POST. MIKROBIOL., 2003,42,3,319-343 http://www.pm.microbiology.pl ZADANIA LABORATORIÓW MIKROBIOLOGICZNYCH W PRZYPADKU ATAKU BIOTERRORYSTYCZNEGO Adam Kaznowski, Joanna Mokracka, Ryszard Koczura I. Wprowadzenie. 2. Zarys historyczny użycia broni biologicznej. 3. Charakterystyka broni biologicznej. 4. Rola laboratoriów mikrobiologicznych. 4.1. Sytuacje świadczące o użyciu broni biologicznej. 4.2. Zasady bezpiecznej pracy w laboratorium mikrobiologicznym 4.3. Organizacja systemu laboratoriów mikrobiologicznych w USA. 4.4. Opakowywanie i przesyłanie materiałów zakaźnych. 4.5. Ochrona laboratorium. 4.6. Identyfikacja ważniejszych czynników broni biologicznej. 4.6.1. B. anthracis. 4.6.2. Francisella tularensis. 4.6.3. Yersinia pestis. 4.6.4. Wirus ospy prawdziwej. 4.6.5. Wirusy gorączek krwotocznych. 4.6.6. Toksyna botulinowa. 5. Podsumowanie Role of microbiologicallaboratories in case of bioterroristic attack Abstraet: The threat of terrorists using biological warfare agents has received increased attention in recent years. Biological agents have been used as weapon for thousands of years to produce fear and harm in humans. They are invisible, silent, odorless, tasteless, easy to disperse and inexpensive to produce. In this article, the properties of the most important biological agents are presented. A short history ofbiological weapon usage, and its clinical aspects are described. Microbiology laboratories are considered to be the first lines of defense for recognision of biological agents during a possible terrorism event. In the USA, laboratories involved in preparedness to bioterrorism have been c1assified by CDC into four biosafety levels depending on their facilities and abilities. The paper focuses on the role ofmicrobiology laboratory in preparation for and response to a bioterroristic event, clues indicating attack and identification methods ofthe most important biological agents. The microbiologists can provide a practical assessment of the biological weapons incident, consequently the best response to a terroristic incident could be undertaken, many lives saved, panie and crisis throughout the country avoided. I. Introduction. 2. Short historical view on using of biological weapon. 3. Characterization of biological weapon. 4. The role of microbiological laboratories. 4.1. Clues of a biologie al weapon attack. 4.2. Biosafety in microbiological laboratories. 4.3. Organization of microbiological laboratory network in the USA. 4.4. Packing and shipping of infectious substances. 4.5. Laboratory security. 4.6. Identification of the most important biologie al weapon agents. 4.6.1. B. anthracis. 4.6.2. Francisella tularensis. 4.6.3. Yersinia pestis. 4.6.4. Variola virus. 4.6.5. Hemorrhagic fever viruses. 4.6.6. Botulinum toxin. 5. Summary 1. Wprowadzenie Zgodnie z artykułem I Konwencji o broni biologicznej, która odbyła się w 1972 r. w Genewie, zalicza się do niej "mikrobiologiczne lub inne biologiczne czynniki lub toksyny, bez względu na ich pochodzenie lub sposób produkcji, typ lub ilość, których użycie nie jest uzasadnione ze względów profilaktycznych, ochronnych lub do innych pokojowych celów" [74]. 319
Ataki terrorystyczne na niespotykaną skalę przeprowadzone w USA (11 września 2001 r.) i Moskwie (październik 2002 r.), doniesienia służb wywiadowczych oraz groźby organizacji terrorystycznych sygnalizują możliwość zastosowania także i broni biologicznej w tego rodzaju akcjach. Przedmiotem ataku mogą być bezpośrednio ludzie [39, 56], a także zwierzęta hodowlane i uprawy rolne, co w konsekwencji może mieć duży wpływ na człowieka [72, 76]. Broń biologiczna nie jest nowością, w przeszłości stosowano ją w działaniach wojennych, podejmowano także próby jej użycia w akcjach terrorystycznych [8, 44, 45,66]. Właściwości broni biologicznej predestynująją do zastosowania w atakach terrorystycznych. Użycie jej może spowodować wysoką zachorowalność i śmiertelność, a w konsekwencji uczynić przeciwnika niezdolnym do walki w czasie wojny lub przyczynić się do osiągnięcia dużego spektakularnego efektu, co jest jednym z celów oczekiwanych przez terrorystów. Zastosowanie broni biologicznej może spowodować także negatywne efekty psychologiczne i społeczne: depresję, panikę, chaos i dezorganizację życia społecznego [17, 36, 39, 61, 63, 70]. Drobnoustroje, które mogą być wykorzystane jako broń biologiczna są stosunkowo łatwe do otrzymania, ponieważ można je wyosobnić z próbek pobranych od chorych zwierząt i ze środowiska. Broń biologiczna jest skuteczna w niewielkich ilościach lub stężeniach, jej produkcja nie wymaga skomplikowanych technologii, a gromadzenie można łatwo utajnić [32; 36,63]. Użycie broni biologicznej nie jest natychmiast wykrywalne, ponieważ jest ona pozbawiona zapachu, smaku, nie tworzy widocznych chmur, a objawy zwykle występują po kilku dniach i mogą mieć one charakter klasycznych symptomów grypowych [3, 61]. Ze względu na dużą różnorodność czynników zakaźnych i toksyn, ich identyfikacja jest czasochłonna i mozolna, często wymaga specjalistycznych metod, natomiast leczenie poszkodowanych jest trudne. Dotyczy to w szczególności drobnoustrojów występujących na danym terenie endemicznie, ale zmienionych genetycznie, o zwiększonej wirulencji i oporności na wiele czynników przeciw drobnoustrojowych, w tym antybiotyki i środki dezynfekcyjne [36, 45, 63]. Broń biologiczną można stosunkowo łatwo zaadaptować do zastosowania na dużą skalę, np. w postaci aerozolu. Jest ona tańsza w produkcji w porównaniu z bronią wybuchowąkonwencjonalną, jądrową i chemiczną [60]. Analiza ekonomiczna wykazała, że do osiągnięcia zbliżonych efektów strat cywilnych nakłady finansowe na broń biologiczną wynoszą zaledwie 0,5% kosztów broni wybuchowej [19]. Ostateczny efekt użycia broni biologicznej uzależniony jest nie tylko od rodzaju preparatu i wielkości dawki, ale także od wielu innych czynników, np. drogi podania. Większość preparatów broni biologicznej przygotowuje się w postaci aerozoli, w takiej fonnie działają one szybciej i skuteczniej niż po rozpuszczeniu w wodzie lub podaniu do żywności. Liczba bakterii, wirusów lub ilość toksyny, podana w preparacie aerozolowym może być niska ponieważ czynniki biologiczne mogą podlegać kumulacji do ilości wywołującej objawy chorobowe i śmierć [14]. Aerozol może być uwolniony z samolotów, łodzi motorowych, samochodów poruszających się pod wiatr lub nawet z wysokich wieżowców. Warunki meteorologiczne mogą mieć wpływ na ostateczną skuteczność użytej broni ponieważ silny 320
