Medycyna regeneracyjna w stomatologii ząb z próbówki stan zaawansowania badań nad uzyskaniem żywych zębów zastępczych

Transkrypt

1 Czas. Stomatol., 2010, 63, 12, Polish Dental Society Medycyna regeneracyjna w stomatologii ząb z próbówki stan zaawansowania badań nad uzyskaniem żywych zębów zastępczych Regenerative medicine in dentistry a test-tube tooth current state of research on vital substitute teeth (bioteeth) Ewa Olender 1, Artur Kamiński 1, 2, Izabela Uhrynowska-Tyszkiewicz 1, Hubert Wanyura 2 1 Z Zakładu Transplantologii i Centralnego Banku Tkanek WUM, Kierownik: dr hab. med. A. Kamiński 2 Z Kliniki Chirurgii Czaszkowo-Szczękowo-Twarzowej WUM, Kierownik: prof. dr hab. med. H. Wanyura Summary Introduction: Reconstruction and regeneration of tissues through the use of patient s own cells and the induction of the autoregenerative potential are elements of a new approach towards medical treatment the regenerative medicine. This kind of treatment is already practised in maxillofacial and oral surgery. Regenerative medicine and biology also create interesting prospects for dentistry: to create functional vital substitute teeth by means of in-vitro technique. It is a potential alternative to contemporary methods of missing tooth replacement. Aim of the study: To present the assumptions, research foundations and trends in the field of biotooth development. Conclusions: Research concerning biotooth is being carried out in many centres. Two main trends can be distinguished: the first one originating in tissue engineering and the second one based on developmental biology and embryology. The basic difference between these two approaches can be described as follows: the engineering-related approach aims at constructing a tooth with the use of biosubstitute material scaffolds, while embryology/developmental biology-related approach aims at creating conditions capable of triggering natural mechanisms of tooth development. Clinical application is not to be expected soon and will require broadening of the knowledge of many mechanisms involved in tooth biology. KEYWORDS: regenerative medicine, cell culture, biotooth Streszczenie Wstęp: wykorzystywanie potencjału autoregeneracji w celu odtwarzania i zastępowania tkanek z zastosowaniem własnych komórek pacjenta stanowi element nowego podejścia do leczenia medycyny regeneracyjnej. Tego typu postępowanie terapeutyczne jest już stosowane w chirurgii szczękowo-twarzowej oraz chirurgii stomatologicznej. Medycyna i biologia regeneracyjna stwarzają interesujące perspektywy także w stomatologii: możliwość uzyskania funkcjonalnych żywych zębów metodami in vitro, potencjalnej alternatywy do współczesnych metod uzupełniania braków uzębienia. Cel pracy: niniejszy artykuł przedstawia główne założenia, podstawy doświadczalne oraz kierunki badań w dziedzinie biologicznego uzyskiwania zęba zastępczego. Podsumowanie: prace nad uzyskaniem biologicznego zęba zastępczego prowadzone są w wielu ośrodkach i można w nich wyróżnić dwa główne nurty: wywodzący się z inżynierii tkankowej oraz opierający się na biologii rozwoju i embriologii. Podstawową różnicę między obu podejściami można opisać następująco: w podejściu inżynieryjnym dąży się do skonstruowania zęba z wykorzystaniem rusztowań z materiałów biozastępczych, zaś w podejściu biologicznym/embrionalnym do stworzenia warunków uruchamiających naturalne mechanizmy rozwoju zęba. Perspektywa zastosowań klinicznych jest jeszcze odległa i wymagać będzie pogłębienia wiedzy na temat wielu mechanizmów biologii zęba. HASŁA INDEKSOWE: medycyna regeneracyjna, hodowle komórkowe, biologiczny ząb zastępczy 739

