ADHEZJA PAŁECZEK ESCHERICHIA COLI DO CEWNIKÓW MOCZOWYCH

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: 335-341 Patrycja Zalas-Więcek 1, Eugenia Gospodarek 1, Katarzyna Piecyk 2 ADHEZJA PAŁECZEK ESCHERICHIA COLI DO CEWNIKÓW MOCZOWYCH 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu Kierownik: dr hab. E. Gospodarek, prof. UMK 2 Katedra Podstaw Teoretycznych Nauk Biomedycznych i Informatyki Medycznej Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu Oceniono adhezję pałeczek Escherichia coli do cewników moczowych wykonanych z różnych materiałów syntetycznych. Pałeczki E. coli znamiennie częściej adherowały do cewników lateksowych i cewników wykonanych z polichlorku winylu niż do silikonowanych cewników lateksowych. Pomimo postępowania zgodnie z zasadami aseptyki, a także spełniania wymogów zgodności biologicznej, zakażenia związane ze stosowaniem biomateriałów w medycynie stanowią poważny problem i są główną przeszkodą w stosowaniu implantów medycznych, tj. cewników naczyniowych, moczowych, neurochirurgicznych, zespoleń naczyniowych, rurek intubacyjnych, zastawek, protez naczyniowych, czy ortopedycznych. Zakażenia te w znacznym stopniu są następstwem zdolności do adhezji i tworzenia biofilmu przez drobnoustroje na powierzchni polimerów. Jest to szczególnie ważny problem w przypadku chorych wymagających długoterminowego stosowania tych biomateriałów. Za najczęstszą przyczynę zakażeń związanych ze stosowaniem biomateriałów uznaje się Staphylococcus aureus i Staphylococcus epidermidis. Spośród bakterii Gram-ujemnych największe znaczenie w tego rodzaju zakażeniach mają pałeczki E. coli, Pseudomonas aeruginosa oraz bakterie należące do grupy Proteus, głównie P. mirabilis i P. vulgaris (4). Adhezja komórek bakteryjnych do biomateriałów jest uzależniona od materiału, z jakiego jest on wykonany. Stąd, celem pracy była ocena adhezji pałeczek E. coli do cewników moczowych wykonanych z różnych materiałów syntetycznych. MATERIAŁ I METODY Szczepy bakteryjne. Do badań użyto 74 szczepów E. coli izolowanych w Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Szpitala Uniwersyteckiego im. dr. A. Jurasza Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu (SU CM UMK), w latach 2003-2006. Wybrano szczepy izolowane z moczu oraz z krwi, które pochodziły

336 P. Zalas-Więcek, E. Gospodarek, K. Piecyk Nr 4 od chorych leczonych w klinikach i poradniach przyklinicznych SU CM UMK. Każdy szczep pochodził od innego chorego. W identyfikacji badanych szczepów uwzględniano następujące cechy: morfologię kolonii na podłożu MacConkey Agar (Becton Dickinson), zdolność fermentacji laktozy, wytrącanie dezoksycholanu sodu. Ponadto, wykorzystano podłoże z mocznikiem i L-tryptofanem (L-tryptofan 3 g/l, mocznik 2 g/l, KH 2 PO 4 2 g/l, czerwień krezolowa 0,2% roztwór w 50% alkoholu etylowym, NaCl 5 g/l, pepton Difco 10 g/l, agar czysty 20 g/l, H 2 O destylowana) w celu potwierdzenia zdolności wytwarzania tryptofanazy przy jednoczesnym wykluczeniu zdolności wytwarzania ureazy. Dla szczepów laktozo-ujemnych przynależność gatunkową określano z użyciem kart do identyfikacji drobnoustrojów Gram-ujemnych (GNI+) (biomérieux), które odczytywano za pomocą automatycznego systemu VITEK (biomérieux). Ocena adhezji szczepów E.coli do cewników moczowych wykonanych z różnych materiałów syntetycznych. W badaniach użyto cewników moczowych wykonanych z różnych materiałów syntetycznych: cewnik Foley a (lateks, L), cewnik Foley a (lateks silikonowany, LS), cewnik Nelaton (polichlorek winylu, PCV). Ocenę adhezji pałeczek E. coli do cewników moczowych wykonano stosując metodę opisaną przez Richardsa i wsp. (wg 2) w modyfikacji własnej. Z 20-godzinnej hodowli badanego szczepu bakteryjnego na podłożu MacConkey Agar sporządzono zawiesinę o gęstości 0,5 według skali MacFarlanda w jałowym podłożu BHI (Brain Heart Infusion Broth, Becton Dickinson). Następnie umieszczano w niej 1,5-centymetrowy fragment jałowego cewnika moczowego i inkubowano 24 godziny w temperaturze 37 C. Cewnik przemywano dwukrotnie PBS o ph 7,2, przenoszono do 3 ml jałowego podłoża BHI i dodawano jedną kroplę 1% wodnego roztworu chlorku 2,3,5 trójfenylotetrazoliowego (TTC, Sigma). Po dwóch godzinach inkubacji w temperaturze 37 C oceniano obecność czerwonego formazanu powstającego w reakcji redukcji TTC prowadzonej przez aktywne metabolicznie drobnoustroje. Przyjęto następującą umowną skalę oceny cewników: brak adhezji brak zmiany zabarwienia cewnika, słaba adhezja lekkie, punktowe zaróżowienie powierzchni cewnika, średnia adhezja zaróżowienie powierzchni cewnika, silna adhezja silne zaczerwienienie powierzchni cewnika. Kontrolę stanowiły jałowe cewniki moczowe umieszczone w jałowym podłożu BHI, z którymi postępowano tak, jak z próbką badaną. Metody statystyczne. Celem stwierdzenia istotności różnic między dwiema zmiennymi skorzystano z testu dwóch wskaźników struktury (6, 10). Wszystkie testy przeprowadzono przy ustalonym poziomie istotności a=0,05. WYNIKI Ocena adhezji szczepów E. coli do cewników moczowych wykonanych z różnych materiałów syntetycznych. Spośród 74 badanych szczepów, 54 (73,0%) adherowały do cewników L, 31 (41,9%) do cewników LS, a 45 (60,8%) do cewników z PCV (Ryc. 1). Stwierdzono, że badane szczepy znamiennie częściej adherowały do cewników L niż LS (p=0,000) i istotnie częściej adherowały do cewników z PCV niż do cewników LS (p=0,022). Najwyższy odsetek szczepów o silnej adhezji (27,0%) stwierdzono w grupie szczepów adherujących do cewników z PCV, a najwyższy odsetek szczepów średnio adherujących

Nr 4 Adhezja E. coli do cewników moczowych 337 i słabo adherujących (odpowiednio, 17,6% i 20,3%) - w grupie szczepów wykazujących adhezję Rycina 1. do cewników L (Ryc. 1). 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 20 43 73,0% 41,9% 60,8% 29 26 21 19 13 15 7 6 3 20 0,0% Cewnik L Cewnik LS Cewnik z PCV brak słaba średnia silna Rycina 1. Adhezja szczepów E. coli (n=74) do cewników moczowych z uwzględnieniem stopnia adhezji Wśród 74 badanych szczepów, 4 szczepy charakteryzowały się silną adhezją do wszystkich rodzajów użytych w badaniu cewników moczowych. Tabela I. Pochodzenie szczepów E. coli adherujących do cewników L (n=54), LS (n=31) oraz z PCV (n=45) Nazwa jednostki, z której pochodziły badane szczepy Liczba i odsetek szczepów wykazujących adhezję do cewników moczowych Cewnik % Cewnik % Cewnik % L LS PCV Klinika Anestezjologii i Intensywnej Terapii 3 5,6 1 3,2 3 6,8 Klinika Chirurgii Dziecięcej 4 7,4 1 3,2 0 0,0 Klinika Chorób Zakaźnych i Hepatologii 2 3,7 0 0,0 1 2,2 Klinika Geriatrii 3 5,6 3 9,7 2 4,4 Klinika Nefrologii, Nadciśnienia Tętniczego i Chorób Wewnętrznych ze Stacją Dializ 12 22,2 6 19,3 11 24,4 Klinika Pediatrii, Alergologii i Gastroenterologii 5 9,3 4 12,9 4 8,9 Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii 5 9,3 3 9,7 5 11,1 Klinika Rehabilitacji 4 7,4 3 9,7 4 8,9 Klinika Transplantologii i Chirurgii Ogólnej 8 14,8 4 12,9 7 15,6 Klinika Urologii, Ogólnej, Onkologicznej i Dziecięcej 1 1,8 1 3,2 1 2,2 Poradnia Urologiczna 4 7,4 3 9,7 4 8,9 Praktyka Lekarza Rodzinnego 2 3,7 2 6,5 2 4,4 Medycyna Sądowa 1 1,8 0 0,0 1 2,2

