Wpływ adhezji i wytwarzania śluzu na zdolność tworzenia biofilmu przez

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 37-44 Emilia Ciok-Pater, Przemysław Smolak, Joanna Wróblewska, Eugenia Gospodarek Wpływ adhezji i wytwarzania śluzu na zdolność tworzenia biofilmu przez Candida sp. Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Kierownik: dr hab. n. med. E. Gospodarek, prof. UMK Ocenę wytwarzania śluzu i zdolności adhezji do polistyrenu przeprowadzono u 50 szczepów Candida sp. izolowanych od pacjentów Kliniki Anestezjologii i Intensywnej Terapii Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy, wykorzystując odpowiednio metody według Christensena i wsp. oraz Richardsa. Zdolność tworzenia biofilmu oceniano metodą redukcji TTC na powierzchni dwóch biomateriałów: lateksie silikonowanym i polichlorku winylu. Stwierdzono zależność między wytwarzaniem śluzu i adhezją a zdolnością tworzenia biofilmu. W ostatnich latach notuje się wzrost częstości występowania zakażeń szpitalnych o etiologii Candida sp. Zakażenia te związane są, między innymi, ze zdolnością Candida sp. do tworzenia biofilmu na powierzchni różnych biomateriałów stosowanych w medycynie. Ponadto, stanowią one poważny problem terapeutyczny, ze względu na oporność grzybów tworzących biofilm na obecnie stosowane antymikotyki. Do czynników wirulencji Candida sp. zalicza się, między innymi, wytwarzanie śluzu czy zdolność przylegania do powierzchni. Wytwarzanie śluzu jest ważnym wskaźnikiem określającym zdolność przylegania grzybów do różnych powierzchni komórek gospodarza. Wchodzi w skład czynników umożliwiających tworzenie biofilmu. Odgrywa ważną rolę w patogenezie grzybic, również tych związanych ze stosowaniem biomateriałów (2, 10, 15). Ważnym czynnikiem drożdży jest przyleganie, czyli adhezja. Jest ona pierwszym etapem zakażenia, poprzedza kolonizację tkanek i narządów (9). Celem pracy była ocena wpływu wytwarzania śluzu i adhezji Candida sp. na zdolność tworzenia biofilmu na powierzchni wybranych biomateriałów. MATERIAŁ I METODY Badaniem objęto 50 szczepów Candida sp. izolowanych od chorych Kliniki Anestezjologii i Intensywnej Terapii Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy. Szczepy te izolowano w 2009 roku.

38 E. Ciok-Pater i inni Nr 1 W celu oceny przynależności gatunkowej drożdże wysiewano na agar Sabourauda (bio- Mérieux) i inkubowano 24 godziny w temperaturze 37 C. Identyfikację szczepów Candida sp. przeprowadzono na podstawie wyników reakcji biochemicznych ujętych w testach API 20C AUX (biomérieux). Przynależność gatunkową badanych szczepów przedstawiono na rycinie 1. Ocenę zdolności wytwarzania pozakomórkowego śluzu przez badane szczepy Candida sp. przeprowadzono w bulionie tryptozowo sojowym (Trypticase Soy Broth, TSB, biomérieux), w dwóch wariantach temperaturowych (22 i 37 C) i czasowych (24-48 godzin), według Christensena i wsp. (5), w modyfikacji podanej przez Davenport i wsp. (6) oraz Branchini i wsp. (2). Uzyskane wyniki oceniano posługując się czterostopniową skalą wytwarzania śluzu: bardzo silne (+++), silne (++), słabe (+) oraz brak (-). Jako wynik dodatni uznawano obecność wybarwionej safraniną warstwy na wewnętrznej powierzchni