2 E. Olender i in. Czas. Stomatol., Wprowadzenie Substytucja utraconych zębów ma długą historię już starożytni Etruskowie, Egipcjanie, Rzymianie oraz Majowie praktykowali różne jej formy z zastosowaniem takich materiałów jak: muszle, żelazo, kości zwierzęce [24]. Teoretycznie najlepszym substytutem byłyby zęby naturalne uzyskane z własnego materiału biologicznego pacjenta, bezpośrednio w jego docelowej lokalizacji. Powyższa koncepcja, choć wydawała się przez wiele lat niemożliwa do zrealizowania, nie była jednak pozbawiona racjonalnych przesłanek: naturalne rozwiązania spotykane w świecie zwierząt świadczą o istnieniu wielu wariantów wymiany i odnowy uzębienia oraz o ogromnym potencjale regeneracyjnym organizmu, w tym o możliwości odtwarzania nie tylko zębów, ale także żuchwy wraz z uzębieniem. Argument podnoszący różnice mechanizmów biologicznych i związane z nimi nieprzekraczalne bariery traci swoją aktualność wobec faktu, że w warunkach eksperymentalnych udało się wyindukować powstanie zębów u ptaków, gromady zwierząt, która w warunkach naturalnych uzębienia nie ma. Znaczny postęp, jaki dokonał się w poznaniu procesu rozwoju zęba, embriologii, biologii komórek macierzystych, a także w technikach hodowli komórkowej i iżynierii tkankowej, pozwala postrzegać odtwarzanie czynnościowych żywych zębów zębów z hodowli jako realną przyszłą alternatywę do współczesnych metod uzupełniania braków uzębienia [22, 23]. Wykorzystywanie autoregeneracji z zastosowaniem własnych tkanek i komórek pacjenta ma już obecnie miejsce np. w chirurgii szczękowo-twarzowej oraz chirurgii stomatologicznej i stanowi element nowego podejścia do leczenia medycyny regeneracyjnej. Prace nad uzyskaniem biologicznego zęba zastępczego prowadzone są w wielu ośrodkach badawczych, także niepublicznych. Autorytety jak profesor Paul Sharp z King s College London wyrażają optymistyczne opinie na temat rysujących się perspektyw. Cel pracy Celem pracy było opisanie głównych założeń, podstaw doświadczeń oraz kierunków badań w dziedzinie uzyskiwania biologicznego zęba zastępczego. Metodyka prób uzyskiwania biologicznego zęba zastępczego Wytwarzanie żywych zębów zastępczych będzie w mniejszym lub większym stopniu opierać się na naturalnych mechanizmach biologicznych rozwoju zęba. Zależność ta jest bardzo wyraźna zwłaszcza w przypadku podejścia biologicznego, które zakłada reprodukcję procesu embrionalnego. Jednak również tradycyjna inżynieria tkankowa, w której podstawę stanowi wykorzystanie materiałów biozastępczych, obok zastosowania odpowiedniej, biokompatybilnej matrycy, musi, uwzględniać naturę rozwoju zęba i dokonać wyboru właściwego składnika biologicznego komórek oraz uzyskać kontrolę nad ich namnażaniem i różnicowaniem. Prowadzi się obecnie badania nad wykorzystaniem do tego celu: komórek macierzystych miazgi zęba (ang. Dental Pulp Stem Cells DPSC), komórek macierzystych pozyskanych z zębów mlecznych (ang. Stem cells from Human Exfoliated Deciduous teeth SHED), komórek macierzystych woreczka zębowego (ang. Dental Follicle Stem Cells DFSC), komórek macierzystych wierzchołkowej części brodawki zębowej (ang. Stem Cells of the Apical part of the Papilla SCAP), komórek macierzystych więzadła przyzębnego (ang. 740

3 2010, 63, 12 Ząb z próbówki Periodontal Ligament Stem Cells PDLSC) oraz komórek macierzystych szpiku kostnego (ang. Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells BMSC) [12, 23]. Sterowanie procesem wzrostu będzie skuteczniejsze dzięki znajomości i zastosowaniu czynników oddziałujących w procesie naturalnym: związków z grupy zwanej czynnikami wzrostu oraz z grupy czynników transkrypcyjnych (uaktywniających transkrypcję genów, czyli stymulujących w efekcie syntezę różnych białek). Podstawowe znaczenie mają: białka morfogenetyczne kości (ang. Bone Morphogenetic Proteins BMP), czynnik wzrostu fibroblastów (ang. Fibroblast Growing Factor FGF), białko genu sonic hedgehog SHH, białka szlaku sygnalizacyjnego Wnt oraz produkty genów Pax9, Msx1, -2, Barx1, Pitx2, Lhx-6, 7, Lef, Runx2 [22, 36]. Podstawy doświadczalne Wstępne doświadczenia dotyczące możliwości hodowli zęba polegały na obserwacji wzrostu zawiązków zębów przeszczepianych we wczesnych stadiach rozwoju. W doświadczeniach tych uzyskiwano w pełni uformowane korony i częściowo wykształcone korzenie. Pierwsze doniesienia na ten temat zostały opublikowane przez S. Glasstone już w 1936 r. [5]. W latch późniejszych podobne próby były podejmowane przez Slavkina [27] oraz Kollara [11] i Kocha [10]. Pomysł modyfikowania naturalnych zawiązków zęba powstał we wczesnych latach 50-ych XX wieku, kiedy to S. Glasstone