wiatr i turbulencja powietrza przyczyniają się do szybkiego rozproszenia aerozolu i tym samym spadku efektywności broni biologicznej [61]. Realna możliwość użycia broni biologicznej w atakach wojennych lub terrorystycznych stworzyła konieczność przeprowadzenia działań informacyjnych wśród społeczeństwa, przygotowania odpowiednich środków pozwalających na przeciwdziałanie skutkom jej użycia, oraz organizacyjnych w zakresie postępowania służby zdrowia, policji, straży pożarnej i administracji [26, 59, 63]. Działania takie podjęto także i w Polsce. Zasady postępowania lekarskiego w przypadku ataku bioterrorystycznego zostały opracowane przez C h o m i c z e w s k i e g o i wsp. [7]. Schematy postępowania i związane z tym zadania szpitali dostępne są na stronach internetowych Głównego Inspektoratu Sanitarnego [18, 37]. Niezwykle ważne jest także określenie zadań laboratoriów mikrobiologicznych, które powinny pełnić podstawową rolę w szybkiej i skutecznej diagnostyce pozwalającej zidentyfikować rodzaj i właściwości użytych preparatów biologicznie czynnych. Wyniki uzyskane w tych laboratoriach powinny przyczynić się do oceny niebezpieczeństwa, podjęcia działań terapeutycznych i profilaktycznych, a także być wykorzystane przy doborze metod neutralizacji użytej broni biologicznej w środowisku [4, 34, 51]. W niniejszej pracy zostanie krótko przedstawiona historia użycia broni biologicznej, najważniejsze jej rodzaje i właściwości, a także zadania i metody diagnostyczne dla laboratoriów mikrobiologicznych w przypadku ataku z zastosowaniem tego rodzaju broni. 2. Zarys historyczny użycia broni biologicznej Poniżej przedstawiono ważniejsze fakty dotyczące użycia broni biologicznej oraz działania zmierzające do zakazu jej użycia. Starożytność - do XIX w. Skażanie wody pitnej wrogów zdechłymi, cuchnącymi zwierzętami [8], Średniowiecze. Katapultowanie zwłok ludzi zmarłych w wyniku epidemii, np. w roku 1346 Tatarzy wywołali w ten sposób epidemię dżumy w oblężonej twierdzy Kaffa na Krymie (aktualnie Feodozja, Ukraina) [71]. 1763 r. Wywołanie epidemii wśród Indian w czasie wojny w Stanach Zjednoczonych, wskutek przekazania im koców i chust zakażonych wirusem ospy prawdziwej [8, 19,21,34]. 1914-1917. Użycie przez Niemców laseczki wąglika i pałeczki nosacizny celem zakażenia zwierząt hodowlanych przeciwników, ponadto podjęcie próby zastosowania bakterii cholery i dżumy przeciwko ludziom [8,14, 19]. 1925 r. Podpisanie "Protokołu Genewskiego" o zakazie stosowania broni chemicznej i biologicznej w działaniach wojennych [63]. 1931-1941. Badania i użycie broni i biologicznej przez Japończyków. Podczas prób w Mandżurii i Chinach zginęło ok. 10000 osób w wyniku zakażenia bakteriami cholery, dżumy, tyfusu, wąglika, riketsjami, wirusem ospy i innymi drobnoustrojami. Japończycy zakażali wodę pitną i żywność, ponadto 321
322 hodowle bakterii były rozpylane z samolotów. Uwolniono także z samolotów 15 mln. pcheł wyhodowanych i zakażonych w laboratoriach [19]. 1941-1942. Przeprowadzenie przez Brytyjczyków prób użycia bomb ze sporami laseczki wąglika na wyspie Gruinard w pobliżu Szkocji. Przetrwalniki wykazywały żywotność aż do roku 1986, kiedy przeprowadzono dezynfekcję wyspy przy użyciu formaldehydu i wody morskiej [8,43]. 1941. Podjęcie programu badawczego w zakresie broni biologicznej w USA [19]. 1957-1963. Zastosowanie w Brazylii wirusów ospy, ospy kurzej, grypy i bakterii gruźlicy przeciwko Indianom [19]. 1972 r. Ustanowienie w Genewie konwencji "O zakazie produkcji, przechowywania i zniszczeniu broni biologicznej i chemicznej". Do 1975 r. podpisały ją 144 państwa [74]. 1978 r. Atak z użyciem rycyny, toksyny wyekstrahowanej z nasion rącznika pospolitego tricinus communis), na bułgarskiego emigranta Władymira Kostowa w Paryżu oraz 10 dni później na innego dysydenta, Georgi Markowa w Londynie, który pomimo udzielonej pomocy medycznej zmarł trzy dni później [8, 19,36,61]. 1979 r. Awaria w ośrodku wojskowym w Swierdłowsku (aktualnie Jekaterynburg), przetrwalniki laseczki wąglika wydostały się do powietrza [27, 43]. Ostatnie analizy dostępnych danych sugerują, że kontakt z endosporami laseczki wąglika miało 250 osób, z których 100 zmarło [29]. 1960-1999. Podjęcie w USA 33 prób użycia broni biologicznej. Między innymi w 1984 roku w stanie Oregon, religijna grupa Indian Rajneeshee skaziła bary sałatkowe w 10 restauracjach w Dallas bakteriami Salmonella Typhimurium w konsekwencji czego zachorowało 751 osób [41, 63, 66]. Motywy terrorystów były różne, poczynając od protestów o charakterze antyrządowym, żądań nacjonalistycznych, politycznych, apokaliptycznych proroctw, motywów przestępczych i kryminalnych, aż do ekoterrorystycznych i walki o prawa zwierząt [41, 64, 66]. 1972-1991. Tajna produkcja broni i biologicznej w ZSRR. W arsenale posiadano 30 ton przetrwalników B. anthracis i ponad 20 ton wirusa ospy prawdziwej, a także wirus Marburg i bakterie dżumy [ll, 34]. 1991 r. Wykazanie posiadania przez Irak 19000 l stężonej toksyny botulinowej. Ta ilość byłaby wystarczaj ąca do zabicia każdego człowieka na ziemi trzykrotnie [2]. Ponadto, w Iraku wyprodukowano 8500 l bakterii i przetrwalników wąglika [11, 27, 36] oraz 2200 l aflatoksyny [11, 36]. 1997-1998. Nowa forma ataku bioterrorystycznego w USA, polegająca na przesłaniu adresatom listów z endosporami bakterii wąglika. Osoby, które miały styczność z bronią biologiczną, w tym pracownicy przyjmujący i sortujący pocztę, zostały poddane natychmiastowej kuracji antybiotykowej, nie zanotowano zgonu w wyniku tych akcji [64]. 2001 r. Ataki sporami B. anthracis przesyłanymi drogą pocztową. Stwierdzono 22 przypadki wąglika u ludzi, w tym 11 zakażeń skórnych i 11 inhalacyjnych.
