Biopsja w diagnostyce chorób jamy ustnej na podstawie piśmiennictwa

Transkrypt

1 Czas. Stomatol., 2009, 62, 12, Polish Dental Society Biopsja w diagnostyce chorób jamy ustnej na podstawie piśmiennictwa Biopsy in the diagnostics of oral diseases review of literature Marlena Trąbska-Świstelnicka 1, Renata Samulak-Zielińska 2, Mariusz Lipski 3 Z Zakładu Periodontologii przy Katedrze Stomatologii Zachowawczej i Periodontologii PAM w Szczecinie 1 Kierownik: prof. dr hab. n. med. J. Banach Prywatna praktyka stomatologiczna w Szczecinie 2 Z Zakładu Stomatologii Zachowawczej Przedklinicznej i Endodoncji Przedklinicznej Katedry Stomatologii Zachowawczej i Periodontologii PAM w Szczecinie 3 Kierownik: dr hab.n.med. M. Lipski prof. nadzw. Summary Introduction: Every dentist should be aware of possible occurrence of potentially malignant oral lesions, and within the oral mucosa in particular. Appropriate treatment is possible only after accurate diagnosis. Even though detailed interview with the patient, exact manual examination, and precise visualization provide useful information, it is often necessary to verify the oral lesion in question histopathologically. Aim of the study: To present types of biopsy, biopsy sampling techniques, clinical indications and the protocol for sample material fixation and transportation. Conclusions: Diagnostics and treatment of oral lesions is based on the outcome of histopathological examination. It is, therefore, necessary for the dentist to provide the pathologist with the tissue material of the highest quality which was obtained following a properly performed biopsy. Streszczenie Wprowadzenie: czujność onkologiczna obowiązuje każdego praktykującego lekarza stomatologa. W przypadku zmian w obrębie błony śluzowej jamy ustnej taka czujność jest szczególnie istotna. Właściwe postępowanie terapeutyczne jest możliwe po postawieniu prawidłowego rozpoznania. Pomimo tego, że dokładnie przeprowadzony wywiad, wnikliwe badanie palpacyjne oraz ocena wizualna dostarczają wielu cennych informacji, często konieczna jest weryfikacja histopatologiczna istniejącej zmiany. Cel pracy: na podstawie piśmiennictwa opisano rodzaje biopsji, procedury ich wykonania, wskazania kliniczne do ich wykonywania oraz zasady utrwalania i transportowania materiału biopsyjnego. Podsumowanie: diagnostyka i leczenie zmian błony śluzowej jamy ustnej oparte są głównie na rozpoznaniu histopatologicznym. Stąd lekarz dentysta powinien dostarczyć patologowi bioptat o najwyższej jakości, otrzymany w wyniku prawidłowo wykonanej biopsji. KEYWORDS: brush biopsy, needle biopsy, excisional biopsy, incisional biopsy, oral biopsy HASŁA INDEKSOWE: biopsja szczoteczkowa, biopsja igłowa, biopsja wycięciowa i nacięciowa, biopsja błony śluzowej 952

2 2009, 62, 12 Biopsja w chorobach jamy ustnej Wstęp Czujność onkologiczna obowiązuje każdego praktykującego lekarza stomatologa. W przypadku zmian w obrębie błony śluzowej jamy ustnej taka czujność jest szczególnie ważna. Właściwe postępowanie terapeutyczne jest dopiero możliwe po postawieniu prawidłowego rozpoznania. Pomimo tego, że szczegółowy wywiad, wnikliwe badanie palpacyjne oraz ocena wizualna dostarczają wielu cennych informacji, często konieczna jest weryfikacja histopatologiczna istniejącej zmiany. Ma to szczególne znaczenie w diagnostyce zmian przedrakowych i potencjalnie złośliwych, zwłaszcza, że ich kliniczne różnicowanie w jamie ustnej jest utrudnione z powodu niespecyficznych objawów [19]. Wczesne rozpoznanie zmiany nowotworowej bardzo często warunkuje powodzenie leczenia. W przypadku raka jamy ustnej szanse na pięcioletnie przeżycie wynoszą 80% wówczas, gdy zostanie on rozpoznany we wstępnym stadium. Niestety 50% pacjentów obciążonych tą chorobą umiera w ciągu pięciu lat od rozpoznania. Oznacza to, że diagnoza stawiana jest w zaawansowanym stadium nowotworu. Jest to spowodowane, z jednej strony, zbyt