W NUMERZE AKTUALNOŚCI DIAGNOSTYKA NA ŚWIECIE DIAGNOSTYKA POD LUPĄ PRZYPADKI KLINICZNE

Transkrypt

1

2 W NUMERZE AKTUALNOŚCI Chorus Trio nowa jakość w immunologii teraz dostępna również na polskim rynku 4 5 Prezes Tomasz Tuora Dynamicznym Przedsiębiorcą 5 DIAGNOSTYKA NA ŚWIECIE Wytyczne w analizie białka Bence Jonesa Easy Interlab G26 kontra Hydrasys i Capillarys DIAGNOSTYKA POD LUPĄ Krioglobuliny PRZYPADKI KLINICZNE Krioglobulinemia 19 Wydawca: PZ Cormay SA ul. Wiosenna Łomianki tel.: faks: office@cormay.pl Redakcja: Redaktor naczelna Monika Dziachan PZ Cormay SA Redakcja i korekta Agape Współpraca: Firma Interlab (Italy) Przygotowanie i produkcja: Agape. Agencja doradcza i wydawnicza ul. Lazurowa 183 lok. 3, Warszawa tel./faks: biuro@agape.com.pl, Redakcja zastrzega sobie prawo do skracania i redagowania publikowanych tekstów Numer zamknięto: 14 czerwca 2013 r. 2 Cała prawda w jednej kropli Biuletyn Informacyjny PZ CORMAY

3 NA WSTĘPIE Szanowni Pañstwo, nie sprawdzi³ siê czarny scenariusz, e identyfikacja bia³ek wykonywana metod¹ elektroforezy agarozowej zniknie z Zak³adów Diagnostyki Laboratoryjnej. Od trzech lat w firmie PZ CORMAY pod kierunkiem dr Beaty Stefañczyk trwa prawdziwy renesans linii produktów do badañ elektroforetycznych i immunofiksacji. Dziêki naszym nowym analizatorom metoda oznaczenia jest szybka, charakteryzuje siê wysok¹ czu³oœci¹, bardzo dobr¹ wizualizacj¹, a rozdzia³ bia³ek jest wyraÿny. Dodatkowo, analizator Interlab Easy G26 pozwala na w pe³ni automatyczny rozdzia³ materia³u. Naszym celem jest nie tylko działalność biznesowa, lecz także profesjonalna praca edukacyjna, która spotyka się z Państwa doskonałym odbiorem Jesteœmy dumni, e jako jedyni na rynku oferujemy pe³na gamê analizatorów elektroforetycznych (w tym automatycznych) do Laboratoriów o ró nym potencjale: od tych ma³ych, a po specjalistyczne, które pracuj¹ na potrzeby Oddzia³ów Klinicznych. Pragnê podkreœliæ, e naszym celem jest nie tylko dzia³alnoœæ biznesowa, lecz tak e profesjonalna praca edukacyjna, która spotyka siê z Pañstwa doskona³ym odbiorem. Potwierdzaj¹ to wype³nione po brzegi sale na Konferencjach i Warsztatach Elek troforetycznych, prowadzonych dla naszych obecnych, jak i planuj¹cych z nami wspó³pracê Diagnostów. Metody elektroforetyczne to nie tylko oznaczenia rutynowe, ale tak e specjalistyczne, m.in. oznaczenie krioglobulin, o których informacje znajd¹ Pañstwo w obecnym egzemplarzu naszego biuletynu Twoje Laboratorium. ycz¹c Pañstwu ciekawej lektury najnowszego magazynu, zapraszamy do krêgu szybko rosn¹cej Rodziny PZ CORMAY, u ytkuj¹cej sprzêt diagnostyczny do wykonywania badañ elektroforetycznych. Dr S³awomir Blachowski Dyrektor Sprzeda y Krajowej Nr 1 (26), wiosna 2013 Cała prawda w jednej kropli 3

4 AKTUALNOŚCI Chorus Trio nowa jakość w immunologii teraz dostępna również na polskim rynku MAREK WITKOWSKI, PRODUCT SALES MANAGER W PZ CORMAY S.A. Marek Witkowski ma 31 lat i jest diagnostą laboratoryjnym. W 2006 r. ukończył Collegium Medicum w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu. Do tej pory zdobywał doświadczenie w ramach pełnionych funkcji kierownika laboratorium szpitalnego oraz przedstawiciela handlowego w firmach diagnostycznych. W PZ CORMAY S.A. jest odpowiedzialny za wprowadzenie nowego produktu immunologicznego Chorus Trio oraz bieżące działania w ramach analityki ogólnej. Wywiad z Markiem Witkowskim, Product Sales Managerem w PZ CORMAY S.A. Obecnie firma PZ CORMAY wprowadza na rynek now¹ liniê produktow¹. Co spowodowa³o rozpoczêcie tzw. projektu immunologicznego? Marek Witkowski: Badania immunologiczne s¹ najszybciej rozwijaj¹c¹ siê dziedzin¹ diagnostyki laboratoryjnej i mikrobiologicznej, co znajduje odzwierciedlenie w liczbie wykonywanych badañ. Ci¹g³y wzrost œwiadomoœci spo³eczeñstwa w zakresie ochrony zdrowia, lidera w diagnostyce chorób infekcyjnych oraz autoimmunoagresyjnych. Czy Chorus Trio to analizator przygotowany do pracy na polskim rynku? M.W.: Analizator Chorus Trio to doskona³e rozwi¹zanie dla wszystkich placówek medycznych w naszym kraju. Ma³e gabaryty, szeroki panel, mo liwoœæ wykonywania pojedynczych oznaczeñ i wygoda u ytkowania stawiaj¹ nasz nowy analizator w gronie najlepszych rozwi¹zañ na rynku. Dziêki zastosowanej technologii i miêdzynarodowemu dzia³owi badañ i rozwoju posiadamy praktycznie nieograniczone mo liwoœci rozszerzania i modyfikacji panelu badañ immunochemicznych dla potrzeb naszych klientów. a tak e mo liwoœci technologiczne powoduj¹ zwiêkszone zapotrzebowanie na tego typu badania ze strony osób prywatnych. W zwi¹zku z tym trendem zarz¹d PZ CORMAY S.A. podj¹³ starania w sprawie poszerzenia portfolio i nabycia udzia³ów we w³oskiej firmie Diesse W jaki sposób rozumiana jest prostota i wygoda dla u ytkownika? M.W.: W naszym analizatorze badania wykonywane s¹ w specjalnych kasetkach zaopatrzonych we wszystkie niezbêdne odczynniki do wykonania oznaczenia. Zasada jeden test, jedna kasetka, to doskona³e rozwi¹zanie dla osób ceni¹cych jasne i proste zasady kalkulacji kosztów badañ, To tak e rozwi¹zanie dla pacjentów oczekuj¹cych niemal natychmiastowego wyniku badania. Chcia³bym te podkreœliæ, e kalibratory i kontrole znajduj¹ siê w ka dym zestawie. W jaki sposób konfekcjonowane s¹ zestawy? M.W.: Zestawy pakowane s¹ po 36 kasetek jednego rodzaju, co pozwala na wykonanie dok³adnie takiej liczby oznaczeñ. W przy 4 Cała prawda w jednej kropli Biuletyn Informacyjny PZ CORMAY

5 AKTUALNOŚCI padku rzadkich badañ zastosowano opakowania po 12 kasetek. Takie frakcjonowanie pozwala na zu ycie wszystkich testów w ramach terminu wa noœci. Wymieniona wy ej liczba oznaczeñ oraz d³ugie terminy przydatnoœci do u ycia naszych zestawów, wykonywane metod¹ ELISA, drug¹ badania chorób autoimmunologicznych (ELISA), a trzeci¹ grupê stanowi¹ badania wykonywane za pomoc¹ odczynu wi¹zania dope³niacza. Nale y podkreœliæ, e wszystkie oznaczenia robione s¹ automatycznie. Jedyn¹ fabryki, st¹d ich cena nie jest obarczona du ymi narzutami ze strony poœredników. Naszym celem jest oferowanie szerokiego panelu badañ immunologicznym laboratoriom, które do tej pory tych badañ nie wykonywa³y lub by³y zmuszone do ich odsy ³ania na zewn¹trz g³ównie ze wzglêdów ekonomicznych. Oferowane przez PZ CORMAY zestawy pochodzą z naszej fabryki, stąd ich cena nie jest obarczona dużymi narzutami ze strony pośredników pozwalaj¹ na ich ekonomiczne wykorzystanie, nawet w ma³ych laboratoriach. Jak szeroki panel badañ oferuje nowy analizator? M.W.: Chorus Trio oferuje badania w zakresie trzech grup produktowych. Pierwsz¹ s¹ badania do identyfikacji chorób zakaÿnych czynnoœci¹ ze strony u ytkownika jest aplikacja surowicy w odpowiednim do³ku kasetki i umieszczenie jej w analizatorze. Czy badania immunologiczne s¹ badaniami kosztownymi? M.W.: Absolutnie nie. Oferowane przez PZ CORMAY zestawy pochodz¹ z naszej Metody ELISA kojarz¹ siê z metodami manualnymi, jak jest w tym przypadku? M.W.: Takie skojarzenie mo e dotyczyæ innych producentów. Nasz nowy analizator Chorus Trio zapewnia rozwi¹zanie nowoczesne, ale te w pe³ni automatyczne. Standaryzacja i zachowanie stabilnych warunków podczas ka dego badania w po³¹czeniu z automatyzacj¹ badañ chorób zakaÿnych oraz autoimmunologicznych wnosz¹ now¹ jakoœæ i bezpieczeñstwo pracy laboratorium XXI wieku. Dziêkujê za rozmowê. Rozmawia³a: Monika Dziachan Prezes Tomasz Tuora Dynamicznym Przedsiêbiorc¹ Tomasz Tuora, prezes giełdowej spółki PZ CORMAY, został w tym roku uhonorowany tytułem Dynamiczny Przedsiębiorca. Nagroda Dynamicznego Przedsiêbiorcy jest presti owym wyró nieniem przyznawanym w³aœcicielom i wspó³w³aœcicielom firm, którzy realizuj¹ z³o one projekty rozwojowe, wymagaj¹ce odwagi, innowacyjnego podejœcia i du ego zaanga owania osobistego. Kapitu³a II edycji konkursu Dynamiczny Przedsiêbiorca zdecydowa³a przyznaæ prezesowi ten zaszczytny tytu³ za bardzo dynamiczny rozwój spó³ki, jej innowacyjnoœæ i udan¹ ekspansjê geograficzn¹. Wrêczenie nagrody odby³o siê 18 kwietnia podczas uroczystej gali w warszawskim hotelu Sheraton. Nr 1 (26), wiosna 2013 Cała prawda w jednej kropli 5