dołka płytki polistyrenowej. Brak takiej warstwy określono jako wynik ujemny. Ocenę zdolności adhezji szczepów Candida sp. do polistyrenu wykonano zgodnie z metodą Richardsa i wsp. (wg 13). Otrzymane wyniki oceniano posługując się czterostopniową skalą: bardzo silna (+++), silna (++), słaba (+) oraz brak (-) adhezji. Ocenę tworzenia biofilmu przez badane szczepy prowadzono stosując własną modyfikację metody (hodowle delikatnie wytrząsano przez dwie pierwsze z 72 godzin inkubacji) opisanej przez Richardsa i wsp. (wg 13), na powierzchni: lateksu silikonowanego (AMSINO) i polichlorku winylu (Unomedical). Zdolność tworzenia biofilmu na każdym z badanych biomateriałów oceniano w czterostopniowej skali: bardzo silna, silna, słaba i brak. WYNIKI Wśród 50 szczepów Candida sp. po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 22ºC bardzo silne wytwarzanie śluzu notowano u 7 (14,0%), silne u 8 (16,0%) oraz słabe u 21 (42,0%) szczepów. Po 48 godzinach inkubacji w tych samych warunkach temperaturowych bardzo silne i silne wytwarzanie śluzu stwierdzono u 11 (22,0%), a słabe u 22 (44,0%) szczepów. W wyniku 24 godzinnej inkubacji badanych szczepów w temperaturze 37ºC śluz wytwarzały 34 (68,0%) szczepy. Po dwóch dobach inkubacji bardzo silne wytwarzanie śluzu wykazano u 10 (20,0%), silne u 14 (28,0%), a słabe u 21 (42,0%) szczepów. Szczegółowe wyniki tej oceny przedstawiono w tabelach I i II. Badane szczepy C. albicans wykazywały bardzo silne, silne oraz słabe właściwości adhezyjne po dobie inkubacji w temperaturze 37ºC odpowiednio: 1 (3,7%), 5 (18,5%) oraz 17 (63,0%) (Ryc. 2). Po 24 godzinnej hodowli bardzo silną adhezję do polistyrenu wykazywało 8 (34,8%) szczepów gatunków innych niż C. albicans (cztery szczepy C. tropicalis, trzy szczepy C. parapsilosis i jeden szczep C. glabrata), silną 6 (26,1%) szczepów (trzy szczepy C. glabrata oraz po jednym szczepie C. parapsilosis, C. krusi, C. lipolytica) oraz słabą 7 (30,4%) (trzy szczepy C. glabrata oraz po jednym szczepie C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusi i C. famata) (Ryc. 3). Zdolność tworzenia biofilmu na wybranych biomateriałach przedstawia tabela III. Po trzech dobach inkubacji w temperaturze 37ºC na powierzchni lateksu silikonowanego stwierdzono bardzo silne wytwarzanie biofilmu u 9 (18,0%) szczepów, silne u 19 (38,0%)

Nr 1 Tworzenie biofilmu przez Candina sp. 39 Tabela I. Zdolność tworzenia śluzu przez szczepy Candida sp. (n=50) w temperaturze 22ºC 24 godziny inkubacji 48 godzin inkubacji Gatunek C. albicans (n=27) C. glabrata (n=8) C. tropicalis C. parapsilosis C. famata (n=2) C. krusei (n=2) C. lipolytica (n=1) Ogółem (n=50) Bardzo silne Silne Słabe Bardzo silne Silne Słabe n % n % n % n % n % n % 1 2,0 1 2,0 15 30,0 2 4,0 4 8,0 16 32,0 2 4,0 2 4,0 1 2,0 4 8,0 1 2,0 3 6,0 1 2,0 3 6,0 1 2,0 2 4,0 3 6,0 0 0,0 3 6,0 0 0,0 2 4,0 3 6,0 0 0,0 2 4,0 0 0,0 1 2,0 0 0,0 0 0,0 1 2,0 0 0,0 0 0,0 1 2,0 1 2,0 0 0,0 2 4,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 1 2,0 0 0,0 0 0,0 1 2,0 7 14,0 8 16,0 21 42,0 11 22,0 11 22,0 22 44,0 Tabela II. Zdolność tworzenia śluzu przez szczepy Candida sp. (n=50) w temperaturze 37ºC Gatunek C. albicans (n=27) C. glabrata (n=8) C. tropicalis