ZASTOSOWANIE MIKROSYSTEMÓW W MEDYCYNIE LABORATORIUM. Ćwiczenie nr 5 INSTRUMENT LAB-ON-A-CHIP DO ELEKTROFORETYCZNEJ ANALIZY MATERIAŁU GENETYCZNEGO

Transkrypt

1 ZASTOSOWANIE MIKROSYSTEMÓW W MEDYCYNIE LABORATORIUM Ćwiczenie nr 5 INSTRUMENT LAB-ON-A-CHIP DO ELEKTROFORETYCZNEJ ANALIZY MATERIAŁU GENETYCZNEGO Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z podstawami elektroforetycznej analizy materiału genetycznego w laboratoriach chipowych (lab-chipach) oraz budową i właściwościami instrumentu lab-on-a-chip do tej metody. W ramach ćwiczenia zostaną wyznaczone współczynniki migracji elektroforetycznej µ próbek (barwników fluorescencyjnych) z uwzględnieniem różnych parametrów procesu elektroforezy. Wprowadzenie Elektroforeza jest jedną najważniejszych metod analityczno-preparatywnych, znajdującą szerokie zastosowanie m.in. w chemii, biologii molekularnej, diagnostyce medycznej. W szczególności, elektroforeza jest podstawowym narzędziem w badaniach genetycznych, takich jak: analizy kryminalistyczne, testy ojcostwa, genetyczny odcisk palca, wykrywanie mutacji genowych, badanie lekooporności. Elektroforeza jest techniką elektroseparacyjną, umożliwia rozdzielenie i/lub wydzielenie składników mieszaniny w polu elektrycznym. Podstawą tej metody jest rozdzielenie cząstek (jonów, związków) ze względu na różną ich ruchliwość w kolumnie separacyjnej, wypełnionej ciekłym elektrolitem (buforem), w wyniku oddziaływania pola elektrycznego (Rys. 1). Kierunek i szybkość migracji rozdzielanych cząstek zależy m.in. od ich ładunku elektrycznego, masy cząsteczkowej, kształtu, wymiaru. Wpływ na jakość rozdziału mają nastawy parametrów procesu, takie jak: natężenie pola elektrycznego, temperatura kolumny, rodzaj wypełnienia. Rys. 1. Mechanizm elektroforetycznego rozdzielenia cząstek w kolumnie separacyjnej Prędkość migracji elektroforetycznej cząstek v w kolumnie (kanale separacyjnym lab-chipa) zależy od natężenia pola elektrycznego E oraz od współczynnika migracji µ, który charakteryzuje zdolność przemieszczania się cząstek. Innym sposobem wyznaczenia tej wielkości jest pomiar czasu migracji t m dla efektywnej drogi migracji L eff, która odpowiada odległości od punktu wstrzyknięcia próbki do punktu jej wykrycia przez detektor: (1) 1

2 Natężenie pola elektrycznego E odpowiada napięciu elektrycznemu U przyłożonemu do końców kanału separacyjnego, podzielonemu przez całkowitą długość tego kanału L: (2) Kluczowym parametrem w analizie elektroforetycznej jest współczynnik migracji µ, który jest często wyznaczany eksperymentalnie na podstawie równania (1). Wartość współczynnika może być porównana z bazą danych próbek, co pozwala na identyfikację składników próbki. W analizie materiału genetycznego wykorzystuje się zależność współczynnika migracji od długości fragmentu DNA, tzn. im fragment jest dłuższy, tym większe opory napotyka podczas migracji. W rezultacie, fragmenty materiału genetycznego ulegają rozdzieleniu i są wykrywane przez detektor jako osobne frakcje (prążki, piki). Detekcja fluorymetryczna W instrumentach lab-on-a-chip najczęściej stosuje się metody detekcji optycznej, z których największą czułością charakteryzuje się metoda fluorymetryczna ze wzbudzeniem fluorescencji światłem laserowym (LIF). W tej metodzie składniki próbki są oznakowane barwnikami fluorescencyjnymi (fluoroforami). Barwniki te w wyniku wzbudzenia światłem o długości fali λ ab emitują światło o długości fali λ em, przy czym zwykle λ ab < λ em. Rozdzielone frakcje, migrując kolejno przez obszar detekcji w końcowej części kanału separacyjnego są oświetlane światłem lasera (λ ab ) i emitują błyski światła fluorescencji wzbudzonej (λ em ). Błyski te są rejestrowane przez detektor (kamerę CCD), a sygnał jest przetwarzany do postaci charakterystyki czasowej (elektroferogramu). Elektroferogramy Elektroferogram jest zapisem czasowym sygnału detektora, umożliwiającym analizę ilościową i jakościową próbki. Do najważniejszych parametrów elektroferogramu zaliczamy czas migracji t M i wysokość H (Rys. 2). Rys. 2. Elektroferogram dla pomiarów czasu migracji 2

