kategorią nozologiczną (Ravogli 1890). Śledząć piśmiennictwo traktujące o DH, łatwo można spostrzec, że istnieje niespójność w jego nozologicznym ulokowaniu. DH może być rozważana jako (i) choroba skóry współtowarzysząca CD, (ii) jako jej skórna manifestacja (Herrero-González 2010) będąca komplikacją wywołaną niestosowaniem przy CD właściwej diety bezglutenowej oraz (iii) jako osobna jednostka chorobowa z nadwrażliwości na gluten będącą jej inną fenotypową ekspresją. Już wcześniejsze badania wykazały brak nozologicznej granicy pomiędzy glutenozależną enteropatią towarzyszącą DH i tą obserwowaną w CD (Démoulins-Giacco i wsp. 1996). Istnieją doniesienia, że DH i CD są różną kliniczną ekspresją tej samej wrażliwości na gluten (Cuartero i wsp. 1992), w co wpisuje się hipoteza zespołu Marietta i wsp. (Marietta i wsp. 2008), którzy definiują DH jako osobną jednostkę chorobową często tylko powiązaną z enteropatią. Dane piśmiennicze ukazują rozbieżność we współdiagnozowaniu obu jednostek zarówno podaje się, że ok. 5% pacjentów DH ma wcześniej zidentyfikowane CD (Gawkrodger i wsp. 1993), jak i, że DH występuje u ok. 25% pacjentów z CD (Collin i wsp. 2003, Rodrigo 2006, Humbert i wsp. 2006). Sugeruje się, że przewlekłe spożywanie glutenu w CD z predyspozycjami genetycznymi może skutkować rozwojem DH Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 15

16 (Gawkrodger i wsp. 1993). Zatem można uważać dietę bezglutenową jako czynnik zapobiegawczy. Ostatnimi czasy DH coraz częściej zaliczana jest do jednej grupy chorób, razem z CD i ataksją glutenową, których cechą wspólna jest nadwrażliwość na gluten (Herrero-González 2010). Z drugiej strony badacze podnoszą, że istnieją rosnące dowody, by rozważać DH jako specyficzną fenotypową, skórną ekspresję glutenozależnej enteropatii nie do rozróżnienia z CD (Kárpáti 2004, Marietta i wsp. 2004). W świetle takiego stwierdzenia proponowanym jest, by patrzeć na DH jak na ciągłe spektrum CD (Reunala 2001, Zone 2004), które w innym przypadku może zostać niezdiagnozowane (Zone 2004). W świetle powyższego, Zone zauważa, że DH można traktować jako marker CD niezależny od stopnia zaawansowania histolpatologicznego CD i towarzyszących objawów jelitowych (Zone 2004). Wciąż jednak niedokładnie wiadomo czy DH jest skórną manifestacją CD lub czy jest osobną jednostką towarzyszącą glutenozależnej enteropatii. Kwestia nozologiczneh przynależności DH jest przyczynkiem dyskursów naukowych m.in. na łamach American Family Physican. Pojawiające się tam sugestie jednych autorów (Bickle i wsp. 2002), że DH jest u większości pacjentów powiązane z glutenozależną enteropatią spotkało się z odzewem środowiska badawczego. Przeciwnicy (Lovett 2003) uważają, że DH winna być traktowana raczej jako wariant lub powikłanie nieleczonej CD. Jako dowód podaje się, że DH i CD dzielą ten sam haplotyp HLA i wykazują podobne wyniki badań surowiczych i tkankowych przeciwciał. Lovett (Lovett 2003)sugeruje także, że DH jest przykładem atypowej CD. Zebrane dane ujawniają nozologiczny chaos w ulokowaniu DH, co może być wynikiem złożonych i nie do końca poznanych mechanizmów patogenetycznych warunkujących wystąpienie choroby. W świetle powyższego, pilna i konieczna jawi się potrzeba ustalenia w tym względzie konsensusu naukowego i uproszczenia aktualnego systemu nozologicznego.być może powinno się rozważyć uaktualnienie definicji DH i wprowadzenie nowego terminu w uznaniu niektórych istotnych aspektów skórnej patofizjologii