Pięć osób zmarło. Dwadzieścia (91 %) osób, u których stwierdzono wąglik było pracownikami poczty, wśród nich byli doręczyciele oraz pracownicy sortowni listów i przesyłek [31]. Obecność laseczek wąglika stwierdzono także w próbkach pobranych na terenie sortowni [16, 65]. Bakterie B. anthracis wyizolowane z proszku z 4 kopert, wyhodowane z próbek materiałów pobranych od 10 pacjentów oraz ze 121 próbek pobranych ze środowiska wzdłuż drogi jaką przebyły przesyłki, nie wykazywały różnic przy zastosowaniu molekularnej metody typowania MLVA (multiple-locus variable-number tandem repeat analysis) [24]. Izolaty miały taki sam wzór oporności na antybiotyki. Były wrażliwe na penicylinę, amoksycylinę, ciprofloksacynę, doksycyklinę, chloramfenikol, klindamycynę, tetracyklinę, rifampicynę, klarytromycynę i wankomycynę, natomiast były średnio wrażliwe na erytromycynę i ceftriakson [31]. 3. Charakterystyka broni biologicznej Wiele rodzajów, gatunków, grup drobnoustrojów lub ich produktów może być wykorzystane jako broń biologiczna. Nie wszystkie mikroorganizmy lub ich produkty mają taką samą potencj ((do użycia w atakach terrorystycznych lub wojnach. Ze względu na chorobotwórczość, możliwość użycia na dużą skalę, trudność w rozpoznawaniu chorób i identyfikacji drobnoustrojów, broń biologiczną podzielono na 3 kategorie. Do kategorii A zaliczono Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis, toksyny Clostridium botulinum, Poxvirus variolae, Filoviridae (np. wirus Ebola) i Arenaviridae (np. wirus Lassa). Czynniki kategorii A stanowią potencjalnie największe zagrożenie dla ludzi, charakteryzują się możliwością wywołania wysokiej śmiertelności i chorobotwórczości, a ich identyfikacja wymaga specjalistycznego przygotowania personelu i nie standardowych metod identyfikacji [39, 56]. W kategorii B umieszczono Coxiella burnetii, Brucella spp., Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia psittaci, Rickettsia prowazekii, rycynę (toksyna z Ricinus communis), toksynę epsilon Clostridium perfringens, enterotoksynę B Staphylococcus aureus i wirusy rodzaju Alphavirus: wenezuelski wirus zapalenia mózgu, wirus końskiego zapalenia mózgu typu wschodniego, wirus końskiego zapalenia mózgu typu zachodniego. Wydzieloną podgrupą w tej kategorii są drobnoustroje, którymi można zakazić żywność lub wodę, natomiast nie opracowano techniki przygotowania ich w postaci aerozolu. Należą do niej: Salmonella sp., Shigella sp., Escherichia coli 0157:H7, Vibrio cholerae i Cryptosporidium parvum. Większość czynników zaliczonych do kategorii B także wykazuje potencjalne możliwości użycia na dużą skalę, ale powodują one niższą śmiertelność i chorobotwórczość, ponadto są łatwiejsze do zidentyfikowania, chociaż także wymagają specyficznych metod diagnostycznych i specjalistycznego przygotowania personelu [39, 56]. Czynniki kategorii C ze względu na swoje cechy chorobotwórcze mogą stanowić zagrożenie w przyszłości. Zaliczono do nich wirus Nipah, hantawirusy, wirus kleszczowego zapalenia mózgu, wirus żółtej febry, wirus kleszczowej gorączki krwotocznej i bakterie Mycobacterium tuberculosis oporne na wiele antybiotyków [39, 56]. 323
Aktualnie powszechnie sądzi się, że największe prawdopodobieństwo użycia jako broni biologicznej dotyczy przetrwalników bakterii wąglika. Ich ważniejsze właściwości przedstawiono w tabeli 1. Spory laseczki wąglika można produkować w dużych ilościach, wykorzystując proste metody, powszechnie znane przez mikrobiologów. Można je przechowywać latami bez utraty ich potencji. Mogą być łatwo rozproszone w powietrzu z pocisków, rakiet lub pojemników pod ciśnieniem. Spory nie mają koloru, nie tworzą obłoków, są bez zapachu i smaku. Istnieją więc bardzo duże trudności w stwierdzeniu użycia tej broni [19,27,61]. W warunkach naturalnych źródłem laseczek wąglika zakażających człowieka są chore zwierzęta roślinożerne (owce, kozy, konie, świnie, bydło) oraz materiały pochodzące od nich, np. mięso, skóra, krew, wełna, produkty spożywcze [15, 27, 38, 67]. Wąglik u człowieka występuje w trzech postaciach: skórnej, płucnej i jelitowej. Najczęściej występuje postać kliniczna skórna (95-98%), która rozwija się jako charakterystyczna czarna krosta. W postaci jelitowej, występującej po spożyciu zakażonego, surowego mleka lub niedogotowanego mięsa zakażonych zwierząt, przetrwalniki dostają się do błony śluzowej i węzłów chłonnych jelit, wywołując zmiany krwotoczne i martwicze. Przebieg choroby jest ciężki, rozpoczyna się wymiotami, bólami brzucha, biegunką, wysoką gorączką. Chory zwykle umiera po 2-3 dniach od daty zakażenia [15, 27, 38,40,46,67]. Postać płucna na początku objawia się zmianami typowymi dla zakażenia górnych dróg oddechowych i już w ciągu 3-5 dni prowadzi do ostrej niewydolności układu oddechowego. [15, 17,27,36,38,40,46, 67]. Większą ilość danych dotyczących chorobotwórczości B. anthracis i jej uwarunkowania przedstawili M a t r a s i B a r t o s z c z e [40]. Dokonano szczegółowej analizy pierwszych 10 przypadków inhalacyjnego wąglika, będącego wynikiem ataku bioterrorystycznego w USA w 2001 r. Miały one miejsce w stanach Columbia, Floryda, New Jersey i Nowy Jork. Średni wiek zakażonych osób wynosił 56 lat (zakres 43-73 lat), 70% stanowili mężczyźni. Poszkodowani ulegli zakażeniu w wyniku otrzymania listu ze sporami lub sortowania, dostarczania przesyłek do odbiorców. Czas od ekspozycji do pojawienia się pierwszych objawów chorobowych wynosił 4-6 dni. Pierwszymi objawami zakażenia była podwyższona temperatura ciała i dreszcze (n = 10), pocenie się (n =7), znużenie lub złe samopoczucie (n = 10), niewielki kaszel (n =9), duszności, wymioty (n = 10). Prześwietlenie klatki piersiowej wykazało nacieki w płucach u 7 osób oraz wysięk opłucnowy u 8 osób. W leczeniu pacjentów zastosowano kombinowaną intensywną terapię z równoczesnym zastosowaniem kilku preparatówantybakteryjnych. Pomimo tego czterech pacjentów zmarło [30]. Do tej pory istnieją braki w zakresie skutecznych metod leczenia ludzi, którzy uprzednio nie zostali zabezpieczeni przez szczepienie. Dostępna w USA szczepionka powoduje niewielkie uboczne reakcje, nie jest jednak przeznaczona do powszechnego zastosowania, zalecana jest do użycia dla osób narażonych zawodowo na kontakt z tymi bakteriami. Antybiotyki są skuteczne wówczas, jeżeli są podane w bardzo krótkim czasie po zakażeniu, zwykle 24-48 godzin. W terapii zakażeń powodowanych przez laseczki wąglika zalecane są: ciprofloksacyna w dawce 400 mg co 324