3 Czas migracji liczony jest od momentu wstrzyknięcia próbki do kanału (dozowanie) do momentu wykrycia frakcji przez detektor, co odpowiada 90% wartości maksymalnej sygnału przed pojawieniem się piku lub plateau. Stanowisko pomiarowe W ćwiczeniu studenci zapoznają się z instrumentem lab-on-a-chip do elektroforetycznej analizy materiału genetycznego, opracowanym w Zakładzie Mikroinżynierii i Fotowoltaiki WEMiF PWr. Instrument ten był wykorzystywany do analizy jedno- i dwuniciowych fragmentów materiału genetycznego. W ramach ćwiczenia wykorzystywane będą barwniki fluorescencyjne, migrujące podobnie jak fragmenty DNA, o określonej długości. Najważniejsze elementy stanowiska pomiarowego to: chip do elektroforezy, stacja dokująca, komputer z oprogramowaniem (Rys. 3). 1. Chip do elektroforezy Rys. 3. Stanowisko pomiarowe Chip jest szklaną strukturą o wymiarach 35 mm 17 mm 2 mm, zawierającą mikroprzepływowe układy dozowania i separacji próbki (Rys. 4). Chip jest wykonany w całości ze szkła borowo-krzemionkowego typu Pyrex, z wykorzystaniem metod mikroinżynierii. Układy mikrofluidyczne są wytworzone w jednym podłożu szklanym techniką trawienia mokrego; w drugim podłożu wykonane są otwory przelotowe. Podłoża są połączone metodą bondingu termicznego, bez użycia warstw pośrednich. a) b) c) Rys. 4. Chip do elektroforezy: a) schemat funkcjonalny, b) schemat przekroju, c) widok 3

4 Chip umieszczony jest w dwuczęściowej, polimerowej obudowie, tzw. module (Rys. 5). Górna strona modułu, wykonana z PTFE (Teflon ), zawiera zbiorniczki cieczowe na bufor oraz okno detekcji optycznej. W bocznej części modułu znajduje się apertura, umożliwiająca wprowadzenie wiązki światła laserowego do szklanego chipa. a) b) c) Rys. 5. Moduł chipa: a) schemat funkcjonalny, b) schemat przekroju, c) widok Przed analizą kanały chipa oraz zbiorniczki cieczowe modułu są wypełniane ciekłym elektrolitem (buforem). Gotowy do pracy moduł umieszczany jest w stacji dokującej, gdzie wykonywane są dalsze etapy analizy. Po zakończeniu procesu, bufor jest usuwany, a kanały i zbiorniczki oczyszczane za pomocą wskazanych odczynników. Po osuszeniu modułu, chip jest zregenerowany i gotowy do ponownego użycia. Stanowisko przygotowania chipa Do przygotowania chipa do pracy oraz jego regeneracji wykorzystywane są pipety laboratoryjne, strzykawka, jednorazowe końcówki (tipsy) oraz pompka (Rys. 6a). Pipety umożliwiają pobranie i dozowanie precyzyjnie odmierzonej objętości cieczy. Na stanowisku dostępne są pipety na zakres 1-10 µl (szara) oraz µl (żółta). Pipety wyposażone są w pokrętła nastawy dozy, spust oraz tłoczek pracujący na dwóch poziomach (Rys. 6b). Pipety mogą być używane przez studentów dopiero po przeprowadzeniu instruktażu przez prowadzącego. Zabrania się przekręcania nastawy dozy poza dopuszczalny zakres pipety. Przed skorzystaniem z pipety, należy wybrać dedykowane do niej tipsy. a) b) Rys. 6. Stanowisko do przygotowania chipa: a) widok stanowiska, b) pipety laboratoryjne 4

