ZASTOSOWANIE MIKROSYSTEMÓW W MEDYCYNIE LABORATORIUM. Ćwiczenie nr 5 INSTRUMENT LAB-ON-A-CHIP DO ELEKTROFORETYCZNEJ ANALIZY MATERIAŁU GENETYCZNEGO

Transkrypt

1 ZASTOSOWANIE MIKROSYSTEMÓW W MEDYCYNIE LABORATORIUM Ćwiczenie nr 5 INSTRUMENT LAB-ON-A-CHIP DO ELEKTROFORETYCZNEJ ANALIZY MATERIAŁU GENETYCZNEGO Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z budową i właściwościami instrumentu lab-on-a-chip do elektroforetycznej analizy materiału genetycznego. W ramach ćwiczenia zostaną przeprowadzone testy dozowania i separacji próbek (DNA i/lub barwników fluorescencyjnych), z uwzględnieniem różnych parametrów procesu elektroforezy. Wykorzystywany w ćwiczeniu instrument lab-on-a-chip został opracowany w Zakładzie Mikroinżynierii i Fotowoltaiki Wydziału Elektroniki Mikrosystemów i Fotoniki Politechniki Wrocławskiej. Jest on rozwinięciem prac grupy MEMSLab nad nowej klasy urządzeniami do wysokowydajnej analizy materiału genetycznego, umożliwiającymi m.in. znaczące skrócenie czasu analizy, zwiększenie czułości detekcji analitów, zmniejszenie zużycia próbki. Wprowadzenie Elektroforeza jest jedną najważniejszych metod analityczno-preparatywnych, znajdującą szerokie zastosowanie m.in. w chemii, biologii molekularnej, diagnostyce medycznej. W szczególności, elektroforezę stosuje się w badaniach genetycznych, takich jak: analizy kryminalistyczne, testy ojcostwa, genetyczny odcisk palca, wykrywanie mutacji genowych. Elektroforeza umożliwia rozdzielenie i/lub wydzielenie składników mieszaniny w polu elektrycznym. Podstawą tej metody jest rozdzielenie cząstek (jonów, związków, substancji) ze względu na różną ich ruchliwość w kolumnie separacyjnej, wypełnionej ciekłym elektrolitem (buforem), w wyniku oddziaływania pola elektrycznego (Rys. ). Kierunek i szybkość migracji rozdzielanych cząstek zależy m.in. od ich masy cząsteczkowej, kształtu, zgromadzonego ładunku elektrycznego. Rys.. Schemat elektroforetycznego rozdzielenia cząstek w kolumnie separacyjnej Szczególnie dobre rozdzielnie uzyskuje się w kolumnach wypełnionych żelem, wykorzystując zjawisko sita molekularnego (Rys. 2). Elektroforeza żelowa jest podstawowym narzędziem stosowanym w badaniach genetycznych do analizy ilościowej i jakościowej oraz preparatyki materiału genetycznego. Rys. 2. Schemat rozdzielenia cząstek metodą elektroforezy żelowej