Charakterystyka broni biologicznej zaliczonej do kategorii A [2, 13,22,27,29,34,36,48] Tabela I Czynnik biologiczny Śmiertel- ność przy braku leczenia Przenoszenie z człowieka chorego na zdrowego Dawka zakaźna (w postaci aerozolu) Czas inkubacji Czas trwania choroby Identyfikacja Bacillus anthracis me 8000-50000 spor 1-6 dni 3-5 dni ok. 99% Morfologia komórek i kolonii, właściwości fenotypowe, immunofluorescencja, RT-PCR, sekwencjonowanie 16S rdna Yersinia pestis tak, 10-50 komórek 2-3 dni 1-6 dni 40-70% Morfologia komórek i kolonii, właściwości wysoka częstość fenotypowe, testy serologiczne Francisella tularensis nie 10-50 komórek 2-10 dni 2 tygodnie 33% Morfologia komórek i kolonii, właściwości fenotypowe, testy serologiczne Variola major tak, 10-100 wirionów 7-17 dni 4 tygodnie 20-50% ELISA, PCR, efekty cytopatyczne i inkluzje wysoka częstość w hodowli na zarodkach kurzych, techniki immunologiczne Wirusy gorączek tak, 1-10 wirionów 4-21 dni 7-16 dni 53-88% PCR, ELISA, testy serologiczne i immunokrwotocznych średnia częstość histologiczne, hodowle na zwierzętach laboratoryjnych Toksyna nie LDso = 0,001 mg/kg l-s dni zgon w czasie wysoka ELISA, odczyn neutralizacji na myszach botulinowa A 24-72 godz. lub kilku miesięcy v:> tv VI
8-12 godzin, doksycyklina (200 mg dożylnie i potem 100 mg co 8-12 godz.) oraz penicylina (2 mln jednostek) ze streptomycyną (30 mg/kg) podawane co 2 godz. [9, 15, 17,27,36,38,67]. W 1970 roku komitet ekspertów WHO teoretycznie określił, że uwolnienie z samolotu 50 kg przetrwalników wąglika nad terenem zamieszkałym przez 5 mln ludzi spowoduje chorobę u 250000 osób z czego, w przypadku braku podjęcia leczenia, zmarłoby ok. 100000 osób [27]. W 1993 r. w USA oszacowano, że po uwolnieniu 100 kg spor wąglika w Waszyngtonie, 130000 do 3 mln osób poniosłoby śmierć [29]. W symulacjach kosztów leczenia terapia 100000 osób kosztowałaby 26,2 miliardów dolarów [33]. Inną bronią biologiczną zaliczoną do kategorii A są bakterie dżumy, Yersinia pestis (Tab. I). Dżuma to ostra choroba zakaźna, która znana jest w dwóch podstawowych postaciach klinicznych: dżumy dymienicznej, przenoszonej na ludzi przez pchły z zakażonych gryzoni, przeważnie szczurów i dżumy płucnej, w której zakażenie następuje od chorego człowieka. Objawami zakażenia pałeczką dżumy są: gorączka, dreszcze, ból głowy, krwioplucie. W typowym przebiegu dżumy liczba leukocytów u pacjentów wynosi 12000-25 OOO/mlkrwi [73]. W krótkim czasie postępuje toksemia i nasilająca się duszność. Śmierć następuje w wyniku niewydolności wielonarządowej. Okres inkubacji trwa 2-3 dni, czas choroby 1-6 dni [28, 36]. Według obliczeń ekspertów WHO uwolnienie 50 kg bakterii Y pestis w postaci aerozolu nad miastem zamieszkiwanym przez 5 mln osób może wywołać zakażenie płucne u 150000 osób, z których 36 000 umrze. Pałeczki dżumy są żywotne w aerozolu przez 1 godz. i mogą być z samolotu rozprzestrzenione na odległość do 10 km. W leczeniu tej choroby stosowane są: streptomycyna, gentamycyna, tetracyklina, doksycyklina, chloramfenikol i fluorochinolony, np. ciprofloksacyna, lewo floks a- cyna i ofloksacyna [17, 28]. Pałeczki tularemii powodują ostrą odzwierzęcą chorobę zakaźną, występującą w naturalnych warunkach wśród gryzoni. Bakterie te mogą dostać się do organizmu człowieka poprzez uszkodzoną skórę, nabłonek, drogi pokarmowe i przez płuca w przypadku aerozolu. Pałeczka ta przekazywana może być na człowieka przez kleszcze, gzy, a nawet komary. Ponadto, źródłem zakażenia człowieka może być woda, gleba i roślinność. Początek choroby u człowieka jest nagły, z gwałtownymi dreszczami, bólem mięśni, głowy, uczuciem osłabienia i wymiotami. Często obserwuje się także zapalenie spojówek i zaczerwienienie twarzy. W przypadku ataku z użyciem tych bakterii w postaci aerozolu zakażenie przybierze naj cięższą postać tej choroby, z obrazem śródmiąższowego zapalenia płuc. Śmiertelność w przypadku braku leczenia jest wysoka i sięga 30-50%. W leczeniu tularemii skuteczne są: streptomycyna, gentamycyna, tetracykliny, chloramfeniko1 i ciprofloksacyna [13, 17,36]. W latach 50- i 60-tych opracowano technikę aerozolizacji tych bakterii, a w 90- -tych przeprowadzono modyfikacje genetyczne, w konsekwencji których uzyskano szczepy oporne na wiele antybiotyków i o innej strukturze antygenowej, co uczyniło nie skutecznym zabezpieczenie szczepionką [36]. W 1969 r. eksperci WHO oszacowali, że rozproszenie 50 kg bakterii tularemii w postaci aerozolu nad obszarem zamieszkiwanym przez 5 mln ludzi spowoduje zakażenie 250000 osób, z których 326
19000 umrze [13]. Analiza kosztów leczenia wykazała konieczność nakładów 5,4 miliarda dolarów na każde 100000 osób [33]. Do bardzo groźnej broni biologicznej zaliczono także wirusy ospy prawdziwej (Tab. I). W okresie gdy ospa panowała endemicznie na różnych kontynentach, obserwowano dwie postacie tej choroby: ospę wielką, czyli klasyczną ze śmiertelnością do 30% oraz ospę małą o śmiertelności ok. 1%. Rezerwuarem tych wirusów i źródłem zakażenia jest wyłącznie człowiek, okres zakaźliwości ok. 3 tygodnie. Do przenoszenia się choroby dochodzi drogą kropelkową lub przez styczność ze zmianami na skórze, błonami śluzowymi lub odzieżą i zanieczyszczonymi przedmiotami. Ospa prawdziwa przebiega z charakterystyczną wysypką, początek choroby jest nagły z gorączką, bólami głowy, uczuciem rozbicia i wyczerpania, silnymi bólami mięśni grzbietu, niekiedy z bólami brzucha. Pierwsze 2-3 dni choroby, przed pojawieniem się wysypki, przypominają objawy grypy, dopiero później temperatura obniża się i na skórze pojawiają się wykwity przechodzące odplarnki, grudki do krosty. Wysypka rozpoczyna się na twarzy i kończynach, a następnie na tułowiu. W roku 1958 WHO podjęła próbę wykorzenienia tej choroby, w latach 70-tych uzyskano sukces. Ostatnie zachorowania na ospę zarejestrowano w 1977 r. [17,21,22,36]. W 1980 r. WHO uznała tą chorobę za zlikwidowaną i zaprzestano szczepień [22]. Wobec zaprzestania szczepień ochronnych aktualnie użycie wirusa ospy prawdziwej jako broni biologicznej wywołałoby katastrofalne efekty. Odporność po szczepionce wynosi 3-5 lat i w celu jej utrzymania konieczne jest ponowne szczepienie [21, 22]. Ponieważ aktualna ilość zgromadzonej szczepionki jest za mała istnieje konieczność opracowania nowych, bardziej efektywnych preparatów antygenowych do uzyskania odporności na ospę prawdziwą na wypadek użycia tych wirusów podczas ataku wojennego lub bioterrorystycznego [42, 55]. Gorączki krwotoczne stanowią grupę zachorowań charakteryzujących się stanem podwyższonej temperatury oraz zaburzeniami krzepnięcia krwi, co prowadzi do wybroczyn, krwawienia narządów wewnętrznych i w jamach ciała oraz ich uszkodzenia. Groźnym powikłaniem przy zakażeniach tymi mikroorganizmami są zakrzepy naczyniowe. Początkowe objawy zakażenia trwają zwykle do 6 dni, nie wykazują cech charakterystycznych i są to: osłabienie, gorączka, ból głowy, bóle mięśniowe, zapalenie gardła, wymioty, biegunka. Wirusy tej grupy mogą być wykorzystane w atakach bioterrorystycznych w celu zakażenia ludzi przez drogi oddechowe. Objawy kliniczne zakażeń zależą od wzajemnych interakcji pomiędzy wirusem i gospodarzem. Śmiertelność waha się od 0,2% aż do 50-90%. Grupa wirusów powodująca gorączki krwotoczne jest zróżnicowana. Arenaviridae obejmują wirusy: argentyński, boliwij ski, wenezuelski i gorączki Lassa. Bunyaviridae obejmują hantawirusy i wirusa gorączki krymsko-kongijskiej. Z kolei do Filoviridae zaliczane są wirusy Ebola, Marburg, żółtej gorączki i Denga. Najgroźniejsze wirusy to Marburg i Ebola. Są to RNA wirusy, wrażliwe na temp. 60 C oraz rutynowo stosowane środki dezynfekcyjne: fenolany, podchloryn sodu, formalina, promienie UV, b-propiolakton, Okres inkubacji wirusem Marburg wynosi 3-9 dni, a Ebola 2-21 dni. Powodują one uszkodzenia śródmiąższowe licznych wewnętrznych narządów. W przypadku zakażenia człowieka obserwuje się zapalenie wątroby, 327
mięśnia sercowego, trzustki, płuc, jąder i nerek. Śmiertelność przy chorobie marburskiej wynosi do ok. 27%, a przy zakażeniu wirusem Ebo1a 50-90% [17, 36,45]. Aktualnie brakuje skutecznej szczepionki chroniącej przed zakażeniami powodowanymi przez te wirusy [10]. Do broni biologicznej kategorii A zaliczono także toksynę botulinową (Tab. I). Jest ona wytwarzana przez laseczki beztlenowe Clostridium botulinum. Wyróżnia się 7 różnych antygenowych typów toksyny botulinowej, oznaczonych od A do G. Typ A toksyny jest letalny dla człowieka o wadze 70 kg w ilości 0,09-0,15 mg przy podaniu dożylnym, 0,7-09 mg podanej drogą wziewną, natomiast 70 mg przy podaniu drogą pokarmową. Obliczono, że 1 gram tej toksyny jest wystarczający do zabicia przeszło 1 miliona osób [2, 17]. Objawami zatrucia toksyną botulinowąjest znużenie, zawroty głowy, nieostre widzenie i dwojenie widzenia, suchość w ustach, trudności w połykaniu, upośledzenie mowy, ból gardła, duszność, zaparcia, nudności, wymioty, bóle brzucha, biegunka, osłabienie mięśni ramion i nóg, porażenie nerwu twarzowego, opadanie powiek, nieruchome źrenice oraz brak czucia, chociaż pacjent jest w pełni świadomy [2, 17, 36]. Objawy neurologiczne przy botulizmie pokarmowym rozpoczynają się w 12-36 godzin po spożyciu toksyny, natomiast przy ekspozycji oddechowej 24-72 godzin. W profilaktyce możliwe jest stosowanie szczepionki opracowanej przez amerykański Departament Obrony [1, 10]. Oprócz szerzej opisanych czynników biologicznych zaliczonych do kategorii A, groźną bronią mogą być inne drobnoustroje i toksyny. Ważniejsze właściwości niektórych czynników zaliczonych do kategorii B przedstawiono w tabeli II. Według danych WHO [74], NATO [48] i innych [32, 35, 53] do broni biologicznej zaliczyć także można wiele innych czynników, z których najczęściej wymieniane są: bakterie Rickettsia rickettsi, grzyby Coccidioides immitis, toksyny bakteryjne (shiga, błonicy), z koralowców morskich (maitotoksynę, palytoksynę), z żab (bratrachotoksynę), jadu węży (alfa-conotoksynę, taipoksynę), z ryb (tetradotoksynę), skorpionów (a1fa-tityustoksyna), glonów (anatoksynę A, mikrocystynę), grzybów (toksynę T-2, aflatoksynę) i roślin (np. abrynę). 4. Rola laboratoriów mikrobiologicznych Ataki bioterrorystyczne przeprowadzone na terenie USA w 2001 r. uświadomiły skalę zagrożeń i koniecznych działań, które występują wskutek użyciu broni biologicznej. W laboratoriach mikrobiologicznych przebadano przeszło 121700 próbek materiałów na obecność B. anthracis [50]. Profilaktycznie podano antybiotyki 94 pracownikom poczty w Connecticut [75]. Telefoniczne centrum informacyjne uruchomione w CDC odpowiedziało na przeszło 11 tys. zapytań [47]. W opracowaniach Centrów Kontroli Chorób Zakaźnych w USA (Centers for Diseasae Central and Preventicy - CDC) [5, 50], Instytutu Badawczego Chorób Zakaźnych Armii Amerykańskiej (USA Army Medical Research Institute of Infections Research - USAMRIID) [36] i innych ośrodków [32, 34, 49, 51] podkreśla się, że laboratoria mikrobiologiczne służb medycznych powinny odegrać kluczową rolę 328
Charakterystyka broni biologicznej kategorii B, która może być użyta w postaci aerozolu [5, 14, 34, 36, 48, 56) Tabela II Przenoszenie Dawka Czynnik biologiczny z człowieka chorego zakaźna/śmiertelna Czas inkubacji Czas trwania choroby na zdrowego (w postaci aerozolu) Śmiertel- ność Coxiella burnetti tak, niska częstość 1-10 komórek 10-40 dni 2-14 dni s 20% Brucella spp. nie 10-100 komórek 5-60 dni tygodnie do miesięcy ::;5% Burkholderia mallei tak, niska częstość brak danych 1-14 dni zwykle zgon po 2-3 tygodniach, 2: 50% w postaci przewlekłej 2-3 lata Burkholderia pseudomallei bardzo niska częstość brak danych kilka dni do 4-20 dni ::;20% kilku lat Rickettsia prowazekii nie brak danych 6-16 dni tygodnie do miesięcy 1-2% Chlamydia psittaci nie brak danych 4-15 dni 2-8 tygodni ::;20% Wirusy zapalenia mózgu tak, niska częstość 10-100 wirionów 2-6 dni kilka dni do kilku tyg. s 20% Rycyna nie 50-100 ug/osobę 18-24 godz. kilka dni 21-49% (dawka śmiertelna) Enterotoksyna B S. aureus nie 1,7 ug/osobę 3-12 godzin kilka godzin ::;1% (dawka śmiertelna) Toksyna epsilon nie LD 50 = 0,1-5 mg/kg 8-12 godzin 24 godziny wysoka C. perfringens v..> N \O
w identyfikacji biologicznych czynników użytych w atakach wojennych lub terrorystycznych. Wymaga to przygotowania odpowiednich środków, wyszkolenia personelu ośrodków diagnostycznych i innych placówek służby zdrowia, do wykrywania nietypowych i rzadko występujących czynników etiologicznych, które mogą być użyte jako broń biologiczna oraz ich zwalczania [32, 34, 41, 68] Kierownictwo i personel laboratoriów wraz z pracownikami działów kontroli zakażeń i administracji powinni przygotować plan działań zarówno dla danego laboratorium oraz całej instytucji, w skład której pracownia wchodzi. Plan ten powinien obejmować [62]: informacje w zakresie uczestnictwa danej pracowni w sieci laboratoriów biorących udział w diagnostyce i przeciwdziałaniu atakom bioterrorystycznym, kryteria świadczące o typie ataku bioterrorystycznego, zasady bezpiecznego postępowania, procedury testowania w kierunku najważniejszych czynników broni biologicznej, w tym protokóły diagnostyczne, protokóły komunikujące i sprawozdawcze, zasady bezpiecznego opakowywania i transportu czynników zakaźnych, ochronę laboratorium. Kierownik laboratorium powinien ustanowić i wprowadzić sposób zawiadamiania, który obowiązuje w przypadku uzasadnionego podejrzenia ataku z użyciem broni biologicznej i konieczności przesłania izolatów do laboratorium wyższej kategorii. Plan musi uwzględniać kontakty z osobami odpowiedzialnymi za przekaz informacji do osób kluczowych w danej instytucji oraz z lokalnym wydziałem zdrowia. Każdy przypadek powinien być szczegółowo opisany. Aby ocenić stopień zagrożenia personel zajmujący się kontrolą zakażeń powinien odnotowywać pojawianie się nie zwykłych zachorowań. Stosowne władze, w oparciu o te dane, powinny ocenić czy występuje zagrożenie dla społeczeństwa i czy materiał od pacjentów oraz izolaty powinny być przekazywane do laboratoriów wyższej kategorii. Wykrycie drobnoustrojów wykazywanych na liście czynników mogących stanowić broń biologiczną nie jest jeszcze dowodem, że doszło do ataku bioterrorystycznego. Niektóre z drobnoustrojów wymienionych na tej liście występują naturalnie na pewnych obszarach geograficznych i powodują sporadyczne zakażenia. Dopiero decyzja uprawnionych władz wydziałów zdrowia i władz ustawowych określa czy przypadek był wiarygodny. Podczas procesu określenia czy istnieje zagrożenie dla społeczeństwa, mikrobiolodzy powinni zawiadomić najbliższe laboratorium B celem otrzymania szczegółowych wskazówek w zakresie ewentualnego użycia testów potwierdzających [62]. 4.1. Sytuacje świadczące o użyciu broni biologicznej Atak bronią biologiczną może być zapowiedziany lub nie, szczególnie groźny jest drugi wariant. Efekty ataku mogą pojawić się dopiero po kilku dniach i mogą być trudne do rozpoznania. Niewątpliwie pierwszoplanową rolę na tym etapie reakcji odegrać powinni lekarze, którzy muszą być przygotowani na rozpoznanie sytuacji 330
będącej wynikiem użycia broni biologicznej oraz laboratoria przygotowane do poboru prób i przeprowadzenia badań [7, 26]. Przesłanki świadczące o ataku bioterrorystycznym są następujące [36, 74]: pojawienie się w populacji dużej liczby zachorowań z podobnymi objawami, wiele przypadków niewyjaśnionych chorób lub zgonów, cięższy przebieg choroby w porównaniu z typowym dla danego czynnika etiologicznego, brak skuteczności standardowej terapii, nietypowa droga zakażenia, np. poprzez drogi oddechowe, podczas gdy zazwyczaj zakażenie danym patogenem następuje przez inne wrota, pojawienie się chorób nie występujących na danym obszarze geograficznym lub w nietypowym sezonie, choroba warunkowana drobnoustrojem, który normalnie nie występuje na danym terenie, równoczesny, wielokrotny wzrost liczby zachorowań lub seria epidemii różnych chorób w tej samej populacji, pojedynczy przypadek zachorowania spowodowany niezwykłym czynnikiem (np. ospa prawdziwa, wirusowa gorączka krwotoczna), wystąpienie choroby, która jest niezwykła w danej grupie wiekowej, nietypowe chorobotwórcze szczepy lub organizmy o oporności na antybiotyki różnej od chorobotwórczych szczepów na danym terenie, podobieństwo genetyczne wśród czynników etiologicznych izolowanych z różnych źródeł, miejsc lub w różnym czasie, wyższa częstość zakażeń wśród ludzi na obszarach otwartych niż u ludzi przebywających w budynkach, wystąpienie wybuchów epidemii tych samych chorób na obszarach nie połączonych ze sobą, wybuch epidemii powodowanych czynnikiem wywołującym epizoocję, informacja o potencjalnym ataku terrorystycznym lub wojennym, odkrycie broni biologicznej nielegalnie przechowywanej lub transportowanej. Niezwykle ważnym zagadnieniem jest odpowiednie zabezpieczenie ludności przed spodziewanym atakiem bioterrorystycznym i podjęcie działań po ataku. Zastosowanie profilaktycznych szczepień lub kuracja antybiotykowa wymagają. dłuższego czasu ażeby uzyskać ich skuteczność i dlatego nie są uważane za optymalne metody. Dodatkową niedogodnością w zastosowaniu szczepień jako pierwszej linii obrony przed bronią biologiczną są wysokie koszty i trudność w szczepieniu dużych populacji na szerokie spektrum czynników biologicznych. Aktualnie brakuje dobrych szczepionek na wszystkie mikroorganizmy i toksyny, które mogą być wykorzystane jako broń biologiczne. Zaleca się stosowanie szczepień jedynie dla grup ludzi wysokiego ryzyka, np. pracowników laboratoriów diagnostycznych i lekarzy [57]. C a s a d e v a l l [4] sugeruje, że najkorzystniejsze zabezpieczenie ludzi w przypadku ataku bioterrorystycznego może stanowić bierne uodpornienie uzyskane w wyniku podania swoistych przeciwciał. Metoda ta ma wiele zalet, z których najważniejsząjest bardzo szybkie nabycie odporności na czynniki biologiczne użyte w ataku. 331
4.2. Zasady bezpiecznej pracy w laboratorium mikrobiologicznym Prace z materiałem zakaźnym mogą być wykonywane wyłącznie w laboratoriach posiadających odpowiednie zabezpieczenia. Pod koniec ubiegłej dekady, w CDC ustalono.rodzaje zabezpieczeń dla mikrobiologicznych i biomedycznych laboratoriów, oznaczając je symbolami od BSL 1 do BSL 4. Zabezpieczenia BSL l polegają na podstawowych procedurach, takich jak zakaz spożywania posiłków i picia w laboratorium, mycie rąk przed jego opuszczeniem, zakaz pipetowania ustami, odkażanie powierzchni roboczych, niszczenie materiału zakaźnego po skończonej pracy. Wejście do zakładu powinno być kontrolowane i ograniczone dla osób postronnych. Zabezpieczenia BSL 2, oprócz wymagań dla BSL 1, polegają na prowadzeniu prac w kabinach biohazard klasy II, stosowaniu fartuchów, rękawiczek i maseczek, które nie mogą być wynoszone poza laboratorium przed wyjałowieniem. Personel powinien być przeszkolony do pracy ze szczególnie niebezpiecznymi drobnoustrojami i szczepiony, np. przeciwko WZW B. W laboratorium powinna być dostępna surowica odpornościowa przeciwko szczególnie niebezpiecznym drobnoustrojom, z którymi prowadzone są prace. Materiały i sprzęt po skończonej pracy powinien być odpowiednio zabezpieczony (zamknięty w szczelnych pojemnikach) i wysterylizowany, laboratoryjny sprzęt i powierzchnie robocze muszą być zdezynfekowane bezpośrednio po skończonej pracy. Meble i sprzęt powinny być wykonane z materiału umożliwiającego jego dezynfekcję. W laboratorium powinna znajdować się płuczka do oczu. W laboratoriach z zabezpieczeniami BSL 3 wszystkie badania z materiałem zakaźnym powinny być prowadzone w kabinach biohazard klasy II lub III. Personel zobowiązany jest do noszenia odzieży ochronnej, laboratorium powinno być specjalnie zaprojektowane, oddzielone od powierzchni powszechnie użytkowanych, zabezpieczone zamkniętymi drzwiami. Powierzchnie ścian, podłóg i sufitu powinny być wykonane z materiałów umożliwiających ich dezynfekcję. Okna powinny być zamknięte i uszczelnione. Klimatyzacja powinna być zaopatrzona w filtry HEPA. Sprzęt tworzący aerozole, w tym wirówki, musi być odpowiednio zabezpieczony. W laboratoriach BSL 4 występują zabezpieczenia najwyższego stopnia. Tego typu laboratoria stanowią wydzielone pomieszczenia odseparowane od pozostałych części budynku lub umieszczone w oddzielnym budynku. Oprócz zabezpieczeń wymaganych dla laboratoriów BSL 3, są one specjalnie zaprojektowane aby uniemożliwić wydostanie się z nich drobnoustrojów do środowiska. Personel musi być odpowiednio przeszkolony, w trakcie prac ubrany w specjalną odzież, która jest sterylizowana po ich ukończeniu. Także wszystkie inne materiały przed opuszczeniem pracowni muszą być odkażone, natomiast pracownicy powinni wziąć natrysk przed opuszczeniem laboratorium. Całość powietrza w laboratorium powinna być sterylizowana przez filtrację i zastosowanie środków bakterio- i wirusobójczych [54]. W laboratoriach należy prowadzić stałą, codzienną kontrolę mikrobiologiczną. Powinna ona objąć badanie personelu, miejsc i sprzętu, który najczęściej podlega zakażeniu: rąk personelu, uchwytów i klamek drzwi, stołów i stołków laboratoryjnych, masek, całej pracowni mikrobiologicznej i pracowni PCR, a ponadto korytarzy i pomieszczeń przechowywania próbek [20]. 332
4.3. Organizacja systemu laboratoriów mikrobiologicznych w USA W USA pod nadzorem CDC utworzono sieć laboratoriów przygotowanych do postępowania w przypadku ataku z użyciem broni biologicznej. Sieć taka obejmuje pracownie prywatne, szpitalne, sanitarno-epidemiologiczne i wojskowe uczestniczące w badaniach mikrobiologicznych i dochodzeniach epidemiologicznych związanych z atakiem bioterrorystycznym. Laboratoria mikrobiologiczne są klasyfikowane na podstawie ich wyposażenia i możliwości diagnostycznych do jednej z czterech kategorii, A-D [5, 34]. Pracownie kategorii A mają odegrać główną rolę w rozpoznaniu sytuacji użycia broni biologicznej wówczas, kiedy atak nie został zapowiedziany. W przypadku takiego typu ataku następuje duże zagrożenie dla lekarzy i personelu laboratoryjnego ponieważ pierwsze objawy występują po okresie inkubacji. Dlatego najważniejszym elementem na tym etapie odpowiedzi jest identyfikacja początkowych przypadków będących wynikiem użycia broni biologicznej. Przesłanki świadczące o możliwości użycia broni biologicznej zostały podane w rozdziale 4.1. niniejszego artykułu. Do laboratoriów tej kategorii zaliczono większość pracowni spełniających warunki bezpieczeństwa BSL 2, w których prowadzone są hodowle drobnoustrojów i identyfikacja powszechnie występujących patogenów. Największą liczbę w tej grupie stanowią laboratoria szpitalne i to właśnie one odegrają najistotniejszą rolę w przypadku ataku z użyciem broni biologicznej. Główna rola tych laboratoriów będzie polegała na pobraniu, zabezpieczeniu i przetransportowaniu próbek materiałów pobranych od ludzi oraz ich wstępnym przebadaniu. W pracowniach kategorii A powinno być możliwe wykonanie niewielkiej liczby prostych testów diagnostycznych i w przypadku przesłanek świadczących o obecności w pobranych próbkach czynników, które mogły być wykorzystane jako broń biologiczna, przesyłanoby je do pracowni kategorii B. Na wyposażeniu laboratorium poziomu A musi znajdować się komora biohazard klasy II. Personel powinien być przeszkolony w zakresie podstawowych metod pozwalających wstępnie rozpoznać czynniki broni biologicznej oraz bezpiecznego pobierania, pakowania, oznakowywania i przekazywania próbek materiałów zawierających niebezpieczne patogeny do pracowni wyższej kategorii. Laboratoria powinny posiadać plan działań, a ponadto przygotowane procedury operacyjne, które obejmują drogi komunikowania się, w tym numery telefoniczne do laboratoriów wyższych kategorii oraz do centralnego ośrodka koordynującego. Laboratoria powinny także posiadać aktualny wykaz czynników, które mogą stanowić broń biologiczną wraz ze stopniem zagrożenia które one stwarzają. W przypadku ekspozycji pracowników na broń biologiczną szybko powinna zostać podjęta decyzja, czy użyć profilaktycznie antybiotyki, podać szczepionkę, czy zastosować tylko obserwację w kierunku wykrycia objawów chorobowych [5, 34, 62]. W przypadku zapowiedzianego ataku z użyciem broni biologicznej laboratoria szpitalne nie powinny pobierać próbek do testowania. Potencjalny odbiorca, cel ataku, powinien być uprzedzony i odpowiednio poinstruowany, natomiast próbki powinny być dostarczone bezpośrednio do laboratoriów kategorii B lub C. Podobną politykę powinno stosować się także w przypadku badania żywności, wody i próbek 333
pobranych od zwierząt. Ograniczenie w prowadzeniu badań tych materiałów w pracowniach klasy A wynika z konieczności utrzymanie bezpieczeństwa personelu, pacjentów i instytucji. Główną przeszkodą w badaniu materiałów środowiskowych w laboratoriach szpitalnych jest nieznana natura próbek, którymi mogą być eksplodujące lub ulatniające się toksyczne chemikalia lub substancje radioaktywne [20, 62]. Wyposażenie laboratoriów kategorii B powinno spełniać wymogi bezpieczeństwa co najmniej BSL 2, chociaż zalecane jest BSL 3. Tą grupę tworzyć powinny laboratoria, które mają możliwości do badania specyficznych czynników i przesyłania mikroorganizmów lub materiałów zawierających je, do pracowni wyższego stopnia. Laboratoria kategorii B powinny zmniejszyć liczbę fałszywie dodatnich, wstępnych wyników i zabezpieczyć laboratoria C przed nadmiernym przeciążeniem. Ich działalność polegałaby na szybkiej, wstępnej identyfikacji drobnoustrojów (np. technikami immunofluorescencyjnymi). W przypadku stwierdzenia czynników, które mogły być użyte w atakach terrorystycznych, izolaty byłyby przekazywane do laboratoriów poziomu C [5, 34]. Laboratoria kategorii C, powinny spełniać wymogi bezpieczeństwa BSL 3 i mieć dodatkowe możliwości szybkiej specjalistycznej identyfikacji czynników stanowiących broń biologiczną. Powinny to być stanowe mikrobiologiczne, akademickie lub federalne centra badawcze, zdolne do wykonania specjalistycznych badań, z wykorzystaniem zaawansowanych technik diagnostycznych (np. opartych o amplifikację kwasów nukleinowych i typowania mikroorganizmów metodami molekularnymi), a ponadto mającymi zdolność do oznaczenia toksyn. Laboratoria tej kategorii powinny również brać czynny udział w ocenie nowo opracowywanych testów i odczynników oraz określeniu, które metody mogą być stosowane w pracowniach kategorii B [5, 34, 62]. Laboratoria kategorii D, posiadające zabezpieczenia BSL 4, powinny pełnić funkcje eksperckie w diagnostyce rzadko występujących w naturze i szczególnie niebezpiecznych biologicznych czynników, np. wirusów gorączek krwotocznych, wirusów zapalenia mózgu i wirusa ospy prawdziwej. W laboratoriach tych powinna istnieć także możliwość oznaczenia drobnoustrojów zmodyfikowanych genetycznie oraz archiwizowania czynników użytych w atakach bioterrorystycznych. Personel tych pracowni powinien posiadać unikatowe doświadczenia i umiejętności w diagnostyce wszystkich czynników, które mogą być użyte jako broń biologiczna. W tych laboratoriach także powinny być opracowywane nowe testy i metody diagnostyczne [5, 34, 62]. W przypadku ataku bioterrorystycznego, oprócz sieci stałych laboratoriów, ważną rolę odegrać mogą ruchome laboratoria terenowe. Przykładem było laboratorium uruchomione w Waszyngtonie po ataku bioterrorystycznym w październiku 2001 roku [23]. Przeznaczone było ono do przeprowadzania szybkich molekularnych analiz próbek środowiskowych, głównie powietrza i wymazów z powierzchni przesyłek, urządzeń, mebli i przedmiotów stanowiących wyposażenie biur w budynkach administracji w Waszyngtonie, na obecność przetrwalników B. anthracis. Laboratorium równolegle kierowało próby do wyznaczonych stałych pracowni celem przeprowadzenia standartowych analiz technikami hodowlanymi. Laboratorium ruchome 334