wykazała, że obie połówki podzielonego na wczesnym etapie rozwoju zawiązka zęba podejmują dalszy rozwój i ostatecznie przekształcają się w zęby o prawidłowej wielkości. Doświadczenie to zademonstrowało plastyczność i zdolność do samoodnowy zarodkowych zawiązków zęba, a tym samym możliwość manipulowania zawiązkami bez szkody dla ich czynności [6]. Innym zjawiskiem, które legło u podstaw koncepcji tworzenia biologicznych substytutów zęba, jest naturalna zdolność komórek wyizolowanych z tkanek do spontanicznej reagregacji i tworzenia tkankopodobnych struktur obserwowana początkowo na komórkach organizmów nizszych. W latach 60-ych XX w. wykazano, że również komórki zarodkowe kręgowców spontanicznie reagregują i są w stanie odtworzyć prawidłowy topograficznie układ charakterystyczny dla danego narządu [33]. Przykładem zdolności do reagregacji, który bezpośrednio przemawiał za możliwością realizacji hodowli zęba z zawiązków, było odtworzenie układu epitelialno-mezenchymalnego z rozdrobnionych tkanek zawiązka wszczepionego w błonę kosmówkowo-owodniową zarodka kurzego, a następnie uzyskanie z tak odtworzonej struktury po wszczepieniu zwierzęciu-biorcy zawiązka zęba [15]. Kolejnym ważnym etapem formułowania podstaw doświadczalnych i teoretycznych hodowli zęba było prowadzenie tzw. eksperymentów rekombinacyjnych, które polegały na odpreparowywaniu składnika epitelialnego bądź mezenchymalnego zawiązka i zastępowania go inną tkanką, a następnie obserwowaniu wpływu takiej modyfikacji na rozwój zęba. [35]. Doświadczenia te wykazały kluczową rolę nabłonka jamy ustnej w indukcji rozwoju zęba oraz uzależnienie dalszego rozwoju zęba od wzajemnych oddziaływań między nabłonkiem jamy ustnej a mezenchymą. Kamieniem milowym w rozwoju medycyny było przedstawienie pod koniec lat osiemdziesiątych XX wieku przez transplantologa J. Vacantiego i chemika R. Langera koncepcji odtwarzania narządów w warunkach in vitro poprzez hodowlę komórek tych narządów na biodegradowalnych rusztowaniach [2]. Sukcesy w rekonstruowaniu fragmentów wątroby doprowadzi- 741

4 E. Olender i in. Czas. Stomatol., ły do upowszechnienia tej metody i podjęcia prób odtwarzania innych narządów, np.: mięśnia sercowego, jelita, tchawicy, a także zęba (żywy ząb jest narządem, składa się bowiem z tkanek różnych typów, które spełniają określone czynności). Główne założenia i kierunki badań współczesnych Zasadniczym celem jest wypracowanie sposobu wytwarzania/indukowania powstawania żywego zęba, który mógłby zastąpić ząb naturalny utracony przez pacjenta. Przewaga zęba żywego nad substytutem zęba polega na jego możliwościach adaptacyjnych i trwałości. Żywy oznacza obecność składnika komórkowego. Obecnie wyróżnić można dwa główne nurty w poszukiwaniu sposobu realizacji powyższego celu: nurt wywodzący się z inżynierii tkankowej oraz nurt opierający się na biologii rozwoju i embriologii [19, 26]. Inżynieria tkankowa w celu odtwarzania tkanek z definicji wykorzystuje komórki, czynniki wzrostu oraz, co jest charakterystyczne dla tego nurtu, rozmaite materiały, z których wykonuje się rusztowania nadające kształt przyszłemu zębowi i na które wysiewa się w warunkach in vitro komórki. W podejściu opierającym się na biologii rozwoju nie stosuje się rusztowań dla komórek, nacisk położony jest na próbę odtworzania procesów embrionalnych (głównie oddziaływań epitelialno-mezenchymalnych). Podstawową różnicę między obu podejściami można opisać nastepująco: w podejściu inżynieryjnym dąży się do skonstruowania zęba, w podejściu biologicznym/ embrionalnym do stworzenia warunków uruchamiających naturalne mechanizmy rozwoju zęba. Teoretycznie istnieją cztery drogi uzyskania biologicznego zęba zastępczego: 1) skonstruowanie zęba z użyciem rusztowań i komórek od razu w całości i w postaci dojrzałej, 2) skonstruowanie zęba z użyciem rusztowań, komórek i czynników wzrostu w postaci niedojrzałej dalszy rozwój następowałby w warunkach hodowli lub już w organizmie biorcy, 3) indukowanie powstawania zęba z odpowiednio dobranych komórek poprzez odtworzenie naturalnych warunków powstawania zawiązka zęba, w warunkach poza organizmem lub w