Michał Gorczykowski. Zmiany ilościowe populacji limfocytów krwi obwodowej bydła jako wskaźnik aktywności IFN-tau PRACA DOKTORSKA

Transkrypt

1 U N I W E R S Y T E T P R Z Y R O D N I C Z Y w e W R O C Ł A W I U W y d z i a ł M e d y c y n y W e t e r y n a r y j n e j Michał Gorczykowski Zmiany ilościowe populacji limfocytów krwi obwodowej bydła jako wskaźnik aktywności IFN-tau PRACA DOKTORSKA Promotor: dr hab. Anna Chełmońska-Soyta prof. nadzw. Katedra Immunologii, Patofizjologii i Prewencji Weterynaryjnej Wrocław 2012

2 Pani Prof. Annie Chełmońskiej-Soyta za pomoc, cenne rady oraz cierpliwość serdecznie dziękuję Za wsparcie merytoryczne i duchowe pragnę również podziękować Przyjaciołom, Koleżankom i Kolegom a zwłaszcza: Magdzie Majewskiej, Tomaszowi Majowi, Joannie Gali, Joannie Bajzert i Patrycji Libako oraz Pani Iwonie Zbyryt

3 I. Wstęp S p i s t r e ś c i 1. Właściwości IFN-τ Charakterystyka ogólna Polimorfizm i kontrola ekspresji IFN-τ Szlaki przekazywania sygnału dla IFN-τ Fizjologiczne efekty IFN-τ w czasie ciąży u bydła Elekt luteotropowy Immunoregulacja Inne efekty fizjologiczne IFN-τ Postęp hodowlany a rozród Techniki rozrodu Ocena jakości zarodków.. 32 II. Cel Pracy. 36 III. Materiał i metody Odczynniki gotowe stosowane w przeprowadzanych badaniach Przygotowywane samodzielnie media i bufory Technika izolacji i przygotowania do hodowli in vitro komórek mononuklearnych krwi obwodowej Doświadczenie I Wpływ rekombinowanego interferonu-tau na indukowaną mitogenami transformację blastyczną limfocytów w teście mikromiareczkowania kolorymetrycznego z MTT Doświadczenie II Ocena przydatności poliklonalnej króliczej surowicy anty-roinf-tau do znoszenia efektu antyproliferacyjnego IFN-τ Doświadczenie III Wpływ rekombinowanego interferonu-tau na frekwencję limfocytów TCD4, TCD8, Tγδ i B oraz ekspresję receptora CD25 w spontanicznej i indukowanej mitogenami tranformacji blastycznej Doświadczenie IV. Wpływ stężenia rekombinowanego IFN-τ na ilość limfocytów Tγδ w indukowanej mitogenami tranformacji blastycznej Doświadczenie V. Reaktywność kriokonserwowanych komórek mononuklarnych krwi obwodowej wybranej jałówki hodowanych in vitro w obecności ConA i IFN-τ Doświadczenie VI. Określenie stężenia IFN-τ w supernatantach z nad hodowli in vitro zarodków bydlęcych Doświadczenie VII. Efekt dodatku supernatantów zarodkowych do hodowli in vitro limfocytów Sposób analizy zarchiwizowanych wyników immunofenotypizacji limfocytów Sposób prezentacji i analiza statystyczna wyników 47 IV. Wyniki badań Doświadczenie I Wpływ rekombinowanego interferonu-tau na indukowaną mitogenami tranformację blastyczną limfocytów w teście mikromiareczkowania kolorymetrycznego z MTT Doświadczenie II Ocena przydatności poliklonalnej króliczej surowicy anty-ro IFN-τ do znoszenia efektu antyproliferacyjnego IFN-τ Doświadczenie III Wpływ rekombinowanego interferonu-tau na frekwencję limfocytów TCD4, TCD8, Tγδ i B oraz ekspresję receptora CD25 w spontanicznej i indukowanej mitogenami tranformacji blastycznej Doświadczenie IV. Wpływ stężenia rekombinowanego IFN-τ na ilość limfocytów Tγδ w indukowanej mitogenami tranformacji blastycznej Doświadczenie V. Reaktywność kriokonserwowanych komórek mononuklarnych krwi obwodowej wybranej jałówki hodowanych in vitro w obecności ConA i IFN-τ Doświadczenie VI. Określenie stężenia IFN-τ w supernatantach z nad hodowli in vitro zarodków bydlęcych Doświadczenie VII. Efekt dodatku supernatanatantów zarodkowych do hodowli in vitro limfocytów...63 V. Dyskusja Analiza wyników doświadczeń w których użyto rekombinowanego IFN-τ Analiza wyników doświadczeń w których użyto nasączy znad hodowli in vitro zarodków bydlęcych Zastosowanie cytometrii przepływowej do oceny proliferacji. 76 VI. Wnioski 82 VII. Piśmiennictwo.. 83 VIII. Streszczenie. 100

4 I. Wstęp 1. Właściwości intereronu tau 1.1 Charakterystyka ogólna Interferon tau (IFN-tau, IFN-τ) po raz pierwszy wyizolowano w latach 80-tych ubiegłego wieku z homogenatów 12 i 13 dniowych zarodków owczych, stąd też pierwotnie nazwano go trofoblastyną bądź białkiem-1 trofoblastu (otp-1); (Winkelman i wsp., 1999; Demmers i wsp., 2001). Białko to produkowane jest wyłącznie przez komórki trofoblastu w okresie okołoimplantacyjnym, jest specyficzne jedynie dla podrzędu Ruminantia (Roberts i wsp., 1998). IFN-τ jest jednym z podstawowych czynników istotnych dla podtrzymania wczesnej ciąży u przeżuwaczy. U bydła produkcja IFN-τ przypada na dzień ciąży, przy czym maksymalna synteza widoczna jest od 16 do 19 dnia po zapłodnieniu. Po implantacji zarodka ekspresja i wydzielanie IFN-τ zanikają (Farin i wsp., 1990; Low i wsp., 1990). Bydlęcy IFN-τ jest glikoproteiną o masie kda, o długości łańcucha wynoszącej 172 aminokwasy i należy do rodziny interferonów typu I (Roberts i wsp., 1997). Pod względem budowy aminokwasowej białko to wykazuje około 80% zgodności sekwencji z interferonem ω, ok. 50% z IFN-α i ok. 25% z IFN-beta (Roberts i wsp., 1997). Badania wykorzystujące modelowanie molekularne wskazują, że struktura przestrzenna cząsteczki IFN-τ jest zbliżona do pozostałych przedstawicieli interferonów typu I. Opiera się ona na pięciu długich alfa-helisach oznaczonych symbolami od A do E połączonych pętlami aminokwasowymi, przy czym na pętli łączącej helisy C i D występuje dodatkowa helisa krótka (Senda i wsp., 1995). Podobnie jak inne interferony typu I, IFN-τ posiada silne właściwości antywirusowe, jednak jego synteza nie jest indukowana przez wirusy (Leaman i wsp., 1994). W porównaniu z IFN-α jest on również znacznie mniej cytotoksyczny (Subramaniam i wsp., 1995) i dlatego też z jego antywirusowymi właściwościami wiązane są duże nadzieje przy leczeniu zakażeń wirusami, np. HIV i FIP (np.: Soos i wsp., 1995; Rogez i wsp., 2003; Pontzer i wsp., 1997). Szeroko opisywaną w literaturze właściwością IFN-τ jest jego antyproliferacyjne działanie w stosunku do komórek ssaków. Hamuje on m.in. stymulowaną mitogenami bądź alloantygenem proliferację limfocytów krwi obwodowej bydła, owiec i człowieka (np.: Emond i wsp., 4

5 2000; Tekin i wsp., 2000; Fillion i wsp., 1991). Antyproliferacyjne działanie IFN-τ nie jest natomiast widoczne w przypadku bydlęcych komórek endometrialnych, będących głównym celem działania IFN-τ. Jest to prawdopodobnie ewolucyjnym przystosowaniem, pozwalającym na wzrost endometrium w czasie ciąży, mimo obecności interferonów typu I (Davidson i wsp., 1994) i zwiększonej pod ich wpływem ekspresji białek proapoptotycznych (Groebner i wsp., 2010). Funkcjonowanie IFN-τ nie tylko jako cytokiny, ale jako hormonu ciążowego jest również widoczne w jego oddziaływaniu na zwierzęta nie będące w ciąży. Przykładowo, podanie IFN-τ owcom w trakcie cyklu płciowego powoduje zmiany polegające na naśladowaniu środowiska ciążowego (np. efekt antyluteolityczny, czy obniżenie ekspresji receptora oksytocynowego) (Chen i wsp., 2006). IFN-τ prócz szeregu cech charakterystycznych dla interferonów typu I, posiada również szereg cech unikatowych, związanych z ewolucyjnie nową funkcją tego białka, jako głównego czynnika warunkującego podtrzymanie ciąży u przeżuwaczy. 1.2 Polimorfizm i kontrola ekspresji IFN-τ Dane z piśmiennictwa dotyczące właściwości i funkcji IFN-τ bywają często ze sobą sprzeczne i wydaje się, że jednym z tego powodów jest istnienie różnych izoform tego białka, a także fakt, że poziom jego ekspresji jest silnie zróżnicowany nawet pomiędzy poszczególnymi komórkami trofoblastu (Guillomot i wsp., 1998; Johnson i wsp., 2006). Wszystkie gatunki w obrębie podrzędu Ruminantia z wyjątkiem żyraf, posiadają wiele genów dla IFN-τ (Roberts, 2007). Geny te są zlokalizowane na chromosomach 8q15 u bydła i kóz oraz 2p15 u owiec (Ryan i wsp., 1993; Martal i wsp., 1998). Szacuje się, że u bydła jest od 4 do 10 genów dla IFN-τ (Leaman i wsp., 1992; Ryan i wsp., 1993; Alexenko i wsp. 2000). Natomiast polimorficznych alleli IFN-τ znanych jest minimum 18 u owiec, 9 u kóz i od 12 do 18 u bydła (Alexenko i wsp., 2000; Ealy i wsp., 2004; Walker i wsp., 2009). Określenie liczby izoform IFN-τ komplikuje fakt, że u niektórych gatunków dochodzi do tzw. potranslacyjnej modyfikacji polipeptydu, a u bydła i kóz dodatkowo do zróżnicowanej glikozylacji (Guillomot i wsp., 1998; Early i wsp., 2006). Poszczególne izoformy zarówno w obrębie gatunku, jak i poza nim cechuje 5