2 Powszechnie stosowana do tego celu aparatura płytowa, w której separację prowadzi się w warstwie żelu zamkniętej między dwiema szklanymi płytami, jest prosta w budowie, tania i dostępna (Rys. 3). Ograniczeniem tej aparatury jest długi czas analizy (kilka godzin), znaczne ryzyko błędów dla badań śladowych ilości materiału genetycznego, stosowanie toksycznych (potencjalnie rakotwórczych) odczynników oraz wymagane wysokie doświadczenie. Rys. 3. Schemat aparatury do elektroforezy żelowej płytowej Aparatura wykorzystująca technikę laboratoriów chipowych (lab-on-a-chip) stwarza nowe możliwości elektroforetycznej analizy materiału genetycznego. Wykorzystanie chipów ze zintegrowanymi, mikroprzepływowymi kanałami transportującymi, dozownikami, separatorami i kolektorami rozdzielonych frakcji, wiąże się ze znaczącym (nawet krotnym) zmniejszeniem zużycia próbki i odczynników, wzrostem stopnia automatyzacji analizy i niezawodności aparatury oraz ograniczeniem ryzyka błędu ludzkiego. Ponadto, wykorzystanie efektu mikroskali pozwala na skrócenie czasu analizy (do kilku minut) i wiąże się ze wzrostem sprawności separacji. Pomimo wielu zalet, instrumenty lab-on-a-chip do analizy elektroforetycznej nadal nie są ogólnodostępne, ich opracowanie jest długotrwałe i kosztowne, a istniejące (nieliczne) komercyjne rozwiązania są ukierunkowane jedynie na wybrane aplikacje. Postęp w dziedzinie analizy genetycznej wymaga dalszych badań nad tej klasy urządzeniami. Detekcja fluorymetryczna W instrumentach lab-on-a-chip chętnie stosuje się metody detekcji optycznej, z których największą czułością charakteryzuje się metoda fluorymetryczna ze wzbudzeniem fluorescencji światłem laserowym. W tej metodzie składniki próbki oznaczane są barwnikami fluorescencyjnymi, które w wyniku wzbudzenia światłem o długości fali λ ab, emitują światło o długości fali λ em, przy czym zwykle λ ab < λ em. Rozdzielone elektroforetycznie składniki, migrując przez odcinek kanału separacyjnego oświetlony wiązką lasera (λ ab ), emitują błyski światła fluorescencji wzbudzonej (λ em ), które są rejestrowane przez detektor (kamerę CCD), przetwarzane i zapisywane w postaci charakterystyki czasowej (elektroferogramu). Elektroferogramy Elektroferogram jest zapisem czasowym sygnału detektora, umożliwiającym analizę ilościową i jakościową próbki. Piki elektroferogramu odpowiadają rozdzielonym składnikom, wykrywanym kolejno przez detektor w kolumnie separacyjnej. Do najważniejszych parametrów pików zaliczamy czas migracji t M, wysokość H i szerokość połówkową W H (Rys. 4a). Istotne jest, że czas migracji składnika liczony jest od momentu jego wprowadzenia do kolumny separacyjnej (dozowanie) do momentu wykrycia przez detektor. 2

3 Kształt i wzajemne położenie pików na elektroferogramie zależy od wielu parametrów, m.in. przekroju kolumny separacyjnej, temperatury procesu, czasu migracji (Rys. 4b). Optymalne parametry analizy pozwalają uzyskać piki smukłe i wyraźnie oddzielone od siebie. a) b) Rys. 4. Elektroferogram: a) parametry pików, b) wpływ czasu separacji na kształt pików W trakcie ćwiczenia studenci będą mogli zmieniać nastawy napięcia zasilającego chip (wpływającego pośrednio na czas migracji) oraz temperatury chipa, wybierając odpowiednie parametry w programie sterującym. Poprawność doboru tych parametrów mierzona jest sprawnością separacji N, wyrażoną ilością półek teoretycznych (pt). Sprawność separacji obliczana jest dla każdego piku ze wzoru: N = 5,545 (t M /w H ) 2 W ćwiczeniu uzyskiwany jest elektroferogram cyfrowy, który jest wyświetlany podczas analizy i zapisywany do wynikowego pliku tekstowego. W pliku tekstowym pierwsza kolumna danych pomiarowych odpowiada czasowi procesu wyrażonemu w sekundach (z dokładnością do ms), a kolumna druga jest zapisem wartości sygnału detektora. Po zakończeniu ćwiczenia studenci kopiują pliki wynikowe, przetwarzają dane w dowolnym arkuszu kalkulacyjnym (np. Excel, Calc, Origin) i obliczają parametry pików elektroferogramu: czas migracji, wysokość pików, szerokość połówkową i sprawność separacji. Obliczone parametry przedstawiają w sprawozdaniu w tabeli zbiorczej, z uwzględnieniem nastaw procesu analizy. Opis stanowiska W ćwiczeniu studenci zapoznają się z instrumentem lab-on-a-chip do elektroforetycznej analizy materiału genetycznego, opracowanym w Zakładzie Mikroinżynierii i Fotowoltaiki WEMiF PWr. Najważniejsze elementy stanowiska pomiarowego to: chip do elektroforezy, stacja dokująca oraz komputer z oprogramowaniem (Rys. 5). Rys. 5. Stanowisko pomiarowe 3

