ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2010 z. 555:

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2010 z. 555: 319 332 GENETYCZNA ZMIENNOŚĆ POTOMSTWA CZTERECH PROWENIENCJI JODŁY POSPOLITEJ (Abies alba MILL.) WYRAŻONA W POLIMORFIZMIE MIKROSATELITARNEGO JĄDROWEGO DNA (nssrs) 1 Ewa Maria Pawlaczyk, Ewa Chudzińska, Maria Anna Bobowicz Zakład Genetyki, Instytut Biologii Eksperymentalnej, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu Wstęp Jodła pospolita (Abies alba MILL.) jest drzewem górskim, reglowym, schodzącym na niziny w północnych partiach swojego zasięgu. Na terenie Polski osiąga północno-wschodnią granicę zasięgu, która przebiega wzdłuż północnego krańca Niziny Śląskiej, następnie północną krawędzią Pasa Wyżyn Środkowych oraz przecina Nizinę Mazowiecko-Podlaską [GOSTYŃSKA-JAKUSZEWSKA 1972; ZAJĄC, ZAJĄC (red.) 2001]. Obserwowana dziś zmienność jodły pospolitej jest wynikiem procesów ewolucyjnych, takich jak: mutacje, dryf i selekcja, które miały miejsce w ciepłych refugiach, gdzie jodła przetrwała ostatnie zlodowacenie oraz podczas postglacjalnej wędrówki gatunku. Uważa się, że różne populacje jodły będą wykazywały geograficzny model genetycznej zmienności [KONNERT, BERGMANN 1995]. Hipotezy na temat rozmieszczenia refugiów glacjalnych są oparte na danych izopolowych [KRAL 1980; LIEPELT i in. 2009], badaniach izoenzymatycznych [KONNERT, BERGMANN 1995; LIEPELT i in. 2009], badaniach chloroplastowego mikrosatelitarnego DNA [VENDRAMIN i in. 1999; LIEPELT i in. 2009] oraz mitochondrialnego mikrosatelitarnego DNA [LIEPELT i in. 2002; GÖMÖRY i in. 2004; ZIEGENHAGEN i in. 2005; LIEPELT i in. 2009]. Na podstawie wyżej wymienionych markerów, autorzy tych prac postulują istnienie pięciu refugiów glacjalnych w: środkowej i/lub wschodniej Francji, środkowych Włoszech, południowych Włoszech (Kalabria), południowej i południowo-wschodniej części Półwyspu Bałkańskiego i Pirenejach. Jako najbardziej prawdopodobne źródła postgalcjalnej rekolonizacji podaje się trzy spośród nich (południowa część Półwyspu Bałkańskiego, środkowe Włochy i środkowo-wschodnia część Francji). Na podstawie wyników analizy mtdna i cpdna [VENDRAMIN i in. 1999; LIEPELT i in. 2002, 2009; GÖMÖRY i in. 2004] powstała hipoteza na temat migracji jodły pospolitej do Polski po ostatnim zlodowaceniu, która mówi, że jodły z dwóch refugiów: z Bałkanów i ze środkowych Włoch, spotkały się i utworzyły tzw. strefę introgresji 1 Badania były finansowane ze środków budżetowych na naukę w latach 2005 2008 jako projekt badawczy Nr 2 P06L 009 28.

320 E.M. Pawlaczyk, E. Chudzińska, M.A. Bobowicz obejmującą Beskidy, Tatry i słowacką część Karpat. Poziom zmienności genetycznej populacji skrajnie położonych często odbiega od zmienności populacji rosnących w centrum zasięgu [MITKA 1997]. Dlatego podjęto badania, których celem było opisanie i porównanie poziomu zmienności potomstwa czterech proweniencji jodły pospolitej z północno-wschodniej granicy zasięgu gatunku. Materiał i metody Dla wykrycia zmienności genetycznej jodły pospolitej w 1999 r. założono doświadczenie proweniencyjno-rodowe. Doświadczenie proweniencyjne na powierzchni doświadczalnej w Uhryniu (Nadleśnictwo Nawojowa) polegało na założeniu uprawy porównawczej, gdzie posadzono siewki wyprowadzone z nasion różnego pochodzenia w wyrównanych warunkach środowiska. Dzięki temu analizowane mogą być różnice genetyczne, dziedziczone niezależnie od wpływu środowiska. Ma to szczególne znaczenie dla wyboru populacji drzew do kolejnych odnowień [SABOR 2006]. Do badań wybrano potomstwo (półrodzeństwa) czterech populacji jodły z północno-wschodniej granicy zasięgu tego gatunku: z Nadleśnictwa Białowieża, z Rezerwatu Jata (Nadleśnictwo Łuków), z Rezerwatu Kamienna Góra (Roztoczański Park Narodowy) i z Rezerwatu Łabowiec (Beskid Sądecki, Nadleśnictwo Nawojowa). Trzy spośród nich (z wyjątkiem jodły z Nadleśnictwa Białowieża) stanowią rodzime populacje jodły powstałe w wyniku naturalnego odnawiania się. Przy zakładaniu doświadczenia brano pod uwagę jakość drzewostanów z punktu widzenia potrzeb hodowlano-użytkowych [KORCZYK 1999] (rys. 1). L R J B populacja z Łabowca population from Łabowiec populacja z Kamiennej Góry (Roztoczański Park Narodowy); population from Kamienna Góra (Roztocze National Park) populacja z Jaty; population from Jata populacja z Białowieży population from Białowieża Rys. 1. Fig. 1. Mapa lokalizacji badanych proweniencji jodły pospolitej (Abies alba MILL.) z uwzględnieniem granicy zasięgu gatunku Map of localization of silver fir (Abies alba MILL.) provenances with border of species natural range