późnym zgłaszaniem się pacjentów do lekarza, zaś z drugiej brakiem skrupulatności lekarzy w ocenie stanu błony śluzowej jamy ustnej [3]. Cel pracy Celem pracy było przedstawienie na podstawie piśmiennictwa rodzajów biopsji, procedur ich wykonania, wskazań klinicznych do ich wykonania oraz zasad utrwalania i transportowania materiału biopsyjnego. Badanie jamy ustnej Głównym sposobem wykrywania potencjalnie złośliwych zmian w jamie ustnej jest badanie oglądaniem i dotykiem. Pomimo, że procedura ta w najprostszej formie zajmuje około 90 sekund jest rzadko wykonywana podczas standardowej wizyty w gabinecie stomatologicznym [3]. Szacuje się, że dokładna ocena jamy ustnej umożliwiłaby uratowanie życia osób na świecie w ciągu roku [22]. Zwiększona czujność onkologiczna powinna wynikać również z faktu, że 25% raków powstaje u osób, które nie paliły tytoniu i nie nadużywały alkoholu, stąd nie zostały zaliczone do grup ryzyka [2]. Ponadto 5% zmian pozbawionych jakichkolwiek klinicznych cech zezłośliwienia w badaniu histopatologicznym okazuje się dysplazją lub rakiem inwazyjnym [12]. Z kolei 25% zmian przedrakowych i wczesnych rakowych przebiega praktycznie bezobjawowo. Stąd często są one niezauważane przez lekarzy podczas rutynowego badania [2]. Systemy wspomagające wizualną ocenę błony śluzowej jamy ustnej Oglądanie jamy ustnej można wspomóc metodami chemiluminescencyjnymi oraz fluorescencyjnymi. Najbardziej znane to: system Vizilite Plus with TBlue i VELscope. System ViziLite Plus with TBlue (Zila Pharmaceuticals, Inc.) jest oparty na zjawisku chemiluminescencji [15]. Wykorzystuje właściwości chlorku toluidyny, zwanego popularnie błękitem toluidyny. Przeznaczony jest do badań przesiewowych. Zestaw składa się z płynu do płukania jamy ustnej, którym jest 1% kwas octowy, szpatułek nasączonych 1% kwasem octowym i 0,5% chlorkiem toluidyny oraz ampułek, które po aktywacji zawartych w nich składników, emitują światło o długości fali nm. Procedura obejmuje standardowe badanie zewnątrz- i wewnątrzustne, płukanie przez pacjenta jamy ustnej w cel usunięcia warstwy glikoprotein z powierzchni 953

3 M. Trąbska-Świstelnicka i in. Czas. Stomatol., błony śluzowej, aktywowanie przez lekarza, poprzez zgniecenie ampułki, mieszaniny, która emitując światło przez 10 minut oświetla badane tkanki. Komórki z większym jądrem, obszary hyperkeratynizacji oraz strefy zmienione zapalnie są białawe, natomiast tkanki zdrowe przyjmują barwę biało-niebieskawą. Czułość metody oceniana jest na 100%, natomiast swoistość na 0-14,2%. Ujawnione podczas badania zmiany dodatkowo wybarwia się chlorkiem toluidyny [20], który jest substancją organiczną służącą do przyżyciowego barwienia tkanek. Łączy się ona z DNA komórek, które podlegają intensywnym podziałom (w stanie zapalnym lub procesach regeneracyjnych), albo mają uszkodzony materiał genetyczny. Wybarwianie miejsc ujawnionych podczas badania systemem ViziLite Plus with TBlue polega na aplikacji 1% roztworu kwasu octowego za pomocą nasączonej nim szpatułki, następnie na naniesieniu 0,5% roztworu chlorku toluidyny. Postępowanie należy zakończyć kolejną aplikacją kwasu octowego. Połączenie chlorku toluidyny z materiałem genetycznym komórki powoduje zabarwienie tkanek na niebiesko [4]. Aparat VELscope wykorzystuje zjawisko zmienionej fluorescencji patologicznych tkanek. Na skutek przemian biochemicznych zmienia się układ komórkowych fluoroforów. Oświetlenie lampą emitującą światło o długości fal nm ujawnia niewidoczne dotychczas zmiany patologiczne, które przyjmują barwę czarną, w przeciwieństwie do zielono zabarwionych tkanek zdrowych. Ograniczeniem w stosowaniu omawianej metody są przypadki wyników fałszywie dodatnich, zwłaszcza w obszarach zmienionych zapalnie. VELscope stosowany jest jako uzupełnienie podstawowego badania oraz umożliwia śródoperacyjne potwierdzenie prawdopodobnej lokalizacji marginesu tkanek zdrowych. Czułość