6 DIAGNOSTYKA NA ŚWIECIE Wytyczne w analizie białka Bence Jonesa Wykrywanie i ilościowa ocena monoklonalnych wolnych łańcuchów lekkich w moczu (białko Bence Jonesa, BJP) to trudne zadanie dla diagnostów laboratoryjnych. Mariastella Graziani 1, Giampaolo Merlini 2 * i Concetta Petrini 3 z Komisji IFCC ds. białek osocza oraz Grupy Badawczej SIBioC ds. białek Oznaczenia z wykorzystaniem immunoelektroforezy (immunofiksacji) umo liwiaj¹ okreœlenie dwóch patognomonicznych cech ³añcuchów lekkich: monoklonalnoœci oraz braku ³añcuchów ciê kich. W celu wykluczenia obecnoœci BJP w praktyce klinicznej czêsto wykorzystuje siê metody immunochemiczne, takie jak nefelometria i turbidymetria. S¹ one jednak ograniczone przez czynniki metaboliczne i analityczne. Na dok³adnoœæ iloœciowych metod immunochemicznych ujemnie wp³ywaj¹ heterogeniczne formy cz¹steczkowe (fragmenty i polimery) BJP oraz brak materia³ów referencyjnych. Równie precyzja metod w odpowiednich obszarach zakresu dynamicznego jest s³abo zdefiniowana. Zaleca siê wykonywanie oznaczeñ metodami immunoelektroforetycznymi, a w szczególnoœci metod¹ immunofiksacji, z uwagi na to, e umo liwiaj¹ one wykazanie monoklonalnoœci i braku ³añcuchów ciê kich. Immunofiksacjê uwa a siê równie za najlepsz¹ metodê udokumentowania znikniêcia bia³ek monoklonalnych (ca³kowitej remisji). Fizjologiê immunoglobulin oraz istotnoœæ kliniczn¹ BJP ilustruje Clin Chem Lab Med. 2003: 41 (3): Skróty: AL amyloidoza powi¹zana z monoklonalnymi ³añcuchami lekkimi; BJP bia³ko Bence Jonesa; FLC wolny ³añcuch lekki; HC ³añcuch ciê ki; IF immunofiksacja; Ig immunoglobulina; LC ³añcuch lekki; LCDD choroba depozytowa ³añcuchów lekkich; MC komponent monoklonlany; PAS reakcja Schiffa; pi punkt izoelektryczny; SAP osoczowe bia³ko amyloidu P. DEFINICJA Bia³ko BenceJonesa (BJP) zosta³o opisane w roku 1962 jako wolne monoklonalne ³añcuchy lekkie, ulegaj¹ce syntezie poprzez pojedynczy klon komórek B (1,2). Prawid³owe komórki osocza wytwarzaj¹ nieznaczny nadmiar ³añcuchów lekkich 6 Cała prawda w jednej kropli Biuletyn Informacyjny PZ CORMAY

7 DIAGNOSTYKA NA ŚWIECIE (LC), lecz w nowotworach komórek B mo e dochodziæ do wytwarzania znacznie wiêkszych iloœci. Po wysyceniu mechanizmu reabsorpcji kanalikowej BJP wydalane jest z moczem. Masa cz¹steczkowa BJP ró ni siê, a BJP wystêpuje w moczu w formie monomerów (22 kda), dimerów (44 kda), fragmentów o niskiej masie cz¹steczkowej (5 18 kda) lub wykazuje wysoki stopieñ polimeryzacji. CHOROBY POWI ZANE Z obecnoœci¹ bia³ek Bence Jonesa najczêœciej powi¹zane s¹ nastêpuj¹ce choroby: szpiczak mnogi, makroglobulinemia Waldenstroma, amyloidoza powi¹zana z monoklonalnymi ³añcuchami lekkimi (AL) i choroba depozytowa ³añcuchów lekkich (LCDD). Choroby te s¹ doœæ rzadkie, a ich wystêpowanie w krajach zachodnich kszta³tuje siê na poziomie 4/100000/rok w przypadku szpiczaka mnogiego i 0,9/100000/rok dla AL. Obecnoœæ BJP mo e równie wi¹zaæ siê z wystêpowaniem ch³oniaków, przewlek³ej bia³aczki limfocytarnej, jak równie mo e byæ idiopatyczna (³agodna lub o nieokreœlonym znaczeniu). PRZYDATNOŒÆ KLINICZNA Oznaczenie BJP jest przydatne w nastêpuj¹cych przypadkach (3) : u chorych z komponent¹ monoklonaln¹ w surowicy (MC) w procesie rozpoznania, badañ kontrolnych, u pacjentów z podejrzeniem gammapatii monoklonanych, z objawami klinicznymi lub laboratoryjnymi takimi, jak: bóle koœci, zmêczenie, nawracaj¹ce infekcje, plamica, obrzêk, nieoczekiwana hipogammaglobulinemia u doros³ych, niewyjaœniony wzrost wskaÿnika opadania erytrocytów, niedokrwistoœæ, leukopenia i trombocytopenia, bia³komocz. WYKRYWANIE PRÓBKA Amerykañskie Kolegium Patologów wyda³o wytyczne dotycz¹ce metod wykrywania i iloœciowego oznaczania BJP w próbce moczu Przy wykorzystaniu metod o wysokiej rozdzielczości i odpowiedniej czułości, często pojawiają się tak zwane wzory drabinkowe LC z dobowej zbiórki (3,4), jednak ten sposób zbierania materia³u jest uci¹ liwy i nie w pe³ni wiarygodny, a BJP jest szczególnie podatne na degradacjê z udzia³em bakterii. Element ten mo na jednak zminimalizowaæ poprzez dodanie czynnika przeciwbakteryjnego (np. 1g/l azydku sodowego). Bior¹c pod uwagê te niedogodnoœci zalecamy wykonanie badania w drugim porannym moczu oddanym spontanicznie (5) i wyra enie stê enia BJP w odniesieniu do poziomu kreatyniny w moczu. Je eli zastosowana metoda jest wystarczaj¹co czu³a (patrz poni ej), oznaczenie mo na wykonaæ w niestê onej próbce moczu (w formie wydalonej przez pacjenta). Je eli dla celów klinicznych wymagana jest wiêksza czu³oœæ oznaczenia BJP, mocz nale y zagêœciæ. W takim przypadku punkt odciêcia dla membrany stosowanej w systemach do zagêszczania powinien wynosiæ 5 kda, a w ka dym przypadku poni ej 10 kda. Ryc. 1 Przykład BJP powiązanych z pełną immunoglobuliną monoklonalną. Zaznaczono każdą wykorzystaną antysurowicę monoswoistą. Anoda u góry. Po prawej stronie obraz elektroforezy białek w moczu (UPE). Oprócz albumin w obszarze anody widoczne są wyraźne dwa pasma. Immunofiksacja pokazuje, że monoklonalne wolne łańcuchy lekkie λ tworzą więcej pasm anody, co potwierdza antysurowica przeciwko wolnym łańcuchom lekkim λ (F) (należy zauważyć nadmiar antygenu spowodowany niskim mianem tej antysurowicy), podczas gdy pasmo katody tworzone jest przez pełne IgG λ, mimo że epitopy λ były dostępne dla antysurowicy tylko w bardzo niewielkim stopniu. Ryc. 2 Przykład BJP współmigrujących z pełną immunoglobuliną monoklonalną. Zaznaczono każdą wykorzystaną antysurowicę monoswoistą. Anoda u góry. Po prawej stronie obraz elektroforezy białek w moczu (UPE). Widoczne są następujące białka: albumina w obszarze anody i ß 2 mikroglobulina tworząca pasmo w obszarze ß oraz pasmo w obszarze katody λ. Immunofiksacja pokazuje, że ostatnie pasmo zostało stworzone przez monoklonalne białko IgG κ z nałożonymi monoklonalnymi wolnymi łańcuchami lekkimi κ. Należy zwrócić uwagę, że w porównaniu z pasmem immunoprecypitowanym antysurowicą anty IgG, antysurowica przeciwko łańcuchowi lekkiemu κ wytworzyła bardziej intensywne pasmo z nieznacznym nadmiarem antygenu. Efekt nadmiaru antygenu jest znacznie bardziej wyraźny przy słabszej antysurowicy przeciwko wolnym łańcuchom lekkim κ (F). METODA Wybrana metoda powinna umo liwiaæ weryfikacjê dwóch podstawowych cech LC, czyli tego, e s¹ one wolne i monoklonalne. Immunofiksacja ³¹czy element elektroforetyczny weryfikuj¹cy jednorodnoœæ molekularn¹ bia³ek z typowaniem immunologicznym (3,4,6,7). Jest to zalecana metoda wykrywania BJP. Nale y zastosowaæ antysurowice przeciwko ³añcuchom lekkim (LC) κ i λ wraz z antysurowic¹ przeciwko ³añcuchom ciê kim (HC) immunoglobuliny monoklonalnej w surowicy. Antysurowice przeciwko wolnym ³añcuchom lekkim (FLC) s¹ kosztowne, czêsto nieswoiste i miewaj¹ nisk¹ awidnoœæ (Ryc. 1). Znajduj¹ zastosowanie wy³¹cznie w przypadku podejrzenia wspó³migracji BJP z nienaruszon¹ immunoglobulin¹. Podejrzenie zachodzi w przypadkach rozbie noœci pomiêdzy sygna³em HC i LC z du ¹ przewag¹ na korzyœæ LC (8,9) (Ryc. 2). CZU OŒÆ WskaŸnik granicy wykrywalnoœci BJP mo e byæ tylko przybli ony, poniewa nie ma mo liwoœci dok³adnej oceny iloœciowej tego bia³ka. Jednak z uwagi na fakt, e wskazana iloœæ wydalania poliklonalnych LC wynosi oko³o 10 mg/l (10,11), zaleca siê wykorzystanie metody z czu³oœci¹ na poziomie tej wartoœci. Spoœród barwników najwiêksz¹ czu³oœæ uzyskuje siê przy zastosowaniu z³ota koloidalnego (1 2 mg/l). Koloidalny barwnik Coomassie umo liwia wykrycie BJP na poziomie 10 mg/l lub ni szym (12). INTERPRETACJA Przy wykorzystaniu metod o wysokiej rozdzielczoœci i odpowiedniej czu³oœci, czêsto pojawiaj¹ siê tak zwane wzory drabinko Nr 1 (26), wiosna 2013 Cała prawda w jednej kropli 7