choroby. Można przypuszczać, że określenie glutenouwarunkowana dermatoza IgA neutrofilowozależna (gluten-sensitive IgA/neutrophil-mediated dermatitis - GAND)dla dermatozy opisywanej przez Duhringa byłoby właściwsze i bardziej zrozumiałe dla społeczności lekarzy bez specjalności dermatologicznej/farmaceutów/biotechnologów i ogólnej opinii publicznej (Gornowicz-Porowska i wsp. 2012c - manuskrypt w recenzji). Omawiając tą kwestię, należy zauważyć, że tego typu tendencje są obserwowane w piśmiennictwie i starszy termin herpes gestationis został już zastąpiony określeniem Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 16

17 pemphigoid gestationis jako lepiej odzwierciedlającym patofizjologię tej autoimmunizacyjnej dermatozy pęcherzowej Patogeneza pemfigoidu pęcherzowego (BP) w kontekście budowy połączenia skórno-naskórkowego BP to dermatoza pęcherzowa skóry z autoimmunizacji wobec białek DEJ, w przebiegu której dochodzi do powstania pęcherza podnaskórkowego (Dmochowski 2006a, Ujiie i wsp. 2010). Jordon i wsp. (Jordon i wsp. 1967) udowodnili, że pacjenci z BP mają krążące przeciwciała skierowane przeciwko antygenom umiejscowionym w obrębie błony podstawnej keratynocytów. Z czasem wykazano białka BP230 (BPAG1) (Stanley i wsp. 1981, Stanleywsp. 1984) i BP180 (BPAG2, kolagen XVII) (Labib i wsp. 1986) jako ważne antygeny w BP. Ponadto BP180 zostało niezależnie opisane i scharakteryzowane przez Nishizawę i wsp. (Nishizawa i wsp. 1993) przy zastosowaniu metod biochemicznych. W celu ułatwienia dalszej charakterystyki BP230 i BP180 zostało sklonowane korespondujące do każdego z białek cdna, dzięki wykorzystaniu funkcjonalnego przeszukiwania bibliotek ekspresyjnych (Stanley i wsp. 1988, Diaz i wsp. 1990, Giudice i wsp. 1992). Ponadto analizy te pomogła ustalić relację względem biosyntezy pomiędzy BP230 i BP180: są one produktami różnych, niepowiązanych genów. Mapowanie chromosomowe umiejscowiło gen dla BP230 na krótkim ramieniu chromosomu 6 (locus 6p11-12) i gen dla BP180 na długim ramieniu chromosomu 10 (locus10q24.3) (Sawamura i wsp. 1990, Li i wsp. 1991). Sugeruje się, że prawdopodobnie domena NC16a BP180 obejmuje najbardziej istotne autoepitopy w patogenezie chorób kręgu BP, który obejmuje BP właściwy, pemfigoid ciężarnych i liszaj płaski pęcherzowy pemfigoidalny (Sitaru i wsp. 2002, Zillikens 2002, Dmochowski 2006a, Ujiie i wsp. 2010, Pietkiewicz i wsp. 2012). Uważa się, że w odpowiedzi autoimmunizacyjnej BP uczestniczą nie tylko immunoglobuliny G, ale również klasy IgE (Ujiie i wsp. 2010). Zjawiska przylegania poszczególnych komórek, ich połączenia z cytoszkieletem wewnętrznym i oddziaływania z macierzą zewnątrzkomórkową warunkują strukturę każdej tkanki. W przypadku skóry, jej funkcja i homeostaza zależy od stabilnej organizacji i kohezji (spójności) pomiędzy naskórkiem a skórą właściwą (Briggaman i wsp. 1975, Villone i wsp. 2008). Tkanki te, zarówno oddziela, jak i wzajemnie łączy strefa połączenia skórno-naskórkowego umożliwiając ich czynnościowy rozdział i jednocześnie wspólnie tworząc stabilne strukturalne kontinuum. To ciągłe spektrum DEJ powoduje, że każde z białek je budujących może być antygenem, w różnych i odpowiednich ku temu Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 17