tej metody oceniana jest na %, zaś swoistość na % [22]. W przypadku stwierdzenia zmian budzących wątpliwość lub ujawnionych w trakcie badania VELscope czy ViziLite Plus with TBlue wskazana jest ich weryfikacja histopatologiczna [15]. Biopsja szczoteczkowa Zaletami biopsji szczoteczkowej jest brak konieczności znieczulania, minimalne krwawienie śródzabiegowe, niskie ryzyko powikłań [12] oraz krótki czas oczekiwania na wynik [2]. Biopsja szczoteczkowa jest łatwiej akceptowana przez pacjenta niż biopsja nacięciowa [20]. Umożliwia ona również pobranie materiału do diagnostyki z wielu miejsc na powierzchni błony śluzowej jamy ustnej podczas jednej wizyty bez większego obciążania pacjenta [22]. Niestety metoda ta wiąże się z dość wysokim ryzykiem wyników fałszywie negatywnych ocenianych na 37% [20]. Dotyczy to sytuacji, w których nie są pobrane wszystkie warstwy nabłonka wraz z blaszką podstawną. Pozyskanie odpowiedniej grubości materiału tkankowego jest utrudnione zwłaszcza w przypadku stanów zapalnych, nadmiernej keratynizacji oraz martwicy, co jest częste w przypadku nowotworów i stanów przednowotworowych [22]. W celu eliminacji pomyłek diagnostycznych skonstruowano system biopsji szczoteczkowej wspomagany komputerowo OralCDx (OralScan Laboratories, Inc.), dostępny w Stanach Zjednoczonych Ameryki Północnej oraz niektórych krajach Europy. Składa się on z jednorazowego zestawu dla każdego pacjenta używanego przez lekarza oraz komputera w pracowni patologa. Zestaw składa się ze szczoteczki, szkiełka, woreczka z roztworem utrwalacza (glikol propylenowy), formularza informacyjnego oraz plastikowego pojemnika 954

4 2009, 62, 12 Biopsja w chorobach jamy ustnej do transportu na sucho. Okrągła szczoteczka jest specjalnie zaprojektowana tak, aby pobrać komórki ze wszystkich warstw nabłonka i blaszki właściwej. Przed użyciem szczoteczkę należy zwilżyć wodą lub śliną pacjenta, przyłożyć częścią płaską do zmiany i obracać, średnio 5-10 razy, do momentu pojawienia się krwawych punktów na powierzchni błony śluzowej, co oznacza osiągnięcie poziomu lamina propria. Pobrany materiał należy rozprowadzić na powierzchni szkiełka i utrwalić glikolem propylenowym. Po przesłaniu do pracowni preparat jest barwiony zmodyfikowaną metodą Papanicolaou i skanowany. Komputer połączony z mikroskopem analizuje kształt oraz wielkość komórek wychwytując wszelkie zmiany mogące sugerować ich złośliwy charakter. Następnie preparaty ogląda patolog. Dzięki współpracy komputera i specjalisty możliwa jest klasyfikacja w czterostopniowej skali: negatywny (brak cech złośliwości), pozytywny (z cechami nowotworowymi), atypowy i niemożliwy do oceny (gdy brakuje wszystkich warstw nabłonka). W przypadku stwierdzenia obecności komórek atypowych lub nowotworowych konieczna jest biopsja nacięciowa, w celu analizy histoarchitektoniki zmiany. Biopsja szczoteczkowa jako metoda skryningowa, służy do identyfikacji potencjalnie złośliwych zmian spośród wszystkich wykwitów stwierdzonych w trakcie badania stomatologicznego [2]. Biopsja igłowa W przypadku zmian znajdujących się głęboko w tkankach lub w miejscach trudnodostępnych, np.: w miąższu ślinianki, języku, węzłach chłonnych [17], istnieje możliwość diagnostyki za pomocą biopsji igłowej [1]. Ze względu na rodzaj stosowanych igieł wyróżniamy biopsję cienko i grubo igłową. Biopsja cienkoigłowa jest metodą stosunkowo małoinwazyjną [18]. Do jej wykonania zazwyczaj nie jest wymagane znieczulenie. Wiąże się również z mniejszym ryzykiem powstania krwiaków, zakażeń czy szpecących blizn. Uniemożliwia przeniesienie i wszczepienie komórek nowotworowych z tkanek głębiej położonych do zdrowych znajdujących się na ich powierzchni. Opisywane są natomiast przypadki wszczepienia komórek mięsaka w trakcie biopsji nacięciowej [23]. Biopsja cienkoigłowa polecana jest także w przypadku osób z obniżona odpornością, ponieważ wiąże się z mniejszym