Algorytmy postępowania w diagnostyce zakażeń wirusów przenoszonych przez krew Ewa Sulkowska, Piotr Grabarczyk Zakład Wirusologii IHiT XIX Zjazd PTDL Wrzesień 2017, Kraków
Dawca krwi, kandydat na dawcę wiek 18-65 lat, ogólnie dobry stan zdrowia, posiadać dokument ze zdjęciem, PESEL lub odpowiednik, władać językiem polskim w mowie i piśmie w stopniu umożliwiającym samodzielne wypełnienie kwestionariusza.
Wykrywanie czynników zakaźnych Metody: serologiczne - testy przeglądowe, - testy potwierdzenia, biologii molekularnej - testy przeglądowe, - testy potwierdzenia, Testy przeglądowe - powszechnie wykonywane w celu wykrycia markerów zakażenia, Testy potwierdzenia potwierdzenie swoistości wyniku powtarzalnie reaktywnego badania przeglądowego.
Zakażenia HCV, HBV, HIV u dawców krwi w Polsce w latach 2005-2015 dane skumulowane Liczba dawców Dodatnich Zbadanych HCV HBV HIV HCV/HBV/HIV serodo datnie WP wszyscy OBI WP wszyscy serodo datnie WP wszyscy Razem n/% Wszyscy dawcy 6 408 819 7055 71 7126 151 44 195 434 15 449 7770/0,12% Pierwszora zowi 2 287 591 6582 15 6597 42 14 56 191 1 192 6845/0,3% Wielokrotni 4 121 228 473 56 529 109 30 139 243 14 257 925/0,02% Mężczyźni 4 657 855 4943 59 5002 140 30 179 388 15 403 5584/0,11% Kobiety 1 598 712 2007 12 2019 11 5 16 37 0 37 2072/0,12%
Metody badań przeglądowych dawców - skracanie okienka diagnostycznego Markery niespecyficzne Badanie przeciwciał Badanie antygenów wirusowych Wykrywanie wirusowego RNA/DNA ALT Anty-HIV Anty-HCV HBsAg NAT HCV RNA HIV-1/2 RNA HBV DNA B19V HAV
Wirusologiczne badania przeglądowe metodami immunoenzymatycznymi CMIA (Architect) schemat reakcji + + Mikropartcle Sample Acridinium Conjugate Inkubation Antibody - Antigen - Antibody Complex Trigger NaOH Pre - Trigger H2 O2 * e- Photon + CO2
Wirusologiczne badania przeglądowe metodami immunoenzymatycznymi (VITROS)- schemat reakcji Ścianka mikrocelki białka wirusa przeciwciała z surowicy koniugat znakowany HRP luminescencja
Wirusologiczne badania przeglądowe metodami immunoenzymatycznymi (ROCHE)- schemat reakcji ECLIA: elektrochemiluminescencyjny test immunologiczny
Wirusologiczne badania przeglądowe metodami immunoenzymatycznymi (BIORAD)- schemat reakcji ELISA
Algorytm badań przeglądowych dla wszystkich krwiodawców (CKiK) Obwieszczenie Ministra Zdrowia z dnia 09 czerwca 2017 w sprawie wymagań dobrej praktyki pobierania krwi i jej składników, badania, preparatyki, przechowywania, wydawania i transportu dla jednostek organizacyjnych publicznej służby krwi.
Badania weryfikacyjne Badania weryfikacyjne w kierunku zakażenia wirusami HCV, HBV i HIV w przypadku powtarzalnie reaktywnego wyniku przeglądowego testu serologicznego - obligatoryjne dla wszystkich krwiodawców (pierwszorazowych i wielokrotnych). Weryfikacje metodami serologicznymi w kierunku zakażenia wirusami HCV i HIV wykonywane są w ośrodku referencyjnym; testy potwierdzenia dla HBsAg wykonują CKiK. Dodatkowe badania w kierunku nosicielstwa wirusa HBV (anty-hbc w klasach: IgG i IgM oraz HBe Ag/Ab) przeprowadzane są w ośrodku referencyjnym. Obwieszczenie Ministra Zdrowia z dnia 09 czerwca 2017 w sprawie wymagań dobrej praktyki pobierania krwi i jej składników, badania, preparatyki, przechowywania, wydawania i transportu dla jednostek organizacyjnych publicznej służby krwi.
Algorytm badań HBsAg (HBV) Obwieszczenie Ministra Zdrowia z dnia 09 czerwca 2017 w sprawie wymagań dobrej praktyki pobierania krwi i jej składników, badania, preparatyki, przechowywania, wydawania i transportu dla jednostek organizacyjnych publicznej służby krwi.
Algorytm badań anty-hcv Obwieszczenie Ministra Zdrowia z dnia 09 czerwca 2017 w sprawie wymagań dobrej praktyki pobierania krwi i jej składników, badania, preparatyki, przechowywania, wydawania i transportu dla jednostek organizacyjnych
Algorytm badań anty-hiv1/2 lub HIV1/2 Ag/Ab Obwieszczenie Ministra Zdrowia z dnia 09 czerwca 2017 w sprawie wymagań dobrej praktyki pobierania krwi i jej składników, badania, preparatyki, przechowywania, wydawania i transportu dla jednostek organizacyjnych publicznej służby krwi.
Wprowadzanie badań NAT na świecie International survey on NAT testing of blood donations: expanding implementation and yield from 1999 to 2009 /Vox Sanguinis (2012) 102, 82 90/ 33 33 12 (15)
Systemy/Czułość badań NAT w Polsce Badania NAT w pojedynczych donacjach Badania NAT w MP 50 40 30 20 10 0 2005-2006 Procleix Ultrio 2007-2010 Procleix Ult.Tygris Procleix Ultrio (półautomatyczny) 2011-2013 Procleix Ultr Plus 2014-2015 Procleix Ultrio Elite HCV IDT HBV IDT HIV Procleix UltrioTygris Procleix Ultrio Plus HCV IDT HIV IDT HBV Procleix Ultrio Elite Lata 2005-2006 2007-2010 2011-2013 2014-2015 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 2005-2006 2007-2011 2012-2015 Cobas Ampliscreen (MP24) Cobas Taqscreen MPX v1 (MP6) HIV MP HCV MP HBV Cobas Ampliscreen (MP24) Cobas Taqscreen MPX v1 (MP6) Cobas Taqscreen v2 MP (MP6) Cobas Taqscreen MPX v2 (MP6) IDT w IU/ml HCV 2,8 3 3 3 HBV 7,5 10 2,1 4,3 HIV 32,3 45 27,6 18 MP w IU/ml lata 2005-2006 2007-2011 2012-2015 HIV 1400 294 303 HCV 504 66 41 HBV 360 22,8 13,8
Zalecenia dotyczące czułości NAT (Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components, Recommendation No.R(95)15, 18th Edition) Marker Min. detekcja dla donacji Kontrola wewnętrzna (IC) HBV-NAT 24 IU/ml w każdej reakcji
Metody NAT w Polsce testy multiplex PCR TMA Liza Liza Odwrotna transkrypcja Odwrotna transkrypcja Synteza DNA Powielanie DNA Powielanie RNA 10 9 amplikonów DNA 10 9 amplikonów RNA cobas e6800/8800 system Procleix Panther System
Format badań NAT w Polsce (2017) Badania obowiązkowe HCV RNA, HBV DNA, HIV RNA Badania osocza w pulach: 6 donacji cobas S201 Roche test MPX v2 (12 RCKiK) 4 donacje Panther Grifols test Ultrio Elite (RCKiK Olsztyn) Badania w pojedynczych donacjach: Panther Grifols test Ultrio Elite (6 CKiK) Laboratorium Referencyjne (IHiT, Warszawa)
Przeglądowe badania NAT w pojedynczych donacjach (Grifols) Badana próbka Test przeglądowy Wynik ujemny Wynik reaktywny Krew do wykorzystania Nastawić badanie w 2 powtórzeniach oraz testy różnicujące (test przeglądowy) Wyniki 2 x ujemny, test różnicujący ujemny: krew nie do celów leczniczych Wyniki 2 x reaktywny: krew zniszczyć; nieotwierana próbka krwi do weryfikacji Wyniki 1 x reaktywny, 1 x ujemny: krew zniszczyć; próbka krwi do weryfikacji Obwieszczenie Ministra Zdrowia z dnia 09 czerwca 2017 w sprawie wymagań dobrej praktyki pobierania krwi i jej składników, badania, preparatyki, przechowywania, wydawania i transportu dla jednostek organizacyjnych publicznej służby krwi.