C. parapsilosis C. famata (n=2) C. krusei (n=2) C. lipolytica (n=1) Ogółem (n=50) 24 godziny inkubacji 48 godzin inkubacji Bardzo silne Silne Słabe Bardzo silne Silne Słabe n % n % n % n % n % n % 0 0,0 1 2,0 15 30,0 1 2,0 7 14,0 15 30,0 0 0,0 3 6,0 2 4,0 3 6,0 2 4,0 2 4,0 1 2,0 2 4,0 2 4,0 1 2,0 2 4,0 2 4,0 2 4,0 1 2,0 1 2,0 3 6,0 1 2,0 1 2,0 0 0,0 0 0,0 1 2,0 0 0,0 1 2,0 0 0,0 0 0,0 1 2,0 1 2,0 0 0,0 1 2,0 1 2,0 0 0,0 0 0,0 1 2,0 0 0,0 0 0,0 1 2,0 3 6,0 8 16,0 23 46,0 8 16,0 14 28,0 22 44,0

40 E. Ciok-Pater i inni Nr 1 54,0% 16,0% 10,0% 10,0% C. albicans (n=27) C. glabrata (n=8) C. paraps ilos is C. tropic alis (n= 5) C. k rus ei (n=2) C. famata (n=2) C. lipolytic a (n= 1) 2,0% 4,0% 4,0% Ryc. 1. Przynależność gatunkowa badanych szczepów Candida sp. (n=50) 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0% 63,0% 18,5% 3,7% B ardz o s ilna S ilna S łaba Ryc. 2. Zdolność adhezji C. albicans (n=27) do polistyrenu po 24 godzinach w temperaturze 37ºC 35,0% 30,0% 25,0% 20,0% 15,0% 10,0% 5,0% 0,0% 34,8% 30,4% 26,1% B ardz o s ilna S ilna S łaba Ryc. 3. Zdolność adhezji szczepów innych gatunków niż C. albicans (n=23) do polistyrenu po 24 godzinach w temperaturze 37ºC

Nr 1 Tworzenie biofilmu przez Candina sp. 41 Tabela III. Zdolność tworzenia biofilmu przez szczepy Candida sp. (n=50) po 72 godzinach inkubacji w temperaturze 37ºC Lateks silikonowany Polichlorek winylu Gatunek Bardzo Bardzo Silna Słaba silna silna Silna Słaba n % n % n % n % n % n % C. albicans (n=27) 3 6,0% 9 18,0% 12 24,0% 6 12,0% 11 22,0% 8 16,0% C. glabrata (n=8) 2 4,0% 6 12,0% 0 0,0% 2 4,0% 5 10,0% 1 2,0% C. tropicalis 2 4,0% 2 4,0% 1 2,0% 2 4,0% 2 4,0% 1 2,0% C. parapsilosis 1 2,0% 0 0,0% 4 8,0% 1 2,0% 2 4,0% 2 4,0% C. famata (n=2) 0 0,0% 1 2,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 2,0% 0 0,0% C. krusei (n=2) 1 2,0% 0 2,0% 1 2,0% 1 2,0% 1 2,0% 0 0,0% C. lipolytica (n=1) 0 0,0% 1 2,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 2,0% Ogółem (n=50) 46 (92,0%) 47 (94,0%) oraz słabe u 18 (36,0%) szczepów. Na powierzchni polichlorku winylu wykazano bardzo silne tworzenie biofilmu u 12 (24,0%) szczepów, silne u 22 (44,0%) oraz słabe u 13 (26,0%) szczepów. DYSKUSJA Biofilm stał się poważnym problemem współczesnej medycyny. Zakażenia z jego udziałem sprawiają trudności terapeutyczne związane z opornością na mechanizmy obronne gospodarza oraz na stosowane leki. Użycie u chorych cewników, drenów, protez, zastawek czy zespoleń naczyniowych skłania do badania cech, które wpływają na zdolność tworzenia biofilmu przez bakterie i grzyby (1, 3, 11, 12, 14, 17). Ważnym czynnikiem predysponującym do tworzenia biofilmu jest zdolność wytwarzania śluzu, który ułatwia przyleganie grzybów do tkanek i powierzchni biomateriałów oraz utrudnia ich penetrację (4, 8, 16). Cecha ta może być kształtowana zmiennymi warunkami środowiska. Vinitha i Ballal (17) oceniali zdolność tworzenia biofilmu przez 27 szczepów gatunków innych niż C. albicans i 7 szczepów C. albicans izolowanych od chorych intensywnej terapii oraz od pacjentów dializowanych. Wykazali oni częstsze wytwarzanie śluzu przez szczepy gatunków innych niż C. albicans, tj. po 11 szczepów wytwarzało śluz bardzo silnie i