ryzykiem infekcji [17]. Do wykonania biopsji cienkoigłowej stosuje się igły 18G, 22G, 23G, 25G ze strzykawką o pojemności 10 cm 3. Igłę przesuwa się we wnętrzu zmiany 2-3 krotnie. Pobrany materiał utrwala się natychmiast na szkiełku w 95% etanolu lub preparacie Citofix. Po kilku minutach możliwe jest barwienie metodą Diff-Quick stanowiącą modyfikację metody Wrighta-Giemsy, którą od pierwowzoru różni skrócony czas procedury: z 4 minut do 15 sekund [18]. Biopsja cienkoigłowa jest metodą mniej czułą, niż biopsja nacięciowa, ponieważ do analizy pobierane są pojedyncze komórki. Możliwa jest ocena ich dysplazji, natomiast pomijane są ważne informacje wynikające z histoarchitektoniki [17]. Ograniczenia wynikają również z trudności w manipulowaniu igłą, zwłaszcza, gdy na drodze dostępu znajdują się przeszkody w postaci struktur anatomicznych. Utrudnieniem jest również brak możliwości stabilizacji zmiany w trakcie zabiegu lub jej małe rozmiary [18]. Stąd dokładność metody szacowana jest na 77-88% [17]. Biopsja cienkoigłowa nie jest badaniem rozstrzygającym i zawsze należy wykonać analizę pobranego wycinka. Pomimo to dostarcza cennych informacji w momencie planowania zabiegu chirurgicznego. Ponadto umożliwia na- 955

5 M. Trąbska-Świstelnicka i in. Czas. Stomatol., tychmiastową ocenę charakteru zmiany [18]. Precyzja biopsji wzrasta (czułość 99,7%, swoistość 98%), gdy wykonywana jest pod kontrolą ultrasonografu lub aparatu rentgenowskiego [17]. W każdym przypadku biopsja powinna być wykonywana przez specjalistę patologa lub radiologa [14]. Biopsja gruboigłowa wykonywana jest igłą o rozmiarze 14G lub 16G. Jej wykonanie wymaga znieczulenia. Pobierany jest fragment tkanki, stąd możliwa jest ocena histoarchitektoniki zmiany, co jest szczególnie przydatne w diagnostyce mięsaków [21]. Jej specyficzność i czułość jest wyższa niż biopsji cienkoigłowej [23]. Utrwalanie wymazów cytologicznych i materiału z biopsji szczoteczkowej i igłowej Zarówno wymazy cytologiczne, jak i materiał z biopsji szczoteczkowej oraz cienkoigłowej mogą być utrwalane na dwa sposoby. Metoda konwencjonalna uwzględnia rozprowadzenie materiału na szkiełku i utrwalenie 95% etanolem. W tej postaci preparat jest przekazywany do laboratorium, gdzie jest opracowywany i barwiony w celu badania pod mikroskopem świetlnym. Nowszą techniką jest płynna cytologia (ang. liquid-based cytology, LBC). Wymaz nie jest od razu rozprowadzany na szkiełku mikroskopowym, lecz przechowywany w płynie (np.: CytoRich System), który umożliwia zachowanie kształtu komórek i w takim stanie przekazywany jest do laboratorium. Proces ten minimalizuje ryzyko uszkodzenia próbki podczas transportu. W laboratorium preparat przygotowywany jest przez specjalistę. Metoda ta umożliwia uzyskanie doskonałego preparatu, gdyż z próbki zostają usunięte komórki bakterii, drożdży, cząstki śluzu oraz elementy morfotyczne krwi. Uzyskany w ten sposób preparat jest trwalszy, a jego wysoka jakość umożliwia wykonanie badań immunohistochemicznych z wykorzystaniem mniejszej ilości przeciwciał. Cytologia płynna jest dokładniejsza w diagnostyce raków i stanów przedrakowych. Niestety badanie to jest znacznie droższe od konwencjonalnej cytologii, a samo przygotowanie próbki jest bardziej skomplikowane [6]. Biopsja nacięciowa i wycięciowa Obecnie złotym standardem w diagnostyce budzących niepokój wykwitów, zlokalizowanych na powierzchni błony śluzowej jamy ustnej jest badanie histopatologiczne zmian wyciętych w całości biopsja wycięciowa lub ich fragmentów biopsja nacięciowa. Wskazania do wykonania biopsji obejmują stany przednowotworowe, takie jak erytroplakia, leukoplakia, liszaj płaski, zmiany barwnikowe, guzy, owrzodzenia, a także wszelkie wykwity o nieznanej etiologii, nie poddające się leczeniu powyżej 2 tygodni [13]. Czujność powinny wzbudzić odbiegające od normy zabarwienia powierzchni błony śluzowej, jej rozrosty, pęknięcia, owrzodzenia, a