18 kombinacjach, wzbudzającym odpowiedź autoimmunizacyjną. Przy czym należy pamiętać, iż DEJ nie stanowi prostego związania komórek przy pomocy obojętnych cząsteczek, ale charakteryzuje się pewną prężnością układu. Jest to niezwykle złożona sieć wzajemnie powiązanych białek, których wiele uczestniczy w procesach przekazywania sygnału, dostarcza adhezji i dynamiki przestrzeni między naskórkiem i skórą właściwą, zapewniając skomplikowany system mechanicznej stabilności strukturalnej skóry (Briggaman i wsp. 1975, Burgeson i wsp. 1997). Ponadto DEJ pełni funkcję bariery transportowej - na podstawie wielkości i ładunku molekuły, ogranicza transport cząsteczek pomiędzy naskórkiem a skórą właściwą, jednocześnie pozwalając na przejście wędrujących lub wnikających komórek w warunkach fizjologicznych (melanocyty i komórki Langerhansa) i patologicznych (limfocyty i komórki nowotworowe) (Burgeson i wsp. 1997). Dodatkowo DEJ wzmacnia naskórek i wpływa na zachowanie keratynocytów poprzez zmianę polarności komórek, procesów proliferacji, migracji czy różnicowania (Burgeson i wsp. 1997). Spełnia także istotną rolę podczas morfogenezy, procesów gojenia i przebudowy skóry. Pomimo, że dokładne funkcje niektórych białkowych składników DEJ nie zostały w pełni wyjaśnione, ich nieprawidłowości wydają się powiązane licznymi odziedziczalnymi i nabytymi dermatozami. W celu zbadania wymienionych procesów, kinetyki ekspresji i regulacji białek obecnych w DEJ powstało wiele modeli doświadczalnych in vivo i in vitro (Chamson i wsp. 1989, Marionnet i wsp. 2006). W przypadku hodowli in vitro analizie zazwyczaj podlega zdolność komórek do syntetyzowania specyficznych dla DEJ białek. Natomiast modele in vivo dostarczają cennego wglądu w powstawanie i odtwarzanie błony podstawnej keratynocytów (Marionnet i wsp. 2006). Nową jakość w badaniach nad DEJ niosą najnowsze osiągnięcia biologii molekularnej trójwymiarowe hodowle organotypowe (wykazujące morfologiczne podobieństwo do skóry) (Marionnet i wsp. 2006). Ultrastrukturalnie DEJ jest podzielona na cztery strefy: podstawne keratynocyty wraz z ich błoną plazmatyczną obejmującąpółdesmosomy (hemidesmosome - HD), elektronowo przezierna lamina lucida, elektronowo gęsta lamina densa i sub-basal lamina(zwana również sublaminadensa) (Briggaman i wsp. 1975, Burgeson i wsp. 1997, Villone i wsp. 2008). DEJ bywa też synonimicznie określane jako strefa błony podstawnej (basement membrane zone - BMZ) (Burgeson i wsp. 1997). Dane piśmiennicze wskazują, że zaburzenie któregoś z głównych jej składowych skutkuje drastycznym zaburzeniem struktury tkanki (Zillikens i wsp. 1999, Villone i wsp. 2008). Analiza przy zastosowaniu mikroskopu elektronowego ujawniła, że DEJ składa się z wąskich, czasem pofałdowanych Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 18

19 granic między keratynocytami podstawnymi a skórą właściwą (McMillan i wsp. 2003). Jednostką dostarczającą mechanicznej stabilności układu jest kompleks zakotwiczający składający się z HD na podstawnej powierzchni keratynocytów, filamentów zakotwiczających w obrębie lamina lucida i wiążących HD do błony podstawnej oraz włókienek zakotwiczających w obrębie laminadensa, które łączą błonę podstawną z leżącym niżej zrębem skóry (McMillan i wsp. 2003, Villone i wsp. 2008). Kompleks zakotwiczający funkcjonuje przez ustanowienie stabilnych, ciągłych połączeń pomiędzy cytoszkieletem podstawnych keratynocytów (filamentami pośrednimi) i zakotwiczającymi strukturami w obrębie warstwy brodawkowej skóry właściwej (Zillikens i wsp. 1999, McMillan i wsp. 2003). Filamenty pośrednie formują część cytoszkieletu i są zaangażowane w utrzymanie kształtu komórek i spójności