6 wysoki stopień zgodności sekwencji aminokwasowej i nukleotydowej co obrazuje tabela 1 (Ealy i wsp., 2004). caifn-τ1 caifn-τ2a caifn-τ3 caifn-τ4a caifn-τ5 caifn-τ6 ovifn-τ4 boifn-τ1a caifn-τ1 90,7 90,7 88,4 87,2 87,2 94,3 79,1 caifn-τ2a 95,9 99,4 96,5 95,3 94,2 93,3 84,9 caifn-τ3 95,5 99,6 97,1 95,9 94,8 93,3 84,9 caifn-τ4a 95,0 98,2 98,2 98,8 97,7 91,2 83,7 caifn-τ5 94,7 98,2 98,2 99,3 96,5 90,2 81,4 caifn-τ6 91,5 97,4 97,4 99,1 98,4 90,2 80,8 caifn-τ4 97,9 90,2 95,9 95,4 95,0 94,7 81,5 caifn-τ1a 89,2 91,4 91,1 90,4 90,4 89,7 89,9 identyczność sekwencji nukleotydowej (%) identyczność sekwencji aminokwasowej (%) Tabela 1. Podobieństwo sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych wybranych izoform IFN-τ [ca kozi; bo - bydlęcy; ov owczy] (z Ealy i wsp., 2004) Walker i wsp. (2009) donosząc o 18 wariantach IFN-τ i analizując sekwencje cdna otrzymane na bazie transkryptów z zarodków bydlęcych zaobserwowali, że za każdy zidentyfikowany wariant IFN-τ odpowiedzialne były jedynie pojedyncze, niesynonimiczne zmiany nukleotydowe. Niekonserwatywnymi było jedynie 9 z pośród 190 kodonów. Co więcej, zmienność aminokwasowa w transkryptach po każdej stronie była ograniczona do dwóch. Pozycjami kodonów zmiennych są: 5 (D/N); 46 (N/S); 65 (L/F); 69 (Y/H); 70 (T/I); 102 ( P/Q); 105 (G/E); 126 (G/D) i 146 (V/M). Na ogół warianty bydlęcego IFN-τ dzielone są na 3 klasy (1-3). Walker i wsp. (2009) konstruując swoje drzewo filogenetyczne dla IFN-τ proponują utrzymać podział na 3 grupy z tym, że pierwszą dzielą na dwie podgrupy I: zawierającą izoformy 1a, 1f, i 1g, oraz II zawierającą 1c i 1d, wyłączając z klasy pierwszej wariant 1b, który ma cechy pośrednie między klasą 1 i 3. Natomiast klasa 2 i 3 pozostają bez zmian, z tym że klasę 3 wzbogacono o nowo odkryte izoformy 3f, 3g, 3h oraz 3i. Podobnie jak w przypadku izoform IFN-alfa (Kumaran i wsp., 2007), poszczególne izoformy interferonów tau cechuje zróżnicowana aktywność biologiczna. Parent i wsp. (2003) badając m. in. boifn-τ1a, boifn-τ2b, boifn-τ3b, wykazali, że izoformy 2b i 3b w komórkach nabłonkowych endometrium hamują ekspresję PGE2 i PGF2α niezależnie od stężenia w zakresie od 0,01 do 20 µg, przy nieznacznym tylko wpływie na komórki podścieliska. Zgoła odmienne działanie ma izoforma 1a, która w 6

7 stężeniach 10 i 20 µg stymuluje ekspresję obu prostaglandyn zarówno w nabłonku, jak i w podścielisku. W obecności octanu mirystynianu forbolu (PMA) produkcja prostaglandyny PGE2 w hodowli pierwotnej bydlęcego nabłonka endometrialnego była najwyższa pod wpływem boifn-τ1a. Natomiast hamowanie produkcji PGF2α w obecności oksytocyny było najsilniejsze pod wpływem boifn-τ2b, a dla boifn-τ1a i boifn-τ3b niemal identyczne. Obecność IFN-τ w medium hodowlanym można wykryć już około 6-9 dnia po inseminacji w przypadku zarodków bydlęcych uzyskiwanych i hodowanych technikami in vitro (Hernandez-Ledezma i wsp., 1992; Chełmońska-Soyta, 2002). W warunkach in vivo maksymalna sekrecja odbywa się między 16 a 19 dniem (Robinson i wsp., 2006). W warunkach laboratoryjnych Stojkovic i wsp. (1995) w hodowli pierwotnej bydlęcej tkanki trofoblastycznej wykazali incydentalne utrzymanie produkcji IFN-τ nawet do 43 dnia po inseminacji, przy czym do 23 dnia następował równoczesny wzrost powierzchni tkanki trofoblastycznej, skutkujący wzrostem produkcji IFN-τ. Po 23 dniu tkanka w dalszym ciągu rozrastała się, ale poziom IFN-τ spadał. Yao i wsp. (2009) stosując hybrydyzację in situ z sondami cdna dla IFN-τ znakowanymi digoksygeniną wykryli mrna dla IFN-τ w bydlęcych zarodkach już od 4 do 9 dnia hodowli. Czas inicjacji ekspresji mrna dla IFN-τ zależał od techniki uzyskania i hodowli zarodka. W przypadku techniki IVF (in vitro fertilization) mrna dla IFN-τ po raz pierwszy wykryto czwartego dnia w stadium 16-komórkowym, w technice SCNT (somatic cell nuclear transfer) w stadium moruli piątego dnia, a przy PA (parthenogenetic activation) dopiero szóstego dnia w stadium blastocysty. W kontekście metod IVF warto wspomnieć także o zróżnicowanej produkcji IFN-τ w zależności od zagęszczenia zarodków hodowli. Zarodki hodowane in vitro w grupach po kilka produkują więcej IFN-τ w przeliczeniu na zarodek, niż hodowane pojedynczo. Mechanizm tego zjawiska nie jest jednak znany, choć można przypuszczać, że produkowane przez zarodki czynniki wzrostu oddziałują parakrynnie, wzajemnie stymulując tempo swojego dojrzewania i produkcję IFN-τ (Larson i Kubisch, 1999). W przypadku zarodków uzyskiwanych in vivo Short i wsp. (1991) obserwowali wzrost aktywności antywirusowej w płynie macicznym dopiero od 14 dnia ciąży, gdy zarodek mierzył około 4-5 mm długości. W 17 dniu zarodki produkowały

8 jednostek antywirusowych w przeliczeniu na sztukę w ciągu 24 godzin. Okazuje się, że w przypadku zarodków bydlęcych pozyskanych w dniu 14 i 18 poziom ekspresji mrna dla IFN-tau jest podobny, natomiast ilość wydzielanego białka jest większa i wprost proporcjonalna do rozmiaru zarodka/trofoblastu (Robinson i wsp., 2006). Natomiast Lonergan i wsp. (2003) wykazali obecność mrna dla IFN-τ w zarodkach bydlęcych zarówno hodowanych in vitro jak i hodowanych w jajowodach owcy już od 6 dnia po zapłodnieniu. Ealy i wsp. (2001) badając ekspresję trzech wariantów bydlęcego IFN-τ (1a; 2b i 3d) w 14, 17, 19 i 25 dniu po zapłodnieniu wykazali ich ekspresję we wszystkich terminach, z tym, że 14 i 25 dnia była ona na bardzo niskim poziomie, w dniu 17 najwyższy poziom ekspresji miał wariant 1a a o około 30% niższą ekspresję miały dwie pozostałe izoformy, natomiast w dniu 19 łączna ekspresja bo-ifn-τ 2b i 3d była zbliżona do ekspresji 1a. Zróżnicowana ekspresja i aktywność interferonów w obrębie jednego gatunku charakterystyczna jest nie tylko dla bydła. Winkelman i wsp., 1999 badając owcze interferony tau wykazali, że aktywność antywirusowa badanych izoform rosła w kolejności: p6, p3, p8. W czasie ekspresji genów interferonów tau poziom produkcji poszczególnych izoform różni się między sobą i zmienia się w czasie rozwoju zarodka. Z badań Matsuda-Minehata i wsp., (2005) że u owiec dominującymi izoformami są warianty 10, 4 i 2, przy czym około 80 % zidentyfikowanych transkryptów należało do pierwszego z nich. Walker i wsp., (2009) u 8 dniowych blastocyst bydlęcych opisali 4 warianty IFN-τ: 1c, 1d, 2b, 3a. Większość transkryptów męskich zarodków żeńskich i męskich było wariantem 1c lub 3a. Normalizowana ekspresja dla tych wariantów, na skali gdzie 1 oznacza brak ekspresji, wynosiła 4,8 i 4,75 dla 1c oraz 4,06 i 3,54 dla 3a odpowiednio dla samic i samców. Dla odmiany średnia ekspresja kolejnego z najintensywniej produkowanego wariantu, IFN-τ2b, wynosiła 1,41 dla obu płci. Poziom ekspresji poszczególnych izoform w późniejszych okresach hodowli przedstawia ryc. 1. 8