GENETYCZNA ZMIENNOŚĆ POTOMSTWA... 321 Materiałem roślinnym były pąki wegetatywne i igły pobrane z 555 drzew potomstwa czterech populacji jodły pospolitej. Do badań wytypowano w sumie 111 rodów (półrodzeństw) jodły (każdy ród był reprezentowany przez 5 osobników) z: Nadleśnictwa Białowieża (22 rody), Rezerwatu Jata (29 rodów), Rezerwatu Kamienna Góra (30 rodów) oraz Rezerwatu Łabowiec (30 rodów). Z pąków i igieł izolowano DNA metodą DOYLE i DOYLE [1990] na buforze ATMAB (akryltrimethyloamonnium bromide). Badany materiał analizowano za pomocą dwóch loci mikrosatelitarnego jądrowego DNA (SF1 i SF 333). Sekwencje i parametry PCR podano w pracy CREMER i in. [2006]. Dla weryfikacji otrzymanych produktów amplifikacji wykonano elektroforezę poziomą na 2% żelu agarozowym. W celu sprawdzenia wielkości produktów amplifikacji wykonano elektroforezę kapilarną na sekwenatorze. Za pomocą programu Peak Scanner precyzyjnie określono długości amplifikowanych fragmentów DNA. Programy GenAlEx i PopGen pozwoliły obliczyć podstawowe statystyczne parametry zmienności genetycznej, takie jak: liczbę alleli w locus (Na), liczbę efektywnych alleli (Ne) [CROW, KIMURA 1970], obserwowaną i oczekiwaną heterozygotyczność (Ho, He) [NEI 1973], indeks wsobności (F), współczynnik zróżnicowania międzypopulacyjnego FST [WRIGHT 1932], przepływ genów (Nm), oraz odległości genetyczne Nei a [NEI 1972]. Dodatkowo wykonano molekularną analizę wariancji (AMOVA) [EXCOFFIER i in. 1992], która dzieli całkowitą wykrytą genetyczną zmienność na dwa komponenty: zmienność pomiędzy i wewnątrz populacji. Wyniki Przeprowadzone badania wykazały, że analizowane loci mikrosatelitarnego jądrowego DNA były polimorficzne, jednak liczba alleli w locus (Na) była niska i wynosiła dla locus SF1 od 3 (dla potomstwa proweniencji Łabowiec) do 5 (dla potomstwa proweniencji Jata), a dla locus SF 333 od 8 (dla potomstwa proweniencji Łabowiec, Kamienna Góra i Jata) do 9 (dla potomstwa proweniencji Białowieża). Największą efektywną liczbą alleli w locus (Ne) dla obydwu loci charakteryzowała się populacja z Białowieży (dla locus SF 1 Ne=2,176, a dla locus SF 333 Ne=4,455), a najmniejszą populacja z Kamiennej Góry (dla locus SF 1 Ne=2,030, a dla locus SF 333 Ne=3,894), (tab. 1). Tabela 1; Table 1 Parametry zmienności genetycznej dla badanego potomstwa jodły pospolitej: N liczba analizowanych osobników: Na liczba alleli na locus, Ne liczba efektywnych alleli na locus, Ho heterozygotyczność obserwowana, He heterozygotyczność oczekiwana, F współczynnik wsobności, SE błąd standardowy Parameters of genetic differentiation within silver fir populations N number of analized individuals, Na number alleles per locus, Ne number of effective alleles per locus, Ho observed heterozygosity, He expected heterozygosity, F fixation index, SE standard error Populacja Population Locus N Na Ne Ho He F 1 2 3 4 5 6 7 8 SF 333 150 8 4,088 0,627 0,755 0,170 Łabowiec SF 1 150 3 2,051 0,447 0,513 0,128 średnia; mean 150,0 5,5 3,070 0,537 0,634 0,149 SE 0,0 2,5 1,018 0,090 0,121 0,021

322 E.M. Pawlaczyk, E. Chudzińska, M.A. Bobowicz 1 2 3 4 5 6 7 8 Kamienna Góra (RPN) Jata Białowieża SF 333 SF 1 Total SF 333 150 8 3,894 0,607 0,743 0,184 SF 1 150 4 2,030 0,467 0,507 0,080 średnia; mean 150,0 6,0 2,962 0,537 0,625 0,132 SE 0,0 2,0 0,932 0,070 0,118 0,052 SF 333 145 8 4,005 0,614 0,750 0,182 SF 1 145 5 2,072 0,428 0,517 0,173 średnia; mean 145,0 6,5 3,038 0,521 0,634 0,178 SE 0,0 1,5 0,967 0,093 0,116 0,004 SF 333 110 9 4,455 0,391 0,776 0,496 SF 1 110 4 2,176 0,509 0,541 0,058 średnia; mean 110,0 6,5 3,316 0,450 0,658 0,277 SE 0,0 2,5 1,139 0,059 0,118 0,219 Średnia w locus; Mean for locus średnia; mean 138,750 8,25 4,111 0,560 0,756 0,258 SE 9,656 0,25 0,122 0,056 0,007 0,079 średnia; mean 138,750 4,00 2,082 0,463 0,519 0,110 SE 9,656 0,41 0,032 0,017 0,007 0,026 średnia; mean 138,750 6,125 3,096 0,511 0,638 0,184 SE 6,321 0,833 0,388 0,033 0,045 0,048 częstość alleli dla locus SF 333; allele frequency for locus SF 333 częstość alleli dla locus SF 1; allele frequency for locus SF 1 Rys. 2. Fig. 2. Częstość alleli dla locus SF 333 i SF 1 w populacjach jodły pospolitej Abies alba MILL. Allele frequency for locus SF 333 and SF 1 in the population of silver fir Ab ies alba MILL.

GENETYCZNA ZMIENNOŚĆ POTOMSTWA... 323 Dla locus SF 1 dla wszystkich czterech populacji allelami, które występowały z największą częstością były allele 215 i 218. Natomiast dla locus SF 333 dla wszystkich czterech populacji najczęstszy był allel 166 oraz dla potomstwa proweniencji z Łabowca, Kamiennej Góry i Jaty allele 170 i 168, a dla potomstwa proweniencji z Białowieży allele 174 i 176 (rys. 2). Najwyższą heterozygotyczność obserwowaną wykazywały populacje z Łabowca i z Kamiennej Góry, a najmniejszą populacja z Białowieży. Najwyższą heterozygotyczność oczekiwaną wykazywała populacja z Białowieży, a najmniejszą populacja z Kamiennej Góry (tab. 1). Analizując wartości współczynnika wsobności (inbredu) Wright a (F) można stwierdzić, że wszystkie populacje charakteryzują się nadmiarem homozygot, a niedoborem heterozygot. Indeks wsobności wskazuje na największy niedobór heterozygot dla potomstwa populacji z Białowieży (F=0,277), a najmniejszy dla potomstwa z Kamiennej Góry (F=0,132), (tab. 1). Z obliczonych wartości współczynnika odległości genetycznych Nei a (DN) wynika, że największą wartość odległości genetycznej zaobserwowano pomiędzy potomstwem populacji z Jaty i z Białowieży, a najmniejszą pomiędzy potomstwem populacji z Łabowca i z Kamiennej Góry. Współczynnik podobieństwa genetycznego (IN) wskazuje na największe podobieństwo pomiędzy potomstwem populacji z Łabowca i z Kamiennej Góry, a na najmniejsze pomiędzy potomstwem populacji z Jaty i z Białowieży (tab. 2). Tabela 2; Table 2 Wartości współczynników odległości genetycznych Nei a (DN) i współczynników podobieństwa genetycznego (IN) pomiędzy badanymi populacjami Abies alba MILL. Nei's genetic distances (DN) and genetic similarity coefficient (IN) between populations of Abies alba MILL. Potomstwo populacji z Łabowca i Kamiennej Góry utworzyło na dendrogramie, skonstruowanym w oparciu o odległości genetyczne Nei a, wspólną grupę skupień (rys. 3). Ponadto z rys. 3 wynika, że populacja z Białowieży dołącza się największą wartością współczynnika odległości genetyczej do pozostałych populacji. Wartość współczynnika zróżnicowania genetycznego (FST) obliczona pomiędzy potomstwem każdej populacji osobno wskazuje na najmniejsze zróżnicowanie (FST=0,001) pomiędzy potomstwem populacji z Łabowca i z Kamiennej Góry, a na największe pomiędzy potomstwem populacji z Jaty i Białowieży (FST=0,033). Z obliczonego współczynnika przepływu genów (NM) wynika, że największy przepływ genów jest pomiędzy potomstwem populacji z Łabowca i z Kamiennej Góry (NM=311,746), a najmniejszy pomiędzy potomstwem populacji z Jaty i Białowieży (NM=7,280), (tab. 3).

324 E.M. Pawlaczyk, E. Chudzińska, M.A. Bobowicz L R J B populacja z Łabowca; population from Łabowiec populacja z Kamiennej Góry (Roztoczański Park Narodowy); population from Kamienna Góra (Roztocze National Park) populacja z Jaty; population from Jata populacja z Białowieży; population from Białowieża Rys. 3. Dendrogram zbudowany na podstawie odległości genetycznych Nei a pomiędzy potomstwem czterech populacji Abies alba MILL. Fig. 3.Dendrogram based on Nei s genetic distances among the progeny of four populations of Abies alba MILL. Tabela 3; Table 3 Wartości współczynnika zróżnicowania międzypopulacyjnego (FST) i współczynnika przepływu genów (Nm) pomiędzy potomstwem badanych populacji Abies alba MILL. Parameters of genetic differentiation (FST) and gene flow (Nm) between progeny of Abies alba MILL.

GENETYCZNA ZMIENNOŚĆ POTOMSTWA... 325 Wartość współczynnika zróżnicowania międzypopulacyjnego obliczona pomiędzy wszystkimi populacjami razem wskazuje na istnienie małego genetycznego zróżnicowania (FST=0,025) jodły pospolitej. Wartości współczynnika przepływu genów wskazują, że przepływ genów pomiędzy populacjami jest duży i wynosi NM =11,840. Molekularna analiza wariancji (AMOVA) wykazała, że populacje różnią się statystycznie istotnie na poziomie istotności α=0,01 oraz że 5% ogólnego wykrytego zróżnicowania występuje pomiędzy populacjami, a 95% wewnątrz populacji jodły. Obliczone częstości występowania genotypów (Pawlaczyk, dane w dokumentacji pracy, niepublikowane) wykazały, że genotypami, które zaobserwowano z największą częstością dla poszczególnych populacji były: genotyp 166/170/215/218 dla potomstwa populacji z Łabowca (częstość 7,6%) i Kamiennej Góry (częstość 8,7%), genotyp 170/170/215/218 dla potomstwa populacji z Jaty (częstość 7,6%) i genotyp 166/166/215/218 dla potomstwa populacji z Białowieży (częstość 10,0%). Genotypy: 166/170/215/218 i 170/170/215/218, które pojawiają się z największą częstością u potomstwa proweniencji z Łabowca, Kamiennej Góry i Jaty, u potomstwa populacji z Białowieży występują z małą częstością. Potomstwo proweniencji z Białowieży charakteryzuje się występowaniem genotypów z częstością powyżej 5% (genotypy: 166/170/215/215 i 166/170/215/218), które nie występują lub występują u 1 osobnika w pozostałych populacjach (populacja z Kamiennej Góry). Wspólne genotypy, które wystąpiły z częstością powyżej 5% obserwowano u potomstwa populacji z Białowieży i z Kamiennej Góry (genotyp 166/166/215/215) oraz u potomstwa populacji z Białowieży i z Łabowca (genotyp 166/166/215/218). W sumie we wszystkich populacjach wykryto 101 różnych genotypów. Najwięcej, bo 54 u potomstwa populacji z Łabowca, 51 genotypów u potomstwa populacji z Jaty i po 44 u potomstwa populacji z Kamiennej Góry i Białowieży. Dyskusja Zmienność genetyczna populacji drzew leśnych badana jest przy użyciu wielu markerów. W przypadku jodły pospolitej stan wiedzy o poziomie zmienności tego gatunku opiera się w zdecydowanej większości na wynikach analiz izoenzymatycznych populacji rosnących w różnych warunkach środowiska [SCHROEDER 1989; LONGAUER 1994; 2001; MEJNARTOWICZ i in. 1994; KONNERT, BERGMANN 1995; HUSSENDÖRFER i in. 1995; PARDUCCI i in. 1996; BREITENBACH-DORFER i in. 1997; FADY i in. 1999; HUSSENDÖRFER 1999; LEWANDOWSKI i in. 2001; LIEPELT i in. 2009]. Najlepiej zbadana została zmienność jodły w populacjach z zachodniej i południowej Europy. Ostatnio pojawiły się też prace obejmujące populacje z północno-wschodniej i wschodniej granicy zasięgu tego gatunku oraz porównujące jodłę południowo-europejską (Włochy, Bułgaria, Macedonia i Rumunia) z jodłą z Europy środkowej (Czechy, Słowacja i Słowenia) i z ukraińskiej części Karpat [LONGAUER 1994; 2001; MATUSOVA 1995; LONGAUER i in. 2003; KORSHIKOV i in. 2005]. W Polsce badania izoenzymatyczne nad poznaniem struktury genetycznej populacji jodły pospolitej są prowadzone od 1979 roku [MEJNARTOWICZ 1979]. Opisano głównie zmienność jodły rosnącej w Sudetach, porównując populacje z Sudetów i Karpat, oraz starając się ustalić pochodzenie nasadzeń jodłowych w Białowieży [MEJNARTOWICZ 1986, 1996, 2000, 2003, 2004; MEJNARTOWICZ i in. 1994; LEWANDOWSKI i in. 2001; MEJNARTOWICZ, BERGMANN 2003]. Z badań tych autorów wynika, że pomimo

326 E.M. Pawlaczyk, E. Chudzińska, M.A. Bobowicz ubywania jodły z populacji rosnących na północno-wschodniej granicy zasięgu, gatunek charakteryzuje duża heterozygotyczność i wysoki polimorfizm. Jeśli jednak porówna się zmienność między badanymi populacjami jodły, to jej poziom, w porównaniu ze zmiennością międzypopulacyjną innych drzew iglastych, jest niższy. Doświadczenia proweniencyjne i testowe, których celem z założenia jest wyeliminowanie lub choćby ograniczenie wpływu środowiska na obserwowaną zmienność, są prowadzone znacznie rzadziej. Niniejsza praca opisuje drzewa, będące potomstwem czterech populacji jodły pospolitej, rosnące w wyrównanych warunkach powierzchni doświadczalnej, których zmienność wyrażona jest w polimorfizmie jądrowego mikrosatelitarnego DNA. Pierwsze dane na temat zmienności uzyskano dla populacji drzew matczynych, z których uzyskano potomstwo badane w niniejszej pracy. Analizy cech morfologiczno-anatomicznych igieł [PAWLACZYK i in. 2002; 2005; PAWLACZYK, BOBOWICZ 2008] wykazały, że istnieje wysoce istotne zróżnicowanie pomiędzy wszystkimi czterema populacjami. Analiza zróżnicowania wewnątrzpopulacyjnego wykazała, że największą zmiennością charakteryzuje się populacja z polskiej części Puszczy Białowieskiej powstała z nasion nieznanego pochodzenia. Pozostałe populacje wykazywały zbliżony poziom zmienności. Osobniki badanych populacji nie różniły się między sobą istotnie statystycznie, za wyjątkiem nasadzeń jodłowych w Białowieży. Stwierdzono również, że szerokość i długość geograficzna oraz wysokość nad poziom morza nie ma istotnego wpływu na otrzymany obraz zmienności cech morfologicznoanatomicznych. Można jednak przypuszczać, że jeden z tych czynników wpływa na długość igły. Cecha ta maleje wraz ze wzrostem wysokości nad poziom morza. Użycie do badań markerów innego typu zaprezentowane w niniejszej pracy wskazuje na niski poziom zmienności międzypopulacyjnej, w odróżnieniu od wyników uzyskanych na podstawie opisanych powyżej analiz cech igieł. Rozbieżności dotyczą jednak poziomu zmienności, a nie obrazu zmienności poszczególnych populacji. Drzewa matczyne rosną w różnych warunkach siedliskowych, a nie w wyrównanych warunkach powierzchni doświadczalnej, w związku z czym powstała zmienność środowiskowa prawdopodobnie wyeksponowała istniejące różnice. Analizy wewnątrzpopulacyjne wykazały, że potomstwo populacji z północno-wschodniej granicy zwartego zasięgu wykazywało podobny poziom zmienności zarówno w przypadku badania cech morfologicznych i anatomicznych igieł, jak i polimorfizmu SSR. Obliczone odległości genetyczne (w przypadku badań molekularnych) i odległości Mahalanobisa (w przypadku analizy cech igieł) wskazują na najmniejsze różnice pomiędzy populacjami z Łabowca i Kamiennej Góry, czyli populacjami ze zwartego zasięgu. Populacja rosnąca na skraju zasięgu, czyli populacja z Jaty wykazuje pośredni poziom zmienności pomiędzy populacjami ze zwartego zasięgu a populacją izolowaną (populacja z Białowieży). Wniosek o odrębności populacji z Białowieży powstały przy analizie izoenzymów [MEJNARTOWICZ 1996] i opisanych cech igieł potwierdziły badania polimorfizmu mikrosatelitarnego DNA. Potomstwo populacji z Białowieży posiadało występujące z dużą częstością genotypy, które nie pojawiały się w innych populacjach. Obserwowano tu też największy nadmiar homozygot, co może świadczyć o istnieniu złożonej struktury wewnętrznej populacji (występowanie subpopulacji) lub/i działaniu takich procesów ewolucyjnych jak dryf genetyczny. Proweniencja białowieska jest sztuczną populacją, założoną na początku XX wieku z nasion niewiadomego pochodzenia, rosnącą ok. 100 km poza granicą naturalnego zasięgu gatunku. Może to ograniczać przepływ genów z innymi populacjami i potwierdza tezę, że odległości genetyczne rosną wraz z odległością

GENETYCZNA ZMIENNOŚĆ POTOMSTWA... 327 przestrzenną populacji. Teza ta pojawiła się w pracy VENDRAMIN i in. [1999]. Autorzy zbadali przestrzenną organizację rozmieszczenia haplotypów na podstawie testów permutacji. Zbadali oni 17 populacji jodły rozmieszczonych wzdłuż całego zasięgu tego gatunku, a mianowicie: po trzy populacje z Francji, Niemiec i Chorwacji, po dwie włoskie i polskie, i po jednej z Rumuni, Bułgarii, Szwajcarii i Hiszpanii. Na podstawie analizy dwóch chloroplastowych mikrosatelitarnych loci autorzy znaleźli 8 i 18 różnej długości sekwencji w każdym locus, które wytworzyły 90 różnych haplotypów. Zaobserwowano również dużą różnorodność w poziomach zmienności w badanych populacjach. Populacje polskie charakteryzowały się największą liczbą alleli w locus (8 alleli) w porównaniu z innymi analizowanymi populacjami jodły. Wyniki niniejszych badań opartych na analizie dwóch jądrowych mikrosatelitarnych loci wskazują na wytworzenie wspólnie we wszystkich proweniencjach 101 genotypów, najwięcej (54 genotypy) u potomstwa z Łabowca, a najmniej u potomstwa z Kamiennej Góry i Białowieży (44 genotypy). Stwierdzono w badanym potomstwie średnią liczbę alleli w locus równą 6,125. Największą liczbą alleli w locus charakteryzowało się potomstwo populacji z Jaty i Białowieży (6,5), a najmniejszą populacja z Łabowca (5,5). Wykorzystywanie różnych typów markerów do opisu populacji jodły jest niezbędne, w celu uzyskania spójnego obrazu zmienności genetycznej. Użycie markerów typu SSR w połączeniu z informacjami uzyskanymi przy użyciu markerów izoenzymatycznych i morfologiczno-anatomicznych potwierdziło podawane wcześniej hipotezy o zróżnicowanym bogactwie genetycznym populacji jodły pochodzących z różnych rejonów geograficznych. Wnioski 1. Potomstwo badanych proweniencji różni się statystycznie istotnie pod względem badanych dwóch loci jądrowego mikrosatelitarnego DNA. 2. U żadnej populacji nie wykryto alleli unikatowych. 3. Wszystkie badane populacje wykazały niedobór heterozygot. Największy niedobór heterozygot wykryto w potomstwie populacji z Białowieży, a najmniejszy u potomstwa z Kamiennej Góry. 4. Największy współczynnik odległości genetycznej zaobserwowano pomiędzy potomstwem populacji z Jaty i Białowieży, a najmniejszy pomiędzy potomstwem populacji z Łabowca i z Kamiennej Góry. 5. Proweniencja z Białowieży różni się od pozostałych populacji. Proweniencja ta, jest populacją sztuczną, założoną na początku XX wieku i powstałą z nasion niewiadomego pochodzenia. Odrębność proweniencji z Białowieży może wynikać z jej lokalizacji. Rośnie ona ok. 100 km poza granicą naturalnego zasięgu gatunku, co może ograniczać przepływ genów z innymi proweniencjami.

328 E.M. Pawlaczyk, E. Chudzińska, M.A. Bobowicz Literatura BREITENBACH-DORFER M., KONNERT M., PINSKER W., STARLINGEN F., GEBUREK T. 1997. The contact zone between two migration routes of silver fir, Abies alba (Pinaceae), revealed by allozyme studies. Pl. Syst. Evol. 206: 259 272. CREMER E., LIEPELT S., SEBASTIANI F., BUONAMICI A., MICHALCZYK M., ZIEGENHAGEN B., VENDRAMIN G.G. 2006. Indentification and characterization of nuclear microsatellite loci in Abies alba Mill. Molecular Ecology Notes 6: 374 376. CROW J.F., KIMURA M. 1970. An introduction to Population Genetics Theory. New York. Harper and Row: 612 ss. DOYLE J.J., DOYLE J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: 13 15. EXCOFFIER L., SMOUSE P.E., QUATTRO J.M. 1992. Analysis of molecular variance inferred from metric distance among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics 131: 479 491. FADY B., FOREST I., HOCHU I., RIBIOLLET A., DE BEAULIEU J.-L., PASTUSZKA P. 1999. Genetic differentiation in Abies alba Mill. population from Southeastern France. Forest Genet. 6: 101 113. GOSTYŃSKA-JAKUSZEWSKA M. 1972. Jodła pospolita (Abies alba Mill.), w: Atlas rozmieszczenia drzew i krzewów w Polsce. K. Browicz (red.). PWN, Warszawa- Poznań, Vol. 12: 5 10. GÖMÖRY D., LONGAUER R., LIEPELT S., BALLIAN D., BRUS R., KRAIGHER H., PARPAN V.I., PARPAN T.V., PAULE L., STUPAR V., ZIEGENHAGEN B. 2004. Variation patterns of mitochondrial DNA of Abies alba Mill. in suture zones of postglacial migration in Europe. Acta Soc. Bot. Pol. 73(3): 203 206. HUSSENDÖRFER E. 1999. Genetic variation of silver fir populations (Abies alba Mill.) in Switzerland. Forest Genet. 6: 101 113. HUSSENDÖRFER E., KONNERT M., BERGMANN F. 1995. Inheritance and linkage of isozyme variants of Silver fir (Abies alba Mill.). Forest Genet. 2: 29 40. KONNERT M., BERGMANN F. 1995. The geographical distribution of genetic variation of silver fir (Abies alba, Pinaceae) in relation to its migration history. Pl. Syst. Evol. 195: 19 30. KORCZYK A.F. 1999. Ocena wartości genetycznej i hodowlanej naturalnych populacji jodły pospolitej (Abies alba Mill.) ze wschodniego zasięgu w Polsce. Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Krakowie. Zeszyty Naukowe 61: 155 170. KORSHIKOV I.I., PIRKO N.N., PIRKO YA.V. 2005. Genetic variation and differentiation of Abies alba Mill. population from Ukrainian Carpathians. Genetica 41(3): 356 365. KRAL F. 1980. Waldgeschichtliche Grundlagen fur die Ausscheidung von Okotypen bei Abies alba. Meyer H. (red.). Proceedings 3. IUFRO Tannensymposium Wien, Osterreichischer Agrarre Verlag, Wien: 158 168. LEWANDOWSKI A., FILIPIAK M., BURCZYK J. 2001. Genetic variation of Abies alba in Polish part of Sudety Mts. Acta Soc. Bot. Pol. 70(3): 215 219. LIEPELT S., BIALOZYT R., ZIEGENHAGEN B. 2002. Wind-dispered pollen mediates postglacial gene flow among refugia. The Proceedings of National Academy of Science USA 99: 14590 14594. LIEPELT S., CHEDDADI R., DE BEAULIEU J-L., FADY B., GÖMÖRY D., HUSSENDÖRFER E.,

GENETYCZNA ZMIENNOŚĆ POTOMSTWA... 329 KONNERT M., LITT T., LONGAUER R., TERHÜRNE-BERSON R., ZIEGENHAGEN B. 2009. Postglacial range expansion and its genetic imprints in Abies alba (Mill.) A synthesis from paleobotanic and genetic data. Review of Palaeobotany and Palynology 153: 139 149. LONGAUER R. 1994. Genetic differentiation and diversity of European silver-fir in Eastern part of its natural range. W. Edger (red.). 7. IUNFRO Tannensyposium 31 X 04 XI 1994. WP 1.01 08, Mainz: 155 164. LONGAUER R. 2001. Genetic variation of European silver fir (Abies alba Mill.) in the Western Carpathians. Journal of Forest Science 47(10): 429 438. LONGAUER R., PAULE L., ANDONOSKI A. 2003. Genetic diversity of southern populations of Abies alba Mill. Forest Genet. 10(1): 1 9. MATUSOVA R. 1995. Genetic variation in five populations of silver fir (Abies alba Mill.) in Slovakia. Biologia 50: 53 59. MEJNARTOWICZ L. 1979. Polymorphism at the LAP and GOT loci in Abies alba Mill. populations. Bulletin de l Académie Polonaise des Sciences. Série des Sciences Biologiques 27(12): 1063 1070. MEJNARTOWICZ L. 1986. Heterozygotyczność populacji jodły pospolitej (Abies alba Mill.). Sylwan 2/3: 77 81. MEJNARTOWICZ L. 1996. Origin of silver fir stands in Białowieża Primeval Forest, w: Biodiversity protection of Białowieża Primeval Forest. Paschaslis P., Zajączkowski S. (red.), Warszawa: 35 50. MEJNARTOWICZ L. 2000. Polish Sudeten and Carpathian Mountains silver-fir (Abies alba) population genetic investigations. Proceedings 9. IUFRO International European Silver fir Symposium, 21 26 V 2000, Skopje: 49 54. MEJNARTOWICZ L. 2003. Genetic analysis of silver-fir populations in the Beskids. Acta Soc. Bot. Pol. 72(2): 115 119. MEJNARTOWICZ L. 2004. Genetic analysis of silver-fir populations in the North Carpathian and Sudeten Mountains. Acta Soc. Bot. Pol. 73(4): 285 292. MEJNARTOWICZ L, BERGMANN F. 2003. Mode of inheritance of aspartate aminotransferase in silver-fir (Abies alba Mill.). Silvae Genetica 52(1): 15 17 MEJNARTOWICZ L., LEWANDOWSKI A., BERGMANN F. 1994. Genetic structure and variation of the European silver fir populations at man-made range disjunction. Proc. of the IUNFRO Weisstannen-Symposium, Altensteig, 31 X 3 XI 1994, Germany: 118 127. MITKA J. 1997. Małe, izolowane populacje na skraju zasięgu geograficznego niektóre procesy ekologiczne i genetyczne. Wiad. Bot. 41(2): 13 34. NEI M. 1972. Genetic distance between populations. Amer. Naturalist 106: 283 292. NEI M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. The Proceedings of National Academy of Science USA 70: 3321 3323. PARDUCCI L., SZMIDT A., VILLANI F., WANG Q.-R., CHERUBINI M. 1996. Genetic variation of Abies alba in Italy. Hereditas 125: 11 18. PAWLACZYK E.M., BOBOWICZ M.A. 2008. Osobnicze zróżnicowanie jodły pospolitej (Abies alba Mill.) z rezerwatu Jata wyrażone w cechach morfologii i anatomii igieł. Leśne Prace Badawcze 69(3): 243 253. PAWLACZYK E.M., BOBOWICZ M.A., KORCZYK A.F. 2002. Variability of three populations

330 E.M. Pawlaczyk, E. Chudzińska, M.A. Bobowicz of Abies alba Mill. expressed in morphological and anatomical needle traits. Ecological Questions 2/2002: 25 32. PAWLACZYK E.M., GRZEBYTA J., BOBOWICZ M.A., KORCZYK A.F. 2005. Individual differentiation of Abies alba Mill. population from the Tisovik Reserve. Variability expressed in morphology and anatomy of needles. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica 47/2: 137 144. SABOR J. 2006. Rola doświadczeń proweniencyjnych w poznaniu zmienności wewnątrzgatunkowej drzew leśnych oraz w ocenie wartości genetyczno-hodowlanej poszczególnych populacji cząstkowych, w: Elementy genetyki i hodowli selekcyjnej drzew leśnych. J. Sabor (red.). Centrum Informacyjne Lasów Państwowych: 99 114. SCHROEDER S. 1989. Isozyme polymorphisms in Silver fir (Abies alba Mill.). Silvae Genetica 36(3 4): 130 133. VENDRAMIN G.G., DEGEN B., PETIT R.J., ANZIDEI M., MADAGHIELE A., ZIEGENHAGEN B. 1999. High level of variation at Abies alba chloroplast microsatellite loci in Europe. Molecular Ecology 8: 1117 1126F. WRIGHT S. 1932. The roles of mutation, inbreeding, crossbreeding and selection in evolution. Proc. Sixth Int. Congr. Genet. 1: 356 366. ZAJĄC A., ZAJĄC M. (red.) 2001. Atlas rozmieszczenia roślin naczyniowych w Polsce. Pracownia Chorologii Komputerowej Instytutu Botaniki Uniwersytetu Jagielońskiego. Kraków: 715 ss. ZIEGENHAGEN B., FADY B., KUHLENKAMP V., LIEPELT S. 2005. Differentiating groups of Abies species with a simple molecular marker. Silvae Genetica 54(3): 123 126. Słowa kluczowe: jodła pospolita, zmienność, jądrowy mikrosatelitarny DNA Streszczenie Przedmiotem badań było potomstwo czterech proweniencji jodły pospolitej (Abies alba MILL.) z północno-wschodniej granicy zasięgu, rosnące na powierzchni doświadczalnej w Nadleśnictwie Nawojowa. Celem badań było poznanie międzyproweniencyjnej zmienności genetycznej jodły pospolitej. Do badań wytypowano potomstwo 111 drzew matczynych (rodów) jodły z: Nadleśnictwa Białowieża, Rezerwatu Jata, Rezerwatu Kamienna Góra oraz Rezerwatu Łabowiec. Przeanalizowano zmienność 2 loci mikrosatelitarnego jądrowego DNA. Obliczono: liczbę alleli w locus (Na), liczbę efektywnych alleli (Ne), obserwowaną i oczekiwaną heterozygotyczność (Ho, He), indeks wsobności Wright a (F), parametry równowagi genotypowej (FIS, FIT), współczynnik zróżnicowania międzypopulacyjnego FST, przepływ genów (Nm), oraz odległości genetyczne. Dodatkowo wykonano molekularną analizę wariancji (AMOVA), która wykazała, że populacje różnią się między sobą istotnie statystycznie. Wykryto, że 5% ogólnego wykrytego zróżnicowania występuje pomiędzy populacjami, a 95% wewnątrz populacji. Badania wykazały, że poziom zmienności genetycznej jodły jest niski w porównaniu z innymi drzewami iglastymi, pomimo że wszystkie analizowane loci były polimorficzne. Żadna populacja nie posiadała alleli unikatowych. Przepływ genów (Nm) pomiędzy populacjami był duży, a współczynnik zróżnicowania międzypopulacyjnego był niski.

GENETYCZNA ZMIENNOŚĆ POTOMSTWA... 331 Najwyższą heterozygotyczność obserwowaną wykazywały populacje z Łabowca i z Kamiennej Góry, a najmniejszą populacja z Białowieży. Najwyższą heterozygotyczność oczekiwaną wykazywała populacja z Białowieży, a najmniejszą populacja z Kamiennej Góry. Wszystkie badane populacje wykazały niedobór heterozygot, a największy niedobór heterozygot zaobserwowano w potomstwie populacji z Białowieży, a najmniejszy z Kamiennej Góry. Największą odległość genetyczną zaobserwowano pomiędzy potomstwem populacji z Jaty i Białowieży, a najmniejszą pomiędzy potomstwem populacji z Łabowca i z Kamiennej Góry. Niniejsze badania wykazały, że Białowieska proweniencja różni się zdecydowanie od trzech pozostałych. Proweniencja ta, jest populacją sztuczną, założoną na początku XX wieku i powstałą z nasion niewiadomego pochodzenia. Odrębność proweniencji z Białowieży może wynikać z jej lokalizacji. Rośnie ona ok. 100 km poza granicą naturalnego zasięgu gatunku, co może ograniczać przepływ genów z innymi proweniencjami. GENETIC VARIABILITY OF FOUR PROVENANCES PROGENY OF SILVER FIR (Abies alba MILL.) EXPRESSED IN MICROSATELLITE NUCLEAR DNA POLYMORPHISM (nssr) Ewa Maria Pawlaczyk 1, Ewa Chudzińska 2, Maria Anna Bobowicz 3 Department of Genetics, Experimental Biology Institute, Adam Mickiewicz University, Poznań Key words: silver fir, variability, microsatellite nuclear DNA Summary The main purpose of the analyses was to describe and estimate the level of nssrs differentiation between the progeny of four provenances of silver fir (Abies alba MILL.) from the north-eastern range limits. The progeny grew in the experimental area which was located in the Nawojowa District. The progeny of 111 maternal trees from Białowieża District, Jata Reserve, Kamienna Góra Reserve (Roztocze National Park) and Łabowiec Reserve were studied. Two polymorphic nuclear microsatellite loci were analysed. Genetic parameters such as the number of alleles per locus (Na), the number of effective alleles (Ne), observed and expected heterozygosity (Ho, He), Wright s fixation index (F), genetic similarity coefficient (IN), genetic differentiation coefficient (FST), gene flow (Nm) and Nei s genetic distances were calculated. The analysis of molecular variance (AMOVA) showed a significant difference in the level of gene diversity between progeny. AMOVA showed that 5% of the total nssr variations were attributable to the differences between populations and 95% to differences within populations. The genetic differentiation level among populations was low, but all the analyzed loci were polymorphic. No unique alleles were detected. Gene flow (Nm) between populations was high and genetic differentiation coefficient (FST), was low. The highest observed heterozygosity (Ho) was detected in populations from Łabowiec and Kamienna Góra, while the lowest from Białowieża. The highest expected heterozygosity (He) was recorded in Białowieża population, whereas the lowest in Kamienna Góra. Analysis of F values revealed deviations from the Hardy-Weinberg equilibrium in all populations,

332 E.M. Pawlaczyk, E. Chudzińska, M.A. Bobowicz with the excess of homozygotes, being the highest in the population from Białowieża. The highest genetic distance was between the progeny from Jata and Białowieża and the lowest between Łabowiec and Kamienna Góra. Results indicate that the population from Białowieża differs from other analyzed populations. It is probably the result of the non-natural derivation of this population, from seeds of unknown origin. Another reason for such difference could be the localization of Białowieża population, over 100 km from the limit of natural range, which may have reduced the gene flow between populations. 1 Dr Ewa Maria Pawlaczyk 2 Dr Ewa Chudzińska 3 Prof. dr hab. Anna Maria Bobowicz Zakład Genetyki Instytut Biologii Eksperymentalnej Uniwersytet im. Adama Mickiewicza ul. Umultowska 89 61 614 POZNAŃ 1 e-mail: ewapaw@amu.edu.pl 2 e-mail: evpell@amu.edu.pl 3 e-mail: mabwa@amu.edu.pl