4 Chip do elektroforezy Chip do elektroforezy jest szklaną strukturą o wymiarach 35 mm x 7 mm x 2 mm, zawierającą mikroprzepływowe układy dozowania i separacji próbki (Rys. 6). Chip wykonany jest w całości ze szkła borowo-krzemionkowego typu Pyrex, z wykorzystaniem metod mikroinżynierii. Układy mikrofluidyczne są wytworzone w jednym podłożu szklanym techniką trawienia mokrego; w drugim podłożu wykonane są otwory przelotowe. Podłoża połączono bezpośrednio metodą bondingu termicznego. a) b) c) Rys. 6. Chip do elektroforezy: a) schemat funkcjonalny, b) schemat przekroju, c) widok Chip umieszczony jest w dwuczęściowej, polimerowej obudowie, tzw. module (Rys. 7). Górna strona modułu, wykonana z PTFE (Teflon ), zawiera zbiorniki cieczowe na bufor, okno detekcji optycznej oraz otwory pozycjonujące chip w stacji dokującej. W dolnej części znajduje się apertura, umożliwiająca wprowadzenie wiązki światła laserowego do chipa. a) b) c) Rys. 7. Moduł chipa: a) schemat funkcjonalny, b) schemat przekroju, c) widok Przed analizą kanały chipa są wypełniane żelem, a do zbiorniczków cieczowych modułu wprowadzany jest bufor elektroforetyczny. Gotowy do pracy moduł umieszczany jest w stacji dokującej, gdzie wykonywane są dalsze etapy analizy. Po zakończeniu procesu, bufor i żel są usuwane, a kanały i zbiorniczki przepłukiwane alkoholem i wodą dejonizowaną. Po osuszeniu modułu, chip jest gotowy do ponownego użycia. Przygotowanie chipa do pracy (wypełnienie żelem i buforem) oraz jego regeneracja (usuwanie buforu i żelu, przepłukiwanie kanałów) wykonywane jest z wykorzystaniem pipet i tipsów oraz pompki, znajdujących się obok instrumentu (Rys. 8a). Pipety umożliwiają pobranie i dozowanie precyzyjnie odmierzonej objętości cieczy. Na stanowisku dostępne są pipety przeznaczone na zakres -0 µl oraz 0-00 µl. Każda pipeta ma pokrętło nastawy dozy, wskaźnik nastawy oraz tłoczek, pracujący na dwóch poziomach (Rys. 8b). 4

5 a) b) Rys. 8. Akcesoria do przygotowania chipa: a) stanowisko, b) pipety Procedura pobierania cieczy pipetą:. ostrożnie ustawić pokrętłem wymaganą objętość (nie przekraczać skrajnych wartości!), 2. założyć na pipetę odpowiednią końcówkę (tzw. tipsa), 3. wcisnąć tłoczek do pierwszego poziomu, aby wypuścić powietrze, 4. zanurzyć tipsa pionowo w cieczy i zwolnić tłoczek, 5. poczekać, aż poziom cieczy w tipsie zatrzyma się; wyjąć tipsa z cieczy. Procedura dozowania cieczy pipetą:. ustawić tipsa pionowo nad miejscem dozowania i wcisnąć tłoczek do drugiego poziomu, 2. po opróżnieniu tipsa, usunąć go do pojemnika na zużyte tipsy (użyć spustu na pipecie). Stacja dokująca i aplikacja sterująca Stacja dokująca jest urządzeniem mechatronicznym, zawierającym wszystkie mechaniczne, elektryczne i optyczne podzespoły systemu, niezbędne do przeprowadzenia analizy w chipie do elektroforezy (Rys. 9). Obsługa stacji dokującej ogranicza się do obsługi włączników oraz głowicy pomiarowej, zawierającej detektor fluorymetryczny i elektrody drutowe do zasilania chipa. W pokrywie stacji umieszczony jest wyłącznik bezpieczeństwa. Rys. 9. Stacja dokująca Pracą stacji steruje komputer z dedykowanym oprogramowaniem z graficznym interfejsem użytkownika. Aplikacja zawiera opis wszystkich czynności niezbędnych do obsługi instrumentu i przygotowania chipa, jak również dodatkowe materiały pomocnicze w formie tekstowej oraz zdjęć i animacji. Po uruchomieniu aplikacji widoczny jest ekran startowy z Menu (Rys. 0a), a dalsza obsługa sprowadza się do wyboru odpowiednich poleceń 5