9 Jednostki normalizowane ekspresji IFN-tau W arianty IFN-tau Ryc. 1 Ekspresja wariantów bydlęcego IFN-τ od 14 do 19 dnia. Na czarno podkreślono nowo opisane izoformy IFN-τ (reprod. z Walker i wsp., 2009) Jak już wspomniano, ekspresja IFN-τ jest regulowana zarówno przestrzennie jak i czasowo, jednak mimo coraz lepszego poznania mechanizmów kontroli transkrypcji tych genów nie jest ona w pełni zrozumiała (Roberts, 2007; Walker i wsp., 2009). Pierwsze koncepcje dotyczące regulacji ekspresji genów dla IFN-τ pojawiły się pod koniec lat dziewięćdziesiątych ubiegłego wieku i zakładały, że w obrębie miejsca promotorowego istnieją dwie sekwencje istotne dla poziomu transkrypcji IFN-τ. Jednym z nich jest miejsce konsensusowe dla czynnika transkrypcyjnego Ets-2. Czynnik ten występuje w trofektodermie, a testy z użyciem genu lucyferazy pod kontrolą promotora IFN-τ wykazały, że wzbudzenie ekspresji Ets-2 aktywuje jej transkrypcję spod promotora IFN-τ. Efekt ten jest wzmacniany przez inne czynniki z rodziny Ets-2, np. GABPalfa, jednak tylko Ets-2 samodzielnie transaktywuje gen IFN-τ (Ezashi i wsp., 1998). Rola czynnika Ets-2 została potwierdzona w kolejnych badaniach i jest on obecnie uznawany za główny czynnik transkrypcyjny kontrolujący ekspresję IFN-τ w komórkach trofoblastu. Dzięki tym odkryciom można było tłumaczyć fenomen niskiej produkcji IFN-τ około 7 dnia po zapłodnieniu i wysokiej, sięgającej nawet 100 µg, około dnia 16 (ryc. 2A), która wymaga przyłączenia się do sekwencji promotorowej koaktywatora. 9

10 Ryc. 2 Proponowane modele kontroli transkrypcji IFN-ta (A) reprod. z Roberts i wsp., 1999; (B i C) reprod. Z Ealy i wsp., 2009 (opis w tekście): AP1, Cdx 2; Ets-2, Dlx3, CDP/p300, Oct 4 czynniki transkrypcyjne. Z Ets-2 współdziałają kolejne białka koaktywatorowe, takie jak np. CBP/p300 (Xu i wsp., 2003). Kontrola aktywności CBP/p300 w trofoblaście przez kinazę białkową A otwiera drogę do regulacji transkrypcji IFN-τ przez czynniki wzrostu obecne w macicy i działające za pośrednictwem szlaku kinaz MAP (Das i wsp., 2008). Innym koaktywatorem Ets-2 jest czynnik DLX3, wzmacniający transkrypcję IFN-τ ok. 250 razy (Ezashi i wsp., 2008). Ekspresja IFN-τ może być dodatkowo wzmacniana przez kompleks cfos/cjun, wiążący się z miejscem AP-1 w rejonie -654 do -555 promotora IFN-τ (Xavier i wsp., 1997; Yamaguchi i wsp., 1999a). W trofoblaście owiec maksymalna ekspresja cfos i cjun występuje w 14 i 15 dniu ciąży, kiedy ma miejsce również maksymalna produkcja IFNτ. Test EMSA (electrophoretic mobility shift assay) jasno wskazuje, że czynniki te są w trofoblaście aktywne i przyłączają się do sekwencji w regionie promotorowym IFN-τ (Xavier i wsp., 1997). Stymulacja komórek nietrofoblastycznych transfekowanych plazmidem zawierającym gen IFN-τ za pomocą czynników pobudzających cjun również prowadzi do aktywacji transkrypcji (Yamaguchi i wsp., 1999b). AP-1 zdaje się współpracować z czynnikiem Ets-2 (Xu i wsp., 2003), chociaż z badań Das i wsp. (2008) 10

11 wynika, że możliwe jest również działanie antagonistyczne. Większość badań nad regulacją transkrypcji IFN jest prowadzonych przy użyciu regionów promotorowych bydlęcego lub owczego interferonu wklonowanego do reporterowego plazmidu z genem lucyferazy lub transacetylazy chloramfenikolu w ludzkich komórkach rakowych JEG3 lub JAR. Spośród opisanych powyżej czynników Ets-2, Jun i CBP są znajdowane w wielu tkankach i komórkach, natomiast wydaje się że specyficznymi koaktywatorami są DLX3 i wspomniany dalej CDX2, kontrolują one ekspresję bifn-τ i oifn-τ w trofoblaście. W ostatnim czasie Bai i wsp. (2009) wykryli w obrębie regionu promotorowego bifn-τ jeszcze 6 potencjalnych miejsc wiążących czynniki GATA (ryc. 3). Autorzy ci wykazali ponadto transkrypcję mrna dla czynników GATA 2, 3 i 6 w komórkach bydlęcych trofoblastów CT-1. Ich transkrypty stwierdzono w 17, 20 i 22 dniowych zarodkach bydlęcych. W badaniach prowadzonych na innych liniach jajnikowej warstwy ziarnistej (ocg) i fibroblastach ucha (EF) wykryto obecność GATA- 2 i 3, ale nie GATA-6. W komórkach CT-1 transkrypcja genu dla endogennego bydlęcego bydlęcego IFN-τ była wzmacniana przez nadekspresję GATA2 lub/i GATA3 i dodatkowo była obniżana przez sirna (mały interferencyjny RNA) specyficzny dla mrna GATA2, co ostatecznie przemawia za udziałem GATA2/3 w kontroli ekspresji genów IFN-τ w trofoblastach. Nie wiadomo w chwili obecnej, czy czynniki GATA współpracują z Ets-2 i cfos/cjun. Ryc.3 Lokalizacja sekwencji GATA w obrębie sekwencji promotorowej IFN-τ (reprod. z Bai i wsp. 2009) Jak widać, ogólny proces regulacji ekspresji genów dla interferonów tau został już dość dobrze poznany, jednak mechanizm prowadzący do zróżnicowanej ekspresji poszczególnych wariantów IFN-τ jest wciąż niejasny. Promotory czterech wariantów bydlęcego interferonu (1a, 1c, 2b,3b), które zostały w pełni zsekwencjonowane na długości 430 pz w górę od miejsca startu transkrypcji wszystkie zachowały kompletną 11

12 sekwencję wzmacniającą DLX3/Ets-2/AP1 i są w powyżej 99% konserwatywne na przestrzeni 430 pz. Również pozostałe opisane promotory w bazie Bovine Genome Datebase Assemble 3.1, są identyczne w 98,3 do 99% na długości powyżej 900 pz przed miejscem start transkrypcja. (Walker i wsp., 2009). Pomimo znacznej konserwatywności sekwencji enhancerowo-promotorowych dla IFN-τ z badań Matsuda-Minehata i wsp., 2005 wynika, że zamiana fragmentu promotra powyżej 452 pz od miejsca start transkrypcji bardzo wyraźnie wpływa na efektywność transkrypcji, co obrazuje rycina 4. Ryc. 4. (A) Wpływ mutacji w obrębie promotora na jego efektywność, mierzona na podstawie aktywności acetylotranferazy chloramfenikolu. (B) Efektywność promotorów dla trzech wariantów owczego IFN-τ z uwzględnieniem roli ich fragmentów w pozycji przed i po -452 pz. (reprod. z Mastuda-Minehata i wsp., 2005) Jeszcze słabiej niż kontrola ekspresji izoform poznane są sekwencje wyciszające, odpowiadające za wygaszenie ekspresji IFN-τ po implantacji jak dotąd zidentyfikowano dwa regiony, mogące pełnić tę funkcję (Yamaguchi i wsp., 2000) oraz poznano rolę białka Oct-4, które jest odpowiedzialne za hamowanie transkrypcji interferonu (Kurosaka i wsp., 2007). Sytuację dodatkowo komplikuje fakt, że ekspresja 12