także śródkostne przejaśnienia z cechami nowotworzenia zaobserwowane na zdjęciach radiologicznych. Badanie histopatologiczne obowiązuje również w przypadku torbieli, ziarniniaków ropotwórczych, nadziąślaków, brodawczaków, włókniaków oraz zmian położonych śródmiąższowo, np. wewnątrz języka, ślinianek, warg, stwierdzonych w badaniu palpacyjnym [13]. Biopsję wykonuje się również w celu potwierdzenia rozpoznania schorzeń ogólnoustrojowych, takich jak toczeń, sklerodermia, amyloidoza, zespół Sjögrena oraz choroby pęcherzowe [14]. Ze względu na lokalizację poddawanych biopsji tkanek wyróżniamy biopsje bezpośrednie lokalizacja powierzchowna lub pośrednie, kiedy badana zmiana znajduje się pod prawidłowo wyglądającą powierzch- 956

6 2009, 62, 12 Biopsja w chorobach jamy ustnej nią błony śluzowej. W przypadku zmian podejrzanych o podłoże naczyniowe lub barwnikowe przeciwwskazanie jest pobierane wycinka. Zmianę należy wyciąć w całości z odpowiednim marginesem z powodu zagrażającego krwotoku lub możliwości rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych drogą krwionośną [13]. Zasady obowiązujące przed wykonaniem biopsji obejmują dokładne badanie pacjenta, w tym badanie węzłów chłonnych, szczegółowy wywiad oraz zabezpieczenie dokumentacji fotograficznej. Należy zanotować kształt, wielkość, lokalizację, kolor, strukturę, konsystencję, czas rozwoju zmiany oraz dodatkowe objawy towarzyszące, czynniki ryzyka, a także rozpoznanie wstępne i różnicowanie [14]. Wynik badania histopatologicznego będzie miarodajny, jeżeli pobrany fragment tkanki będzie najbardziej reprezentacyjny [16]. Należy wybrać obszar o potencjalnie najgroźniejszym charakterze, ale obejmujący również pogranicze zdrowych tkanek [13]. Nie powinno się pobierać bioptatów ze środka owrzodzeń czy wnętrza guzów, ponieważ obraz histopatologiczny wykaże najczęściej obecność martwicy i stanu zapalnego [14]. W przypadkach wątpliwych można się posiłkować błękitem toluidyny lub urządzeniem VELscope oraz skierować pacjenta do specjalisty chirurga lub periodontologa, w celu wykonania biopsji [16]. Najdogodniejsza sytuacja ma miejsce wtedy, gdy preparat zabezpiecza lekarz, który następnie będzie leczył pacjenta. Stąd polecane jest, aby lekarz dentysta wykonywał biopsję tylko w przypadku torbieli, ziarniniaków okołowierzchołkowych, ropotwórczych, nadziąślaków, włókniaków [14]. Biopsje z pozostałych zmian, zwłaszcza przednowotworowych i nowotworowych powinny być pobierane w ośrodkach specjalistycznych. Biopsji wycięciowej, czyli usunięciu w całości z marginesem tkanek zdrowych, należy poddać wykwity o charakterze naczyniowym, barwnikowym, włókniaki, brodawczaki oraz ziarniniaki [13]. W przypadku chorób pęcherzowych ważne jest, aby wycinek pobrać z tkanek sąsiadujących ze zmianami. Badanie histopatologiczne samego pęcherza nie dostarczy potrzebnych informacji, ponieważ obraz mikroskopowy będzie przedstawiał nadżerki i owrzodzenia z cechami stanu zapalnego [14]. W przypadku stanów patologicznych o niejednorodnym charakterze lub zajmujących duży obszar pobiera się materiał tkankowy z wielu miejsc. W trakcie zabiegu poleca się stosowanie znieczulenia przewodowego, ponieważ podanie roztworu substancji znieczulającej w obszar zmiany może doprowadzić do powstania zniekształcających artefaktów w bioptacie [16]. Zbyt duża objętość anestetyku w sposób istotny zaburza histoarchitektonikę, co uniemożliwia skuteczne wykonanie badań histologicznych i immunohistochemicznych [9]. Pobieranie materiału można wykonać za pomocą skalpela lub trepana. Należy unikać stosowania lasera czy noża elektrycznego, ponieważ powodują one powstanie artefaktów koagulacyjnych, uniemożliwiających ocenę obrzeży zmiany [16]. Korzystnym rozwiązaniem jest wykonanie biopsji nacięciowej trepanem. Trepan jest okrągłym ostrzem osadzonym na plastikowym uchwycie o średnicy od 2 do 10 milimetrów. Najczęściej używa się ostrza czteromilimetrowego. Trepan umożliwia pobranie tkanek odpowiedniej grubości przy ich jednoczesnym atraumatycznym uchwycie. Ogranicza to liczbę artefaktów w ocenianym preparacie [11]. Miejsce zabiegu zazwyczaj nie wymaga szycia. Stosowanie trepanów umożliwia pobranie wielu preparatów u jednego pacjenta w czasie tej samej wizyty, co ma szczególne zna- 957

7 M. Trąbska-Świstelnicka i in. Czas. Stomatol., czenie w przypadku rozległych zmian [14]. Ograniczeniem metody jest utrudnione stosowanie w tych rejonach jamy ustnej gdzie błona śluzowa nie spoczywa na podłożu kostnym [13]. Technika pobierania i utrwalania wycinka Podczas pobierania wycinka należy uważać, aby nie zmiażdżyć tkanek, może to skutkować powstaniem artefaktów zaburzających obraz mikroskopowy. W tym celu stosuje się podszycie nicią i pośredni uchwyt kleszczykami hemostatycznymi lub atraumatycznymi, tak aby materiał tkankowy pociągany był ku górze, nie zaś miażdżony [14]. Cięcie, zazwyczaj skalpelem nr 15 [13], prowadzi się równolegle do naczyń i nerwów, na głębokości 4-5mm i przy zachowaniu średnicy bioptatu co najmniej 3mm [16]. Zaleca się uzyskanie kształtu klina bądź soczewkowatego, co ułatwi następnie zszycie oraz umożliwi pobranie wycinka o pełnej grubości nabłonka wraz z kilkoma milimetrami lamina propria. Najkorzystniej jest gdy długość preparatu jest trzy razy większa niż jego szerokość. Większą przydatność diagnostyczną mają wycinki wąskie i głębokie, niż płytkie, lecz rozległe [14]. Bioptat musi być wystarczająco duży, ponieważ skurczy się po umieszczeniu w formalinie [9]. Pobrany fragment tkanki umieszcza się na sterylnym papierze, np.: fragmencie pakietu papierowo-foliowego używanego do sterylizacji, stroną łącznotkankową do papieru, na 1 minutę, aby wycinek był płaski i właściwie zorientowany. Ma to również zapobiec zwijaniu się preparatu [16]. Przed zwijaniem bioptatu zabezpiecza również jego odpowiednia grubość (minimalne rozmiary to 1,0x0,5x0,5cm), wówczas wraz z nabłonkiem pobrana zostaje tkanka łączna. Często szwami zaznacza się obrzeża wycinka by pomóc w orientacji patologowi [14]. Preparat umieszcza się w 10% roztworze neutralnej zbuforowanej formaliny czyli w 4% roztworze formaldehydu, w objętości razy większym niż objętość preparatu [9], w plastikowym bądź szklanym pojemniku [13]. Ma to zapobiec autolizie, umożliwić właściwe utrwalenie a także utwardzić tkanki [7]. Zbuforowaną formalinę (ph = 7,2) otrzymuje się poprzez dodanie 6,5g Na 2 HPO 4 oraz 3,5g NaH 2 PO 4 na jeden litr roztworu [10]. Pojemniczki z ciemnego szkła z gumowym korkiem są dostępne w aptekach. Można wykorzystać dobrze oczyszczone plastikowe pojemniczki po preparatach stomatologicznych. Naczynko z bioptatem musi być odpowiednio opisane. Można przykleić kawałek plastra, na którym umieszczone są dane pacjenta. Bioptatów nie wolno umieszczać w roztworach alkoholowych, dezynfekujących, znieczulających, płynach do płukania jamy ustnej, soli fizjologicznej czy wodzie destylowanej. Działanie formaliny polega na tworzeniu wewnątrzmolekularnych mostków między proteinami oraz wiązań krzyżowych pomiędzy grupami końcowymi peptydów. W nieutrwalonym preparacie w krótkim czasie rozpoczyna się autoliza uniemożliwiająca jego dokładną ocenę [14]. Zalecany czas przebywania bioptatu w formalinie wynosi 24 godziny. Nie należy go przedłużać, gdyż uniemożliwi to późniejsze prawidłowe wykonanie niektórych badań, np. molekularnych [7]. W przypadku planowania badań immunologicznych bezpośrednich, mikrobiologicznych, śródoperacyjnych [14], molekularnych, cytogenetycznych [9], docelowym barwieniu na tłuszcze [7] oraz do badań w mikroskopie elektronowym [9] preparatów nie utrwala się w formalinie. W takich przypadkach preparaty tkankowe, umieszczone w suchym pojemniku. Powinny być jak najszybciej przetransportowane do pracowni, gdzie są zamrażane w kriostacie [9]. Nie 958