organizmie biorcy, 4) indukcja powstania trzeciej i kolejnych generacji zębów w szczęce/żuchwie pacjenta poprzez manipulacje genetyczne lub zastosowanie odpowiednich czynników stymulujących (czynników wzrostu itp.) [19, 26]. Obecnie realizowane są próby głównie na drodze drugiej i trzeciej. Konstruowanie zastępczego żywego zęba wyłącznie w warunkach in vitro oraz indukcja trzeciej generacji zębów in vivo dwie skrajne koncepcje uzyskania żywych zębów zastępczych pozostają na razie w sferze rozważań i badań wstępnych. W praktyce prowadzi się intensywne prace nad trzecią drogą, która łączy w sobie metodykę inżynierii tkankowej oraz wykorzystanie mechanizmów biologii rozwoju. Ogólnie rzecz biorąc, celem jest wytworzenie w warunkach laboratoryjnych konstruktów o funkcji zawiązka zęba, który po wszczepieniu dawcy kontynuowałby rozwój, aż do uformowania dojrzałego, wyrzniętego zęba. Próby idą w dwóch zasadniczych kierunkach: tworzenia konglomeratu komórek zdolnych do różnicowania w komórki zęba i tworzenia jego tkanek z zastosowaniem rusztowania-podpory dla komórek [19, 26]. Podejście inżynieryjne z zastosowaniem rusztowań Ze względu na niewielki rozmiar ząb wydaje się być idealnym narządem-kandydatem do odtworzenia w warunkach laboratoryjnych. 742

5 2010, 63, 12 Ząb z próbówki Pierwsze podejście, zbliżone do tradycyjnej inżynierii tkankowej, zakłada możliwość skonstruowania zęba, o strukturze trójwymiarowej uformowanej poprzez zastosowane rusztowania o odpowiednim kształcie. Na rusztowanie wysiewane są odpowiednio dobrane komórki, które mnożąc się zasiedlają stopniowo całe rusztowanie. Zazwyczaj materiał, z którego wykonane są rusztowania, jest biodegradowalny, a więc z czasem zanika, a jego miejsce zajmuje macierz wytworzona przez komórki. Macierz utrzymuje wyznaczony przez rusztowanie pierwotny kształt całej struktury. Ponieważ komórki i tkanki cechuje zdolność do reagregacji, przyjmuje się również, że zmieszanie odpowiednich typów komórek w odpowiednich proporcjach i umieszczenie ich na matrycy odwzorowujacej naturalne, trójwymiarowe środowisko powinno doprowadzić do odbudowy tkanki czy narządu, z której dane komórki pochodzą [2]. Podejście to budziło duże nadzieje ze względu na zakładaną możliwość łatwego modelowania kształtu hodowanych zębów. W praktyce, w warunkach eksperymentalnych istotnie dokonano postępu w zakresie kontroli kształtu żywego dzięki zastosowaniu odpowiednio uformowanych rusztowań z gąbek kolagenowych i sekwencyjnemu wysiewaniu komórek mezenchymy zębotwórczej w bezpośrednim kontakcie z nabłonkiem zębotwórczym. Jednak efekty nie są w pełni zadawalające [7]. Robey [25] zaproponował modyfikację metody, według której każdą ze składowych zęba należy odtwarzać indywidualnie: koronę z materiału syntetycznego o właściwościach szkliwa, wypełnioną biomateriałem HA/TCP (hydroksyapatyt/fosforan wapnia) z zawieszonymi w nim komórkami macierzystymi, zaś korzeń z wykorzystaniem komórek macierzystych więzadła przyzębnego PDLSC. Konstrukt taki byłby wszczepiany np. do mięśnia, jako naturalnego inkubatora. Stamtąd, w odpowiednim momencie byłby przeszczepiany do jamy ustnej. Autorzy koncepcji nie opisują jednak szczegółowo sposobu odtworzenia zębiny korony i korzenia. Opisana metoda wykorzystywałaby nieresorbowalny materiał syntetyczny nie byłby to więc w całości ząb biologiczny. Byłby to zatem żywy implant. Zaletą metody jest pełna kontrola nad kształtowaniem korony oraz możliwość zautomatyzowania procesu wytwarzania zębów i tym samym prowadzenia procesu na dużą skalę. Wadą metody jest niemożność ominięcia etapu inkubacji w tkankach biorcy. Zespół P.C.Yelick zaproponował odmienną metodę i wykonał jej eksperymentalną weryfikację [3]. Z trzecich niewyrzniętych zębów trzonowych świń (sześciomiesięcznych) i szczurów (czterodniowych) pozyskiwano tkanki zawiązka zęba w późnym stadium pączka. Tkanki trawiono enzymatycznie w celu uwolnienia komórek. Komórki następnie namnażano i wysiewano na biodegradowalne rusztowania polimerowe (z poliglikolu, polimleczanu, polimleczano-co-glikolu) uformowane na kształt zębów siecznych i trzonowych. Rusztowania dla komórek