Przeglądowe badania NAT w pulach (Roche) Badana próbka Test przeglądowy Wynik ujemny Wynik reaktywny test multiplex zbadać pojedyncze próbki Krew do wykorzystania Wynik ujemny krew do wykorzystania W 1 próbce reaktywny test różnicujący, pozostałe do zwolnienia. Obwieszczenie Ministra Zdrowia z dnia 09 czerwca 2017 w sprawie wymagań dobrej praktyki pobierania krwi i jej składników, badania, preparatyki, przechowywania, wydawania i transportu dla jednostek organizacyjnych publicznej służby krwi.
Badanie parvowirusa B19 w pulach osocza do produkcji preparatów osoczopochodnych - podstawy prawne European Pharmacopoeia Monographs: Human anti-d immunoglobulin & Human anti-d immunoglobulin for intravenous administration (Sep. 2016) Human plasma (pooled and treated for virus inactivation) EUROPEAN PHARMACOPOEIA 5.0 (July 2005) Pula produkcyjna osocza nie powinna zawierać więcej niż 10 4 IU DNA parvowirusa B19 /ml
Badanie B19V u wybranych dawców w Polsce Obwieszczenie Ministra Zdrowia z dnia 09 czerwca 2017 w sprawie wymagań dobrej praktyki pobierania krwi i jej składników, badania, preparatyki, przechowywania, wydawania i transportu dla jednostek organizacyjnych publicznej służby krwi. U dawców, których krwinki służą do immunizacji (badanie wykonuje się w pojedynczych próbkach) (10.4.2) Krew pobrana do uodparniania podlega 6 miesięcznej karencji (w stanie zamrożenia). Pod koniec okresu karencji należy skontrolować u dawcy markery zakażeń wirusowych metodami serologicznymi oraz metodami biologii molekularnej (8.2.4.2) W osoczu od dawców zimmunizowanych przeznaczonym do produkcji immunoglobuliny anty-rhd i anty-hbs (badania wykonuje się w pulach) (10.4.2)
Badanie NAT Parvowirusa B19 Badana próbka PULA: MP-96 DPX HAV/B19V PCR MP-16 Procleix HAV/B19V TMA Wynik ujemny Wynik reaktywny zbadać pojedyncze próbki (TMA) Wynik reaktywny (PCR) zbadać pule MP-12 Krew do wykorzystania Wynik ujemny krew do wykorzystania Wynik reaktywny: odsunięcie dawcy na 18 miesięcy, badanie kontrolne w IHiT
Kontrola jakości wirusologicznych badań przeglądowych Walidację wszystkich nowych testów (IHiT) Walidację oraz rewalidację wszystkich stosowanych (metod) procedur w RCKiK Audyty laboratoriów wirusologicznych Udział laboratoriów w zewnętrznych programach kontroli jakości (VQC Amsterdam, QCMD Glasgow, Labquality Helsinki) (Rozporządzeniem Ministra Zdrowia z dnia 23 marca 2006 roku w sprawie standardów jakości dla medycznych laboratoriów diagnostycznych i mikrobiologicznych (Dz.U. 2016 poz. 1665). Codzienną zewnętrzną kontrolę jakości EDC-NET Kontrolę wewnątrzlaboratoryjną - próbki kontrolne firmowe (analiza FN i FP), IC Walidację urządzeń i systemów automatycznych Kontrolę warunków przechowywania i transportu próbek oraz przechowywania odczynników (monitoring temperatur) Kwalifikację odczynników i sprzętu jednorazowego użytku (sju) Batch release (kontrola jakości serii odczynników)
EDCNet - wyniki jedno laboratorium
EDCNet - wyniki jedno laboratorium błąd systematyczny
EDCNet - wyniki z różnych laboratoriów błąd losowy mały błąd losowy duży
EDCNet - postępowanie w przypadku nieprawidłowości Analiza wyników EQC;QconnectBlue Analiza po wprowadzeniu 30 oznaczeń Wyniki niedokładne i/lub niepowtarzalne Wyniki dokładne i powtarzalne Diagnoza przyczyn Błąd urządzenia Błąd operatora Seria odczynników Działania naprawcze Szkolenie Konserwacja Wymiana odczynników
Dziękuję za uwagę