8 DIAGNOSTYKA NA ŚWIECIE we LC. Jest to wiele pasm rozmieszczonych w równych odleg³oœciach. Zosta³y one dok³adnie opisane i stanowi¹ nastêpstwo wydalania poliklonalnych LC u osób z upoœledzon¹ reabsorpcj¹ kanalikow¹ (13,14). Obraz jest typowy i doœwiadczona osoba mo e odró niæ go od BJP, jednak czasami trudnoœci mo e przysparzaæ identyfikacja pasma BJP wspó³migruj¹cego z jednym z licznych pasm. PODEJŒCIE ALTERNATYWNE Metody immunochemiczne (nefelometria, turbidymetria) iloœciowego oznaczenia FLC w moczu mo na wykorzystywaæ jako badanie przesiewowe w celu wykluczenia obecnoœci BJP, co pozwala na zmniejszenie liczby kolejnych oznaczeñ wykonywanych w próbkach. Jednak iloœæ BJP mo e wahaæ siê od kilku miligramów do kilku gramów na litr, wiêc w prosty sposób mo e wyst¹piæ nadmiar antygenu. Dlatego obowi¹zkowe jest kontrolowanie i unikanie nadmiaru antygenu oraz dokumentowanie poziomu wykrywalnoœci poni ej 10 mg/l. W przypadku uzyskania wyniku dodatniego badanie nale y wykonaæ ponownie, metod¹ immunofiksacji (IF), z nastêpuj¹cych przyczyn: je eli antysurowice wykorzystywane w metodzie immunochemicznej s¹ skierowane przeciwko ³añcuchom lekkim (wolnym i zwi¹zanym), konieczne jest udokumentowanie faktu, e ³añcuchy lekkie wystêpuj¹ w formie wolnej; z uwagi na fakt, e antysurowica przeciwko FLC nie ma zdolnoœci ró nicowania monoklonalnych i poliklonalnych LC, konieczne jest definiowanie klonalnoœci. Wprawdzie w szpiczaku mnogim LC synteza poliklonalnych LC jest zazwyczaj spowolniona, jednak w kilku innych istotnych klinicznie stanach (AL, LCDD) stê enie poliklonalnych FLC w moczu mo e byæ znaczne i ulegaæ zmianom w miarê przebiegu choroby; obecnie w celu ustalenia odpowiedzi na wysokodawkow¹ chemioterapiê w szpiczaku mnogim zaleca siê wykonywanie oznaczeñ metod¹ IF (15). Wykazano, e ujemny wynik IF oznacza najlepsze rokowania u pacjenta (16) i w zwi¹zku z tym opracowywane strategie leczenia maj¹ na celu uzyskanie w³aœnie takiego wyniku. Bilans zysków i strat przesiewowego badania próbek na obecnoœæ BJP iloœciowymi Metody immunochemiczne (nefelometria, turbidymetria) ilościowego oznaczenia FLC w moczu można wykorzystywać jako badanie przesiewowe w celu wykluczenia obecności BJP metodami immunochemicznymi nale y poddaæ szczegó³owej ocenie w zale noœci od badanej populacji i analitycznych wyników zastosowanej metody immunochemicznej. Badania, których wykonywania nale y zaprzestaæ: 1. Metody oznaczania bia³ka ca³kowitego w moczu (metoda precypitacji i wi¹zania z barwnikiem) charakteryzuje niska czu³oœæ i brak dok³adnoœci dla BJP. 2. Paski testowe wykorzystywane w badaniach przesiewowych na obecnoœæ bia³ka w standardowych badaniach moczu s¹ nas¹czone buforowanym barwnikiem, który wykazuje czu³oœæ przede wszystkim na albuminê i mo e nie wykryæ obecnoœci BJP. 3. Badanie metod¹ ciepln¹ jest niewiarygodne i zosta³o wspomniane wy³¹cznie z uwagi na swoj¹ wartoœæ historyczn¹, poniewa nie ca³e BJP podlega precypitacji pod wp³ywem wysokiej temperatury. OZNACZENIA ILOŒCIOWE Wiele systemów oceny stadium zaawansowania choroby, definicji wolno postêpuj¹cej choroby oraz wytycznych dotycz¹cych leczenia szpiczaka mnogiego i chorób powi¹zanych, opartych jest o poziom dobowego wydalania BJP (17 20). Jednak adne z badañ nie okreœla sposobu wykrycia i oznaczenia substancji zwanej BJP. Wartoœæ kliniczna iloœciowego oznaczenia BJP jest ograniczona przez problemy metaboliczne i analityczne. Na wydalanie BJP wp³yw ma stopieñ polimeryzacji, czynnoœæ nerek oraz stopieñ odk³adania siê bia³ek w ró nych tkankach, wiêc iloœæ BJP w moczu nie jest bezpoœrednio powi¹zana z mas¹ nowotworow¹. Nale y ponownie podkreœliæ, e dok³adny pomiar BNP nie jest mo liwy przy pomocy dostêpnych obecnie technik laboratoryjnych. Wytyczne Amerykañskiego Kolegium Patologów zalecaj¹ wprowadzenie nastêpuj¹cej procedury (4) : 8 Cała prawda w jednej kropli Biuletyn Informacyjny PZ CORMAY