5 Procedura pobierania cieczy pipetą: 1. sprawdzić czy wymagana objętość dozy jest dobrze ustawiona, jeśli nie to ustawić ją pokrętłem (nie przekraczać skrajnych wartości!), 2. założyć na pipetę odpowiednią końcówkę (tipsa), 3. wcisnąć tłoczek do pierwszego poziomu, aby wypuścić powietrze, 4. trzymając pipetę w pionie zanurzyć tipsa w cieczy i stopniowo zwolnić tłoczek, 5. poczekać, aż poziom cieczy w tipsie przestanie podnosić się; wyjąć tipsa z cieczy. Procedura dozowania cieczy pipetą: 1. ustawić pipetę pionowo nad obszarem dozowania i wcisnąć tłoczek do drugiego poziomu, 2. po opróżnieniu tipsa, odsunąć końcówkę pipety od miejsca dozowania i zwolnić tłoczek. 3. wyrzucić tipsa do pojemnika na odpady (użyć odpowiedniego spustu na pipecie). Pipety nie wolno obracać do góry nogami lub kłaść poziomo - pracujemy z pipetą ustawioną pionowo lub, jeśli musimy zwolnić rękę, zawieszamy ją na stojaku. Przygotowanie chipa do analizy Przed rozpoczęciem pracy upewnić się czy kanały i zbiorniczki modułu są opróżnione. 1. Czyszczenie mikrokanałów chipa Pobrać bufor z pojemnika C (4 x 50 µl, żółta pipeta) i wypełnić nim kolejno 4 puste zbiorniczki, następnie oczyścić mikrokanały używając pompki (opis poniżej). Upewnić się, że kanały i zbiorniczki są puste (odwrócić chipa). 2. Wypełnienie buforem Pobrać 0,25 ml buforu z pojemnika B do strzykawki medycznej. Delikatnie wprowadzić końcówkę strzykawki do zbiorniczka 1 (Rys. 7a) i wpasować, aby połączenie było szczelne. Powoli naciskając tłok strzykawki wypełnić buforem mikrokanały i zbiorniczki 2-4. Zakończyć proces, gdy zbiorniczek 2 będzie wypełniony buforem. Ostrożnie usunąć strzykawkę, aby nie wytworzyć bąbli powietrza w zbiorniczku 1. Uzupełnić poziom buforu we wszystkich zbiorniczkach korzystając z żółtej pipety, przy czym w zbiorniczkach 1 i 2 powinien być menisk wypukły. Sprawdzić, czy w zbiorniczkach 1 i 2 nie ma bąbli powietrza i czy widoczny jest otwór wlotowy oraz fragment kanału separacyjnego. Jeśli wytworzył się bąbel powietrza, należy zaciągnąć go z dna zbiorniczka za pomocą pipety, a następnie uzupełnić poziom buforu w zbiorniczku. Bufor pozostały w strzykawce lub pipecie można zlać do pojemnika B. Na koniec należy sprawdzić, czy bufor nie rozlał się na obudowie chipie lub czy nie przedostał się przez uszczelkę (chip należy obejrzeć z obu stron). 3. Umieszczenie chipa w platformie pomiarowej stacji dokującej. Otworzyć pokrywę, podnieść uchwyty elektrod (Rys. 8 i 9a), położyć chipa zgodnie ze schematem w aplikacji pomiarowej (Rys. 9b). Opuścić elektrody i sprawdzić czy są one zanurzone w buforze w zbiorniczkach 1 i 2 (Rys.9c). Ustawić parametry stacji dokującej (napięcie, temperaturę, opis poniżej, Rys. 10). 4. Wprowadzenie próbki 5