świńskich miały wymiary 1 x 0,5 x 0,5 cm, dla szczurzych 1 x 5 x 5 mm. Tak przygotowane konstrukty wszczepiano chirurgicznie szczurom w tkankę sieci i pozostawiano na tygodni. Po tym czasie wszczepy eksplantowano i poddawano analizie histologicznej. Analiza ta potwierdziła obecność drobnych struktur zębopodobnych o wymiarach od 1 do 2 mm, wykazujących cechy kształtu koron zębów trzonowych. Jednak we wszystkich przypadkach kształt ten nie odwzorowywał kształtu użytego rusztowania. Uzyskane twory były też znacznie mniejsze, aniżeli wszczepione rusztowania. W powstałych strukturach obecne były ameloblasty i odontoblasty. Nie stwierdzono 743

6 E. Olender i in. Czas. Stomatol., wykształcenia się korzenia, ani tkanki kostnej, której tworzenie towarzyszy powstawaniu zęba w warunkach naturalnych. Wyniki powyższego doświadczenia interpretuje się raczej jako dowód na reorganizowanie się użytych elementów epitelialnych i mezenchymalnych, nie zaś na formowanie sie tkanek de novo. Porównywalne wyniki uzyskano w doświadczeniu z komórkami wyizolowanymi z pączka zęba trzonowego czterodniowego szczura. W odróżnieniu od poprzedniego doświadczenia, komórki przed wysianiem były utrzymywane w hodowli in vitro przez 6 dni. Po tym czasie zostaly wysiane na rusztowanie i wraz z nim wszczepione szczurom-biorcom. Implanty pozostawiono na 12 tygodni. W efekcie doświadczenia otrzymano drobne skupiska chaotycznie zorganizowanej tkanki zębopodobnej, która nie osiągnęła rozmiarów rusztowania [3]. W 2008 r. zespół P.C. Yelick wykonał doświadczenia z zastosowaniem rusztowania obsianego w jednej części komórkami pochodzącymi z zawiązka zęba w stadium pączka, w drugiej mezenchymalnymi komórkami macierzystymi szpiku kostnego. Konstrukty wszczepiano do żuchwy zwierzęcia-dawcy komórek. Efekty oceniano po 12 i 20 tygodniach. Stwierdzono obecność małych zębopodobnych tworów składających się z zębiny, szkliwa, miazgi, cementu, ozębnej, otoczonych zregenerowaną tkanką kostną. Nie zaobserwowano struktur korzenia [4]. Niepowodzenie w uzyskaniu jakichkolwiek struktur korzeniopodobnych przełamał zespół Sonoyamy w 2006 r. Na rusztowania z HA/ TCP ukształtowane na kształt korzenia wysiewano komórki macierzyste wywodzące się z brodawki wierzchołkowej (SCAP) i więzadła przyzębnego (PDLSC) świń [23], a następnie umieszczano rusztowania w zębodole poekstrakcyjnym. Analiza tomograficzna i histologiczna wykonana po 4 tygodniach i 6 miesiącach wykazała częściową regenerację korzenia (odtworzona została zębina) oraz ozębnej [29]. Nie w pełni satysfakcjonujące efekty metod inżynierii tkankowej tłumaczy się negatywnym wpływem samego rusztowania. Rusztowanie stanowi barierę dla odontogennych oddziaływań epitelialno-mezenchymalnych oraz dla przepływu informacji pozycyjnej (gradientu morfogenów) w kształtujacym się zębie. Poza tym kwaśne produkty degradacji tworzywa użytego do budowy rusztowania wpływają niekorzystnie na mikrośrodowisko tworzącego się zęba [8]. Podejście biologiczne Drugie podejście, bez użycia rusztowania, realizuje strategię w większym stopniu opartą na naśladowaniu naturalnych procesów powstawania zębów, obserwowanych w rozwoju zarodkowym. Metoda ta wymaga pełniejszego zrozumienia mechanizmów kontroli wczesnych etapów wykształcania się zęba. Wiodącym ośrodkiem, który podjął ten kierunek badań, jest Katedra Rozwoju Twarzoczaszki w King s College w Londynie. Grupa badawcza skupia sie wokół założyciela i kierownika Katedry profesora P. T. Sharpe a. Zespół ten prowadzi doświadczenia głównie na komórkach mysich, zarodkowych, jak i osobników dorosłych. Osią koncepcji jest wykorzystanie naturalnego potencjału oddziaływań epitelialno-mezenchymalnych, zwłaszcza zdolności komórek nabłonka jamy ustnej do indukcji rozwoju zęba [17, 19]. Ich doświadczenia polegały na wytworzeniu konglomeratu komórek mezenchymalnych nie pochodzących z zawiązka zęba, które pokrywano warstwą komórek embrionalnych komórek nabłonka jamy gębowej (komórki mezenchymalne należały do jednego z trzech pierwotnie nieodontogennych typów 744