struktur naskórkowych (McMillan i wsp. 2003), ponadto ich sieć dostarcza szkieletu molekularnego przekazującego mechaniczną siłę keratynocytom (Zillikens i wsp. 1999). Główny komponent kompleksu, HD to niewielkie (<5 µm), regularnie oddzielone, gęste elektronowo struktury (Zillikens i wsp. 1999, McMillan i wsp. 2003), które dostarczają przyczepu filamentom keratyny do podstawno-bocznej powierzchni naskórka i dodatkowo zakotwiczają go mocno z lamina densa przez sieć połączeń z filamentami i włókienkami zakotwiczającymi (Burgeson i wsp. 1997). HD mogą być podzielone na wewnętrzną płytkę leżącą bezpośrednio pod keratyną filamentów pośrednich oraz na zewnętrzną płytkę przykrywającą błonę plazmatyczną (McMillan i wsp. 2003). Pięć głównych składników HD zostało biochemicznie zidentyfikowanych: są to białka o masie cząsteczkowej 500, 230, 200, 180 i 120 kda i oznaczane,odpowiednio, HD1-5 (Hieda i wsp. 1992). HD1 to cząsteczka plektyny, HD2 i HD4 to antygeny w BP (BP230 i BP180), HD3 i HD5 odpowiadają podjednostką β4 i α6 integryny α6β4 (Burgeson i wsp. 1997). Przynajmniej dwa wysokocząsteczkowe białka związane z rodziną plakin są rozważane jako łącznik pomiędzy filamentami pośrednimi a HD: plektyna i naskórkowa forma antygenu BP230 (BPAG1e) (Burgeson i wsp. 1997, McMillan i wsp. 2003). Obydwa są zamocowane w wewnętrznej płytce HD. BP230 zawiera N-terminalną domenę plakinową, centralną część przypominającą zwinięty spiralnie pręt i domenę C-terminalną, która wiąże filamenty pośrednie (McMillan i wsp. 2003). Uważa się, że BP230 jest zdolny do samoskładania w dimery o wysokim podobieństwie do innych członków rodziny plakin (Sawamura i wsp. 1991). Dotychczas zostały zidentyfikowane trzy produkty będące wynikiem alternatywnego składania (alternative splicing) genu BPAG1, określane BPAG1a (forma powiązana ze zmianami neurodegeneracyjnymi u myszy), BPAG1e Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 19

20 (forma naskórkowa) i BPAG1n (forma nerwowo-mięśniowa, znana też jako dystonin) (Leung i wsp. 2001). BP230 ulega ekspresji w nerwach skórnych i podstawnych keratynocytach. Białko to może oddziaływać z szeregiem cząsteczek: cytoplazmatyczną domeną kolagenu XVII, włóknami pośrednimi keratyny (keratin intermediate filaments - KIF), białkiem erbin i cytoplazmatyczną domeną integryny β4. Zatem, zdaje się, że BP230 ogrywa rolę w łączeniu cytoszkieletu KIF do wielu komponentów HD (Zillikens i wsp. 1999, Borradori i wsp. 1999). Przypuszcza się, że ma też istotne znaczenie w zapoczątkowaniu odpowiedzi autoimmunizacyjnej (Zillikens i wsp. 1999). Plektyna i BP230 są kolejno połączone z molekułami przezbłonowymi: kolagenem XVII (BP180,BPAG2) i integryną α6β4, przy czym BP180 i integryna α6β4 mogą być połączone przy pomocy białka erbin (Favre i wsp. 2001). Integryna α6β4 i BP180 mają wiele domen wiążących, zarówno zewnątrz jak i wewnątrzkomórkowych, dzięki którym mogą zapewne oddziaływać z lamininą 332. Na granicy lamina lucida/lamina densa laminina 332 może przypuszczalnie tworzyć kompleksy z lamininą 6 i 10 (Burgeson i wsp. 1997, McMillan i wsp. 2003). Nidogen jest w stanie łączyć kompleksy lamininy 6 i 10 do sieci kolagenu IV. W obrębie błony plazmatycznej znajduje się przezbłonowa tetraspanina CD151, która jest najprawdopodobniej zaangażowana w sygnalizację komórkową i morfogenezę (Sterk i wsp. 2000). Konkretna jej funkcja zapewne polega na grupowaniu niespecyficznych receptorów integryny, co ułatwia wiązanie komórek (Sterk i wsp. 2000, McMillan i wsp. 2003). CD151 stanowi niewielkie białko obejmujące błonę cztery razy, w wyniku czego tworzy dwie zewnątrzkomórkowe pętle. Przypuszcza się, że CD151 jest kodystrybuowany na powierzchni podstawno-bocznej keratynocytu z wiążącymi lamininy integrynami: α6β4, α3β1 i α6β1. Z kolei w budowie innego przezbłonowego białka, BP180, można wyróżnić wewnątrzkomórkowy N-koniec i zewnątrzkomórkowy C-koniec (Zillikens i wsp. 1999, McMillan i wsp. 2003) Stosując przeciwciała specyficzne dla konkretnych domen BP180 wykazano, że domena NC16a (uważana za najbardziej immunogenną) jest umiejscowiona w obrębie górnej częścilamina lucida, w bezpośrednim sąsiedztwie HD, podczas gdy C- końcowy region kolokalizuje z lamininą 332 na powierzchni międzyfazowej lamina lucida/lamina densa (Masuanga i wsp. 1997, Ishii i wsp. 2003). Można zatem stwierdzić, że BP180 posiada kolistą głowę w obrębie keratynocytu, domenę zewnątrzkomórkową o przedłużonej konformacji przecinającą lamina lucida, z C-końcem, który tworząc zapętlony ogon przechodzi do lamina densa (Dmochowski 2006c). Cytoplazmatyczna domena BP180 wiążę integrynę α6β4 i BP230, a zewnątrzkomórkowy region oddziałuje z integryną α6β4 (McMillan i wsp. 2003). Dokładna funkcja BP180 nie została jeszcze do Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 20

21 końca poznana, jednak sugeruje się jego wielozadaniowość. Przypuszcza się, że pomaga grupować BP230 i plektynę i ułatwiając tym samym montowanie HD: istnieją doświadczalne dowody wskazujące, że BP180 wiąże BP230, który może także przyłączać integrynę α6β4, co sugeruje rolę BP180 w zaciąganiu BP230 do istniejącego kompleksu integryny α6β4 i plektyny (Burgeson i wsp. 1997). Ponadto BP180 prawdopodobnie wspiera strukturę i funkcję filamentów oraz włókienek zakotwiczających (Zillikens i wsp. 1999). Istnieje hipoteza, że długa zewnątrzkomórkowa i haczykowata (zapętlona) domena BP180 funkcjonuje jako cząsteczka adhezyjna układu komórka-macierz (McMillan i wsp. 2003), co może być powiązane ze zdolnością tej domeny do wiązania lamininy 332 i domeny NC-1 kolagenu VII. Filamenty zakotwiczające występują w regionie lamina lucida i stanowią cienkie, nitkowate struktury składające się z lamininy 332 i łączące HD z lamina densa (przecinają lamina lucida i pojawiają się w lamina densa). Dane doświadczalne wskazują, że laminina 332 może bezpośrednio wiązać N-koniec (NC1) domeny kolagenu VII (Rousselle i wsp. 1997). Zakotwiczające włókienka to z kolei centrosymetryczne twory mające początek początek w laminadensa i rozciągające się do skóry właściwej/sub-densa lamina (Burgeson i wsp. 1997). Zakotwiczające włókienka są złożone głównie z kolagenu VII. Keene i wsp. zaproponowali, że tworzą one wielowarstwową sieć wzajemnych połączeń będących strukturami określanymi płytkami zakotwiczającymi (Keene i wsp. 1987), co stało się przyczynkiem do dyskusji nad ich strukturą. Shimizu i wsp. (Shimizu i wsp. 1997) nie zaobserwowali podobnego tworu, natomiast wykazali, że włókienka zakotwiczające tworzą pętle w sub-densa lamina i oba końce powracają do lamina densa. Późniejsi badacze (Ishii i wsp. 2003) również nie zauważyli struktur płytek zakotwiczających, pozostawiając kwestię ich istnienia jako wątpliwą. Integryny α6β4 i α63β1 są receptorami dla laminin (McMillan i wsp. 2003). Integryny mogą przekazywać sygnał regulujący ekspresję genów i wzrost komórek (Burgeson i wsp. 1997), składają się z niezwiązanych kowalencyjnie, genetycznie