silnie, a dwa słabo. Natomiast wśród C. albicans po trzy szczepy wytwarzały śluz silnie i słabo. Autorzy stwierdzili, że wczesne wykrycie zdolności wytwarzania śluzu przez grzyby może być przydatne we wstępnym rozpoznaniu zakażenia grzybiczego, gdzie jednym z głównych czynników wirulencji jest biofilm. Zer i wsp. (18) badali wytwarzanie śluzu przez 205 szczepów Candida sp. Zdolność tę odnotowali u 53,9% szczepów C. albicans i 67,8% gatunków innych niż C. albicans. Badania Szymankiewicz i wsp. (16) wykazały

42 E. Ciok-Pater i inni Nr 1 zdolność wytwarzania śluzu u wszystkich gatunków Candida sp. po 48 godzinach inkubacji w temperaturze 37ºC. W niniejszej pracy, badając zdolność tworzenia śluzu przez Candida sp. stwierdzono ją u wszystkich gatunków Candida sp. Częściej śluz był wytwarzany przez szczepy gatunków innych niż C. albicans zwłaszcza po przedłużeniu czasu inkubacji do 48 godzin. Nie wykazano wpływu temperatury na zdolność jego tworzenia. Adhezja Candida sp. do komórek gospodarza jest istotnym czynnikiem zapoczątkowującym zakażenie. Drożdże dzięki zdolności przylegania do powierzchni różnych biomateriałów stosowanych w medycynie mogą tworzyć biofilm, który ma niekorzystne znaczenie w rozwoju zakażenia. W badaniach własnych oceniano adhezję do polistyrenu. Stwierdzono, że gatunki inne niż C. albicans wykazujące zdolność wytwarzania śluzu częściej ujawniały zdolność adhezji. Najwyższą zdolność przylegania notowano wśród szczepów C. tropicalis (80,0%). Vinitha i Ballal (17) stwierdzili wyższy odsetek szczepów gatunków innych niż C. albicans wytwarzających biofilm. Ponad 63% szczepów gatunków innych niż C. albicans, izolowanych z krwi, wykazało zdolność do tworzenia biofilmu, w porównaniu z 42,9% szczepów C. albicans. Badania własne potwierdzają wyniki Vinitha i Ballal (17). Częściej stwierdzono zdolność tworzenia biofilmu wśród szczepów gatunków innych niż C. albicans. Hawser i Douglas (7) oceniali zdolność tworzenia biofilmu Candida sp. na powierzchni lateksu silikonowanego i polichlorku winylu. Stwierdzili częstsze wytwarzanie biofilmu na powierzchni lateksu silikonowanego niż polichlorku winylu. Uzyskane wyniki są odmienne. Stwierdzono podobny odsetek szczepów tworzących biofilm na obu badanych powierzchniach biomateriału. Przedstawione wyniki badań własnych świadczą o wpływie śluzu i adhezji na zdolność tworzenia biofilmu przez drożdże z rodzaju Candida. Stwierdzono zależność między wybranymi właściwościami biologicznymi a zdolnością tworzenia biofilmu. Dokładniejsze poznanie czynników wpływających na tworzenie biofilmu, np. czasu inkubacji, temperatury, mogłoby w przyszłości doprowadzić do lepszego poznania procesu tworzenia przez drożdże biofilmu oraz wprowadzenia działań prewencyjnych jego powstawania. WNIOSKI 1. Większość badanych szczepów Candida sp. wykazała zdolność wytwarzania śluzu i adhezji. 2. Drożdże z rodzaju Candida posiadają zdolność tworzenia biofilmu na powierzchni lateksu silikonowanego i polichlorku winylu. Gatunki inne niż C. albicans częściej wykazywały tę cechę niż szczepy C. albicans. 3. Właściwości biologiczne drożdży Candida sp. takie jak wytwarzanie śluzu czy adhezja predysponują do tworzenia biofilmu.