7 2010, 63, 12 Ząb z próbówki komórek: mezenchymalnych zarodkowych komórek macierzystych, nerwowych komórek macierzystych, komórek szpiku osobnika dorosłego), utrzymaniu konglomeratu w warunkach hodowli przez 2-3 dni, a następnie wszczepieniu go podtorebkowo do nerki myszy i oceny jego struktury po dniach. Po tym czasie stwierdzono wyraźne formowanie struktur korony zęba i tkanki kostnej w każdym przypadku, niezależnie od rodzaju zastosowanych komórek mezenchymalnych. Doniosłość tych wyników tkwi w fakcie, że okazało się możliwym zastosowanie jako komponentu mezenchymalnego komórek innych niż zarodkowych, czy wywodzących się z niewyrzniętych zębów [21]. W 2007 roku grupa badaczy skupiona wokół T. Tsuji z Tokyo University zaproponowała metodę także bez użycia rusztowania, w której konglomerat komórek zatapiany był w kropli żelu kolagenowego, a następnie inkubowany in vitro bądź wszczepiany podtorebkowo do nerki. W doświadczeniach z użyciem komórek epitelialnych i mezenchymalnych wyizolowanych z mysiego zawiązka siekacza uzyskano każdorazowo zawiązki zęba (zarówno w wariancie in vitro, jak i in vivo). Zawiązki te wszczepiano dorosłej myszy do zębodołu po ekstrakcji siekacza. Obserwowano normalny rozwój korony siekacza z obecnością szkliwa, miazgi, naczyń krwionośnych i nerwów, a także początki wytwarzania struktur korzenia. Nie wiadomo jednak, czy wytworzony ząb jest w stanie się wyrznąć [20]. Poza badaniami dotyczącymi uzyskania samego zęba prowadzi się także prace nad możliwością pełnego zasymilowania zęba zastępczego ze środowiskiem jamy ustnej, w tym jego ukrwieniem i unerwieniem [14, 18]. Odniesienia do biologii kręgowców Uzyskiwanie żywego zęba drogą hodowli komórkowej będzie polegać, przynajmniej w części, na wykorzystaniu i naśladowaniu procesów naturalnych. Poznanie mechanizmów sterujących tymi procesami jest kluczowym zadaniem. Zrozumienie podstaw odmiennej biologii zęba u gatunków bardziej odległych taksonomicznie i genetycznie od człowieka może mieć także duże znaczenie. Zęby są strukturami charakterystycznymi dla kręgowców. Występują u ryb, płazów, gadów i ssaków. Prawdopodobnie wykształciły się jako przydatki skórne (podobnie jak włosy czy gruczoły potowe), które wtórnie zajęły obszar jamy gębowej i uzyskały połączenie z kością [13]. U wielu ryb spodoustych błona śluzowa jamy gębowej wysłana jest łuskami plakoidalnymi, tworami o funkcji zębów, podobnymi do tych, które pokrywają skórę. Identyczność budowy wewnętrznej zębów i łusek plakoidalnych oraz istnienie tworów pośrednich świadczy o ich pełnej homologii [30]. Stanowi to przesłankę, by poszukiwać brakującego komponentu epitelialnego niezbędnego do rozwoju zęba w nabłonku skóry. U ryb, płazów i gadów okres życia zęba jest ograniczony. Po pewnym czasie ząb wypada, a na jego miejsce wyrzyna się ząb należący do następnej generacji. Wymiana taka może trwać całe życie. U rekinów, u których wymiana zębów następuje szybko, można dostrzec na przekroju szczęki lub żuchwy kolejne zęby w różnym stopniu rozwoju. Wymiany następują niezależnie od stanu zębów w danym momencie używanych rolą wymiany zębów nie jest zastępowanie konkretnych zniszczonych zębów. Sytuacja u ssaków, a więc i ludzi, w której wymiana zębów następuje najwyżej jeden raz i nie obejmuje nigdy wszystkich zębów (difiodontyzm) nie jest zatem uniwersalnym rozwiązaniem biologicznym [30]. Być może zjawisko występowania trzeciej generacji zębów u człowieka w przypad- 745

8 E. Olender i in. Czas. Stomatol., ku mutacji genu Runx2 jest dowodem na to, że polifiodontyzm może zostać przywrócony przy zmienionej ekspresji niektórych genów. Przykładem możliwości uruchomienia uśpionych mechanizmów odontogenezy jest wywołanie rozwoju zęba w jamie gębowej kurcząt. Mimo, że ptaki utraciły uzębienie 80 milionów lat temu, prawdopodobnie jako przystosowanie do lotu, nadal jednak mają geny umożliwiające odpowiednie interakcje międzytkankowe i wykształcenie zębów. W warunkach eksperymentalnych, po przeszczepieniu do embrionu kurczęcia mysich komórek grzebienia nerwowego (prekursorów składnika epitelialnego zawiązka zęba) składnik mezenchymatyczny, wywodzący się z kurczęcia, odpowiada na stymulację przez mysi składnik epitelialny skutkując