6 Pobrać z probówki 1 µl granatowego barwnika za pomocą szarej pipety. Barwnik jest silnie brudzący, więc probówkę należy otwierać i zamykać ostrożnie, uważając by nie rozchlapać cieczy. Próbówkę zamknąć natychmiast po pobraniu. Próbkę wprowadzić do zbiorniczka nr 2 (Rys. 7b). 5. Rozpoczęcie analizy Zamknąć pokrywę i nacisnąć kontrolkę START w panelu oprogramowania sterującego (Rys. 11). Czas pomiędzy wprowadzeniem próbki a uruchomieniem elektroforezy powinien być jak najkrótszy i najlepiej jednakowy, np. 30 sekund. a) b) Rys. 7. Przygotowanie chipa: a) wprowadzenie buforu, b) wprowadzenie próbki Regeneracja chipa Po zakończeniu każdej analizy, należy oczyścić zbiorniczki i kanały chipa za pomocą pompki. Na końcówkę rurki należy założyć tips 10 µl i uruchomić pompkę. Wsunąć tips do kolejnych zbiorniczków, zaczynając od zbiorniczka 2, i wyciągnąć próbkę oraz bufor. W zbiorniczkach 1 i 2 wycelować końcem tipsa w otwór wlotowy tak, aby wyciągnąć próbkę i bufor także z kanału mikrofluidycznego (należy delikatnie poruszać tipsem i przytrzymać go chwilę w otworze mikrokanału). Przed kolejnym krokiem upewnić się, że kanały chipa są opróżnione. Na koniec wyczyścić chipa buforem C, jak opisano wcześniej w punkcie Stacja dokująca Stacja dokująca jest mechatronicznym urządzeniem umożliwiającym przeprowadzenie elektroforezy w lab-chipach (Rys. 8). Kluczowymi podzespołami stacji są: układ generacji wysokiego napięcia (HV), układ regulacji temperatury oraz układ detekcji fluorymetrycznej ze wzbudzeniem laserowym. Rys. 8. Stacja dokująca instrumentu do elektroforetycznej analizy lab-on-a-chip 6

7 a) b) c) Rys. 9. Umieszczanie modułu chipa w stacji dokującej Przed rozpoczęciem analizy należy włączyć zasilanie układów stacji dokującej: włącznik główny z prawej strony urządzenia oraz włączniki HV, lasera i regulacji temperatury na panelu frontowym (Rys 10a). Wartość napięcia elektrycznego HV doprowadzanego do chipa jest ustawiana prawym potencjometrem na panelu frontowym stacji dokującej i mierzona za pomocą zewnętrznego woltomierza (Rys. 10b). a) b) Rys. 10. Panel frontowy stacji dokującej (a), woltomierz (b) Stacja dokująca wytwarza potencjalnie niebezpieczne napięcie w zakresie VDC. Przed rozpoczęciem pracy, należy sprawdzić czy multimetr jest ustawiony na pomiar napięcia DC w zakresie do 1000 V. Wysokie napięcie jest podawane na elektrody przez uruchomienie oprogramowania sterującego (zapala się wtedy czerwona dioda na panelu frontowym stacji dokującej). W razie wątpliwości prosić o pomoc prowadzącego. 3. Oprogramowanie sterujące Pracą stacji zarządza komputer z oprogramowaniem sterującym. Oprogramowanie wykorzystuje graficzny interfejs użytkownika (LabVIEW) i umożliwia nastawę parametrów analizy (m.in. wartości temperatury), przetwarzanie sygnałów oraz prezentację i zapis wyników elektroforezy. Panel kontrolny zawiera podgląd z kamery CCD obszaru detekcji lab-chipa w czasie elektroforezy (okno detekcji), wykresy czasowe sygnału fluorescencji i temperatury oraz przycisk START (Rys 11). Wbudowany algorytm przetwarzania sygnałów pozwala na 7