8 2009, 62, 12 Biopsja w chorobach jamy ustnej należy ich umieszczać w wodzie destylowanej bądź soli fizjologicznej, ponieważ może to doprowadzić do powstania artefaktów imitujących choroby pęcherzowe [8]. W przypadku badań śródoperacyjnych, kiedy istotny jest czas oczekiwania na wynik, materiał biopsyjny jest mrożony tak, aby jego konsystencja umożliwiła cięcie mikrotomem. Mikroskopowa ocena skrawków przygotowanych w ten sposób jest trudniejsza i patolog może postawić tylko jedną z trzech możliwych diagnoz: pozytywne, negatywne lub wątpliwe [13]. W przypadku badań immunohistochemicznych (dotyczy to między innymi chorób pęcherzowych), bioptat należy pobrać z miejsca makroskopowo niezmienionego chorobowo i umieścić w płynie Michela. Roztwór ten składa się z siarczanu amonu, N-etylomaleimidu, cytrynianu potasu, siarczanu magnezu oraz wody destylowanej. Nie posiada właściwości utrwalających struktur komórkowych, lecz umożliwia wykonanie badań immunofluorescencyjnych nawet po kilku dniach [5]. Poza prawidłowym pobraniem i utrwaleniem materiału do badania histopatologicznego, bardzo istotną kwestią jest dostarczenie prawidłowych informacji do laboratorium. Powinny one zawierać dane pacjenta: imię nazwisko, wiek, datę pobrania wycinka. Należy uwzględnić opis zmiany, jej lokalizację, czas trwania oraz opisać jej rozmiary. W skierowaniu do pracowni powinno znaleźć się także wstępne rozpoznanie. W miarę możliwości można dostarczyć kolorową fotografię zmiany przed biopsją. W przypadku pobrania kilku wycinków, każdy należy opisać osobno z zaznaczeniem, z jakiego obszaru został pobrany [14, 16]. Ważne jest zapewnienie szybkiego i bezpiecznego transportu do pracowni uwzględniającego zabezpieczenie przed skrajnymi temperaturami [14]. Usunięcie zmiany nowotworowej z odpowiednim marginesem niezmienionych tkanek, potwierdzonym badaniem histopatologicznym, nie zabezpiecza niestety przed nawrotem choroby. Wznowę notuje się u 10-30% pacjentów. Wynika to z faktu, że zmiany genetyczne poprzedzające zmiany histologiczne są niewidoczne w rutynowym badaniu histopatologicznym. Stąd makroskopowo i mikroskopowo niezmienione tkanki mogą zawierać komórki ze zmienionym materiałem genetycznym. Możliwość ich diagnozowania stworzyły metody molekularne, do których zaliczamy badania w kierunku mutacji genu supresorowego p53, analiza utraty heterozygotyczności, niestabilności mikrosatelit oraz zmian epigenetycznych, a także oznaczenie przeciwciał przeciwko filamentom pośrednim (cytokeratyn o szerokim spektrum: CKAE1/AE3). Analiza ilościowa DNA umożliwia rozpoznanie aneuploidii, która o 1-15 miesięcy wyprzedza zmiany tkankowe. Umożliwia ona również przewidzenie zezłośliwienia zmian przednowotoworowych w przeciągu najbliższych pięciu lat. Stąd obecnie zaleca się całościowe wycięcie zmiany w przypadku stwierdzenia aneuploidii. Czułość metody oceniana jest na 98,2%, zaś swoistość na 100%. Do ilościowej analizy DNA pobiera się materiał w formie wymazu, stosując płynną cytologię. Preparat nie powinien być barwiony hematoksyliną i eozyną, lecz metodą Feulgena. Polega ona na selektywnym barwieniu DNA, opartym na kwaśnej hydrolizie, gdzie kwas dezoksyrybonukleinowy barwi się w niej na czerwono [12]. Podsumowanie Postawienie prawidłowego rozpoznania w przypadku patologicznych zmian błony śluzowej jamy ustnej, jest możliwe między innymi po weryfikacji histopatologicznej. Dobór od- 959