9 DIAGNOSTYKA NA ŚWIECIE oznaczenie bia³ka ca³kowitego w próbce z dobowej zbiórki, elektroforeza i IF stê onego moczu w celu wykrycia BJP, densytometria piku BJP, okreœlenie stosunku odsetka piku BJP do bia³ka ca³kowitego. Procedura ta ma jednak pewne minusy: brak dok³adnoœci metod wykorzystywanych w celu pomiaru bia³ka ca³kowitego od wielu czynników (np. stê enie LC, ph). Oprócz tego, antysurowice wykorzystywane w iloœciowym oznaczeniu FLC s¹ skierowane przeciwko epitopom ukrytym w cz¹steczkach pe³nych immunoglobulin. W zaawansowanych stanach, takich jak AL, fragmenty LC o masie 5 18 kda zawieraj¹ce obszar aminokoñcowy s¹ obecne w surowicy i moczu, stanowi¹c jeden z g³ównych sk³adników w³ókienek amyloidowych. S¹ to patogenne fragmenty LC, w których mo e brakowaæ niektórych lub wszystkich epitopów i które mog¹ byæ s³abo rozpoznawalne lub nierozpoznawalne przez antysurowice. Wszystkie te czynniki mog¹ mieæ wp³yw na reakcjê immunologiczn¹ i powodowaæ uniewa nienie kalibracji, przez co iloœciowa ocena monoklonalnych LC w moczu bêdzie niewiarygodna; precyzja metod iloœciowych w punktach ekstremalnych zakresu dynamicznego (bardzo istotna klinicznie: przy niskim poziomie pozwala oceniæ remisjê, a przy wysokim udokumentowaæ postêp) jest s³abo zdefiniowana; brak jest materia³u referencyjnego dla monoklonalnych LC i dlatego dok³adnoœæ pozostaje nierozwi¹zanym problemem; brak jest standaryzacji dostêpnych metod iloœciowej oceny FLC w moczu. Wyniki mog¹ siê znacznie ró niæ, w zale noœci od metody wykonania oznaczenia; bior¹c pod uwagê znaczn¹ mobilnoœæ pacjentów, stanowi to powa ny problem. Pomimo powy szych minusów immunochemiczna ocena BJP mo e stanowiæ wartoœæ kliniczn¹ w monitorowaniu klonów w trakcie leczenia, lecz konieczne jest stosowanie tych samych antysurowic i kalibratorów podczas wszystkich badañ kontrolnych i wziêcie pod uwagê wszystkich opisanych tu zastrze eniach. Niedawno stwierdzono, e w szpiczaku LC iloœciowa ocena FLC w surowicy metod¹ nefelometrii koreluje ze zmianami w wydalaniu FLC z moczem (23). Autorzy sugeruj¹, e oznaczenia w surowicy mog¹ stanowiæ alternatywê dla uci¹ liwej dobowej zbiórki moczu w monitorowaniu pacjentów ze szpiczakiem LC, jednak przed rozpatrzeniem tej alternatywy nale y zgromadziæ wiêcej danych. Autorzy badañ: 1. Laboratorium Chemii Klinicznej, Ospedale Civile Maggiore, Werona, W³ochy. 2. Biotechnologiczne Laboratoria Badawcze, IRCCS Policlinico San Matteo, Instytut Biochemii, Uniwersytet Pavia, W³ochy. * adres autora koresponduj¹cego: gmerlini@smatteo.pv.it. 3. Laboratorium Biochemiczne,Szpital San Carlo Borromeo, Mediolan, W³ochy. Pomimo minusów immunochemiczna ocena BJP może stanowić wartość kliniczną w monitorowaniu klonów w trakcie leczenia w moczu: metody te (zarówno precypitacja, jak i wi¹zanie z barwnikiem) wykazuj¹ siê czêsto nisk¹ czu³oœci¹ na mikroproteiny, a w szczególnoœci na BJP. Je eli jednak elektroforeza moczu wykazuje, e niemal e ca³e bia³ko wydalane z moczem to w³aœnie BJP, okreœlenie ca³kowitego bia³ka w moczu wykonane w tym samym laboratorium i t¹ sam¹ metod¹ w dwóch punktach czasowych mo e dostarczyæ istotnych informacji dotycz¹cych skutecznoœci leczenia; bia³ka mog¹ wykazywaæ siê ró nym powinowactwem do barwników wykorzystywanych na barwionych paskach w elektroforezie i dlatego mo na zaobserwowaæ brak liniowoœci odpowiedzi densytometrycznej; czêsto obecnych jest kilka pasm BJP w moczu lub BJP wspó³migruje z innymi bia³kami, wiêc prawid³owe oznaczenie piku BJP metod¹ densytometrii przysparza trudnoœci. Zaleca siê, aby badania kontrolne w nastêpstwie leczenia wykonywaæ w tym samym laboratorium, aby zminimalizowaæ zró nicowanie analityczne. Wady metod immunochemicznych (nefelometria, turbidymetria) z wykorzystaniem antysurowicy przeciwko FLC (7, 11, 21, 22) opisano w ustêpie Podejœcie alternatywne. Oprócz tego: antysurowice przeciwko poliklonalnej mieszaninie LC nie zawsze reaguj¹ w ten sam sposób z monoklonalnymi LC w próbce; masa cz¹steczkowa BJP mo e byæ zró nicowana; w moczu bia³ko to przybiera postaæ monomerów (22 kda), dimerów (44 kda), fragmentów o niskiej masie cz¹steczkowej lub wykazuje wysoki stopieñ polimeryzacji. Stan agregacji/fragmentacji FCL w moczu jest bardzo zró nicowany, nieprzewidywalny i zale y Piśmiennictwo: 1. Edelman GM, Gaily JA. The nature of Bence Jones protein: chemical similarities to polypeptide chains of myeloma globulins and normal)' globulins. J Exp Med 1962; 116: Solomon A. Light chains immunoglobulin. Structure lgenetic correlates. Blood 1986; 68: Kyle RA. Sequence of testing for monoclonal gammopathies. Serum and urine assays. Arch Pathol Lab Med 1999; 123: Keren DF, Alexanian R, Goeken JA, Go re vie PD, Kyle RA, Tomar RH. Guidelines for clinical and laboratory evalua tion of patients with monoclonal gammopathies. Arch Pathol Lab Med 1999; 123: Hofmann W, Guder WG. A diagnostic programme for quantitative analysis of proteinuria. J Clin Chem Clin Biochem 1989; 27: 589 Go re vie PD Merlini G, Aguzzi F, Whicher J. Monoclonal gammapathies. J Internat Fed Clin Chem 1997; 9: Beetham R. Detection of Bence Jones protein in practice. Ann Clin Biochem 2000; 37: Levinson SS, Keren DF. Free light chains of immunoglobulins: clinical laboratory analysis: critical review. Clin Chem 1994; 40: Attaelmannan M, Levinson SS. Understanding and identifying monoclonal gammopathies. Clin Chem 2000; 46: Soiling K. Free light chains of immunoglobulins in normal urine determined by radioimmunoassay. Scand J Clin Lab Invest 1975; 35: Brad we II AR, CarrSmith HD, Mead GP, Tang LX, S ho well PJ, Drayson MT, et at. Highly sensitive, automated im munoassay for immunoglobulin free light chains in serum and urine. Clin Chem 2001; 47: Aguzzi F, Bergami MR, Gasparro C, Merlini G. High sensi tivity electrophoretic method for the detection of Bence Jones protein and for the study in unconcentrated urine. Ann Clin Biochem 1993; 30: Harrison HH, The "ladder light chain" or "pseudooligoclonal" pattern in urinary immunofixation electrophoresis <IFE) studies: a distinctive IFE pattern and an explanatory hypothesis relating it to free polyclonal light chains. Clin Chem 1991; 37: Mac Namara EM, Aguzzi F, Petrini C, Higginson J, Gasparro C, Bergami MR, etai Restricted electrophoretic heterogeneity of immunoglobulin light chains in urine. A cause of confusion with Bence Jones protein. Clin Chem 1991; 37: Blade J, Samson D, Reece D, Apperley J, Bjorkstrand B, Gahrton G, et al. Criteria for evaluating disease response and progression in patients with multiple myeloma treated by highdose therapy and haemopoietic stem cell trans plantation. Myeloma Subcommittee of the EBMT. Euro pean Group for Blood and Marrow Transplant. Br J Haematol 1998; 102: Lahuerta JJ, MartinezLopez J, Serna JD, Blade J, Grande C, Alegre A, et al. Remission status defined by immunofix ation vs. electrophoresis after autologous transplantation has a major impact on the outcome of multiple myeloma patients. Br J Haematol 2000; 109: Durie BG, Salmon SE. A clinical staging system for multiple myeloma. Correlation of measured myeloma cell mass with presenting clinical features, response to treatment, and survival. Cancer 1975; 36: Alexanian R. Localized and indolent myeloma. Blood 1980; 56: Kyle RA, Greipp PR. Smoldering multiple myeloma. N Engl J Med 1980; 302: Weber DM, Dimopoulos MA Moulopoulos LA, Delasalle KB, Smith T, Alexanian R. Prognostic features of asympto matic multiple myeloma. Br J Haematol 1997; 97: Tillyer CR. The estimation of free light chains of immunoglobulins in biological fluids. Int J Clin Lab Res 1992; 22: Boege F. Measuring Bence Jones protein with antibodies against bound immunoglobulin light chains: how reliable are the results? Eur J Clin Chem Clin Biochem 1993; 31: Abraham RS, Clark RJ, Bryant SC, Lymp JF. LarsonT, Kyle RA etal. Correlation of serum immunoglobulin free light chain quantification with urinary Bence Jones protein in light chain myeloma. Clin Chem 2002; 48: Nr 1 (26), wiosna 2013 Cała prawda w jednej kropli 9

10 DIAGNOSTYKA NA ŚWIECIE Easy Interlab G26 kontra Hydrasys i Capillarys Wyniki załączonego badania przeprowadzonego w 2011 roku, zaprezentowano podczas Krajowej Konferencji w Tuluzie (Francja), która odbyła się września 2012 roku. Jest to badanie wielooœrodkowe przeprowadzone przez dwa francuskie szpitale: Gonesse i Eaubonne z wykorzystaniem analizatora Sebia Capillarys 2 i Sebia Hydrasys w porównaniu z analizatorem Easy Interlab G26. W badaniu porównawczym oznaczono bia³ka w surowicy metod¹ immunofiksacji/immunotypowania. Badanie wykaza³o znaczne rozbie noœci w wynikach uzyskanych technik¹ Capillarys i technik¹ z elem agarozowym w analizatorach Easy Interlab G26 i Hydrasys. Dane podane w tabeli wykaza³y równie niewielkie rozbie noœci pomiêdzy wynikami uzyskanymi w Easy Interlab G26 i Hydrasys. Jak widaæ, rozbie noœci pomiêdzy wynikami uzyskanymi w oznaczeniach z wykorzystaniem elu agarozowego przemawiaj¹ na korzyœæ Easy Interlab G26. Streszczenie badania zostanie równie opublikowane we francuskim czasopiœmie naukowym Opinion Bio. H. Louati 1, G. Mechin 2, E. Vanessche 2, C. Poupon 1 Elektroforeza białek w surowicy jest rutynowym badaniem wykonywanym w laboratoriach 10 Cała prawda w jednej kropli Biuletyn Informacyjny PZ CORMAY

