Tkanki zęba potencjalne źródło komórek macierzystych

Transkrypt

1 Czas. Stomatol., 2006, LIX, 6, Organ Polskiego Towarzystwa Stomatologicznego Tkanki zęba potencjalne źródło komórek macierzystych Dental tissues a potential source of stem cells Marcin Tutak 1, Justyna Drukała 2, Katarzyna Sporniak-Tutak 3 Z Zakładu Protetyki Stomatologicznej PAM w Szczecinie 1 Kierownik: dr hab. n. med. B. A. Frączak Z Pracowni Inżynierii Komórkowej i Tkankowej Zakładu Biologii Komórki Wydziału Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego 2 Kierownik: prof. dr hab. n. przyr. W. Korohoda Z Zakładu Chirurgii Stomatologicznej PAM w Szczecinie 3 Kierownik: dr hab. n. med. L. Myśliwiec Streszczenie Wprowadzenie: Komórki macierzyste są to komórki mające zdolność do samoodnawiania oraz różnicowania się w dowolną komórkę. Występuja one również w embrionalnych stadiach rozwojowych zęba jak również w miazdze dojrzałego zęba. Cel pracy: na podstawie piśmiennictwa opisano właściwości komórek macierzystych występujących w nabłonkowych i mezenchymalnych tkankach zęba. Rezydujące tam komórki mają wiele cech wspólnych z pozostałymi komórkami macierzystymi występującymi w organizmie. Mezenchymalne komórki macierzyste izolowane z miazgi dojrzałego zęba reagują na specyficzne sygnały środowiska, wybierając konkretny program różnicowania. Mogą różnicować się w odontoblasty oraz w komórki fibroblastyczne odtwarzające miazgopodobną tkankę łączną. Podsumowanie: umiejętność hodowli komórek macierzystych izolowanych z tkanek zęba stwarza możliwość prób rekonstrukcji tego narządu in vitro, jednak złożona morfologia stwarza wiele trudności w odtworzeniu wszystkich jego struktur. Summary Introduction: Stem cells are defined as cells that have the capacity to self-renew as well as the ability to generate differentiated progeny. They are also present during embryonic stages of tooth development and are retained in dental pulp of a mature tooth. Aim of the study: To review the properties of dental pulp stem cells of epithelial and mesenchymal origin on the basis of recent literature. These cells are, in many aspects, similar to the stem cells residing in other tissues. Mesenchymal stem cells isolated from dental pulp of mature teeth are able to react specifically to environmental signals, undertaking a differentiation program. Accordingly, they can differentiate into odontoblasts, fibroblastic cells regenerating pulp-like connective tissue. Conclusion: The ability to culture stem cells isolated from dental tissues offers a possibility to attempt the reconstruction of this structure in vitro, however, the morphological complexity poses difficulties in the regeneration of all of its tissues. HASŁA INDEKSOWE: komórki macierzyste, inżynieria tkankowa KEYWORDS: stem cells, tissue engineering 451

2 M. Tutak i in. Czas. Stomatol., Komórki macierzyste są to komórki mające zdolność do samoodnawiania oraz różnicowania się. Definicja ta jest bardzo uogólniona, gdyż dotyczy wielu rodzajów komórek macierzystych różniących się potencjałem proliferacyjnym. Wyróżnia się zasadniczo dwa typy komórek macierzystych: embrionalne i pochodzące z tkanek dojrzałego organizmu, tzw. komórki macierzyste somatyczne. Embrionalne komórki macierzyste występują powszechnie we wczesnych stadiach rozwojowych organizmów wielonarządowych. Z czasem, tracą one swoje zdolności do nieograniczonej proliferacji, ulegają zróżnicowaniu, tworząc wysoce wyspecjalizowane tkanki pełniące różnorodne funkcje. Po zakończeniu morfogenezy, w organizmach pozostaje pewna pula, rozproszonych, dojrzałych (somatycznych), tkankowo specyficznych komórek