8 jednoczesną obserwację obrazu kamery i przetwarzanie sygnału detektora podczas procesu. Po wybraniu wartości napięcia i umieszczeniu lab-chipa w stacji dokującej, należy wybrać nastawę temperatury (25 C) i wcisnąć START. W czasie analizy należy obserwować okno detekcji (zaznaczyć je w miejscu mikrokanałów) i zmiany sygnału fluorescencji na elektroferogramie. Pojawienie się próbki widoczne jest jako rozbłysk w oknie detekcji i dynamiczny wzrost sygnału detektora. Analiza zakończy się automatycznie (po 5 minutach). Jeśli wzrost sygnału fluorescencji pojawi się wcześniej można skrócić proces analizy. Rys. 11. Panel kontrolny oprogramowania sterującego Sygnał detektora zostanie zapisany w tekstowym pliku wynikowym, w katalogu na pulpicie. Nazwa pliku wynikowego pojawi się po zakończeniu analizy. Plik zawiera dwie kolumny danych: pierwsza czas procesu liczony w milisekundach, druga wartość sygnału detektora. Po zakończeniu ćwiczenia studenci kopiują pliki wynikowe, przetwarzają dane w dowolnym arkuszu kalkulacyjnym (np. Excel, Calc, Origin) i wyznaczają parametry: H, t M, a następie wyznaczają prędkość migracji i współczynnik migracji. Obliczone parametry przedstawiają w sprawozdaniu w tabeli zbiorczej, z uwzględnieniem nastaw procesu analizy. Przebieg ćwiczenia Przed przystąpieniem do ćwiczenia: zapoznaj się z instrukcją, zapoznaj się z obsługą pipet laboratoryjnych, pracę z odczynnikami wykonuj w rękawiczkach ochronnych, pliki wynikowe, potrzebne do przygotowania sprawozdania, będzie można wysłać na adres po zakończeniu ćwiczenia; zaleca się jednak przyniesienie na zajęcia pamięci USB i skopiowanie plików wynikowych. Ćwiczenie: W ramach ćwiczenia studenci mierzą czas migracji t M próbki dla nastaw napięcia w zakresie V dla temperatury 25 C. Analizę należy rozpocząć od najwyższej wartości napięcia 8

9 (800 V). Po wykonaniu serii dla wszystkich napięć, można zmienić wartość temperatury i wykonać serię pomiarów dla temperatury chipa równej15 C lub 35 C. Procedura analizy: 1. Przygotować chip (bufor, próbka), 2. Ustawić wartość napięcia (800 V; 600 V; 400 V; 200 V), 3. Wybrać nastawę temperatury (25 C, 15 C; 35 C), 4. Wcisnąć START, obserwować wykres fluorescencji i zanotować t M, 5. Po zakończeniu każdej analizy zregenerować chipa (przepłukać koniecznie buforem C). Sprawozdanie: Przetworzyć pliki wynikowe w arkuszu kalkulacyjnym (np. Excel, Calc, Origin) Przedstawić aproksymowane wykresy v = f (E) dla temperatury jako parametru. Wyznaczyć parametry: t M, H, 90% H, v, µ i przedstawić w tabeli podając odpowiednie jednostki: Nr procesu Napięcie Temperatura t M H 0,9 H v µ V 25 C 2 W obliczeniach przyjąć: L = 30 mm, L eff = 27 mm. Opisać wpływ parametrów elektroforezy na wartość v i µ. Opisać powtarzalność wykonywanych operacji przygotowania i regeneracji chipa. Czy mogły mieć one wpływ na wyniki? Jeśli tak, to które wartości wyników to obrazują? Zagadnienia do przygotowania: 1. Podstawy elektroforezy lab-on-a-chip: schemat, opis i zasada pracy chipa oraz wzory. 2. Konstrukcja modułu oraz szklanego chipa do elektroforezy. 3. Co to jest elektroforeza i gdzie znajduje zastosowanie? Literatura 1. W. Kubicki, R. Walczak, J. Dziuban, Injection, separation and fluorimetric detection of DNA in glass lab-on-a-chip for capillary electrophoresis, Optica Applicata (2011) 41: Publikacje na temat elektroforetycznej analizy lab-on-a-chip 9