11 DIAGNOSTYKA NA ŚWIECIE Wyniki zgodne uzyskane w analizatorze Interlab G26 w porównaniu z Capillarys i Hydrasys % zgodnych wyników Capillarys Hydrasys Wyniki niezgodne uzyskane w analizatorze Interlab G26 w porównaniu z Capillarys i Hydrasys Liczba niezgodnych próbek Interlab G26 Capillarys IFE Interlab G IgM L () słaba IgG wolna L 2 IgM K słaba Numer próbki Interlab G26 Capillarys IFE Interlab G % niezgodnych próbek Interlab G26 Capillarys 0,4% (1/258) Hydrasys 0% (0/258) słaba IgG wolna L IgM K słaba Wyniki niezgodne uzyskane w analizatorze Capillarys i Hydrasys w porównaniu z Interlab G26 liczba niezgodnych próbek 100 Capillarys Interlab G26 * IT Capillarys słaba *Próbka ujemna również w oznaczeniu Hydrasys. U pacjenta nie występowały objawy kliniczne gammapatii monoklonalnej. Porównanie wyników IFE w analizatorze Interlab G26 i immunotypowania w analizatorze Capillarys IFE G26 IFE G26 IT Capillarys identyczne 40% (12/30) IFE Hydrasys identyczne 70% (24/36) Interlab G26 97% (251/258) 98% (254/258) IT Capillarys niezgodne 60% (18/30) Porównanie wyników IFE w analizatorze Interlab G26 i IFE w analizatorze Hydrasys IFE Hydrasys niezgodne 30% (12/36) WYNIKI Wyniki oznaczeñ trzema podanymi metodami by³y porównywalne, a zgodnoœæ pomiêdzy analizatorem Interlab G26, a Capillarys i Hydrasys wynosi³a 97,5 proc. Rozbie noœæ pomiêdzy immunotypowaniem i immunofiksacj¹ wynosi³a 60 proc. (18/30) pomiêdzy IFE i Interlab G26 immunotypowanie Capillarys oraz 33 proc. (12/36) pomiêdzy IFE w Hydrasys i IFE w Interlab G26. Immunofiksacja w analizatorze Interlab G26 charakteryzuje siê doskona³¹ czu³oœci¹ i ulepszon¹ wizualizacj¹ pasm w ró nych frakcjach wyodrêbnionych w elektroforezie bia³ek, prawdopodobnie z powodu powinowactwa antysurowic. WNIOSKI System Interlab G26 to wysokiej jakoœci innowacyjne rozwi¹zanie w zakresie oznaczeñ metod¹ elektroforezy/immunofiksacji. Zapewnia wysok¹ jakoœæ oznaczeñ. OCENA DZIA ANIA NOWEGO ANALIZATORA INTERLAB G26 CEL BADANIA Badanie mia³o na celu ocenê dzia³ania automatycznego analizatora Interlab G26 w zakresie oznaczeñ wykonywanych w materiale z probówek pierwotnych, w dwóch rutynowych procedurach w szpitalach Eaubonne i Gonesse. MATERIA Y I METODY Badanie przeprowadzono w oparciu o oznaczenia wykonane w 258 próbkach metod¹ elektroforezy bia³ek w surowicy w analizatorze Interlab G26 (zestaw referencyjny SRE601K) rozprowadzanym we Francji przez Orgentec SAS oraz w analizatorach Hydrasys (zestaw referencyjny 4142) i Capillarys firmy Sebia (zestaw referencyjny 2003). Po wykonaniu elektroforezy, 32 próbki oznaczono metod¹ immunotypowania w analizatorze Capillarys (zestaw referencyjny 2100), a 36 próbek metod¹ immunofiksacji w analizatorze Interlab G26 (zestaw referencyjny SRE628K) i Hydrasys (zestaw referencyjny 4302/4802). OCENA ELEKTROFOREZY BIA EK W SUROWICY NA ANALIZATORZE INTERLAB G26 Elektroforeza bia³ek w surowicy jest rutynowym badaniem wykonywanym w laboratoriach. Z uwagi na jego gwa³townie rosn¹c¹ popularnoœæ, konieczne jest wprowadzenie zautomatyzowanej techniki, umo liwiaj¹cej wykrywanie dysproteinemii przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej rozdzielczoœci i jak najni szej granicy wykrywalnoœci. Analizator Interlab G26 rozprowadzany przez Orgentec France SAS umo liwia pe³n¹ automatyzacjê elektroforezy elowej z probówki pierwotnej. Badanie przeprowadzono w oparciu o porównanie trzech metod elektroforezy bia ³ek w surowicy w elu agarozowym: analizatory Interlab G26, Hydrasys i Capillarys firmy Sebia, w celu oceny dzia³ania Interlab G26. MATERIA Y I METODY W ci¹gu trzech tygodni oznaczono 258 próbek pochodz¹cych z laboratoriów szpitali w Gonesse i Eaubonne. 30 próbek oznaczono metod¹ immunotypowania w analizatorze Capillarys, a 36 metod¹ immunofiksacji (IFE) w analizatorach Interlab G26 i Hydrasys. WYNIKI OZNACZEÑ PRZEPROWADZONYCH METOD ELEKTROFOREZY SPE Oznaczenia metod¹ elektroforezy charakteryzowa³a doskona³a wizualizacja i rozdzia³ ró nych frakcji poprzez ulepszon¹ rozdzielczoœæ, prawdopodobnie dziêki zaletom dobrego systemu analitycznego w zakresie fiksacji z barwnikiem. Zautomatyzowany analizator Interlab G26 jest prosty w obs³udze i wyposa ony w intuicyjne, przyjazne dla u ytkownika oprogramowanie. W oznaczeniach powy szych próbek metod¹ immunofiksacji stwierdzono wysok¹ czu³oœæ analizatora Interlab G26. Nr 1 (26), wiosna 2013 Cała prawda w jednej kropli 11

12 DIAGNOSTYKA NA ŚWIECIE Niezgodne wyniki IFE w analizatorze Interlab G26 i immunotypowania w analizatorze Capillarys Numer próbki IFE Interlab G26 IT Capillarys Niezgodne wyniki IFE w analizatorze Interlab G26 i IFE w analizatorze Hydrasys IgG L IgM L wolna L 2 wolna L (wolna K) IgM L IgG L 3 IgA K 2 wolna K 2 IgG L IgA K IgG L wolna K IgG L IgM L IgM K IgG L wolna L IgM L IgA K Numer próbki IFE Interlab G26 IFE Hydrasys IgM L IgM L wolna L 2 wolna L wolna K 2 IgA K wolna K 2 wolna L 2 2 wolna L prawidłowy prawidłowy prawidłowy prawidłowy triklonalna oligoklonalna z hiper IgA prawidłowa IgA K IgG L prawidłowa IgM L prawidłowa prawidłowa IgM K IgG LL L IgM L prawidłowa prawidłowa 2 prawidłowa prawidłowa 2 IgA K prawidłowa IgG L IgM L słabe pasmo K wolna L 2 IgA L IgG L WYNIKI OZNACZEÑ METOD IMMUNOFIKSACJI/IMMUNOTYPOWANIA Oznaczenia metod¹ immunofiksacji w analizatorze Interlab G26 charakteryzowa³a bardzo wysoka czu³oœæ i ulepszona wizualizacja pasm odpowiadaj¹cych frakcjom wyodrêbnionym w elektroforezie bia³ek, dziêki powinowactwu antysurowic. Podobnie stopieñ automatyzacji umo liwia po³¹czenie elektroforezy i immunofiksacji, dziêki czemu czas uzyskania wyniku oznaczenia bia³ek jest krótszy. WNIOSKI Analizator Interlab G26 to innowacyjne rozwi¹zanie w zakresie oznaczeñ metod¹ elektroforezy/immunofiksacji w elu agarozowym. Umo liwia pe³n¹ automatyzacjê oznaczeñ materia³u z probówki pierwotnej. Badanie wykaza³o doskona³¹ czu³oœæ i ³atwoœæ interpretacji wyniku. Oprogramowanie jest proste w obs³udze, wspomaga interpretacjê i umo liwia pe³n¹ spójnoœæ pomiarow¹ w zarz¹dzaniu danymi pacjenta. Analizator doskonale spe³nia jakoœciowe wymagania laboratoriów w zakresie elektroforezy/immunofiksacji bia³ek w surowicy. Autorzy badañ: 1. Service Biochimie, Immunologie, Parasitologie, Centre Hospitalier de Gonesse. 2. Service de Biochimie, Centre Hospitalier Intercommunal Eaubonne. 12 Cała prawda w jednej kropli Biuletyn Informacyjny PZ CORMAY

13 DIAGNOSTYKA POD LUPĄ Krioglobuliny W niektórych przypadkach interpretacja proteinogramu, a zwłaszcza immunofiksacji bywa problematyczna. Jednym z typowych przykładów na to jest obecność krioglobulin w surowicy. Krioglobuliny to bia³ka oraz kompleksy bia³ek, które precypituj¹ w niskiej temperaturze i zazwyczaj rozpuszczaj¹ siê ponownie w temperaturze 37 C. (211) (23) (42) (48) Zjawisko krioprecypitacji po raz pierwszy w 1929 roku zbadali i opisali Heidelberg i Kendall. Ponownie, w kontekœcie klinicznych objawów u kobiety nosicielki szpiczaka, zbadali je w 1933 roku Wintrobe i Bull. W roku 1947 Lerner i Watson po raz pierwszy u yli okreœlenia krioglobuliny w odniesieniu do grupy immunoglobulin (Ig) posiadaj¹cych w³aœciwoœci precypitacji i powrotu do ponownej rozpuszczalnoœci, po podgrzaniu do temperatury 37 C. Nie zawsze podgrzanie powoduje ponown¹ rozpuszczalnoœæ ca³ego krioprecypitatu: Nr 1 (26), wiosna 2013 Cała prawda w jednej kropli 13

14 DIAGNOSTYKA POD LUPĄ KLASYFIKACJA KRIOGLOBULIN Nastêpnie w 1974 roku Brouet wraz z zespo³em, wyodrêbni³ trzy typy krioglobulin w oparciu o immunochemiczne w³aœciwoœci precypitatu (20). KRIOGLOBULINEMIA TYP 1. WG BROUETA: Makroagregacja przy wewn¹trzcz¹steczkowych interakcjach elektrostatycznych, Immunoglobulina monoklonalna z tendencj¹ tworzenia kompleksów przy wysokim PM, Wiêksza czêstotliwoœæ dla IgM k, Mniejsza czêstotliwoœæ dla IgG i podklas IgG1G2G3, Rzadko IgA, Postaæ krioprecypitatu: amorficzny lub bez okreœlonej struktury, cylindryczny i nawodniony, zwarte kryszta³y (postaæ najbardziej uszkadzaj¹ca IgG3 w mikrokryszta³ach). KRIOGLOBULINEMIA TYP 2. WG BROUETA: Immunokompleksy, Pochodzenie formowania wskazuje na biologiczn¹ aktywnoœæ immunoglobuliny, Immunoglobulina monoklonalna (IgM) z aktywnoœci¹ FR przeciwko poliklonalnej IgG, z rzadka przeciwko IgA, Tendencja do tworzenia kompleksów z immunoglobulin¹ poliklonaln¹ i FR, Czynnik reumatoidalny oddzia³uje przede wszystkim na agregowan¹ formê immunoglobuliny, a w mniejszym stopniu na natywn¹. Czynniki reumatoidalne powstaj¹ w wyniku patologicznej proliferacji klonu komórki osocza: Pojedyncze monoklonalne pasmo w immunofiksacji. KRIOGLOBULINEMIA TYP 2. B WG BROUETA: Immunokompleksy, Pochodzenie formowania wskazuje na biologiczn¹ aktywnoœæ immunoglobuliny, Immunoglobulina oligoklonalna (IgM) z aktywnoœci¹ FR przeciwko poliklonalnej IgG (z rzadka przeciwko IgA), Tendencja do tworzenia kompleksów z poliklonaln¹ IgG i FR, Czynnik reumatoidalny oddzia³uje przede wszystkim na agregowan¹ formê immunoglobuliny, a w mniejszym stopniu na natywn¹. Czynniki reumatoidalne powstaj¹ w wyniku patologicznej proliferacji klonu komórki osocza: Dwa pasma monoklonalne w immunofiksacji. Niedawno przeprowadzone badania Qi wykazały istotną rolę wapnia w procesie krioprecypytacji już przy temperaturze 37 o C w interakcji pomiędzy dwiema immunoglobulinami KRIOGLOBULINEMIA TYP 3. WG BROUETA: Immunoglobina poliklonalna, Sk³ada siê z jednej lub kilku immunoglobulin, Czynniki reumatoidalne powstaj¹ w wyniku zaburzeñ i nasilenia zapalnego procesu immunomodulacji podczas odpowiedzi na antygen. W wielu przypadkach wystêpuj¹ formy obecnie uznawane przez Musseta (1992) i Bellottiego (1991), które nie spe³niaj¹ kryteriów adnej z powy szych klas, co daje nadziejê na stworzenie uproszczonej klasyfikacji, sk³adaj¹cej siê z dwóch klas, gdzie w pierwszej znajduj¹ siê bia³ka monoklinalne, a w drugiej wszystkie formy mieszane. 14 Cała prawda w jednej kropli Biuletyn Informacyjny PZ CORMAY

15 DIAGNOSTYKA POD LUPĄ MIKROHETEROGENICZNE GLOBULINY WG MUSSETA: Obecnoœæ co najmniej dwóch lekkich sk³adników monoklonalnych (22), Widoczny kontekst poliklonalny, Wiêksza czêstotliwoœæ IgG i IgM. Tabela nr 1 Objawy Plamica Martwica kończyn Pokrzywka Siność siatkowata Objaw Raynauda Sinica kończyn Artralgia Objawy nerkowe Objawy neurologiczne Ogólne występowanie % występowania w odniesieniu do typu krioglobulinemii według Broueta Typ I Typ II Typ III Tabela nr 2 Powiązane choroby % występowania w odniesieniu do typu krioglobulinemii według Broueta Potwierdzaj¹c to, co zosta³o zaproponowane i bior¹c pod uwagê zró nicowane piœmiennictwo, stwierdza siê homogenicznoœæ w wystêpowaniu krioglobulin typu 1. wg Broueta oraz wed³ug tego, co inni autorzy okreœlaj¹ mianem krioglobulinemii monoklonalnej. Z kolei dane dotycz¹ce innych form s¹ bardzo zró nicowane, podkreœlaj¹c heterogennoœæ w wyborze populacji krioglobulin oraz brak standaryzacji tych samych metodologii. OBJAWY KLINICZNE S¹ one zró nicowane z uwagi na to, e oko³o 50 proc. krioglobulinemii monoklonalnych oraz 15 proc. form mieszanych przebiega bezobjawowo. Najczêœciej wystêpuj¹ce objawy s¹ zwi¹zane z utrudnionym przep³ywem krwi spowodowanym przez krioprecypitacjê w naczyniach w³osowatych (objaw Raynauda, martwica koñczyn, sinica koñczyn, plamica naczyniowa itp.) W tabeli pokazaliœmy zale noœci pomiêdzy objawami i krioglobulinemiami (tabela 1) oraz ich wystêpowanie w ró nych formach choroby (tabela 2). MECHANIZMY KRIOPRECYPITACJI Wiêkszoœæ czynników wp³ywaj¹cych na krioprecypitacjê immunoglobulin monoklonalnych wystêpuje równie w przypadku krioglobulinemii mieszanych. Oprócz fazy zastoju (Lawson 1987), wystêpuje faza spowolniona z powstawaniem niewielkich agregatów immunoglobulin, a nastêpnie gwa³towna i rozleg³a agregacja zwieñczona precypitacj¹. Precypitacja mieszanych krioglobulin jest nastêpstwem gwa³townego i postêpuj¹cego Szpiczak mnogi Makroglobulinemia Waldenstroema LLC LES AR Zespół Sjogrena Choroby wątroby Brak istotnych w krioglobulinemii wzrostu rozmiarów immunokompleksów (I.C.) IgGIgM powstaj¹cych w niskich temperaturach (Brandau 1986). Czynniki maj¹ce wp³yw na powstawanie krioprecypitatów s¹ nastêpuj¹ce: 1. stê enie immunoglobulin, liczba kolizji, liczba spotkañ, liczba skutecznych zderzeñ, 2. temperatura, 3. wartoœæ ph, je eli<7,0, 4. sta³y dielektryk rozpuszczalnika, 5. sytuacja hemodynamiczna. Krioglobuliny s¹ wiêc zjawiskiem fizycznym, wyró niaj¹cym siê i sztucznie stworzonym. Dane zawarte w piœmiennictwie, na które powo³uj¹ siê autorzy zainteresowani wyjaœnieniem tego zjawiska, s¹ sprzeczne i nierozstrzygaj¹ce. W niniejszych bia³kach Levo stwierdzi³ redukcjê glukozamin i kwasu sialowego, co zinterpretowa³ jako nieod³¹czne cechy charakterystyczne krioprecypitacji immunoglobulin. Inni autorzy skoncentrowali wysi³ki na zmodyfikowanej rozpuszczalnoœci jako funkcji odpowiedzi na czynniki zewnêtrzne, takie jak temperatura, ph lub si³a jonowa rozpuszczalnika. Na przyk³ad, niska temperatura mo e powodowaæ zmianê struktury bia³ek, zmniejszaj¹c biegunowoœæ i rozpuszczalnoœæ. Bia³ka zazwyczaj precypituj¹ do swojego punktu izoelektrycznego, przy optymalnym ph w zakresie 5,5 do 8,0. Wp³yw si³y jonowej zjawisk precypitacji jest Typ I Typ II Typ III ró ny (0,09 0,3 u). Spójnoœæ immunoglobulin jest zazwyczaj niezbêdna dla celów precypitacji i tylko w szczególnych przypadkach Fab i Fab2 zachowuj¹ w³aœciwoœci umo liwiaj¹ce precypitacjê w niskich temperaturach. Z tego powodu krioprecypitacja monoklonalnych krioglobulin typu 1. wydaje siê zale eæ od czwartorzêdowej struktury wêglowodanów i aminokwasów. Je eli rola wêglowodanów jest trudna do oceny w zjawisku precypitacji, widzieliœmy w zamian szczególne sekwencje aminokwasów, które zaobserwowano w zró nicowanym obszarze ³añcuchów ciê kich krioglobulin IgM na zewnêtrznej czêœci cz¹steczki. W pewnych typach krioglobulinemii wykryto niedobór tyrozyny i seryny lub obecnoœæ leucyny zamiast proliny w pozycji 44. w ³añcuchach lekkiego ³añcucha krioglobulinemii. Równie obecnoœæ pewnych komponentów lipidowych mo e stanowiæ element promuj¹cy brak rozpuszczalnoœci i krioprecypitacjê. Szczególnie interesuj¹ce s¹ niektóre mieszane krioglobuliny monoklonalne z izotypem IgG3, wykazuj¹ce sk³onnoœæ do autoagregacji. Cz¹steczki te posiadaj¹ dodatkowy aminokwasowy segment 11,000 MW w regionie zawiasowym z czternastoma resztami cysteinowymi, stanowi¹cymi element mostków dwusiarczkowych wewn¹trz i pomiêdzy ³añcuchami ciê kimi. Nie wyjaœniono czy dodatkowy ³añcuch w ³añcuchach ciê kich oraz liczba mostków dwusiarczkowych wspomagaj¹ au Nr 1 (26), wiosna 2013 Cała prawda w jednej kropli

16 DIAGNOSTYKA POD LUPĄ toagregacjê, która jest typowa dla tego izotopu (po³¹czenie s³abych niejonowych i hydrofobowych interakcji). Molekularna podstawa krioprecypytacji w mieszanych krioglobulinemiach jest mniej okreœlona, poniewa zjawisko to pojawia siê przede wszystkim w zale noœci od powstawania I.C. W przesz³oœci du ¹ wagê przypisywano do IgG jako antygenu stymuluj¹cego powstawanie czynnika reumatoidalnego IgM. Wed³ug niektórych autorów krioprecypitat czynnika reumatoidalnego ró ni siê od przeciwcia³ przeciwko IgG w zakresie niewielkiej reaktywnoœci z króliczym IgG, zwyczajowo wykorzystywanym w oznaczaniu czynników reumatoidalnych. Zale noœæ pomiêdzy krioprecypitowanym czynnikiem reumatoidalnym i IgG badano równie pod k¹tem monomerycznych podjednostek oraz fragmentów Fab pentamerycznych przeciwcia³ klasy IgM. Uzyskano wartoœæ 1 w przeciwieñstwie do obecnoœci dwóch typów przeciwcia³, prawdopodobnie dla ograniczenia sterycznego, z uwagi na niewielk¹ mo liwoœæ dostêpu do antygenu w niektórych miejscach wi¹zania. Kompleksy czynnik reumatoidalny IgM IgG s¹ obecne w temperaturze 37 o C, a zmniejszenie temperatury powoduje wzrost liczby miejsc wi¹zania dostêpnych na kompleksie czynnika reumatoidalnego. Niedawno przeprowadzone badania Qi wykaza³y istotn¹ rolê wapnia w procesie krioprecypytacji ju przy temperaturze 37 o C w interakcji pomiêdzy dwiema immunoglobulinami. Zjawisko to jeszcze œciœlej zachodzi w temperaturze 4 o C, kiedy utworzona w ten sposób I.C., zostaje poddana precypitacji tylko, je eli zachodz¹ szczególne warunki fizyczne i chemiczne takie jak, obecnoœæ wapnia lub innych kationów, jak bar lub mangan. Jednym z czynników uwa anych za wspomagaj¹cy krioprecypitacjê s¹ niektóre elementy ostrej fazy stanów zapalnych, a uwagê badaczy zwróci³a szczególnie fibronektyna. Fibronektyna jest integralnym sk³adnikiem kriofibrynogenu oraz krioprecypitatów poheparynowych, gdzie przyjmuje siê teoriê dzia³ania cz¹steczek bia³ka na wzmaganie i objawy krioprecypitacji. W szczególnoœci we wtórnych formach autoimmunologicznych procesów zapalnych, z obecnoœci¹ krioglobulin g³ównie 3. typu, wykryto jej obecnoœæ, lecz interakcje i ³¹czenie z krioprecypitatem nie zosta³y jeszcze w pe³ni zdefiniowane. FAZA PRZEDANALITYCZNA Proponowane rozwi¹zanie problemu transportu próbek biologicznych Z uwagi na brak zaleceñ dotycz¹cych konserwacji próbek, które musz¹ byæ spe³ nione w procedurze wykrywania krioglobulin, laboratoria przyjmuj¹ procedury, które uznaj¹ za najodpowiedniejsze. Dlatego weryfikacji poddaje siê seriê niejednorodnych i niepowtarzalnych sytuacji mog¹cych mieæ wp³yw na procedurê wykrywania obecnoœci krioglobulin. Proponujemy nastêpuj¹c¹ procedurê umo liwiaj¹c¹ praktyczne rozwi¹zanie tego problemu: NIEZBÊDNE MATERIA Y: 1. Termos z zakręcaną nakrętką lub pojemnik o kontrolowanej temperaturze (patrz rysunek). 2. Szklana probówka z korkiem, 40 ml (może zawierać probówkę do pobrania próbki i wody). 3. Piasek. 4. Termostat o temperaturze 37 o C. Tabela nr 3 Temperatura oznaczona w surowicy, upływ czasu Warunki zewnętrzne: t = 25 C Termos z piaskiem 37 C Termos z wodą 37 C Pojemnik z piaskiem 37 C Pojemnik z wodą 37 C 20 minut 30 minut 40 minut 37 C 36 C 32,5 C 32,5 C Procedura usuniêcia krioglobulin w kontrolowanej temperaturze W otwartym termosie powinien znajdowaæ siê piasek oraz probówka o odpowiedniej objêtoœci (powinna pomieœciæ 20/30 ml wody i nastêpnie probówkê z próbk¹) w termostacie o temperaturze 37 o C. Czas oczekiwania, aby temperatura piasku wzros³a do po ¹danej temperatury 37 o C, wynosi 24 godziny. Pobraæ próbkê krwi ylnej przy pomocy strzykawki ogrzanej do temperatury 37 o C. Otworzyæ termos i umieœciæ probówkê z próbk¹ w wiêkszej probówce. Zatkaæ wiêksz¹ probówkê, zamkn¹æ termos i przes³aæ go do laboratorium. Sposób utrzymania temperatury w probówce z próbk¹ opisano w tabeli nr 3, w której podane s¹ równie inne procedury dotycz¹ce postêpowania z próbk¹. W tabeli nr 3 podano wartoœci temperatury w próbkach, które przed przekazaniem do laboratorium przechowywano na dwa ró ne sposoby. W tabeli nr 4 znajduj¹ siê wyniki typowania przeprowadzonego na trzech seriach próbek surowicy, w trzech ró nych stadiach konserwacji podczas fazy pobierania próbek. Propozycja przedstawiona w tabeli nr 5 umo liwia zwiêkszenie odsetka próbek nadaj¹cych siê do typowania, w kontekœcie ukierunkowanych badañ nad krioglobulinami. Faza przedanalityczna: Materia³y i metody typowania krioglobulin Metoda: Ditiotreitol > 98 proc. (Sigma Aldrich) Dane dotycz¹ce DTT: Ditiotreitol: doskona³y do utrzymania grup SH w stanie redukcji, a dodany do buforu próbkowego redukuje wi¹zania dwusiarczkowe bia³ek przed SDS PAGE. DTT mo na równie wykorzystaæ w celu redukcji mostków dwusiarczkowych N, N bis (akryloil) cystaminy w elu poliakrylamidowym. DTT jest mniej toksyczny ni 2merkaptoetanol. Zazwyczaj, aby uzyskaæ efekt podobny do 2merkaptoetanolu DTT wykorzystuje siê w stê eniu siedmiokrotnie mniejszym: 100 mm DTT = 5 proc. 2merkaptoetanolu (5 proc. v/v, 700 mm). Odczynnik Clelanda DTT. C4H10O2S2 FW Mp 41 przy 44 o C. 1.1 Próbka Objêtoœæ próbki krwi niezbêdna do wykrycia krioglobulinemii wynosi 10 ml. 36,9 C 35,2C 30 C 30 C 36,5 C 34,5 C 28,5 C 28 C 50 minut 60 minut 36,4 C 34 C 27 C 26,5 C 36,3 C 32 C 26 C 25 C 16 Cała prawda w jednej kropli Biuletyn Informacyjny PZ CORMAY