Nr 1 Tworzenie biofilmu przez Candina sp. 43 E. Ciok-Pater, P. Smolak, E. Gospodarek Influence of slime production and adhesion of Candida sp. on biofilm formation SUMMARY The increase of fungal infections in recent years is connected with the progress in medicine. The vast usage of biomaterials is an inseparable element of contemporary medicine but it also leads to development of infections. Yeast-like fungi Candida albicans are still the main pathogen of candidiasis. The ability to slime production and adhesion to polystyrene of Candida sp. on different surfaces can cause to form biofilm on surfaces of biomaterials used in production of catheters, drains and prosthesis. The aim of the study was to evaluate the influence of slime production and adhesion to polystyrene, of Candida sp. on biofilm formation on different biomaterials. 50 strains of Candida sp. were examined. They isolated from ill to Clinics of Anesthesiology and Intensive Therapy University Hospital No 1 of dr. A. Jurasza in Bydgoszcz. The ability to slime production was evaluated by Christensen method in modification Davenport and Branchini methods. The adhesion to polystyrene was evaluated by Richards et el method. The ability to produce biofilm biomaterials by the studied fungi was measured after 72 hours of incubation at 37ºC on different biomaterials. Yeast-like fungi Candida sp. fabricating slime and adhesion forming frequently biofilm on surface researched of biomaterials. Influence of chosen biological specificity ascertain on the ability to produce biofilm on surfaces of siliconized latex and polyvinylchloride. PIŚMIENNICTWO 1. Bizerra FC, Nakamura CV, de Poersch C i inni. Characteristics of biofilm formation by Candida tropicalis and antifungal resistance. FEMS Yeast Res 2008; 8: 442-50. 2. Branchini ML, Pfaller MA, Rhine-Chalberg J i inni. Genotypic variation and slime production among blood and catheter isolates of Candida parapsilosis. J Clin Microbiol 1994, 32: 452-6 3. Chandra J, Kuhn DM, Mukherjee PK i inni. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development architecture and drug resistance. J Bacteriol 2001; 183: 5385-94. 4. Chen H, Fujita M, Feng Q, Clardy J, Fink GR. Tyrosol is a quorum sensing molecule in Candida albicans. Proc Natl Acad Sci 2004, 101: 5048-52. 5. Christensen GD, Simpson WA, Bisno AL, Beachey EH. Adherence of slime-producing strains of Staphylococcus epidermidis to smooth surfaces. Infect Immun 1982, 37: 318-26. 6. Davenport DS, Massanari RM, Pfaller MA i inni. Usefulness of a test for slime production as a marker for clinically significant infections with coagulase - negative staphylococci. J Infect Dis 1986, 153: 332-9. 7. Hawser SP, Douglas LJ. Biofilm Formation by Candida species on the Surface of Catheter Materials In Vitro. Infection and Immunity, 1994, 3: 915-21 8. Hazen KC, Cutler JE. Isolation and purification of morphogenic autoregulatory substancje produced by Candida albicans. J Biochem 1983, 94: 777-83 9. Macura AB. Przyleganie grzybów z rodzaju Candida do komórek ssaków. Post Mikrobiol 1993, 32: 321-35. 10. Ozkan S, Kaynak F, Kalkanci A i inni. Slime production and proteinase activity of Candida species isolated from blood samples and the comparison of these activities with minimum inhibitory concentration values of antifungal agents. Mem Inst Oswaldo Cruz 2005, 100: 319-24. 11. Ramage G, Martinez JP, López-Ribot JL. Candida biofilms on implanted biomaterials: a clinically significant problem. FEMS Yeast Res 2006; 6: 979-86.

44 E. Ciok-Pater i inni Nr 1 12. Ramage G, Saville SP, Thomas DP, López-Ribot J. Candida biofilms: an update. Eukaryot Cell 2005; 4: 633-8. 13. Różalska B.., Sadowska B, Więckowska M, Rudnicka W. Wykrywanie biofilmu bakteryjnego na biomateriałach medycznych. Med Dośw Mikrobiol 1998, 50: 115-22. 14. Shin JH, Kee SJ, Shin MG i inni. Biofilm production by isolates of Candida species recovered from nonneutropenic patients: comparison of bloodstream isolates with isolates from other sources. J Clin Microbiol 2002; 40: 1244-8. 15. Szymankiewicz M, Janicka G, Sieradzka E, Krawiecka D. Ocena produkcji śluzu i właściwości hydrofobowych u wybranych grzybów z rodzaju Candida. Pro Med Res 2003, 1: 32-46 16. Szymankiewicz M, Janicka G, Sieradzka E, Krawiecka D. Wpływ podłoża na zdolność wybranych gatunków grzybów z rodzaju Candida do wytwarzania śluzu. Mikol Lek 2002, 9: 97-100. 17. Vinithia M, Ballal M. Biofilm as virulence marker in Candida isolated from blood. World J Med Sci 2007; 2: 46-8. 18. Zer Y, Balci I, Meric G. Identification and antifungal susceptibility of Candida isolated from intensive care unit patients. New Microbiol 2002, 25: 489-94. Otrzymano: 24 I 2011 r. Adres Autora: 85-094 Bydgoszcz ul. M. Curie-Skłodowskiej 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum w Bydgoszczy Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu