ECOLOGICAL CHEMISTRY AND ENGINEERING S Vol. 15, No. 1 2008 Teresa KRZYŚKO-ŁUPICKA* i Katarzyna GRATA* EKOLOGICZNE SKUTKI DZIAŁANIA HERBICYDU FOSFOORGANICZNEGO NA DIAZOTROFY GLEBOWE W OKRESIE JESIENNYM. CZĘŚĆ I ECOLOGICAL EFFECTS OF PHOSPHOORGANIC HERBICIDE ON SOIL DIAZOTROPHS IN AUTUMN. PART I Streszczenie: Badano wpływ herbicydu fosfoorganicznego Roundup na liczebność i intensywność wiązania azotu przez glebowe drobnoustroje niesymbiotyczne (diazotrofy) w glebie nienawoŝonej i nawoŝonej obornikiem w okresie jesiennym. Liczebność diazotrofów oznaczano metodą płytkową na bezazotowej poŝywce Fenglerowej, a potencjalną aktywność wiązania azotu atmosferycznego przez diazotrofy glebowe zmodyfikowaną metodą Pochona. Na podstawie przeprowadzonych badań w okresie jesiennym stwierdzono okresową stymulację liczebności diazotrofów po 30 dniach działania herbicydu zarówno w glebie nienawoŝonej, jak i glebie z obornikiem. Natomiast po 7 i 90 dniach odnotowano duŝy (10-krotny) spadek ich liczebności. W tym okresie potencjalna aktywność wiązania azotu molekularnego była stymulowana przez herbicyd w glebie nienawoŝonej po 90 dniach jego działania, natomiast w glebie z obornikiem proces ten był najwyraźniej hamowany po 30 dniach. StęŜenie azotu azotanowego i amonowego było większe w obiektach z Roundupem. Słowa kluczowe: gleba, Roundup, diazotrofy, intensywność wiązania azotu, jesień Wpływ herbicydów na rozwój i aktywność mikroorganizmów glebowych zaleŝy nie tylko od właściwości herbicydu, ale równieŝ od fizykochemicznych właściwości gleb, ich aktywności biologicznej, zabiegów agrotechnicznych, warunków klimatycznych [1, 2], a takŝe od terminu jego zastosowania [3, 4]. Oddziaływanie herbicydów na rozwój populacji drobnoustrojów następuje na skutek zaburzeń w metabolizmie komórki, ale nie wszystkie jego zmiany prowadzą do zahamowania procesu rozmnaŝania się. Jednym ze zjawisk zaburzenia metabolizmu pierwotnego jest wiązanie wolnego azotu przez mikroorganizmy glebowe [5]. Biologiczne wiązanie azotu molekularnego ma znaczenie ekologiczne i ekonomiczne. Tą drogą bowiem do gleby dostaje się znacznie więcej tego pierwiastka niŝ wprowadza się go w postaci nawozów azotowych. Wzbogacenie gleby w azot nie wymaga więc wy- * Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej, Uniwersytet Opolski, ul. kard. B. Kominka 4, 45-035 Opole, tel. 077 401 60 57, e-mail: teresak@uni.opole.pl
96 Teresa Krzyśko-Łupicka i Katarzyna Grata sokich kosztów produkcji nawozów i nie zanieczyszcza środowiska. Rocznie zostaje związane 175 10 6 Mg azotu, z czego 30% przypada na wiązanie niesymbiotyczne [6]. Za wiązanie azotu molekularnego odpowiedzialne są diazotrofy - zróŝnicowane pod względem systematycznym bakterie, zawierające enzym nitrogenazę [7]. Przeprowadzają one reakcje wbudowywania azotu do związków organicznych, które bezpośrednio trafiają do zapasów białka w glebie. Wolno Ŝyjące diazotrofy potrafią prowadzić ten proces całkowicie bez udziału rośliny, wykorzystując jako źródło energii związki organiczne, często oporne na rozkład. Do grupy tej zaliczane są sinice (Cyanoprokariota), bakterie tlenowe z rodzajów: Azotobacter, Arthrobacter, Azomonas, Azospiryllum, Azotococcus, Beijerinckia, Klebsiella, Derxia Pseudomonas i Xanthomonas, względnie tlenowe, takie jak: Enterobacter i Bacillus, oraz beztlenowe np. Clostridium czy redukujące siarczany Desulfovibrio i Desulfotomaculum [8-10]. Nie ma jednak ostrego zróŝnicowania pomiędzy wolno Ŝyjącymi i symbiotycznymi organizmami wiąŝącymi azot, poniewaŝ wolno Ŝyjące Bradyrhizobium takŝe wiąŝe pewne jego ilości. Do rozwoju diazotrofów w środowisku konieczne są rozpuszczalne połączenia fosforowe, Ŝelazo, molibden lub wanad oraz bor [9]. Negatywny wpływ na wiązanie azotu molekularnego poza pestycydami i metalami cięŝkimi wywierają nadmierne ilości azotu mineralnego, zwłaszcza amonowego [11]. Większa koncentracja jonów amonowych w środowisku, a zatem i wewnątrz komórki moŝe prowadzić do zahamowania tworzenia syntetazy glutaminowej, a w konsekwencji do zatrzymania syntezy nitrogenazy [9, 12]. Aktywność nitrogenazy u wszystkich diazotrofów hamowana jest przez tlen, dlatego wykształciły one specyficzne mechanizmy ochrony enzymu. U diazotrofów tlenowych utrzymanie niskiego stęŝenia tlenu w komórce zapewnia związanie kompleksu enzymatycznego z membranami, produkcja śluzu i tworzenie skupień oraz duŝe tempo oddychania [12]. Zaburzenia w gospodarce azotowej mogą być związane z procesami transaminacji, powstawaniem łańcuchów peptydowych lub teŝ z przepuszczalnością błony cytoplazmatycznej, wskutek czego zmienia się natęŝenie wypływu aminokwasów poza komórkę. W kulturach A. chroococcum poddanych działaniu venzaru notowano ubytek leucyny, fenyloalaniny i tryptofanu, będących prekursorami kwasów huminowych. Związane jest to z blokowaniem enzymu transaminazy i nitrogenazy, co spowodowało zahamowanie procesu wiązania azotu molekularnego [13]. Rozwój czystych kultur bakterii z rodzajów Azotobacter, Azotomonas i Beijerinckia silnie natomiast hamowały fungicydy tiuramowe [14]. W badaniach niewielu autorów podejmuje problem wpływu herbicydu Roundup na proces wiązania wolnego azotu przez niesymbiotyczne diazotrofy glebowe. Wachowska [15] zaobserwowała, Ŝe w warunkach polowych herbicyd ten stosowany do niszczenia traw wywoływał niekorzystne zmiany środowiska, prowadzące początkowo do zahamowania rozwoju bakterii z rodzaju Azotobacter, a po 20 dniach, w miarę zanikania substancji aktywnej, do odbudowy tej populacji. Znacznie więcej prac dotyczy skutków działania Roundupu na proces wiązanie wolnego azotu przez brodawkowe bakterie symbiotyczne. Zwrócono uwagę na duŝą wraŝliwość bakterii brodawkowych z gatunku Rhizobium japonicum nawet na bardzo małe dawki tego herbicydu [16]. Objawiało się to zmniejszoną zdolnością tworzenia brodawek
Ekologiczne skutki działania herbicydu fosfoorganicznego na diazotrofy glebowe Cz. I 97 na korzeniach soi, a przez to i inhibicją wiązania azotu [3] oraz obniŝoną aktywnością nitrogenazy, której stopień zahamowania zaleŝał od ilorazu C/N w glebie [17]. Herbicyd Roundup (substancja aktywna glifozat-n-(fosfonometylo)glicyna) jest powszechnie stosowany do niszczenia około 70 gatunków chwastów oraz do desykacji zbóŝ i rzepaku. Jest on degradowany prawie wyłącznie pod wpływem wytwarzanych przez drobnoustroje enzymów [18, 19] do sarkozyny lub kwasu aminometylofosfonowego (AMPA), NH 3, CO 2, C 2 H 5 OH, wody i fosforanów [20, 21]. Jednak AMPA moŝe ulegać w glebie kumulacji albo degradacji wolniejszej niŝ glifozat [22], co prowadzi do wzrostu liczebności grzybów [23], a tym samym zakłócenia równowagi biologicznej gleby. Mikroorganizmy glebowe w większym stopniu mogą reagować na zmiany środowiska związane z wegetacją roślin, zabiegami agrotechnicznymi, warunkami klimatycznymi niŝ bezpośrednio na sam herbicyd. Z tego względu w badaniach nad wpływem herbicydów na właściwości gleb i mikroorganizmy preferowane są testy laboratoryjne, prowadzone w glebie w warunkach kontrolowanych. Celem badań była laboratoryjna ocena wpływu Roundupu na liczebność i intensywność wiązania azotu przez diazotrofy niesymbiotyczne, w glebie nienawoŝonej i nawo- Ŝonej obornikiem, w okresie jesiennym. Materiał i metody Materiał badawczy stanowiły próbki gleby brunatnej właściwej o ph = 5,5, pobrane jesienią z warstwy gleby ornej 0 25 cm. Zawartość azotu azotanowego wyjściowo w roztworze glebowym wynosiła 27,5 mg(kg s.m.) 1, a azotu amonowego 23,8 mg(kg s.m.) 1. Doświadczenie wazonowe załoŝono w następujących obiektach: I-Gleba (G), II-Gleba + Roundup (GH), III-Gleba + obornik (GO), IV-Gleba + obornik + Roundup (GOH). Do kaŝdego wazonu wprowadzono 1 kg badanej gleby. Roundup rozpylono na powierzchni wazonów w ilości równowaŝnej dawce polowej 2,67 10 3 cm 3, a dojrzały obornik wprowadzono w ilości równowaŝnej dawce polowej 1,33 g kg 1. Za podstawę obliczenia przyjęto masę 5 cm warstwy ornej na powierzchni 1 ha. Badaną glebę inkubowano w temperaturze 20ºC przez 7, 30 i 90 dni, utrzymując stałą wilgotność na poziomie 60% pojemności wodnej. Liczebność diazotrofów oznaczano metodą płytkową na bezazotowej poŝywce Fenglerowej [24] w temperaturze 28ºC, po 7 dobach inkubacji, a potencjalną aktywność wiązania azotu atmosferycznego przez diazotrofy glebowe (Dn) zmodyfikowaną metodą Pochona [25]. Wyniki podano w przeliczeniu na 1 g suchej masy gleby. Obliczenia statystyczne wykonano metodą analizy wariancji z zastosowaniem testu Duncana. Analizy chemiczne wykonywane po 7 i 90 dniach z próbek uśrednionych obejmowały: oznaczenie ph KCl metodą potencjometryczną, fosforu metodą kolorymetryczną [26] i wybranych pierwiastków: Ŝelaza, manganu, boru metodą AAS oraz mineralnych form azotu metodą Greweling-Peecha [27]. Wyniki i ich omówienie Herbicydy wpływają zarówno na rozwój wolno Ŝyjących asymilatorów azotu, a w szczególności na szczepy rodzaju Azotobacter, jak i aktywność wiązania przez te
98 Teresa Krzyśko-Łupicka i Katarzyna Grata gleby azotu. Przy czym wiązanie azotu było hamowane znacznie silniej niŝ rozwój Azotobacter ssp. [14]. Wyniki badań przeprowadzonych w okresie jesiennym wykazały po 30 dniach w obiektach z Roundupem okresową stymulację liczebności diazotrofów, większą w glebie nienawoŝonej niŝ w glebie z obornikiem. Natomiast po 7 i 90 dniach odnotowano znaczne hamowanie ich rozwoju zarówno w glebie nienawoŝonej, jak i w glebie z obornikiem (rys. 1). Okresowy wzrost liczebności diazotrofów moŝe powodować wzbogacenie gleby w substancje pokarmowe, pochodzące z rozkładu Roundupu, oraz z ciał organizmów zabitych jego działaniem. Związany jest takŝe z czasem zanikania 90% początkowej dawki herbicydu wynoszącym 14 90 dni. Przetrwanie największego stęŝenia Roundupu w glebie zaleŝy równieŝ od zdolności adaptacyjnych mikroorganizmów i umoŝliwia po 20 dniach odbudowę populacji Azotobacter [15]. K - kontrola; G - gleba nienawoŝona; GH - gleba nienawoŝona traktowana herbicydem; GO - gleba nawoŝona obornikiem; GOH - gleba nawoŝona obornikiem traktowana herbicydem. Wartości oznaczone takimi samymi literami nie róŝnią się dla p < 0,05 Rys. 1. Ogólna liczebność diazotrofów w glebie w obecności herbicydu w okresie jesiennym [jtk (g s.m. gleby) 1 ] Potencjalna aktywność wiązania azotu atmosferycznego w obiektach z Roundupem była początkowo wyraźnie hamowana, najsilniej po 30 dniach w glebie nawoŝonej, natomiast po 90 dniach zaobserwowano 12% stymulację w glebie nienawoŝonej (rys. 2). Na znacznie silniejsze hamowanie wiązania azotu w obecności pestycydów niŝ rozwój Azotobacter ssp. zwraca uwagę Strzelec [14]. Inną przyczyną moŝe być wzrost kwasowości gleby (rys. 3) w obiektach z Roundupem, większy w glebie nawoŝonej (ph = 5,2), co zadziałało jak czynnik selekcyjny i zahamowało rozwój niektórych diazotrofów, takich jak Azotobacter [12], a dalszą konsekwencją wzrostu kwasowości mogło być hamowanie aktywności nitrogenazy i wiązania azotu. W obiektach z herbicydem w glebie nienawoŝonej stęŝenie Ŝelaza utrzymywało się na zbliŝonym poziomie, ale odnotowano wzrost stęŝenia boru po 90 dniach (rys. 3a). Natomiast w glebie nawoŝonej początkowo obserwowano 13% wzrost stęŝenia Ŝelaza, a po 90 dniach spadek stęŝenia wszystkich badanych pierwiastków, największy boru. Towarzyszył temu wzrost kwasowości gleby (rys. 3b). ObniŜenie stęŝenia fosforu ogó-
Ekologiczne skutki działania herbicydu fosfoorganicznego na diazotrofy glebowe Cz. I 99 łem w obiektach z Roundupem (rys. 3a) związane było z pobieraniem go przez bakterie, ale najprawdopodobniej takŝe ze wzrostem wiązania przez jony Al i Fe, poniewaŝ ph < 6,5. Zaobserwowane zmiany stęŝeń pierwiastków są trudne do wyjaśnienia, niemniej wskazują na inną dynamikę przemian w badanych typach gleby. K - kontrola; G - gleba nienawoŝona; GH - gleba nienawoŝona traktowana herbicydem; GO - gleba nawoŝona obornikiem; GOH - gleba nawoŝona obornikiem traktowana herbicydem. Wartości oznaczone takimi samymi literami nie róŝnią się dla p < 0,05 Rys. 2. Intensywność wiązania azotu w obecności herbicydu w okresie jesiennym a) b) 20,00 20,0 zmainy stęŝenia pierwiastków w czasie [%] 15,00 10,00 5,00 0,00-5,00-10,00-15,00-20,00-25,00-30,00 7 90 [dni] zmainy stęŝenia pierwiastków w czasie [%] 15,0 10,0 5,0 0,0-5,0-10,0-15,0-20,0-25,0-30,0 7 90 [dni] ph P2O5 Fe B Mn ph P2O5 Fe B Mn Rys. 3. Wpływ Roundupu na zmiany ph i stęŝenia pierwiastków w glebie po 7 i 90 dniach: a) w glebie nienawoŝonej i b) glebie nawoŝonej [%] StęŜenia azotu azotanowego (N-NO 3 ) wyraźnie wzrastało w obecności herbicydu w glebie nienawoŝonej, osiągając maksimum w 30 dniu. Natomiast w glebie z obornikiem potraktowanej herbicydem stęŝenie N-NO 3 do 30 dnia doświadczenia było mniej-
100 Teresa Krzyśko-Łupicka i Katarzyna Grata sze niŝ w samej glebie z obornikiem. Następnie ulegało powolnemu obniŝeniu do poziomu 33 mg kg 1 s.m gleby zarówno w glebie nawoŝonej, jak i nienawoŝonej (rys. 4). Wzrost stęŝenia azotanów moŝe być wynikiem degradacji glifozatu [1] albo zwiększonej proliferacji bakterii nitryfikujących w wyniku stymulacji glifozatem. Pozwala to na zachowanie w glebie zasobu nieorganicznych soli azotu dostępnych dla roślin [28, 29]. G - gleba nienawoŝona; GH - gleba nienawoŝona traktowana herbicydem; GO - gleba nawoŝona obornikiem; GOH - gleba nawoŝona obornikiem traktowana herbicydem Rys. 4. StęŜenie N-NO 3 w glebie [mg (kg s.m.) 1 ] w zaleŝności od czasu działania herbicydu G - gleba nienawoŝona; GH - gleba nienawoŝona traktowana herbicydem; GO - gleba nawoŝona obornikiem; GOH - gleba nawoŝona obornikiem traktowana herbicydem. Rys. 5. StęŜenie N-NH 4 w glebie [mg (kg s.m.) 1 ] w zaleŝności od czasu działania herbicydu StęŜenia azotu amonowego (N-NH 4 ) w obiektach z herbicydem wykazywało podobną tendencję spadkową, ale było większe niŝ w obiektach bez herbicydu (rys. 5). Pomiędzy
Ekologiczne skutki działania herbicydu fosfoorganicznego na diazotrofy glebowe Cz. I 101 7 a 30 dniem doświadczenia niezaleŝnie od typu gleby utrzymywało się na poziomie 20,4 mg kg 1 s.m. gleby. Biologiczna redukcja azotu molekularnego do jonów amonowych była większa w obecności Roundupu, a więc utrata azotu glebowego do atmosfery spowodowana denitryfikacją nie jest bezpowrotna. Hauke-Pacewiczowa [2] takŝe zaobserwowała silny wzrost zawartości azotu amonowego w glebach juŝ w kilka dni po potraktowaniu ich herbicydami. W rzeczywistości mineralizacja azotu wyraŝona jako suma jonów amonowych i azotowych wzrastała w glebach traktowanych Roundupem w większym stopniu w glebie nienawoŝonej niŝ bogatszej w substancję organiczną. Roundup zastosowany do desykacji zbóŝ i rzepaku oraz w zespole upraw poŝniwnych do niszczenia chwastów wpływa na zwiększenie zasobności gleb o mniejszej zawartości substancji organicznej w azot, a tym samym poprawia rozwój upraw. Wnioski Na podstawie przeprowadzonych badań sformułowano następujące wnioski: 1. W okresie jesiennym Roundup powodował okresową (po 30 dniach) stymulację diazotrofów niesymbiotycznych, większą w glebie nienawoŝonej niŝ nawoŝonej. 2. Wzrost intensywności wiązania azotu w obecności Roundupu obserwowano po 90 dniach w glebie nienawoŝonej, a znaczny spadek po 30 dniach w glebie z obornikiem. 3. StęŜenie N-NH 4 wykazywało tendencję spadkową, ale było większe w obiektach z Roundupem. 4. StęŜenia azotu azotanowego (N-NO 3 ) wyraźniej wzrastało w obecności herbicydu w glebie nienawoŝonej, osiągając największą wartość w 30 dniu doświadczenia. 5. W obecności herbicydu zmniejszało się stęŝenie fosforanów zarówno glebie nienawoŝonej, jak i nawoŝonej, a stęŝenie boru wzrastało tylko w glebie nienawoŝonej. Literatura [1] Grossbard E.: Effect on soil microflora, [w:] Herbicides: Physiology, Biochemistry, Ecology. Ed. L.J. Audus, Academic Press, London 1976. [2] Hauke-Pacewiczowa T.: Pam. Puław. - Prace IUNG, 1971, 46, 5-48. [3] Marsh I.A.P., Davies H.A i Grossbard E.: Weed. Res. 1977, 17, 77-82. [4] Koper J. i Piotrowska A.: Z. Nauk. Akademii Tech.-Rol., Bydgoszcz, 1999, 220(44), 151-158. [5] Balicka N.: Post. Mikrobiol., 1983, 22(3/4), 291-299. [6] Król M.J. i Zielewicz- Dukowska J.: Post. Mikrobiol., 2005, 44(1), 47-56. [7] Wielbo J. i Skorupska A.: Post. Mikrobiol., 2003, 42(3), 263-283. [8] Barabasz W.: Post. Mikrobiol., 1992, 31(1), 3-40. [9] Schlegel H.G.: Mikrobiologia ogólna. WN PWN, Warszawa 1996. [10] Hubbell B.H. i Gaskins M.H. [w:] Biological nitrogen fixation. Plenum Press, New York-London 1984. [11] Myśków W. i Kobus J.: Post. Mikrobiol., 1986, 25(3/4), 243-255. [12] Bergey s manual of determinative bacteriology. Wiliams and Wilkins, Baltimore 1994. [13] Pietr S.J. i Jabłońska B.: Polish J. Soil Sci., 1987, 20, 17-23 [14] Strzelec A.: Roczn. Glebozn., 1986, 37(1), 129-138. [15] Wachowska U. i Banaszkiewicz T.: Natur. Sci., 1999, 2, 191-200. [16] Jaworski.: J. Agricult. Food Chem., 1972, 20, 1195-1198.
102 Teresa Krzyśko-Łupicka i Katarzyna Grata [17] Mőller M.M., Rosenberg C., Siltanen H. i Wartiovaara T.: Bull. Environ. Contamin. Toxicol., 1981, 27, 724-730 [18] La Nauze I., Rosenberg H. i Show P.C.: Biochim. Biophys. Acta, 1970, 212, 332-350. [19] Zeleznick L.D., Myers T.C. i Tichener E.B.: Biochim. Biophys. Acta, 1963, 78, 546-547. [20] Dick R.E. i Quinn J.P.: Appl. Microbiol. Biotechnol., 1995, 43, 545-550. [21] Klimek- Ochab M., Obojska A. i Lejczak B.: Biotechnologia, 2004, 1, 68-84. [22] Rueppel M.L., Brighwell B.B., Schaefer J. i Marvel J.T.: Agric. Food Chem., 1997, 25, 517-528. [23] Araujo A.S.F., Monteiro R.T.R. i Abarkeli R.B.: Chemosphere, 2003, 52, 799-804. [24] Fenglerowa W.: Acta Microbiol. Pol., 1970, 14(2), 203-206. [25] Pfeifer-Maliszewska W.: Metody oznaczania potencjalnej aktywności procesu wiązania wolnego azotu w glebie. Prace z dziedziny mikrobiologii gleby. PTG, Warszawa 1974. [26] Lityński T., Jurkowska H. i Gorlach E.: Analiza chemiczno-rolnicza gleby i nawozów. PWN, Warszawa 1972. [27] Nowosielski O.: Metody oznaczania potrzeb nawozowych. PWRiL, Warszawa 1974. [28] Burris R.H. i Roberts G.P.: Ann. Rev. Nutr., 1993, 13, 317-335. [29] Mandermack K.W., Kinney C.A., Coleman D., Huang Y.S., Freeman K.H. i Bogner J.: Environ. Microbiol., 2000, 2, 298-309. ECOLOGICAL EFFECTS OF PHOSPHOORGANIC HERBICIDE ON SOIL DIAZOTROPHS IN AUTUMN. PART I Summary: The main aim of the research, was to check how Roundup affects the number and intensity of nitrogen absorption by diazotrophs, in autumn, depending on the soil organic substance content. The number of diazotrophs has been determined by means of the plate method based on the nitrogen free Fengler s medium and their potential ability of atmospheric nitrogen absorption by means of the modified Pochon s method. On the basis of the carried out research, it has been found that the 30 day herbicide presence seems to stimulate diazotrophs number in both, manured and non-manured soil. However, after 7 and 90 days tenfold decrease in their number has been observed. In autumn, potential ability of atmospheric nitrogen absorption has been stimulated by the herbicide after its 90 day activity in the non-manured soil, whereas this process in the manured soil has been obviously suppressed after 30 days. The use of Roundup to desicate crops and rape and post-harvest crops in order to fight weeds has shown the influence on the increase of nitrogen amount in the soil of lower organic substance content, simultaneously improving crops development after 90 days since it was applied. Keywords: soil, Roundup, diazotrophs, N-fixing activity, autumn