17 DIAGNOSTYKA POD LUPĄ Próbkê nale y pobraæ do probówki przy pomocy strzykawki podgrzanej do temperatury 37 o C. Dziêki takiej temperaturze jest pewnoœæ, e w adnej z faz pobierania ani transportu próbki temperatura nie spadnie poni ej wartoœci 36 o C Koagulacja Pojemnik nale y przetransportowaæ do laboratorium, z uwzglêdnieniem termostatu ustawionego na temperaturê 37 o C, dla fazy koagulacji próbki krwi. Utrzymywaæ pracê termostatu przez 2/3 godz. Po koagulacji odwirowaæ probówkê w temperaturze 37 o C w celu uzyskania czystej surowicy wolnej od œladów krwinek czerwonych i/lub fibryny. 1.3 Uwaga: nie oznaczaæ surowicy ze œladami hemolizy/lipemii Tabela nr 4 Temperatura próbek po dostarczeniu do laboratorium Statystyki Termos z piaskiem i wewnętrzna probówka 37 C Pojemnik z wodą 37 C Średnia 36,1 C 30,7 C Odchylenie standardowe 2,5 C 2,7 C Zakres temperatur 31,5 C\41 C 25 C\35 C Za zakoñczenie procesu inkubacji mo na uznaæ ca³kowite utworzenie siê krio elu. Zazwyczaj czas precypitacji krio elu wynosi 3 do 7 dni. Próbki pochodz¹ce od pacjentów z HCV nale y przechowywaæ w lodówce przez 10 dni. 1.7 Brak krioprecypitatu Próbki bez obecnoœci krioglobulin. Tabela nr 5 Warunki transportu Termos z piaskiem i probówką 37 C Pojemnik z wodą 37 C W dłoni około 35 C 1.4 Laboratorium W laboratorium powinny znajdowaæ siê probówki podgrzane do temperatury 37 o C oraz probówki o temperaturze 4 o C, które pos³u ¹ do rozdzia³u surowicy na dwie porcje. 1.5 Postêpowanie z surowic¹ 1) probówka nr 1 podgrzana do temperatury 37 o C. Oznaczyæ probówkê nazwiskiem i okreœleniem 37 o C. Nastêpnie odpipetowaæ 500 mikrolitrów surowicy i zamkn¹æ probówkê korkiem. Umieœciæ w termostacie w temperaturze 37 o C. 2) probówka nr 2 sch³odzona do temperatury 4 o C. Oznaczyæ probówkê nazwiskiem i okreœleniem 4 o C. Nastêpnie odpipetowaæ pozosta³¹ surowicê i zamkn¹æ probówkê korkiem. Umieœciæ w lodówce w temperaturze 2 6 o C. Liczba Odsetek dodatniego typowania 1.8 Obecnoœæ krioprecypitatu Wzrokowo oceniæ obecnoœæ krioprecypitatu w probówce umieszczonej w lodówce. Je eli krioprecypitat jest obecny w probówce, nale y przejœæ do wykonania kolejnej czynnoœci. 1.9 Odwirowanie na zimno Odwirowaæ probówkê z krioprecypitatem, przy zachowaniu nastêpuj¹cych warunków: temperatura 4 o C, 1600 obrotów na minutê, czas wirowania 10 minut. Odczytanie kriokrytu. Po zakoñczeniu wirowania sprawdziæ wartoœæ procentow¹ krioprecypitatu w odniesieniu do ca³oœci, je eli do pomiaru u yto probówki z podzia³k¹. Nr 1 (26), wiosna 2013 Cała prawda w jednej kropli 17 11% 0% 5% Krioprecypitacja monoklonalnych krioglobulin typu 1. wydaje się zależeć od czwartorzędowej struktury węglowodanów i aminokwasów Zamiast probówki nr 2 do odczytu kriokrytu mo na wykorzystaæ probówkê z podzia³k¹. 1.6 Inkubacja probówek Czas inkubacji wynosi nie mniej ni 3 dni i rozpoczyna siê od momentu umieszczenia probówki w lodówce.

18 DIAGNOSTYKA POD LUPĄ 1.10 Iloœæ bia³ka ca³kowitego i/lub immunoglobulin oraz (opcjonalne) przygotowanie probówek 3 i 4 Oznaczyæ iloœæ w surowicy z probówki nr 1 znajduj¹cej siê w termostacie i w supernatancie z probówki nr 2 znajduj¹cej siê w lodówce, a nastêpnie odwirowanej. Ró nica pomiêdzy uzyskanymi wynikami wskazuje na zawartoœæ i stê enie krioglobulinemii i obecne klasy immunoglobulin Przygotowanie buforu fosforanowego do p³ukania krioprecypitatów Roztwór 1: rozpuœciæ w 500 ml wody destylowanej 3,4 g KH2PO4 (PM 136). Roztwór 2: rozpuœciæ w 500 ml wody destylowanej 4,45 g Na2HPO4.2H2O (PM 178). Aby uzyskaæ ostateczny roztwór roboczy nale y zmieszaæ 185 ml Roztworu 1 i 315 ml Roztworu 2. Nastêpnie dodaæ PEG 600 (v/v), aby uzyskaæ 3 proc. roztwór PEG. Roztwór ten nale y przechowywaæ w temperaturze 2 6 o C Przygotowanie roztworu ditiotreitolu w buforze Odwa yæ 0,5 g ditiotreitolu i rozpuœciæ go w 100 ml buforu fosforanowego (ph 7,2) lub buforu u ywanego w procesie elektroforezy. Roztwór przechowywany w lodówce i bez dostêpu œwiat³a zachowuje stabilnoœæ przez 1 rok P³ukanie krio elu Proces p³ukania odbywa siê w probówce nr 2 przechowywanej w lodówce. Ostro nie usun¹æ supernatant, uwa aj¹c aby nie usun¹æ jednoczeœnie czêœci krioprecypitatu. Dodaæ bufor fosforanowy z lodówki, ph = 7,2, w nastêpuj¹cy sposób: umieœciæ w probówce niewielk¹ iloœæ buforu, ponownie zawiesiæ krioprecypitat, zachowuj¹c przy tym szczególn¹ ostro noœæ, odwirowaæ na zimno (4 o C) probówkê, w taki sam sposób jak opisano w punkcie 1.9, usun¹æ supernatant z krio elu, powtórzyæ operacjê w 3/4 cyklach. Po zakoñczeniu ostatniego p³ukania usun¹æ bufor. Próbka zosta³a przygotowana do dysagregacji Postêpowanie z próbk¹ i roztworem ditiotreitolu przed typowaniem Umieœciæ szczelnie zamkniêt¹ probówkê z wyp³ukanym precypitatem na godzinê w k¹pieli wodnej w temperaturze 37 o C. Umieœciæ probówkê z ditiotreitolem w buforze na godzinê w k¹pieli wodnej o temperaturze 37 o C Rozcieñczenie krioprecypitatu roztworem ditiotreitolu. Metoda wzrokowa Oparta o zmêtnienie zawiesiny. Powtarzane rozcieñczenia: bardzo mêtna próbka = 1 czêœæ 3 czêœci ditiotreitolu, mêtna próbka = 1 czêœæ 2 czêœci ditiotreitolu, przejrzysta próbka = 1 czêœæ 1 czêœæ ditiotreitolu. Metoda eksperymentalna W oparciu o ró nicê stê eñ pomiêdzy probówk¹ nr 1 i supernatantem w probówce nr 2 oceniliœmy nastêpuj¹ce rozcieñczenia: 1) ró nica pomiêdzy IgG oko³o 200 mg/dl, rozcieñczenie 1:2. 2) ró nica pomiêdzy IgM oko³o 150 mg/dl, rozcieñczenie 1:2. 3) ró nica pomiêdzy IgA oko³o 150 mg/dl, rozcieñczenie 1:2. 4) ró nica pomiêdzy IgG/IgA/IgM równa lub mniejsza ni 100 mg/dl, rozcieñczenie 1: Temperatura rozcieñczonej próbki Rozcieñczone próbki nale y przechowywaæ w k¹pieli wodnej przez godzinê Temperatura przyrz¹dów (koñcówki mikropipet, pojemniki, itp.) Przyrz¹dy przechowywaæ w termostacie w temperaturze 37 o C Postêpowanie z próbk¹ przeznaczon¹ do typowania Wyj¹æ probówki zawieraj¹ce materia³ do oznaczeñ z k¹pieli wodnej i umieœciæ w pojemniku z wod¹ o temperaturze o C. Pozwoli to unikn¹æ nara enia probówek na nag³e zmiany temperatury. Przenieœæ pojemnik na blat roboczy. Nie wyjmuj¹c probówek z wody, szybko przenieœæ materia³ do studzienek jednorazowego pojemnika na próbki Ustawiæ program krioglobuliny w analizatorze Interlab Program pozwala wykonaæ immunofiksacjê krioglobulin, posiada nastêpuj¹c¹ charakterystykê: Zaprogramowanie podgrzania elu Umo liwia podgrzanie elu agarozowego do temperatury 37 o C. Dziêki temu próbka zawieraj¹ca krioglobuliny nie zostaje poddana gwa³townym zmianom temperatury podczas nanoszenia próbki. Zaprogramowanie immunofiksacji krioglobulin Temperatura naniesienia materia³u biologicznego = 37 o C. Umo liwia naniesienie próbki w kontrolowanej temperaturze, dziêki czemu nie rozpocznie siê proces precypitacji krio elu. Temperatura 37 o C podczas fazy migracji. Umo liwia migracjê krio elu bez nara enia na gwa³towne zmiany temperatury. 18 Cała prawda w jednej kropli Biuletyn Informacyjny PZ CORMAY

19 PRZYPADKI KLINICZNE Krioglobulinemia Każdy z Państwa może zaangażować się w tworzenie tego działu. Jeżeli spotkali się Państwo z interesującym, nietypowym przypadkiem, chętnie go opublikujemy. Mamy nadzieję, że te przypadki będą edukacyjnym narzędziem w doskonaleniu Państwa umiejętności diagnostycznych. We Włoszech, Hiszpanii i Francji, jak również prawdopodobnie w innych krajach śródziemnomorskich, występowanie krioglobulinemii jest dosyć powszechne (od 30 do 50 proc. pacjentów jest zakażonych HCV). Z kolei w krajach anglosaskich (UK, USA) występuje ona stosunkowo rzadko (u około 2 proc.). Atlas Krioglobuliny poddane immunofiksacji Typ 1 krioglobulin wg Broueta IgGK i brak form poliklonalnych Typ 3 krioglobulin wg Broueta poliklonalna IgG Typ 2 krioglobulin wg Broueta IgM RF i poliklonalna IgG Mikroheterogenność krioglobulin wg Musseta IgGK i poliklonalna IgMK wolne κ poliklonalne λ Nr 1 (26), wiosna 2013 Cała prawda w jednej kropli 19

20