macierzystych. Komórki te dzielą się asymetrycznie dając początek populacji komórek zróżnicowanych, z zachowaniem stałej puli komórek macierzystych. Pula ta, odpowiedzialna jest także za odnawianie zużywających się z czasem komórek somatycznych oraz za regenerację narządów i tkanek (16). Oprócz klasycznego podziału komórek macierzystych, proponowany jest także inny podział zakładający, że w tkankach dojrzałego organizmu komórki macierzyste są znacznie bardziej prymitywne, multipotencjalne, mające zdolność do odtwarzania komórek pochodzących z poszczególnych listków zarodkowych powstających w trakcie gastrulacji. Uważa się, że właśnie na tym etapie pozostaje pewna populacja komórek, które zachowują swoją multipotencjalność i w takim stanie zróżnicowania zasiedlają w pełni zróżnicowane tkanki (11). Inna teoria zakłada, że w organizmie obecna jest heterogenna populacja ukierunkowanych tkankowo komórek macierzystych, krążących w ustroju. Komórki te wykazują ekspresję receptora CXCR4 i w warunkach fizjologicznych współzawodniczą o nisze, czyli miejsca, w których rezydują komórki macierzyste, w tkankach i narządach. Nisze takie wydzielają ważny czynnik chemotaktyczny SDF1 (ang. stroma derived factor 1), którego swoistym receptorem jest CXCR4. W warunkach stresu związanego z uszkodzeniem tkanki, komórki te są mobilizowane do krwioobiegu i na zasadzie chemotaksji trafiają do miejsc uszkodzenia (15). Mechanizmy regulujące niesymetryczne podziały somatycznych komórek macierzystych nie są w pełni poznane. Nie wiadomo, czy są one związane z ekspresją określonych genów czy też uwarunkowane są specyficznymi interakcjami pojawiającymi się w niszach, w których rezydują. Pojęcie niszy zostało wykorzystane do analizy zachowania komórek macierzystych przez Schofielda badającego wpływ mikrośrodowiska na aktywność hematopoetycznych komórek macierzystych (17). Nisza to mikrośrodowisko komórek znajdujących się w macierzy zewnątrzkomórkowej, której składniki mogą kontrolować asymetryczne podziały komórek macierzystych oraz sąsiednich komórek (21). Czynność charakterystycznego przedziału (niszy) jest regulowana przez czynniki autonomiczne, których aktywność jest modulowana sygnałami zewnętrznymi. Do regulujących czynników wewnętrznych należą białka odpowiedzialne za asymetryczny podział komórek, jądrowe czynniki kontrolujące ekspresję genów oraz modyfikacje chromosomalne. Z kolei zewnętrzne czynniki wpływające na nisze i zawarte w nich komórki macierzyste to TGFβ i WNT, integralne białka błonowe wpływające na kierunkowe interakcje między komórkami, integryny i zewnątrzkomórkowe białka macierzy. Integryny odpowiedzialne są za 452

3 2006, LIX, 6 Komórki macierzyste w tkankach zęba utrzymanie komórek w prawidłowym położeniu w tkankach, a utrata lub zmiana ekspresji integryn doprowadza do zmiany przeznaczenia komórek macierzystych (KM) rezydujących w niszy poprzez ich zróżnicowanie lub apoptozę (23). Wykazano obecność komórek macierzystych w takich narządach jak szpik kostny, siatkówka, naskórek, skóra. Obecne są także w organach o ograniczonej liczbie podziałów takich jak mózg czy wątroba (14). Źródłem somatycznych komórek macierzystych mogą być także tkanki zęba, gdzie zidentyfikowano prawdopodobne, wolno dzielące się zębowe komórki macierzyste. Rezydujące tam komórki mają wiele cech wspólnych z pozostałymi KM występującymi w organizmie. Charakteryzuje je swoista lokalizacja w tkankach, poza głównymi szlakami migracji komórek, długi cykl komórkowy oraz niewielkie rozmiary. W przypadku uszkodzenia tkanek umożliwiają ich regenerację (10). W embrionalnych stadiach rozwojowych zęba są obecne nabłonkowe i mezenchymalne KM. Pochodzą one z tkanki neuroektodermalnej. Pierwsze, przyczyniają się do rozwoju nabłonkowych struktur zęba takich jak: zewnętrznej i wewnętrznej warstwy komórek nabłonkowych, komórek gwiaździstych, warstwy pośredniej, ameloblastów i szkliwa. Drugie, dają początek brodawkom zębowym, woreczkom zawiązkowym, odontoblastom, prezębinie, cementowi, włóknom ozębnej i kości wyrostka zębodołowego. Nabłonkowe komórki macierzyste W czasie formowania zęba, korona pokryta jest nabłonkiem, który w trakcie jego wyrzynania zanika. Doskonałym modelem do analizy mechanizmów regulacji i czynności nabłonkowych KM jest siekacz myszy. Cechuje go stały wzrost, utrzymywany przez całe życie gryzonia. Zjawisko to jest związane z podziałami komórek nabłonkowych umiejscowionych w strukturze określanej jako pętla wierzchołkowa (ang. cervical loop). Badania wykazały, że obszar ten wypełniony jest komórkami gwiaździstymi, w którym nabłonkowe komórki macierzyste dzielą się asymetrycznie na dwie komórki. Pierwsza, zwana siostrzaną, niezróżnicowana, pozostaje w pętli wierzchołkowej, natomiast druga komórka przemieszcza się ku brzegowi siecznemu tworząc wraz z innymi, populacje komórek przejściowo proliferujących (ang. transit amplifying TA), dających początek ameloblastom. Kiedy rozwój korony jest już zaawansowany, dzielące się komórki pętli wierzchołkowej migrują w dwóch kierunkach kontynuując rozwój korony lub korzenia (8, 22). W początkowych stadiach rozwoju pętla wierzchołkowa jest obecna w zębach siecznych jak i pozostałych zębach. Kiedy rozwój korony jest już zaawansowany, pętla wierzchołkowa w przypadku zębów trzonowych zanika, pozostawiając zewnętrzny i wewnętrzny nabłonek, tzw. pochewkę Hertwiga, strukturę obecną aż do uzyskania prawidłowej długości korzenia, która następnie jest podzielona i zastąpiona przez prekursory cementoblastów zwane resztkowymi nabłonkowymi komórkami Melaasseza. Ograniczone zdolności proliferacyjne obu struktur wskazują na brak KM (9). Mezenchymalne komórki macierzyste W przeciwieństwie do struktur nabłonkowych zęba, tkanki mezenchymalne cechują się zdolnością do odnawiania i odtwarzania utraconych tkanek. Jest to możliwe dzięki obecności odontoblastów i cementoblastów w dojrzałych zębach. Komórki te wykazują zwiększoną 453

4 M. Tutak i in. Czas. Stomatol., aktywność w przypadku zadziałania czynników uszkadzających, takich jak próchnica czy starcie patologiczne. W wyniku procesu naprawczego powstaje słabo zorganizowana zębina reparacyjna. Przypuszcza się, że źródłem odontoblastów mogą być komórki macierzyste, których dokładna lokalizacja w dojrzałej miazdze zębowej nie jest jednak jeszcze znana. Stwierdzono, że komórki macierzyste wyizolowane z miazgi wyrzniętych, dojrzałych zębów zdolne są do tworzenia zębiny (19). Po wszczepieniu podskórnie myszom hodowanych in vitro komórek macierzystych miazgi zęba stwierdzono formowanie się pojedynczych, kulistych ognisk zębiny otaczających komórki miazgi infiltrowane przez naczynia krwionośne. Stwierdzono również obecność białek markerowych charakterystycznych dla macierzy zębinowej (sjaloproteiny oraz fosfoproteiny zębinowej) (7). Mimo, że podobne czynniki regulują różnicowanie komórek macierzystych pochodzących z miazgi zęba i z podścieliska szpiku kostnego, to populacje te różnią się istotnie pod względem zdolności proliferacyjnych in vitro i zdolności wytwarzania różnych typów tkanek (6). Komórki macierzyste izolowane z miazgi są zdolne do samoodnawiania się po przeszczepieniu do organizmu biorcy. Reagują one na specyficzne sygnały środowiska wybierając konkretny program różnicowania z jednoczesnym odtwarzaniem puli komórek macierzystych. Wykazano, że komórki te mogą różnicować się nie tylko w odontoblasty, lecz także w komórki fibroblastyczne odtwarzające miazgopodobną tkankę łączną nawet 5 miesięcy po przeszczepie. O multipotencjalnym charakterze komórek macierzystych pochodzenia zębowego świadczą badania in vitro, w których udało się sprowokować różnicowanie w kierunku adipocytów, potwierdzone obecnością dwóch specyficznych dla tych komórek markerów, PPARγ2 i lipazy liporoteinowej. Wykazano również, że mogą one różnicować w kierunku komórek nerwowych (6), o czym świadczy ekspresja na ich powierzchni specyficznych markerów neuronalnych (nestyny i GFAP ang. glial fibrillary acid protein). Populacja komórek macierzystych przyzębia Przypuszcza się, że nisza komórek macierzystych przyzębia jest zlokalizowana w pobliżu naczyń krwionośnych, a obecne w niej komórki mają typowe cechy komórek macierzystych, czyli mały rozmiar i wydłużony cykl podziałowy. Komórki progenitorowe ozębnej wykazują zdolność do różnicowania w fibroblasty, osteocyty i cementocyty utrzymując prawidłową szerokość i integralność przestrzeni ozębnej. Obecnie sądzi się, że komórki macierzyste przyzębia wywodzą się z niewielkiej populacji KM multipotencjalnych lub z licznych populacji komórek progenitorowych, które występują w otoczeniu zęba lub na skutek uszkodzenia migrują w jego obszar (5). Włóknom ozębnej przypisuje się istotne właściwości regeneracyjne ze względu na to, że kolagen w nich zawarty charakteryzuje się wyjątkowo małą stabilnością, co pozwala na szybką przebudowę tej bardzo dynamicznej tkanki. Stwierdzono, że w odpowiedzi na uszkodzenie pięciokrotnie wzrasta aktywność proliferacyjna komórek ozębnej (20). Możliwości wykorzystania KM w regeneracji zęba Wykorzystanie komórek macierzystych do regeneracji utraconych struktur kostnych i zębów staje się z każdym dniem coraz bardziej 454

5 2006, LIX, 6 Komórki macierzyste w tkankach zęba prawdopodobne. Optymistyczne wizje opierają się na wielu dotychczasowych osiągnięciach z zakresu biologii molekularnej, genetyki, biotechnologii, embriologii. Postęp w dziedzinie inżynierii tkankowej stwarza realne podstawy do zastępowania utraconych organów i struktur nowo wytworzonymi tkankami w pełni podejmującymi ich czynność. Zrozumienie roli, jaką odgrywają KM, poznanie złożonych mechanizmów oraz interakcji pomiędzy komórkami i tkankami, a także wpływu czynników molekularnych, których wynikiem jest rozpoczęcie rozwoju zęba pozwala badaczom na coraz śmielsze eksperymenty prowadzące do rekonstrukcji zęba in vitro (3). Wstępne doświadczenia w zakresie hodowli zębów polegały na obserwacji wzrostu przeszczepionych we wczesnych stadiach rozwoju zawiązków. W efekcie uzyskiwano w pełni uformowane korony i częściowo wykształcone korzenie. Pierwsze doniesienia na ten temat były opublikowane przez Glasstone w roku 1936 (4). W latach późniejszych podobne próby były podejmowane przez Slavkina w roku 1968 (18) oraz w 1969 r. przez Kollara (13) i Kocha (12) w 1972 roku. Próbowano również hodować komórki pochodzące z brodawki mezenchymalnej i narządu szkliwotwórczego. Uzyskiwano struktury zębino oraz szkliwopodobne, zawierające białka charakterystyczne dla tych tkanek (2). Kolejnym krokiem była próba wygenerowania zęba z komórek zawartych w miazdze, zawierającej zębowe KM. W publikacji Younga i wsp. (24) przedstawiono opis doświadczenia, w którym wykorzystano nośniki poliglikolowe, na które wysiewano komórki pochodzące z zawiązków trzecich zębów trzonowych świń. Zawiązki zębów trzonowych zostały podzielone na porcje µm średnicy, składające się z komórek, które następnie wysiewano na trójwymiarowe rusztowanie zbudowane z włókien poliglikolu, kształtem i wielkością imitujące zęby sieczne i trzonowe. Takie biostruktury implantowano w sieć. Po tygodniach zbadano rozwijające się tkanki zęba i poddano je wszechstronnej analizie. Makroskopowo widoczne były struktury o średnicy 2 mm, kształtem przypominające koronę zęba. W badaniach histologicznych wykazano obecność zmineralizowanej zębiny i prezębiny przylegającą do warstwy komórek odontoblasto-podobnych. Stwierdzono ponadto mezenchymę i naczynia krwionośne w jej obrębie tkankę przypominającą miazgę. Prawdopodobne komórki odontoblastyczne były widoczne pod wewnętrzną powierzchnią macierzy prezębinowej. Wykazano także obecność struktur przypominających pochewkę Hertwiga. W 25 tygodniu stwierdzono tkanki przypominające odwapnione szkliwo przylegające do zębiny, składające się z macierzy szkliwnej zawierającej amelogeninę i ameloblasty z charakterystycznymi spolaryzowanymi jądrami. Stwierdzono kolagen typu I rozłożony wzdłuż granicy zębiny i szkliwa pomiędzy kanalikami, podobnie jak w zębach trzonowych u świń oraz sjaloproteinę zębinową. W wyniku wykonanego doświadczenia z wysianych komórek na nośniki uzyskano rozpoznawalne struktury zęba z charakterystycznym uporządkowaniem komórek i obecnością białek typowych dla dojrzałych, naturalnych zębów. W zębach tych określono komorę zębową, odontoblasty, prezębinę, zębinę, szkliwo morfologicznie składające się z komórek gwiaździstych, warstwy przejściowej, ameloblastów i szkliwa. Stwierdzono także obecność struktury przypominającej pochewkę nabłonkową Hertwiga (24). Odtworzony ząb wykazywał wyraźną organizację wierzchołkowo- 455

6 M. Tutak i in. Czas. Stomatol., -koronową jednak dotychczas wykonane próby odtworzenia struktury zęba z wykorzystaniem komórek macierzystych izolowanych z miazgi zęba w przypadku dojrzałego organizmu dowiodły, że implantowane substytuty zęba nie są w stanie odtwarzać struktury korzenia. Wąskim gardłem metody jest także brak epitelialnych komórek macierzystych, co uniemożliwia prawidłowy rozwój narządu szkliwotwórczego. Nierozwiązany pozostaje także problem kształtu zęba w przypadku przeszczepów zawiązków zębów, ponieważ jest on determinowany przez aktywność genów homeotycznych w czasie embriogenezy, zaś nadal nie znaleziono mechanizmów, które mogłyby sterować tym procesem w okresie postnatalnym. Należy jednak pamiętać, że samo wygenerowanie struktur zębowych jest niewystarczające, gdyż ząb zasadniczo tkwi w kostnym wyrostku zębodołowym. Utrata zęba doprowadza najczęściej do zaniku podłoża kostnego. Istotne jest również odbudowanie struktur kostnych, czyli wiąże się to z kombinacją regeneracji zarówno zęba jak i kości, która dostarczy podparcia zębom. Dotychczasowe metody sterowanej regeneracji tkanek, czy to za pomocą przeszczepów auto lub allogenicznych niosą ze sobą pewne ograniczenia. Alternatywnym rozwiązaniem mogą być metody odtworzenia kości in vitro (1). Podsumowanie Prace z zakresu inżynierii tkankowej nad odtworzeniem struktur zęba in vitro są nieodłącznie związane z badaniami nad komórkami macierzystymi, które biorą udział w jego formowaniu. Postęp w ich identyfikacji i ekspansji tych komórek z pewnością przyspieszy rekonstrukcję żywego zęba in vitro. Piśmiennictwo 1. Abukawa H., Terai H., Hannouche D., Vacanti J. P., Kaban L., Troulis M. J.: Formation of a Mandibular Condyle In Vitro by Tissue Engineering. J. Oral Maxillofac. Surg., 2003, 61, Buurma B., Gu K., Rutherford R. B.: Transplantation of Human Pulpal and Gingival Fibroblast Attached to Synthetic Scaffolds. Eur. J. Oral Sci., 1999, 107, Chai Y., Slavkin H.: Prospects for Tooth Regeneration in the 21 st Century: A Perspective. Microsc. Res. Tech., 2003, 60, Glasstone S.: The Development of Tooth Germs in vitro. J. Anat., 1936, 70, Gould T. R., Melcher A. H., Brunette D. M.: Migration and Division of Progenitor Cell Populations in Periodontal Ligament After Wounding. J. Periodontol. Res., 1980, 15, Gronthos S., Brahim J., Li W., Fisher L. W., Cherman N., Boyde A., DenBesten P., Robey P. C., Shi S.: Stem Cell Properties of Human Dental Pulp Stem Cells. J. Dent. Res., 2002, 81, Gronthos S., Mankani M., Brahim J., Robey P. C., Shi S.: Postnatal Human Dental Pulp Stem Cells (DPSCs in vitro and in vivo). Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2000, 97, Harada H., Kettunen P., Jung H. S., Mustonen T., Wang Y. A., Thesleff I.: Localization of Putative Stem Cells in Dental Epithelium and Their Association witch Notch and FGF Signaling. J. Cell Biol., 1999, 4, Harada H., Toyono T., Toyoshima K., Yamasaki M., Itoh N., Kato S., Sekine K., Ohuchi H.: FGF10 Maintains Stem Cell Compartment in Developing Mouse Incisors. Development, 2002, 129, Hume W. J., Potten C. S.: Advances in Epithelial Kinetics an Oral View. J. Oral Pathol., 1979, 8, Jiang Y., Jahagirdar B. N., Reinhardt R. L., Schwartz R. E., Keene C. D., Ortiz-Gonzalez X. R., Reyes M., Lenvik T., Lund T., Blackstad M., Du J., Aldrich S., Lisberg A., Low W. C., Largaespada D. A., Verfaillie C. M.: Pluripotency of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adult Marrow. Nature, 2002, 418, Koch W. E.: Tissue Interaction During in Vitro Odontogenesis. In: Slavkin H.C., Bavetta L.A. editors Developmental Aspects of Oral Biology. 456

7 2006, LIX, 6 Komórki macierzyste w tkankach zęba New York: Academic Press Inc. 1972, Kollar E. J., Baird G.: The Influence of the Dental Papilla on the Development of Tooth Shape in Embryonic Mouse Germs. J. Embroy. Exp. Morph., 1969, 21, Kucia M., Drukała J.: Postęp w metodach hodowli komórek dla transplantologii komórki macierzyste. Post. Biol. Kom., 2002, 29, Ratajczak M. Z., Majka M., Kucia M., Drukala J., Pietrzkowski Z., Peiper S., Janowska- Wieczorek A.: Expression of Functional CXCR4 by Muscle Satellite Cells and Secretion of SDF-1 by Muscle-Derived Fibroblasts is Associated with the Presence of Both Muscle Progenitors in Bone Marrow and Hematopoietic Stem/Progenitor Cells in Muscles. Stem. Cells, 2003, 21, Ratajczak M. Z., Kucia M.: Komórki Macierzyste Wyzwanie XXI wieku? Post. Biol. Kom., 2005, 32, Schofield R.: The Relationship Between the Spleen Colony-Forming Cell and the Hematopoietic Stem Cell. Blood Cells, 1978, 4, Slavkin H. C., Beierle J., Bvetta L. A.: Odontogenesis: Cell-Cell Interaction in vitro. Nature, 1968, 217, Slavkin H. C.: Tooth Formation: a Tool in Developmental Biology. Oral Sci. Rev., 1974, 4, Sodek J., Limeback H. F.: Comparison of the Rates of Synthesis, Conversion, and Maturation of Type I and III Collagens in Rat Periodontal Tissue. J. Biol. Chem., 1979, 254, Spradling A., Drummond-Barbosa D., Kai T.: Stem Cells Find Their Niche. Nature, 2001, 414, Tummers M., Theshlef I.: Root or Crown: A Developmental Choice Orchestrated by the Differential Regulation of the Epithelial Stem Cell Niche of the Tooth of Two Rodent Spieces. Development, 2003, 130, Watt F., Hogan B.: Out of Eden: Stem Cells and Their Niches. Science, 2000, 287, Young C. S., Terada S., Vacanti J. P., Honda M., Bartlett J. D., Yelick P. C.: Tissue Engineering of Complex Tooth Structures on Biodegradable Polymer Scaffolds. J. Dent. Res., 2002, 81, Otrzymano: dnia 21.II.2006 r. Adres autorów: Szczecin, ul. Powst. Wlkp