wykształceniem struktur zębopodobnych [16]. W przeciwieństwie do człowieka, u wielu kręgowców zębotwórczy składnik epitelialny jest dostępny także po wykształceniu się dojrzałych zębów. I tak, siekacz gryzoni cechuje stały wzrost. Jest to możliwe dzięki podziałom komórek epitelialnych w strukturze zwanej pętlą wierzchołkową (ang. cervical loop). Znajdują się w niej komórki macierzyste, które, dzieląc się asymetrycznie, odtwarzają komórkę macierzystą i komórkę ukierunkowaną na różnicowanie do ameloblastów. Ta ostatnia przemieszcza się ku brzegowi siecznemu zęba, gdzie przekształca się w czynną komórkę szkliwotwórczą [31]. Jak wspomniano wyżej, bierze się pod uwagę tworzenie konstruktów-chimer, które zawierać będą obok komórek ludzkich, odpowiadających składnikowi mezenchymatycznemu, komórki pętli wierzchołkowej siekaczy gryzoni. Obecność stale odnawiającego się składnika epitelialnego, zawierającego epitelialne komórki macierzyste, umożliwia również wielokrotną wymian zębów u ryb wykazano to m.in. na przykładzie zębów gatunku Danio pręgowane (ang. Zebrafish). Stwierdzono znaczne podobieństwa między rozwojem zęba następczego a odnową krypt jelitowych i morfogenezą mieszka włosowego. Interesujące jest również, że wzorzec ekspresji genów dla zębów pierwszej generacji jest inny, aniżeli dla kolejnych generacji [9]. Kwestie do rozwiązania. Perspektywy Bioinżynieria zębów w porównaniu do bioinżynierii innych narządów uczyniła bardzo duży postęp w stosunkowo krótkim czasie. Wykazano bezsprzecznie, że: po pierwsze, można wytworzyć struktury korony zęba stosując komórki zawiązka zęba i rusztowania, po drugie, można odtworzyć koronę zęba bez użycia rusztowania, wykorzystując embrionalny nabłonek jamy ustnej i macierzyste komórki mezenchymatyczne szpiku, po trzecie, mezenchymatyczne komórki macierzyste szpiku mogą różnicować się w kierunku komórek odontogennych, po czwarte, komórki ze zdysocjowanych tkanek zawiązka zęba zawieszone w kolagenie mogą rozwinąć się w prawidłowy zawiązek zęba, ukształtować prawidłową koronę i korzeń po wszczepieniu ortotopowym u dorosłego biorcy [28, 35]. Wykonane doświadczenia pozwoliły także zidentyfikować ograniczenia, z którymi nauka i biotechnologia muszą się zmierzyć: zawodność metod tradycyjnej inżynierii tkankowej, brak zadawalającego substytutu embrionalnych komórek epitelialnych, niezbędnych do rozwoju zęba, fragmentaryczna znajomość mechanizmów molekularnych towarzyszących wykształcaniu sie zęba, odrzucanie przeszczepu (jeśli z różnych względów stosowany w hodowlii materiał komórkowy będzie allo bądź ksenogeniczny), trudności w kontrolowaniu kształtu, wielkości i koloru wytwarzanych zębów. Poza tym, do rozwiązania pozostają kwestie: asymilacji zęba uzyskanego in vitro ze 746

9 2010, 63, 12 Ząb z próbówki środowiskiem, skrócenia czasu rozwoju zęba do postaci dojrzałej (miesiące zamiast lat), indukcji wyrzynania się zęba zastępczego, uzyskiwania komórek zdolnych do różnicowania i efektywnego namnażania od pacjentów w starszym wieku [28, 35]. Podsumowanie W świetle powyższego, prognozy przewidujące wypracowanie skutecznej metodologii uzyskiwania biologicznych zębów zastępczych w ciągu najbliższych lat mogą okazać się nadmiernie optymistyczne. Piśmiennictwo 1. Chai Y, Slavkin HC: Prospects for tooth regeneration in the 21st century: a perspective. Microsc Res Tech 2003, 60 (5): Cima L G, Vacanti J P, Vacanti C, Inqber D, Mooney D, Langer R: Tissue engineering by cell transplantation using degradable polymer substrates. J Biomech Eng 1991, 113 (2): Duailibi M T, Duailibi S E, Young C S, Barlett J D, Vacanti I P, Yelick P C: Bioengineered teeth from cultured rat tooth bud cells. J Dent Res 2004, 83: Duailibi S E, Duailibi M T, Zhang W, Asrican R, Vacant I P, Yelick P: Bioengineered dental tissues grown in the rat jaw. J Dent Res 2008, 87: Glasstone-Hughes S: The development of tooth germs in vitro. J Anat 1936, 70: Glasstone-Hughes S: The development of halved tooth germs; a study in experimental morphology. J Anat 1952, 86: Honda MJ, Tsuchiya S, Sumita Y, Sagara H, Ueda M:The sequential seeding of epithelial and mesenchymal cells