13 genów dla IFN-tau podlega dodatkowo kontroli mechanizmów epigenetycznych. Metylacja sekwencji regulujących ekspresję IFN-τ jest regulowana czasowo i pokrywa się z okresem wydzielania IFN-τ przez zarodek (Nojima i wsp., 2004). Z kolei wspomniany powyżej czynnik transkrypcyjny CDX2 kontrolujący ekspresję IFN-τ we współpracy z Ets-2 jest również jednym z białek regulujących acetylację histonów poprzez współdziałanie z czynnikiem o aktywności acetylotransferazy histonowej. W regionie promotorowym IFN-τ znajdują się dwa miejsca wiążące CDX2 i w bezpośrednim otoczeniu jednego z nich rzeczywiście obserwuje się większy poziom acetylacji histonu H3K18, czemu towarzyszy zwiększenie aktywności transkrypcyjnej (Sakurai i wsp., 2010), ponadto kontrola ekspresji CDX2 i jego wyciszanie przy pomocy sirna korelują z aktywnością promotora IFN-τ, być może we współpracy z metylacją innych histonów (Sakurai i wsp., 2009). Prawdopodobnie właśnie mechanizmy epigenetyczne są również odpowiedzialne za wyciszenie ekspresji genów IFN-τ w tkankach niezarodkowych. 1.3 Szlaki przekazywania sygnału dla IFN-τ Podobnie jak pozostałe interferony typu I, interferon tau wiąże się z receptorami klasy II dla cytokin, określanymi mianem IFNAR (ang. interferon alpha/beta receptor). Receptory te składają się z dwóch podjednostek, IFNAR1 i IFNAR2c (Han i wsp., 1997; Rosenfeld i wsp., 2002). Cząsteczki IFNAR obecne są na powierzchni wielu komórek ciała, w tym limfocytach T i B oraz monocytach (Massirer i wsp., 2004; Pogue i wsp., 2004). W macicy, będącej głównym narządem docelowym IFN-τ, receptory IFNAR występują na nabłonku luminalnym i gruczołowym i wydaje się, że są to główne tkanki macicy, na które oddziałuje IFN-τ (Rosenfeld i wsp., 2002). Ze względu na współdzielenie tego samego receptora z pozostałymi interferonami typu I (Li i Roberts, 1994a), IFN-τ uruchamia podobne szlaki sygnałowe, co IFN-α i IFN-beta, a efekt działania tych szlaków jest rozległy. Obecnie proponowane są dwa modele szlaków przekazywania sygnału wewnątrzkomórkowego pod wpływem IFN-τ (ryc. 5). Pierwszy szlak (A), charakterystyczny dla komórek zrębu i nabłonka gruczołowego, znany jest od dawna i polega na aktywacji kinaz JAK i białek STAT (Spencer i wsp., 1998). W efekcie przyłączenia się interferonu do receptora IFNAR dochodzi do aktywacji reszt tyrozynowych kinaz białkowych z rodziny JAK, w szczególności Jak1 i 13

14 Tyk2. Kinazy te fosforylują białka STAT, które łączą się w homo- lub heterodimery STAT1-STAT1 oraz STAT1-STAT2, a następnie ulegają translokacji do jądra komórkowego. Homodimer STAT1 znany jest jako czynnik transkrypcyjny GAF (ang. gamma activated factor) i ma on zdolność do łączenia się z sekwencjami regulatorowymi DNA określanymi jako GAS (ang. IFN-gamma activated site). Z kolei heterodimer STAT1-STAT2 wymaga połączenia z białkiem IRF-9, a tak powstały trimer to czynnik transkrypcyjny ISGF3 (ang. IFN-stimulated gene factor 3), który przyłącza się do sekwencji ISRE (ang. interferon stimulated response element) znajdującej się w obszarach promotorowymh genów indukowanych przez IFN-τ (Samuel, 2007). Za pośrednictwem szlaku JAK/STAT aktywowane są m. in. takie geny, jak STAT1, STAT2, IRF9, ISG15, MIC, OAS (Spencer i wsp., 2008). W bydlęcym endometrium wykazano nie tylko fosforylację białek STAT1, STAT2 i STAT3, ale także aktywację czynników regulowanych przez interferon (IRF), co ma istotne znaczenie w antyluteolitycznym działaniu IFN-τ omówionym dalej (Binelli i wsp., 2001). Czynniki te, szczególnie IRF-1, po wzbudzeniu transkrypcji przez aktywowane białka STAT uczestniczą w kontroli ekspresji kolejnych genów, stanowią one zatem swego rodzaju przedłużenie klasycznego szlaku JAK/STAT (Binelli i wsp., 2001; Wesseley, 2005). Doświadczalnie wykazano, że dynamika fosforylacji poszczególnych elementów szlaku JAK/STAT może być zróżnicowana. Przykładowo, IFN-τ w komórkach nabłonkowych endometrium owiec powoduje długotrwałą fosforylację oraz translokację do jądra komórkowego białek STAT1 i STAT2, trwającą od 10 minut do 48 godzin po stymulacji interferonem. Natomiast w przypadku białek STAT3; STAT5a/b oraz STAT6 fosforylacja i translokacja do jądra komórkowego jest przejściowa i trwa od 10 do 60 minut, a zjawiskom tym towarzyszy także zróżnicowana czasowo ekspresja genów zależnych od GAS (od 3 do 24 godz. po stymulacji) i ISRE (długotrwała ekspresja powyżej 24 godz.) (Steward i wsp., 2001). Regulacja fosforylacji białek STAT i ich aktywności jest dodatkowo regulowana poprzez zwiększenie ekspresji negatywnych regulatorów omawianego szlaku, wiadomo bowiem, że IFN-τ oddziałując na owcze endometrium nie tylko uaktywnia białka STAT, ale i podwyższa poziom mrna dla białek SOCS (ang. suppressor of cytokine signaling), hamujących fosforylację STAT (Sandra i wsp., 2005). Szlak JAK/STAT jest w wzbudzany pod wpływem IFN-τ nie 14

15 tylko w endometrium, ale również w komórkach bydlęcego miometrium, czego efektem jest utworzenie funkcjonalnych dimerów GAF oraz czynnika transkrypcyjnego ISGF3 (Doualla-Bell i Koromilas, 2001). A B zarodek szlak Migracja Proliracja Elongacja szlak Ekspresja genów & Wydzielnicza odpowiedź Ryc. 5 Schemat wewnątrzkomórkowych szlaków przekazywania sygnałów pod wpływem IFN-τ szczegółowy opis w tekście; Uterine stroma podścielisko macicy; Uterine LE/sGE komórki nabłonka gruczołowego (reprod. ze Spencer i wsp., 2008 oraz Bazer i wsp., 2008) Drugi szlak (ryc. 5 B) dotyczy komórek adluminalnej warstwy nabłonka i gruczołów powierzchownych błony śluzowej macicy. Pod wpływem IFN-τ nie dochodzi w nich do aktywacji białek STAT1, gdyż w komórkach tych wzbudzenie ekspresji czynnika transkrypcyjnego IRF2 prowadzi do zablokowania sekwencji ISRE, które nie mogą odpowiadać na powstający w wyniku fosforylacji STAT1/STAT2 czynnik ISGF3 (Kim i wsp., 2003) i po stymulacji IFN-τ ekspresja genów STAT1- zależnych jest jedynie przejściowa (Johnson i wsp., 1999a). Podobnie jak w przypadku innych IFN typu I, IFN-τ w wyniku oddziaływania z IFNAR może pobudzać także szlaki sygnałowe, w których pośredniczą kinazy MAP. IFN-τ z pewnością pobudza szlak zależny od p38 MAPK (Doualla-Bell i Koromilas, 2001; Guzeloglu i wsp., 2004b). Dodatkowo opisano także aktywację szlaków opartych o Ras, Raf, Erk1/2, Akt i Jnk w komórkach nabłonka i zrębu (Banu i wsp., 2010; Lee i wsp., 2011). Podobnie jak w przypadku innych cząsteczek pobudzających szlak sygnałowy kinaz MAP, także w przypadku IFN-τ zaobserwowano oddziaływania z innymi 15

16 ścieżkami przekazywania sygnału np. z receptorami estrogenowymi i progesteronowymi. Przykładowo, doświadczalnie wykazano regulacyjny wpływ IFN-τ na ekspresję wielu genów, m. in.: CST3, CTSL, LGALS15 i WNT7A. Aktywacji ekspresji tych genów nie da się wyjaśnić samym oddziaływaniem IFN-τ. Bazer i wsp. (2008) sugerują powiązanie szlaków IFN-τ i progesteronu. Według nich progesteron (P4) obniża ekspresję swojego receptora w obrębie luminalnej warstwy nabłonka i w nabłonku gruczołowym oraz w gruczołach powierzchniowych (sge). Natomiast w komórkach zrębu progesteron poprzez swój receptor (PGR) indukuje syntezę czynnika wzrostu fibroblastów FGF7 i FGF10 oraz czynnika wzrostu hepatocytów (HGF), a skutkiem tego jest parakrynne ich działanie na śluzówkę macicy i zarodek, w których dochodzi do ekspresji receptorów FGFR2IIIb i MET. Natomiast pod wpływem IFN-τ czynnik IRF2 na zasadzie konkurencyjności łączy się z sekwencją ISRE i tym samym blokuje ekspresję białek aktywowanych w szlaku klasycznym, czyli m. in. STAT1 i PGR. W wyniku wzajemnej interakcji pomiędzy IFN-τ i receptorem progesteronowym dochodzi do aktywacji kolejnych czynników transkrypcyjnych w szlakach MAPK i PI3K. IFN-τ działa zatem za pośrednictwem dwóch typów szlaków sygnałowych, wzbudzanych w zależności od warunków osobno lub jednocześnie i oddziałujących z innymi ścieżkami sygnałowymi. W efekcie skutki działania IFN-τ mogą być rozległe. Przykładowo, Chen i wsp. (2007) wykazali, że w luminalnych komórkach nabłonkowych IFN-τ powoduje zmianę poziomu transkrypcji 1274 genów z genów badanych przy użyciu mikromacierzy DNA. Gray i wsp. (2006) stosując technikę mikromacierzy na modelu owczym wykazali, że ekspresja wielu genów ważnych z punktu widzenia implantującego się zarodka oraz reaktywności macicy może być indukowana, wzmacniana lub blokowana przez IFN-τ, przy czym 180 zbadanych przez nich genów zależało wyłącznie od IFN-τ, natomiast 74 wymagało interakcji z progesteronem, a 70 zależało jedynie od progesteronu. Podobnymi metodami porównano wpływ IFN-τ oraz IFN-α i wykazano, że niektóre efekty IFN-τ są swoiste tylko dla niego i nie są obserwowane w przypadku innych IFN typu I, mimo działania za pośrednictwem tego samego receptora (Bauersachs i wsp., 2011). Metody wielkoskalowego badania transkryptomu i proteomu są coraz częściej stosowane w 16