9 M. Trąbska-Świstelnicka i in. Czas. Stomatol., powiedniej metody oraz właściwe postępowanie umożliwiają uzyskanie jak najdokładniejszego wyniku. Pomimo rozwoju technik molekularnych, biopsja nacięciowa pozostaje nadal złotym standardem w postępowaniu diagnostycznym. Każdy praktykujący stomatolog powinien umieć wykonać biopsję w prostych sytuacjach klinicznych oraz znać wskazania do tego typu badań. Należy pamiętać, że w przypadku zamian podejrzewanych o nowotworowe, nieprawidłowe pobranie materiału do oceny histopatologicznej może narazić w sposób poważny życie pacjenta. W tych sytuacjach bezwzględnie należy przekazać pacjenta pod opiekę specjalisty chirurga, który w sposób kompetentny poprowadzi dalszą diagnostykę i leczenie. Piśmiennictwo 1. Bommer K K, Ramzy I, Mody D: Fine-needle aspiration biopsy in the diagnosis and management of bone lesions: a study of 450 cases. Cancer 1997, 81, 3: Christian D C: Computer-assisted analysis of oral brush biopsies at an oral cancer screening program. J Am Dent Assoc 2002, 133, 3: Epstein J B, Gorsky M, Fischer D, Gupta A, Epstein M, Elad S: A survey of the current approaches to diagnosis and management of oral premalignant lesions. J Am Dent Assoc 2007, 138, 12: Epstein J B, Zhang L, Rosin M: Advances in the diagnosis of oral premalignant and malignant lesions. J Can Dent Assoc 2002, 68, 10: Fisher E G: To fix or not to fix: Michel s is the solution. International J Surg Pathology 2006, 14, 1: Hayama F H, Motta A C, Silva Ade P, Migliari D A: Liquid-based preparations versus conventional cytology: specimen adequacy and diagnostic agreement in oral lesions. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2005, 10, 2: Jankowski Z, Pleśniak D: Uwagi dotyczące badania histopatologicznego w medycynie sądowej znaczenie i wskazania oraz podstawowe zasady zabezpieczania narządów. Arch Med Sąd Krym 2007, 57, 3: Khoo S P: Oral Biopsy in Dental Practice. The Pathologist s perspective. Annals Dent Univ Malaya 1995, 2, 1: Kozłowski W, Patera J: Zasady współpracy patologa i klinicysty w procesie diagnostyki czerniaka. Wspólczesna Onkologia 2003, 7, 8: Kozłowski W, Wojtuń S, Koktysz R, Gil J: Zasady współpracy kliniczno-patomorfologicznej w opracowywaniu materiału biologicznego. Pol Merk Lek 2007, 22, 131: Meghana S M, Ahmedmujib B R: Surgical artefacts in oral biopsy specimens: Punch biopsy compared to conventional scalpel biopsy. J Oral Maxillo Facial Pathology 2007, 11, 1: Mehrotra R, Gupta A, Singh M, Ibrahim R: Application of cytology and molecular biology in diagnosing premalignant or malignant oral lesions. Mol Cancer 2006, 23, 5: Mota-Ramírez A, Silvestre F J, Simó J M: Oral Biopsy in dental practice. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2007, 1, 12, 7: Oliver R J, Sloan P, Pemberton M N: Oral biopsies: methods and applications. Br Dent J 2004, 27, 196, 6: Patton L L, Epstein J B, Kerr A R: Adjunctive techniques for oral cancer examination and lesion diagnosis: a systematic review of the literature. J Am Dent Assoc 2008, 139, 7: Poh C F, Ng S, Berean K W, Williams P M, Rosin M P, Zhang L: Biopsy and histopathologic diagnosis of oral premalignant and malignant lesions. J Can Dent Assoc 2008, 74, 3: Sack M J, Weber R S, Weinstein G S, Chalian 960

10 2009, 62, 12 Biopsja w chorobach jamy ustnej A A, Nisenbaum H L, Yousem D M: Imageguided fine-needle aspiration of the head and neck: five years experience.arch Otolaryngol Head Neck Surg 1998, 124, 10: Saleh H A, Clayman L, Masri H: Fine needle aspiration biopsy of intraoral and oropharyngeal mass lesions. Cytojournal 2008, 28, 5: Sciubba J J: Improving detection of precancerous and cancerous oral lesions. Computerassisted analysis of the oral brush biopsy. U.S. Collaborative OralCDx Study Group. J Am Dent Assoc 1999, 130, 10: Sciubba J J: Improving detection of precancerous and cancerous oral lesions. JADA, 1999, 130: Serpell J W, Fish S H, Fisher C, Thomas J M: The diagnosis of soft tissue tumours. Ann R Coll Surg Engl 1992, 74, 4: Trullenque-Eriksson A, Muñoz-Corcuera M, Campo-Trapero J, Cano-Sánchez J, Bascones-Martínez A: Analysis of new diagnostic methods in suspicious lesions of the oral mucosa. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2009, 1, 14, 5: Wakely P E Jr, Kneisl J S: Soft tissue aspiration cytopathology. Cancer 2000, 25, 90, 5: Otrzymano: dnia 5.X.2009 r. Adres: Szczecin, Al. Powstańców Wklp.72 Tel.: marlenka271@wp.pl 961