for tissueengineered tooth regeneration. Biomaterials 2007, 28: Hu B, Nadiri A, Kuchler-Bopp S, Perrin- Schmitt F, Peters H, Lesot H: Dental epithelial histomorphogenesis in vitro. J Dent Res 2005, 84: Huysseune A: Formation of a successional dental lamina in the zebrafish (Danio rerio): support for a local control of replacement tooth initiation. Int J Dev Biol 2006, 50 (7): Koch W E: Tissue interaction during in vitro odontogenesis. W: Slavkin H C, Bavetta L A red. Developmental Aspects of Oral Biology. Academic Press Inc. New York 1972, Kollar E J, Baird G: The influence of the dental papilla on the development of tooth shape in embryonic mouse germs. J Embryo Exp Morph 1969, 21: Li ZY, Chen L, Liu L, Lin YF, Li SW, Tian WD: Odontogenic potential of bone marrow mesenchymal stem cells. J Oral Maxillofac Surg 2007, 65 (3): Lin Y, Yelick P: Dental tissue engineering. W: Atala A, Lanza R editors: Principles in Regenerative Medicin. Elsevier Luukko K, Moe K, Sijaona A, Furmanek T, Hals Kvinnsland I, Midtbø M, Kettunen P: Secondary induction and the development of tooth nerve supply. Ann Anat 2008, 190 (2): Main JH: Retention of potential to differentiate in long-term cultures of tooth germs. Science 1966, 152: Mitsiadis TA, Caton J, Cobourne M: Wakingup the sleeping beauty: recovery of the ancestral bird odontogenic program. J Exp Zool B Mol Dev Evol 2006, 306 (3): Modino SA, Sharpe PT: Tissue engineering of teeth using adult stem cells. Arch Oral Biol 2005, 50 (2): Nait Lechguer A, Küchler-Bopp S, Hu B, Haïkel Y, Lesot H:Vascularization of engineered teeth. J Dent Res 2008, 87 (12): Nakahara T, Yoshiaki I: Tooth regeneration: 747

10 E. Olender i in. Czas. Stomatol., Implications for the use of bioengineered organs in first-wave organ replacement. Human Cell 2007, 20: Nakao K, Morita R, Saji Y, Ishida K, Tomita Y, Ogawa M, Saitoh M, Tomooka Y, Tsuji T: The development of a bioengineered organ germ method. Nat Methods 2007, 4 (3): Ohazama A, Modino S A, Miletich I, Sharpe P T: Stem-cell-based tissue engineering of murine teeth. J Dent Res 2004, 83 (7): Olender E, Kamiński A, Ubrynowska- Tyszkiewicz I, Wanyura H: Aspekty histologiczne i molekularne mechanizmy kontroli naturalnego rozwoju zęba. Czas Stomatol 2010, 63, 9: Olender E, Kamiński A, Ubrynowska- Tyszkiewicz I, Wanyura H: Komórki macierzyste tkanek zęba i możliwości odtwarzania struktur zęba przegląd pismiennictwa. Czas Stomatol 2010, 63, 11: Ring ME: A thousand years of dental implants: a definitive history. Comp Cont Edu Dent 1995, 16: Robey PG: Post-natal stem cells for dental and craniofacial repair. Oral Biosci Med 2005, 2: Sartaj R, Sharpe P: Biological tooth replacement. J Anat 2006, 209: Slavkin H C, Beierle J, Bvetta L A: Odontogenesis: cel-cell interaction in vitro. Nature 1968, 217: Snead M L: Whole-tooth regeneration: it takes a village of scientists, clinicians, and patients. J Dent Educ 2008, 72 (8): Sonoyama W, Liu Y, Fang D, Yamaza T, Seo BM, Zhang C, Liu H, Gronthos S, Wang CY: Mesenchymal stem cell-mediated functional tooth regeneration in swine. PLoS One 2006, 20, 1: e Szarski W: Anatomia porównawcza kręgowców. Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa 1987, Tummers M, Thesleff I: Root or crown: a developmental choice orchestrated by the differential regulation of the epithelial stem cell niche in the tooth of two rodent species. Development 2003, 130 (6): Wang S, Shi S: Mesenchymal stem cell-mediated functional tooth regeneration in swine. PLoS 2006, 20, 1:e Weiss P, Taylor AC: Reconstitution of complete organs from single-cell suspensions of chick embryos in advanced stages of differentiation. Proc Natl Acad Sci USA 1960, 46: Yen A, Sharpe P: Stem cells and tooth tissue engineering. Cell Tissue Res : Yu J, Shi J, Jin Y: Current approaches and challenges in making a bio-tooth. Tissue Eng Part B Rev 2008, 14 (3): Zhang Y, Chen Z, Song Y, Liu C, Chen Y: Making a tooth: growth factors, transcription factors, and stem cells. Cell Research 2005, 15 (5): Adress: Warszawa, ul. Chałubińskiego 5 Tel./Fax: ewa.olender@wum.edu.pl Paper received 5 July 2010 Accepted 11 January