6 i postępowania zgodnie z instrukcjami na ekranie. Aplikacja przetwarza sygnały pomiarowe, steruje pracą chipa (zasilaniem, temperaturą) zgodnie z wybranymi przez użytkownika programami oraz prezentuje i zapisuje w plikach wynikowych sygnały wyjściowe (Rys. 0b). a) b) Rys. 0. Aplikacja sterująca: a) ekran startowy z Menu, b) ekran analizy Przebieg ćwiczenia Przed wykonaniem ćwiczenia: proszę koniecznie zapoznać się z wprowadzeniem i opisem stanowiska z instrukcji, przed użyciem pipet proszę zapoznać się z ich obsługą, pracę z odczynnikami należy wykonywać zawsze w rękawiczkach ochronnych, pliki wynikowe, potrzebne do realizacji sprawozdania, można przesłać na adres mailowy; ze względu na możliwą awarię sieci, zaleca się jednak przyniesienie na zajęcia nośnika pamięci USB (pendrive) z ok. 20 MB wolnego miejsca. W razie wątpliwości należy zawsze poprosić o pomoc Prowadzącego. Wykonanie ćwiczenia:. Włączyć komputer i zalogować się na konto Student. 2. Uruchomić program Elektroforeza (ikona na pulpicie) i poczekać na pojawienie się komunikatu o gotowości do pracy. Kliknąć OK, na ekranie pojawi się Menu. 3. Wybrać Przygotowanie instrumentu, zapoznać się z Wprowadzeniem, a następnie przeprowadzić Uruchomienie instrumentu. Wrócić do Menu. 4. Wybrać Przygotowanie chipa i wykonać kolejno czynności: Wprowadzenie żelu, Wprowadzenie buforu, Umieszczenie chipa. 5. Wybrać Analiza i kolejno: program sterowania zasilaniem i program nastaw temperatury. Wybór programów uzgodnić z Prowadzącym. Zanotować parametry. 6. Wprowadzić próbkę do chipa i opuścić głowicę pomiarową, zgodnie z instrukcjami na ekranie. Pojawi się ekran analizy przedstawiający schemat chipa, podgląd obszaru detekcji oraz charakterystyki pomiarowe temperatury i sygnału fluorescencji. 7. Wcisnąć START i poczekać na zakończenie procesu. Wrócić do Menu. 8. Przeprowadzić Regenerację chipa. Kanały mikrofluidyczne muszą być puste! 9. Jeśli wykonywana będzie kolejna analiza, wrócić do pkt. 4. W przeciwnym razie wybrać Wyłączenie instrumentu i postępować zgodnie z instrukcjami. 0. Skopiować pliki wynikowe z folderu WYNIKI na pulpicie. Wyłączyć komputer. 6

7 Po wykonaniu ćwiczenia: przetworzyć pliki wynikowe w arkuszu kalkulacyjnym i przygotować czytelne elektroferogramy przeprowadzonych analiz (opisać i wyskalować osie), wyznaczyć dla każdego piku: czas migracji t M, wysokość H, szerokość połówkową W H i sprawność separacji N. w sprawozdaniu przedstawić elektroferogramy wykonanych analiz oraz tabelę zbiorczą parametrów wg schematu: Nr analizy Program zasilania Nr dozowanie: 00 V, 5 minut separacja: 500 V, 5 minut Program temperatury Nr dozowanie: 25 C separacja: 25 C 2 Nr piku 2 n n t M [s] H [j.u.] W H [s] N [pt] Przykładowe pytania Co to jest elektroforeza i gdzie znajduje zastosowanie? Na czym polega analiza materiału genetycznego metodą elektroforezy żelowej? Porównaj urządzenia do elektroforezy płytowej i lab-on-a-chip. Narysuj schemat funkcjonalny i opisz zasadę działania chipa do elektroforezy. Literatura. Jan A. Dziuban, Technologia i zastosowanie mikromechanicznych struktur krzemowych i krzemowo-szklanych w technice mikrosystemów, Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, Wrocław W. Kubicki, R. Walczak, J. Dziuban, Injection, separation and fluorimetric detection of DNA in glass lab-on-a-chip for capillary electrophoresis, Optica Applicata (20) 4: Publikacje na temat elektroforetycznej analizy lab-on-a-chip 7