różnych podjednostek α i β. Różne kombinacje tych podjednostek tworzą kompleksy różniące się swoistością wiązania ligandu (Burgeson i wsp. 1997). W obrębie lamina densa mogą też występować serie małych zmostkowanych cząsteczek obejmujących fibulinę 2, nidogen, perlekan i fibronektynę potrafiących krzyżowo wiązać lamininę i kolagen IV w obrębie lamina densa (McMillan i wsp. 2003). Dalsze badania DEJ zapewne skoncentrują się na określeniu precyzyjnej funkcji nowo zidentyfikowanych składowych, jak CD151 czy białko erbin. Dodatkowo szczegółowej analizy wymagają czynniki wpływające kontrolę Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 21

22 procesu przylegania i ścieżki sygnalizacji komórkowej w obrębie DEJ, a także istotność wariantów splicingowych (np. ekspresja różnych izoform plektyn, BP230 czy białka erbin). Poszczególne składowe elementy DEJ pełnią istotną rolę w utrzymaniu skórno- -naskórkowego przylegania, którego zakłócenie jest cechą charakterystyczną niektórych chorób pęcherzowych, w tym BP. Wiadomo, że BP cechuje się obecnością przeciwciał skierowanych przeciwko składowym błony podstawnej, a będące wynikiem odpowiedzi autoimmunizacyjnej organizmu późniejsze zmiany, strukturalne i czynnościowe, w obrębie DEJ prowadzą do powstania, charakterystycznych dla tej dermatozy, pęcherzy podnaskórkowych. Ultrastrukturalne badania ujawniły, że przeciwciała anty-bp umiejscawiają się w wewnątrzkomórkowej płytce HD i na wierzchniej warstwie lamina lucida bezpośrednio poniżej leżącego HD (Zillikens i wsp. 1999). Szczegółowe analizy wykazały, że miejsce tworzenia pęcherzy w obrębie lamina lucida odpowiada umiejscawianiu związanych in vivo przeciwciał w lamina lucida (Holubar i wsp. 1975). Wiadomo, że w BP pęcherz tworzy się w niższej części lamina lucida. Ponadto skonstruowany doświadczalny model in vitro ujawnił, że tworzenie pęcherzy w BP zależy również od aktywacji komplementu i związania neutrofilów do BMZ (Gammon i wsp. 1984). Aktywowane procesem autoimmunizacyjnym neutrofile wydzielają enzymy proteolityczne, w tym elastazę neutrofilową, odpowiedzialne za rozdział naskórkowoskórny (Verraes i wsp. 2001, Briggaman i wsp. 1984). Udowodniono, że DEJ jest wysoce wrażliwa na trawienie proteolityczne i komórki zapalne (w tym neutrofile) zawierające proteazy mogą mieć istotne patologiczne znaczenie w chorobach związanych z rozpadem DEJ (Schechter 1989), w tym w BP. Przeciwciała anty-bmz w różnych podnaskórkowych autoimmunizacyjnych dermatozach pęcherzowych są wiązane do docelowych antygenów umiejscowionych w różnych regionach BMZ, co prowadzi do specyficznych zmian strukturalnych, które odzwierciedlają różnice we wzorze świecenia immunofluorescencyjnego związanych in vivo przeciwciał oraz w umiejscowieniu pęcherzy (Vodegel i wsp. 2004). Zmiany w BMZ mogą odpowiadać nie tylko za różnice w lokalizacji pęcherza, ale również za różnice w przebiegu klinicznym poszczególnych dermatoz dotykających DEJ (Woźniak i wsp. 2005). Stosując skanujący laserowy mikroskop konfokalny (laserscanning confocal microscopy - LSCM) analizowano zmiany różnych regionów BMZ w autoimmunizacyjnych dermatozach podnaskórkowych, w tym w BP. W przypadku analizy pacjentów z BP uzyskane dane wykazały, że większość zmian ma miejsce w obrębie lamina lucida, która zawiera liczne wgłębienia (inwaginacje), bardziej wyrażone we wierzchniej części lamina lucida i stopniowo mniej widoczne na Justyna Gornowicz-Porowska Rozprawa doktorska 22