wyposażone było w dwie kabiny z laminarnym przepływem powietrza klasy I, przenośny autoklaw, dwa przenośne termo cykl ery do przeprowadzania RT-PCR oraz niezbędne odczynniki. Analiza RT-PCR związana była z monitorowaniem fluorescencji wynikającej z zastosowania fluorogennych sond w PCR. DNA do reakcji PCR uzyskiwano bezpośrednio z wymazów i próbek powietrza oraz z materiału wyhodowanego z ww. próbek na podłożach hodowlanych. Wykorzystując metody hodowlane i RT-PCR możliwe było uzyskanie wyników w ciągu 24 godzin od pobrania próbki. Podsumowując, laboratorium zapewniło wygodny i łatwo dostępny punkt do zbierania i badania na obecność przetrwalników B. anthracis, próbek środowiskowych i potencjalnie zakażonych powierzchni np. kopert. Dzięki analizom molekularnym w połączeniu ze standartowymi metodami hodowlanymi udało się zidentyfikować kilka przypadków występowania przetrwalników B. anthracis i przeprowadzić skuteczną dekontaminację skażonych miejsc [23]. 4.4. Opakowywanie i przesyłanie materiałów zakaźnych Próbki zawierające materiały, które mogą być źródłem zakażenia powinny być pakowane zgodnie z wytycznymi Międzynarodowego Stowarzyszenia Transportu Powietrznego oraz innymi rozporządzeniami obowiązującymi w danym kraju. Wszystkie materiały zawierające kultury drobnoustrojów są traktowane jako zakaźne i powinny być opakowywane oraz transportowane w taki sam sposób bez względu na odległość [62]. Podstawowy zestaw do pakowania składa się z trzech warstw. Opakowanie bezpośrednie stanowi oznakowane, wodoszczelne naczynie, zawierające próbkę. Naczynie to powinno być owinięte materiałem chłonnym, przeznaczonym do zaadsorbowania całej zawartości płynnej w przypadku uszkodzenia opakowania bezpośredniego. Drugą warstwę stanowi naczynie wtórne, będące wodoszczelnym pojemnikiem chroniącym opakowanie bezpośrednie. Zewnętrzna paczka przesyłowa chroni naczynie wtórne i jego zawartość przed działaniem czynników zewnętrznych [1]. Personel laboratoriów powinien być przeszkolony i posiadać certyfikaty upoważniające do pakowania i wysłania materiałów zakaźnych przy zastosowaniu zatwierdzonych materiałów opakowujących i pojemników. Kierownictwo laboratoriów powinno posiadać wykaz przewoźników uprawnionych do transportu takich materiałów. Większość takich przesyłek będzie wysyłana z pracowni A do B [62]. Próbki przed przyjęciem do badań w laboratorium powinny przejść przez specjalnie zaprojektowane wejście, gdzie będą dodatkowo podwójnie opakowane w torebki i następnie odkażane zewnętrznie przed przeniesieniem do pracowni gdzie będą poddane analizom. Ponadto, powinna zostać dla nich wykonana dokumentacja oraz ocena, które z nich są priorytetowe [20]. Materiały wyjściowe i kultury pierwotne powinny być przechowywane ponieważ mogą być wykorzystane w dochodzeniach epidemiologicznych i kryminalnych. Po pobraniu do badania pozostała część próbki powinna być na nowo opakowana tak, ażeby na zewnątrz nie była skażona i następnie umieszczona w wyznaczonym miejscu, zabezpieczonym przed dostępem przez nieuprawniony personel [20, 62]. 335
4.5. Ochrona laboratorium Laboratoria powinny posiadać ochronę zaplanowaną przez specjalistów [62]. Mogą one być monitorowane kamerami telewizyjnymi przez całą dobę, wstęp do pracowni powinien być kontrolowany i ograniczony tylko dla personelu posiadającego karty wstępu. Osoby postronne powinny być przyjmowane w wyznaczonym miejscu. Korzystne jest ograniczenie do jednego liczby wejść dostępnych dla pacjentów i osób z zewnątrz oraz wydzielenie innego wyjścia do przyjmowania próbek materiałów [20]. Dodatkową ochroną jest zamykanie wszystkich kabin, chłodni, inkubatorów i drzwi do pomieszczeń w których prowadzone są prace oraz przechowywane materiały i hodowle pierwotne [62]. 4.6. Identyfikacja ważniejszych czynników broni biologicznej Poniżej przedstawiono laboratoryjne procedury testowania w kierunku najważniejszych czynników, które mogą być wykorzystane jako broń biologiczna. 4.6.1. B. anthracis Bakterie wąglika mogą być izolowane w przypadku zakażenia przebiegającego w postaci skórnej z uszkodzeń nabłonka, w postaci płucnej z plwociny, krwi, natomiast w postaci jelitowej z kału, płynu żołądkowo-jelitowego i krwi. Plwocinę, kał i wymazy skórne posiewa się na podłoże agarowe z krwią baranią, agar czekoladowy i MacConkey'a. Kryteria wstępnej identyfikacji B. anthracis, prowadzonej w laboratoriach A, obejmują barwienie metodą Grama, opis morfologii kolonii, zdolność do sporulacji i ocenę ruchliwości [6]. B. anthracis rośnie dobrze na podłożu agarowym z krwią baranią w temperaturze 35 C, tworząc po 15-24 godzinach inkubacji, kolonie o średnicy 2-5 mm, płaskie, lekko wyniosłe, z nieregularnymi brzegami, matowe o lepkiej konsystencji, nie hemolizujące. Laseczki B. anthracis są Gram- -dodatnie, względnie beztlenowe (1-1,5 mm x 3-5 mm), wytwarzające katalazę. Bakterie te są nieurzęsione, często ułożone są w łańcuszki składające się z 2-4 komórek. Otoczki zwykle widoczne są w preparatach wykonanych z zainfekowanych tkanek, natomiast nie obserwuje się ich tworzenia, kiedy bakterie hodowane są na standardowych podłożach laboratoryjnych. Barwienie tuszem indyjskim może być stosowane przy przygotowywaniu preparatów bezpośrednich z krwi lub płynu rdzeniowomózgowego. Bakterie te mogą tworzyć w obecności tlenu przetrwalniki owalne, nie zniekształcające komórki, zlokalizowane centralnie lub podbiegunowo [5, 15, 34, 40, 67]. Najważniejsze właściwości różnicujące B. anthracis z innymi fenotypowo podobnymi gatunkami tego rodzaju to brak ruchliwości i zdolności do hemolizowania erytrocytów barana oraz wytwarzanie poliglutaminowych otoczek [5, 34]. Przy minimalnym kontakcie z tymi bakteriami szczepienie personelu nie jest wymagane, natomiast zalecane jest używanie fartuchów, rękawic, maseczek na twarz oraz wykorzystywanie technik nie tworzących aerozolu. Izolaty wstępnie zidentyfikowane jako B. anthracis powinny być niezwłocznie przekazane najbliższemu upoważnionemu laboratorium wyższej kategorii w celu wykonania identyfikacji potwierdzającej 336