17 określaniu efektu IFN-τ i wszystkie one wskazują na zmianę ekspresji przynajmniej kilkuset genów pod wpływem tej cytokiny. 2. Fizjologiczne efekty IFN-τ w czasie ciąży u bydła 2.1 Efekt luteotropowy Jak już wspomniano, IFN-τ jest u przeżuwaczy jednym z podstawowych czynników utrzymania ciąży. Mimo współdzielenia szeregu właściwości z innymi interferonami, jego funkcja polega przede wszystkim na podtrzymywaniu aktywności ciałka żółtego (corpus luteum, CL) poza czas trwania cyklu płciowego (Hansen i Tekin, 2005). Na rycinie 6 przedstawiono schemat mechanizmu utrzymania ciąży u przeżuwaczy. U bydła i owiec regresja lub przetrwanie ciałka żółtego związane jest z sekrecją prostaglandyn: PGF2α, która powoduje regresję CL (luteoliza) oraz PGE2, która podtrzymuje funkcjonowanie CL (efekt luteotropowy albo antyluteolityczny). ZARODEK CYKL IFNR CIĄŻA IFN-TAU ENDOMETRIUM IFNR ENDOMETRIUM cox2 cox2 ER OTR PR ER OTR PR E PĘCHERZYK JAJNIKOWY JAJNIK OXT P CIAŁKO ŻÓŁTE PGF2α PGF2αR E PĘCHERZYK JAJNIKOWY JAJNIK OXT P CIAŁKO ŻÓŁTE PGF2αR Ryc.6. Uproszczony mechanizm antyluteolitycznego działania IFN-τ (opis w tekście). IFNR receptor dla interferonów typu I; E- estradiol; ER receptor dla estradiolu; PR receptor dla progesteronu, OXT oksytocyna; OTR receptor dla oksytocyny, PGF2αR receptor dla prostaglandyny F2 α (na podstawie Spencer i Bazer, 2004; Demeters i wsp., 2001 i Kimura, 2005, zmodyfikowano) Komórki nabłonka błony śluzowej macicy krowy są głównym źródłem uwalniania PGF2, produkują one około 10-krotnie więcej tej prostaglandyny niż komórki tkanki łącznej (Asselin i wsp., 1996; Skarżyński i wsp., 2000). Oba typy komórek zawierają kompletny zestaw enzymów niezbędnych do biosyntezy prostaglandyn: PTGS 1 i 2 17

18 (dawna nazwa cyklooksygenaza 1 i 2; COX-1, COX-2), fosfolipazę A2 (PLA2), syntazy PGE i PGF (PGES i PGFS) oraz dehydrogenazy i transportery prostaglandyn (Arosh i wsp., 2004). Zarówno w nabłonku jak i zrębie podstawowe uwalnianie PGE2 jest wyższe w okresie wczesnej ciąży w porównaniu z cyklem. Wykazano również, iż podstawowe uwalnianie PGF2α w obu wymienionych typach komórek jest wyraźnie obniżone, gdy porówna się je z analogicznym okresem cyklu jajnikowego (Woclawek-Potocka i wsp., 2009). Jeżeli nie doszło do zapłodnienia, 17β-estradiol produkowany przez pęcherzyk jajnikowy wiąże się ze swoim receptorem (ER) w endometrium, wywołując ekspresję receptora dla oksytocyny (OTR). Z kolei oksytocyna, produkowana przez ciałko żółte i przysadkę, po związaniu się z OTR indukuje syntezę PGF2α, a to prowadzi do zaniku luteolizy. Według jednej z dotychczas obowiązujących hipotez, gdy rozwijający się zarodek rozpoczyna implantację w macicy i zapoczątkowuje wydzielanie IFN-τ zahamowana zostaje ekspresja receptorów dla estradiolu i oksytocyny, w efekcie nie dojdzie do syntezy PGF2α i ciałko żółte przetrwa (Goff, 2004). Zanim jednak zacznie działać IFN-τ, który jest wydzielany przez zarodek bydlęcy od 7 do 24 dnia, główną rolę odgrywa progesteron (P4), którego stężenie we wczesnej ciąży i post-owulacyjnej fazie cyklu płciowego jest wysokie. Hormon ten działa za pośrednictwem receptora progesteronowego (PGR) i hamuje ekspresję OTR. Jeśli jednak nie doszło do zapłodnienia, w miarę jak wzrasta poziom P4, zmniejsza się poziom jego receptora i w efekcie blok progesteronowy zostaje zniesiony, np. u owiec około dnia po owulacji (Bowen i Burghard, 2000). Wpływ IFN-τ jako czynnika podtrzymującego wczesną ciążę powinien zatem odbijać się na części lub wszystkich wymienionych powyżej cząsteczkach biorących udział w luteolizie lub podtrzymywaniu CL. We wcześniejszych badaniach wykazano, iż oksytocyna nie pełni pierwszoplanowej roli w luteolizie u krowy (Kotwica i wsp., 1997; Skarzyński i wsp. 1999), co prawdopodobnie wyjaśnia dlaczego w czasie trwania ciąży obserwowany jest jedynie nieznaczny spadek ekspresji OTR i ER w porównaniu do krów będących w cyklu, pozwala to wnioskować, że IFN-τ może hamować pulsacyjne wydzielanie 18

19 PGF2α poprzez bezpośrednie blokowanie ekspresji PTGS-2 w endometrium (Asselin i wsp., 1997; Robinson i wsp., 1999; Guzeloglu 2004b; Chen i wsp., 2007) lub myometrium (Doualla-Bell i Koromilas, 2001). Komórki zrębu pod wpływem IFN-τ prawdopodobnie nie zmieniają poziomu ekspresji genu PTGS-2 (Okuda i wsp., 2004). Pru i wsp., (2001) sugerują, że osłabienie ekspresji genu PTGS-2 w nabłonku stymulowanym estrami forbolu jest wynikiem bezpośredniego i specyficznego działania czynników transkrypcyjnych aktywowanych przez sam IFN-τ, a nie poprzez hamowanie wpływu czynnika aktywującego. Inne badania wskazują jednak, że IFN-τ powoduje raczej podniesienie, a nie obniżenie poziomu PTGS-2 w luminalnej warstwie nabłonka endometrium u bydła (Emond i wsp., 2000) lub też zupełnie nie wpływa na ekspresję PTGS-2 u owiec (Kim i wsp., 2003). Generalnie akceptowany jest pogląd, że w warunkach in vitro u owiec i bydła, niskie stężenia IFN-τ hamują produkcję PGF2α oraz PGE2, natomiast wysokie stężenia IFN-τ stymuluje produkcję PGE2, nie wpływając na poziom PGF2alfa. Guzeologlu i wsp. (2004a) badając in vitro wpływ IFN-τ na produkcję prostaglandyn w komórkach BEND (Bovine Endometrial Cells) wykazali, że steżenia poniżej 5 µg/ml hamują zarówno produkcję PGE2, jak i PGF2α. Natomiast wzrost produkcji PGE2 wymagał dziesięciokrotnie lub stukrotnie wyższego dodatku IFN-τ, odpowiednio dla komórek stymulowanych i niestymulowanych estrami forbolu. Dane te są trudne do interpretacji w kontekście jedynie PTGS-2. Arosh i wsp. (2004) wykazali, że wspomniane efekty są regulowane w sposób bardziej skomplikowany i dotyczą różnych elementów biosyntezy prostaglandyn. W nabłonku endometrium oraz w myometrium IFN-τ powoduje spadek ekspresji PGFS, podczas gdy w ciałku żółtym wywołuje wzrost ekspresji PGES. Skutkiem tego jest przechylenie równowagi w kierunku syntezy PGE2, a efekty działania różnych stężeń IFN-τ można by tłumaczyć poprzez zróżnicowany wpływ szlaków interferonowych na każdy z tych enzymów. Zjawisko takie pozwala także zrozumieć znaczenie wzrostu ekspresji PTGS-2 pod wpływem IFN-τ (jeśli rzeczywiście do niego dochodzi), bowiem enzym ten jest niezbędny zarówno do wytwarzania PGE2, jak i PGF2α, zaś dopiero regulacja ekspresji specyficznych syntaz pozwala odpowiednio ukierunkować biosyntezę prostaglandyn. W takim ujęciu regulacja poziomu PTGS-2 wpływałaby raczej na całkowite tempo syntezy prostaglandyn (jako punkt limitujący szybkość reakcji), a nie na równowagę 19

20 PGE2/PGF2α. Zdają się to potwierdzać eksperymenty in vitro przeprowadzone na komórkach bydlęcych. Otóż stymulacja komórek zwiększającymi się stężeniami IFN-τ prowadzi do wzrostu ekspresji PTSG-2 w komórkach nabłonka i podścieliska, nie wpływa natomiast na ekspresję PTGS-1 i PLA2, również uczestniczącej w produkcji PG. Co ciekawe, zwiększonemu poziomowi mrna dla PTGS-2 towarzyszyło zwiększenie produkcji PGE2 i PGF2α przez komórki podścieliska, podczas gdy w komórkach nabłonka adluminalnego dochodziło do wzrostu poziomu jedynie PGE2. Jeżeli wyniki te potraktować jako całość, to wypadkowo dochodziło do wzrostu produkcji PGE2 (Asselin i wsp., 1997). Xiao i wsp. (1998) w podobnej metodzie zaobserwowali również korzystną zmianę stosunku wydzielanej PGE2 i PGF2α, ale w stosunku do komórek zrębu, natomiast w komórkach nabłonka odnotowali spadek ekspresji PTGS-2 i spadek ogólnej produkcji prostaglandyn. Co jednak istotne, w obydwu typach komórek znacząco spadła ekspresja mrna dla PGFS i stąd prawdopodobnie wynika dominacja produkcji PGE2, a efekt ten może być jeszcze wzmocniony przez wzrost ekspresji PGES w komórkach zrębu i nabłonka (Parent i wsp., 2002) oraz obniżenie poziomu enzymu katabolizującego PGE2 reduktazy 9-ketoprostaglandy E2 (Asselin i Fortier, 2000). Warto również pamiętać, że wpływ IFN-τ na produkcję PGF2α może polegać również na hamowaniu efektu działania oksytocyny (Mann i Lamming, 2001) gdyż istotnie zaobserwowano, że IFN-τ działa antagonistycznie, hamując stymulowaną OT produkcję za pośrednictwem uaktywnienia ekspresji PTGS-2 i PGFS (Asselin i wsp., 1997; Xiao i wsp., 1999). Mimo że in vivo u bydła obserwuje się wspomniany wcześniej nieznaczny spadek ekspresji OTR pod wpływem IFN-τ, to efekt ten niekoniecznie ma wpływ na luteotropowe działanie interferonu, bowiem w warunkach in vitro hamowanie wydzielania prostaglandyn jest niezależne od obniżenia poziomu OTR, które w ogóle nie jest obligatoryjne (Krishnaswamy i wsp., 2009). Przypuszcza się, że różne izoformy kwasu fosfatydylowego (PLA2) preferencyjnie wspierają tworzenie odpowiednich rodzajów PG, np. izoforma PLA2G6 jest odpowiedzialna za przygotowanie substratu do produkcji PGF2α, podczas gdy PLA2G4C dostarcza substratu zarówno do produkcji PGE2, jak i PGF2α, lecz z wyraźnym wskazaniem na PGE2. Izoformy te występują w 20

21 nabłonku luminalnym bydlęcego endometrium i oksytocyny powoduje podniesienie ekspresji jedynie PLA2G6. IFN-τ znosi ten efekt, a jednocześnie stymuluje wytwarzanie izoformy PLA2G4C, wspierając tym samym produkcję PGE2 i antagonizując efekt OT (Tithof i wsp., 2007). Sam wpływ IFN-τ na obniżenie poziomu ekspresji OTR nie jest prawdopodobnie efektem bezpośrednim, ale polega raczej na obniżeniu poziomu receptora estrogenowego, będącego jak już wspomniano pozytywnym regulatorem ekspresji OTR. Jak już wspomniano mechanizm taki jest dominujący u owiec (Spencer i Bazer, 1996; Spencer i wsp., 1999; Fleming i wsp., 2006), a opiera się on na sekwencyjnej aktywacji szlaku JAK/STAT i czynników IRF-1 i IRF-2 (Spencer i wsp., 1998). 2.2 Immunoregulacja Allogeniczne komórki rozwijającego się w macicy zarodka, a następnie płodu mogą być celem rozpoznania immunologicznego matki. Z punktu widzenia układu odpornościowego antygeny ojcowskie są obce, powinno zatem dojść do odrzucenia zarodka/płodu tak, jak to ma miejsce w przypadku przeszczepu allogenicznego (paradoks przeszczepu płodowego, Medawar, 1953). Tak się jednak nie dzieje ze względu na towarzyszące ciąży zjawiska immunoregulacyjne. Są to z jednej strony zagadnienia związane z ekspresją cząsteczek głównego układu zgodności tkankowej (MHC) klasy I i II oraz rekrutacją wybranych populacji leukocytów do tkanek macicy, z drugiej zaś zjawiska opisane paradygmatem komórek Th. Poniżej zostaną one przedstawione w kontekście roli wydzielanego przez zarodek IFN-τ. Przeżycie antygenowo obcego płodu w organizmie matki uwarunkowane jest m. in. budową łożyska, które stanowi anatomiczna barierę pomiędzy matką a płodem oraz zmienna ekspresja antygenów MHC na komórkach trofoblastu. W tym miejscu należy zwrócić uwagę, iż budowa łożyska przeżuwaczy jest odmienna od budowy łożyska u ludzi (ryc. 7), a inwazyjność komórek pochodzenia płodowego ogranicza się do części nabłonkowej endometrium (Bowen i Burghardt, 2000). U owiec i świń brak jest klasycznych antygenów MHC klasy I w obrębie trofoblastu (Gogolin-Ewens, 1989; Ramsoondar 1999). Występują one wprawdzie u koni, ale ich ekspresja jest niska (Donaldson i wsp., 1992). U bydła natomiast metodami immunohistochemicznymi wykazano niewielką ekspresję MHC klasy I na blastocystach po wykluciu (ang. hatching) z osłonki przejrzystej oraz na nabłonku kosmówki (Low i wsp., 1990). 21

22 Wykazano że cząsteczki MHC klasy I występują na komórkach zrębu, adluminalnej warstwie nabłonka i nabłonku gruczołowym endometrium. Podczas ciąży u owiec dochodzi do spadku ekspresji MHC klasy I w macicy, jednak IFN-τ ma zdolność do wybiórczego wzmocnienia ekspresji zarówno łańcucha alfa MHC klasy I (Todd i wsp., 1998; Choi i wsp., 2003), jak i beta2-mikroglobuliny na komórkach podścieliska i nabłonku gruczołowym (Choi i wsp., 2003). U bydła wykazano również ekspresję nieklasycznych receptorów MHC klasy I, przy czym pojawiają się one dopiero w trzecim trymestrze ciąży. Przy zastosowaniu techniki RT-PCR wykazano, że klasyczne MHC stanowią 34-79% transkryptów, zaś nieklasyczne 21-66% transkryptów (Davies i wsp., 2006). Badania na liniach bydlęcego endometrium przy użyciu testu lucyferazowego wskazują, że IFN-τ podnosi ekspresję nieklasycznych cząsteczek MHC klasy I, które potencjalnie mogą brać udział w ustaleniu tolerancji immunologicznej względem antygenów płodowych (O'Gorman i wsp., 2010). Niska ekspresja MHC klasy I, bądź jej brak, co prawda chroni komórkę przed atakiem limfocytów T cytotoksycznych ale jednocześnie naraża ją na atak ze strony komórek NK. U człowieka mechanizmem, który przypuszczalnie chroni trofoblast przed reakcją ze strony komórek NK jest fakt, że na jego powierzchni obecne są nieklasyczne receptory MHC takie jak HLA-G, HLA-E i HLA-F (Wood, 1994; Pende i wsp., 1997) a z klasycznych jedynie HLA-C. Przy czym te ostatnie, choć pojawiają się już w pierwszym trymestrze ciąży, to występują jedynie na powierzchni pozakosmówkowej trofoblastu (Chaouat, 1999; King i wsp., 2000). U bydła natomiast funkcje ochronną dla trofoblastu może pełnić prostaglandyna E2 (PGE2), udowodniono bowiem, że produkowana przez 12 dniowe zarodki bydlęce, hamuje lityczną aktywność ludzkich i króliczych komórek NK i LAK (Bergeron i wsp., 1997). Immunoregulacyjny efekt prostaglandyn jest tym bardziej prawdopodobny, że ich wydzielanie również jest regulowane przez IFN-τ, natomiast sam IFN-τ, jak wykazano na modelu owczym, stymuluje lityczną aktywność komórek NK (Tekin i Hansen, 2002). Wydaje się zatem, że potrzebny jest mechanizm ochronny i tę funkcję mogą pełnić właśnie prostaglandyny. 22

23 Bydło i inne przeżuwające blastocysta trofoblast Epithelium glandular luminal s. spongiosum s. compactum Stratum functionale Stratum basale Człowiek i mięsożerne blastocysta trofoblast Epithelium s. spongiosum s. compactum Stratum functionale Stratum basale Ryc. 7 Schemat różnic anatomicznych w implantacji zarodka ludzkiego i bydlęcego (na podstawie Bowen i Burghardt, 2000; zmodyfikowano) Podobnie jak u człowieka, nie wykazano na trofoblaście występowania białek MHC klasy II (Low i wsp., 1990). Cząsteczki MHC klasy II występują co najwyżej na komórkach dendrytycznych, makrofagach i limfocytach B występujących w macicy. Niewiele jest prac dotyczących topografii występowania leukocytów u przeżuwaczy w endometrium. Cobb i Watson (1995) badając poubojowo jałówki wykazali, że limfocyty CD4+ występują głównie w warstwie gąbczastej (stratum spongiosum), CD8+ w nabłonku adluminalnym i gruczołowym oraz warstwie zbitej (stratum compactum), natomiast limfocyty B były obserwowane jedynie jako pojedyncze skupiska limfoidalne. Stosując technikę cytometrii przepływowej Majewska (2006) u krów w 8 9 dniu ciąży wykazała obecność limfocytów CD4, CD8, TCRγδ i CD21, zarówno w stromie jak i nabłonku. Stosunek limfocytów CD4:CD8 wynosił odpowiednio 0,99 i 0,65 natomiast procent limfocytów B wynosił średnio 9 i 11% wszystkich badanych subpopulacji. Z kolei Vander Wielen i King (1984) badając zmiany ilościowe limfocytów u jałówek będących w ciąży (między 19 a 27 od inseminacji) oraz w 5, 10, 15 i 20 dniu cyklu płciowego stwierdzili wyraźny spadek ilości limfocytów śródnabłonkowych począwszy od 23 dnia i niewielkie różnice w czasie cyklu. Wydaje się, że IFN-τ może wpływać na dystrybucję leukocytów w macicy u bydła, wiadomo bowiem, że u owiec jest on odpowiedzialny za wzbudzenie ekspresji mrna dla chemokiny IP-10 (ang. IFN-gamma inducible protein 10 kda) w macicznych 23

24 monocytach. Dalsze eksperymenty in vitro wykazały, że IP-10 rzeczywiście jest produkowana pod wpływem IFN-τ w tkankowych hodowlach endometrium, a przeciwciała neutralizujące IP-10 w znacznej mierze ograniczają chemotaktyczne właściwości nadsączy z takich hodowli (Nagaoka i wsp., 2003). Również u owiec wykazano udział IFN-τ we wzmocnieniu ekspresji chemokin MCP-1 i MCP-2 w macicznych eozynofilach (Asselin i wsp., 2001). U bydła natomiast IFN-τ reguluje także ekspresję białka chemotaktycznego dla granulocytów 2 (GCP-2), które w kooperacji z innymi cytokinami może wpływać w macicy na rekrutację granulocytów (Teixeira i wsp., 1997). Jednorazowe domaciczne podanie IFN-τ w 7 dniu cyklu płciowego wywołuje u krów przejściowe obniżenie liczby limfocytów i neutrofilów (Matsunaga i wsp., 2011). IFN-τ wzmacnia również ekspresję czynnika hamującego migrację makrofagów (MIF) w komórkach nabłonka, ale nie zrębu u bydła. Efekt ten jest widoczny zarówno na poziomie mrna, jak i białka (Wang i Goff, 2003). Przykłady te wskazują, że IFN-τ lokalnie reguluje napływ leukocytów, przynajmniej w pobliżu miejsca implantacji, chociaż badania Leung i wsp. (2000) zdają się przeczyć temu poglądowi, przynajmniej w kontekście komórek CD4+, CD14+ i CD21+. Jak wyżej wspomniano, obok regulacji ekspresji MHC i zmian liczby leukocytów w macicy istotną rolę w ustaleniu areaktywności na antygeny płodowe odgrywa immunomodulacja oparta na aktywnym udziale komórek T helper. Według hipotezy Wegmanna i wsp. (1993) w trakcie ciąży dochodzi do ustalenia odpowiedzi typu Th2, która jest korzystna, i zahamowania odpowiedzi typu Th1. Prawidłowa ciąża cechuje się zatem produkcją cytokin takich jak IL-4, IL5, IL-6, IL10. Innymi czynnikami które nie należą do odpowiedzi typu Th2, ale również promują rozwój ciąży są CSF-1, GMC-SF i TGF-beta2. Prowadzi to do proliferacji limfocytów B, czyli nasilenia odpowiedzi humoralnej z jednoczesnym zahamowaniem odpowiedzi typu komórkowego (Malinowski, 2000). Z wielu prac doświadczalnych wynika, że u kobiet z tendencją do nawykowych poronień we krwi obwodowej poziom cytokin charakterystycznych dla odpowiedzi Th1 jest znacząco wyższy niż u kobiet zdrowych. dotyczy to zwłaszcza IL- 2, IL-12 oraz IFN-γ (Jenkins i wsp., 2000; Wilson i wsp., 2004; Hadinedoushan i wsp., 2007). Hipoteza Wegmanna została więc potwierdzona w wielu badaniach, jednak obecnie jest ona rozszerzona o udział dodatkowych populacji komórek CD4+: 24

25 limfocytów T regulatorowych (Treg) oraz limfocytów wydzielających IL-17 (Th17), przy czym wszystkie te subpopulacje limfocytów Th są powiązane wzajemnymi zależnościami. Limfocyty Treg biorą udział w antygenowo-swoistym lub antygenowonieswoistym hamowaniu odpowiedzi odpornościowej jako komórki ogólnie immunosupresyjne, zaś limfocyty Th17 wspierają odpowiedź zapalną (Saini i wsp., 2011). Udział IFN-τ u bydła w kontekście regulacji odpowiedzi Th1/Th2 oraz aktywnej odpowiedzi tolerogennej jest obecnie słabo poznany. Eksperymenty in vitro wskazują, że czynnik ten powoduje wzrost ekspresji mrna dla IL-4 i IFN-gamma w pobudzonych antygenem bydlęcych limfocytach T CD4+, nie wpływa natomiast na ekspresję IL-10 (Tuo i wsp., 1999b). W tym kontekście nie można zatem stwierdzić, że IFN-τ pobudza odpowiedź typu Th1 lub Th2. Z kolei eksperymenty in vivo wykazały, że domaciczne podanie IFN-τ u bydła powoduje spadek poziomu transkryptów kodujących trzy izoformy TGF-beta w endometrium (Godkin i wsp., 1997), a sama produkcja TGF-beta w czasie ciąży rozpoczyna się dopiero w momencie, gdy zanika sekrecja IFN-τ (Imakawa i wsp., 1998). Cytokina ta jest istotna z punktu widzenia aktywności limfocytów Treg, wykazuje także szereg właściwości immunosupresyjnych, stąd wpływ IFN-τ na obniżenie poziomu transkryptu paradoksalnie wydaje się być szkodliwy z punktu widzenia prawidłowej ciąży. Sam IFN-τ wpływa natomiast ogólnie immunosupresyjnie, podobnie jak inne IFN typu I, poprzez hamowanie indukowanej przez IL-2 proliferacji limfocytów (Niwano i wsp., 1989). Efekt ten może być wybiórczy, bowiem w warunkach in vitro zaobserwowano, iż IFN-τ hamuje ekspansję stymulowanych antygenami pasożytów bydlęcych limfocytów Tγδ WC1+CD2-CD6- CD8-, jednocześnie jednak wspiera rozwój subpopulacji komórek Tγδ WC1- CD2+CD6+CD8+ i Tαβ CD8+ (Tuo i wsp., 1999). Innym mechanizmem immunosupresyjnym może być stymulacja ekspresji 2,3-dioksygenazy indoleaminowej (IDO), enzymu odpowiadającego za katabolizm tryptofanu i powstanie L-kinureniny, metabolitu tryptofanu wywierającego efekty immunosupresyjne i wspierającego rozwój odpowiedzi tolerogennej (Mandi i Vecsei, 2011). Ekspresja tego enzymu wzrasta od 12 do 18 dnia ciąży u krów, głównie w komórkach stromy, czemu towarzyszy obniżenie poziomu tryptofanu w endometrium i podwyższenie poziomu kinureniny. IFN-τ w 25

26 warunkach in vitro znacząco podnosi ekspresję mrna dla IDO w tkankowych hodowlach endometrium, działając przede wszystkim na komórki stromy, co powoduje powstanie środowiska immunosupresyjnego i wspierającego rozwój aktywnych mechanizmów tolerancji immunologicznej (Groebner i wsp., 2011). Również ludzkie makrofagi reagują podniesieniem ekspresji IDO w odpowiedzi na stymulację interferonem tau (Maneglier i wsp., 2007). U bydła, pod wpływem IFN-τ produkowanego przez zarodek wydzielanych jest miejscowo szereg czynników promujących rozwój ciąży, takich jak m. in.: UCRPubiquitin cross-reactive protein (Austin i wsp., 1996), GM-CSF- granulocyte, macrophage colony stimulating factor (Emond i wsp., 2000). Wpływ IFN-τ nie zawsze ma zasięg miejscowy, może on powodować reakcję ogólnoustrojową. Yankey i wsp. (2001) sugerują, że IFN-τ powoduje u owiec wydzielanie białka Mx przez komórki mononuklearne krwi obwodowej. Podwyższony poziom tego białka utrzymuje się od 15 do 30 dnia po inseminacji i jest prawie dwukrotnie wyższy u owiec w ciąży niż w trakcie cyklu. Także w pracy Gifforda i wsp. (2008) wykazano, że IFN-τ wpływa na owcze leukocyty krwi obwodowej i reguluje ekspresję białka RTP4, zarówno u zwierząt w ciąży, jak i w modelu in vitro. Jak widać na powyższych przykładach, dane dotyczące immunoregulacyjnych efektów IFN-τ są czasami sprzeczne. Sprzeczności te mogą wynikać np. z faktu występowania różnych izoform IFN-τ. Tekin i wsp. (2000) badając in vitro owczy IFN-τ (izoformy 4, 6d i 11) wykazali, że wszystkie one działają silnie antyproliferacyjnie na limfocyty stymulowane PHA. Działanie to w każdym przypadku jest silniejsze w porównaniu z IFN-ω, ale zależy od izoformy, przy czym najsilniej działa IFN-τ4, a najsłabiej IFN-τ11. Należy także podkreślić, iż ze względu na charakter implantacji u przeżuwaczy wiele efektów IFN-τ, również tych immunoregulacyjnych, może mieć charakter pośredni, wynikający ze zmian ekspresji innych czynników bioaktywnych pod wpływem IFN-τ. Biorąc pod uwagę badania nad IFN-τ prowadzone na myszach, szczurach i materiale ludzkim w kontekście potencjalnych korzyści immunoterapeutycznych, najbardziej prawdopodobne jest działanie IFN-τ wspierające odpowiedź typu Th2 i promowanie rozwoju limfocytów T regulatorowych (Treg) 26

27 poprzez regulację wydzielania takich cytokin, jak IL-10, IFN-gamma czy TGF-beta (np. Soos i wsp., 1995; Soos i wsp., 1997 Mujtaba i wsp., 1997; Rogez-Kreuz i wsp., 2005). 2.3 Inne efekty fizjologiczne IFN-tau Mając na uwadze szeroki zestaw genów regulowanych przez IFN-τ nie powinien dziwić fakt, że cytokina ta wywiera także wpływ na szereg zjawisk, szczególnie zachodzących lokalnie w macicy, nie mających bezpośredniego związku z immunoregulacją bądź efektem luteotropowym. Przykładem takiego zjawiska może być zwiększenie produkcji katepsyn, proteaz odpowiedzialnych za przebudowę tkanek oraz aktywację hormonów peptydowych. IFN-τ zwiększa ekspresję katepsyny L, a w połączeniu z progesteronem także ekspresję katepsyn H, K, S i Z w owczym endometrium i w trofoblaście, uczestniczy zatem pośrednio w rozwoju łożyska (Song i wsp., 2005). IFN-τ bierze także udział w rozwoju trofoblastu i regulacji funkcji endometrium u owiec poprzez podwyższenie ekspresji receptora dla czynnika hamującego białaczkę (LIFR) oraz jego koreceptora IL6ST na trofoblaście i nabłonku gruczołowym endometrium (Song i wsp., 2009). U owiec wykazano również efekt IFNτ polegający na podniesieniu poziomu mrna dla receptora prolaktyny w kompartymencie gruczołowym endometrium (Martin i wsp., 2004), zwiększeniu ekspresji syntazy tlenku azotu 1 w luminalnej warstwie nabłonka (Gao i wsp., 2009) oraz pobudzeniu ekspresji receptorów prostaglandynowych EP2 i EP4 na komórkach endometrium (Lee i wsp., 2011). U bydła IFN-τ wydzielany przez zarodki powoduje również obniżenie produkcji metaloproteinaz przez komórki endometrialne w hodowlach in vitro (Hashizume i wsp., 2003). Wszystkie te zjawiska mogą być związane z powodzeniem implantacji i ustaleniem odpowiednich interakcji matczynopłodowych, wymagają jednak dalszych badań. 3. Postęp hodowlany a rozród Do szybko postępującego wzrostu produktywności krów przyczynia się poprawa warunków bytowania i żywienia. Ekonomiczny wynik hodowli bydła w 27

28 największym stopniu zależy jednak od racjonalnego rozrodu. W wyniku prowadzonej ciągłej pracy hodowlanej uzyskano około 1000 ras bydła domowego, z czego dobrze poznanych jest około 250 (cyt. za Karczmarkiem, 2005). Wielkość pogłowia bydła na świecie szacuje się na prawie 1,5 miliarda sztuk, z czego w Polsce wynosi ono 5,7 milionów sztuk (Mały Rocznik Statystyczny 2010). Około 85% pogłowia krajowego stanowi bydło rasy czarno białej, która użytkowana jest dwukierunkowo, dla pozyskania mleka i mięsa (Rycombel, 2004). Niestety intensywna eksploatacja zwierząt nie jest obojętna dla ich rozrodczości. Dla zobrazowania postępu hodowlanego, jaki się ostatnio dokonał warto podać, że w latach 50 ubiegłego wieku średnia roczna produkcja mleka w USA wynosiła około 2,5 tysiąca kg od krowy podczas gdy w roku 2000 wydajność ta osiągnęła wartość 6,5 8 tysięcy kg rocznie (Stevenson, 2001). Wynik będzie jeszcze bardziej zdumiewający jeśli zestawi się to z litrami rocznie jakie można było uzyskać od wymarłego już tura będącego, jak się uważa, protoplastą współczesnego bydła. Z badań Stevensona (2001) wynika jednak bardzo wyraźnie, że wysoka mleczność stoi w sprzeczności z dobrymi wynikami rozrodu (ryc.8). Produkcja mleka w tys. kg / rok Procent zacieleń lata Ryc. 8. Zestawienie średniej mleczności krów z wynikami reprodukcyjnymi. (Stevenson, 2001). Dane dotyczące zacieleń odnoszą się do jednokrotnego zabiegu inseminacji. Skala problemów związanych z rozrodem bydła mięsnego jest zdecydowanie mniejsza z uwagi na warunki utrzymania i intensywność użytkowania (Żółkowski i Przysucha, 2005). Potwierdzają to badania Alves a i wsp. (1996) którzy badając w Kanadzie częstość poronień u krów mlecznych i mięsnych wykazali znacznie niższy ich odsetek u tych drugich (ryc. 9). 28

29 Ryc.9. Częstość utrat ciąż u bydła w Kanadzie z uwzględnieniem sposobu jego użytkowania w latach (Alves i wsp., 1996) Główną przyczyną niepowodzeń reprodukcyjnych u bydła jest wczesna utrata ciąż, czyli przed 42 dniem jej trwania (zanim wytworzy się funkcjonalne łożysko). W roku 1980 Diskin i wsp. (2006) szacowali, że 28% zabiegów inseminacyjnych kończy się niepowodzeniem właśnie z tego powodu, podczas gdy w roku 2006 problem ten dotyczył już aż 43 % krów (ryc. 10). Ryc.10. Porównanie wyników reprodukcyjnych bydła (Diskin i wsp. 2006) Mimo intensywnych i zakrojonych na szeroką skalę badań etiologia poronień u bydła w większości przypadków nie jest znana i na przestrzeni lat utrzymuje się na zbliżonym poziomie (ryc. 11). Zdefiniowane przyczyny dotyczą przeciętnie 40 % wszystkich przypadków (Kirkbride, 1992; Alves i wsp., 1996; Campero i wsp., 2003), dodatkowo znaczący wpływ na płodność krów mlecznych mogą mieć czynniki lokalne, jak np. klimat (Paula-Lopes i wsp., 2003; Flamenbaum i Galon, 2010). 29

30 Ryc.11. Etiologia poronień u krów w USA (Kirkbride, 1992) Jak widać problem wczesnych utrat ciąż miał i ma u bydła zasięg światowy, jest on przyczyną poważnych strat finansowych. U nowoczesnych ras krów wysokomlecznych przypuszczalnie związany jest m. in. z wysokim wskaźnikiem imbredu zwierząt, ociepleniem klimatu i związanym z nim stresem cieplnym (Hansen 2007). 4. Techniki rozrodu Postęp hodowlany nie byłby możliwy bez doskonalenia technik rozrodu. Pierwszym krokiem w tym względzie było sztuczne unasiennianie, pozwala ono na racjonalne wykorzystanie samca. Przy tradycyjnym użytkowaniu jeden buhaj obsługuje maksymalnie przy kryciu haremowym 30 krów i do 100 przy kryciu z ręki. (Litwińczuk i Szulc 2005). Podczas gdy przy stosowaniu nasienia rozrzedzanego a następnie mrożonego można z tylko jednej porcji nasienia, teoretycznie inseminować nawet 400 do 600 krów (Głód, 1969). Obecnie krycie naturalne stosowane jest jeszcze głównie przy hodowli bydła mięsnego oraz w przypadkach, gdy sztuczna inseminacja nie zakończyła się zacieleniem. Stosunkowo najmłodszym osiągnięciem sztucznej inseminacji jest tak zwane seksowanie nasienia celem uzyskania potomstwa o pożądanej płci. 30