338 P. Zalas-Więcek, E. Gospodarek, K. Piecyk Nr 4 Pochodzenie pałeczek E.coli, a adhezja do cewników moczowych. Spośród szczepów wykazujących adhezję do cewników moczowych, najwięcej pochodziło z Kliniki Nefrologii, Nadciśnienia Tętniczego i Chorób Wewnętrznych ze Stacją Dializ, odpowiednio 11 (20,4%) adherujących do cewników L, 5 (16,1%) adherujących do cewników LS oraz 10 (22,2%) adherujących do cewników z PCV. Pochodzenie pozostałych szczepów adherujących do cewników moczowych zestawiono w tabeli I. Ocena adhezji do cewników moczowych szczepów E.coli izolowanych z krwi i z moczu. Wśród pałeczek E. coli wyosobnionych z krwi stwierdzono wyższy odsetek szczepów adherujących do cewników L i cewników z PCV niż w grupie pałeczek E. coli wyosobnionych z moczu (odpowiednio, 79,3% vs 68,9% i 69,0% vs 55,6%) (Ryc. 2). Nie wykazano znamienności statystycznej tych różnic. Wśród pałeczek Rycina 2. E. coli wyosobnionych z krwi i z moczu najwyższe odsetki szczepów wykazujących silną adhezję, stwierdzono w grupie adherujących do cewników PCV (odpowiednio, 34,5% i 22,2%) (Ryc. 2). Cewnik L Cewnik LS 1 4 5 6 7 6 10 79,3% 34,5% 19 Krew Cewnik z PCV 2 8 9 10 69,0% Cewnik L 8 7 16 14 68,9% Cewnik LS 3 2 16 46,7% 24 Mocz Cewnik z PCV 4 10 11 20 55,6% 0,0% 20,0% 40,0% 60,0% 80,0% 100,0% brak słaba średnia silna Rycina 2. Adhezja do cewników moczowych szczepów E. coli izolowanych z krwi (n=29) i z moczu (n=45) z uwzględnieniem stopnia adhezji Ocena adhezji do cewników moczowych laktozo ujemnych szczepów E.coli. Laktozo-ujemne szczepy E. coli w wyższym odsetku adherowały do cewników L niż do cewników z PCV i znamiennie częściej adherowały do cewników L niż do cewników LS

Nr 4 Adhezja E. coli do cewników moczowych 339 (p=0,049) (Ryc. 3). Wszystkie laktozo-ujemne szczepy adherujące do badanych cewników moczowych wykazywały słabą adhezję. Rycina 3. 85,7% 28,6% 57,1% 100,0% 6 80,0% 5 60,0% 3 4 40,0% 20,0% 0,0% 2 1 0 0 0 0 0 0 Cewnik L Cewnik LS Cewnik PCV brak słaba średnia silna Rycina 3. Rozkład procentowy adhezji do cewników moczowych laktozo-ujemnych szczepów E. coli (n=7) z uwzględnieniem stopnia adhezji DYSKUSJA W niniejszej pracy w celu oceny adhezji badanych szczepów E. coli do cewników wykonanych z różnych polimerów, posłużono się zmodyfikowaną metodą Richardsa i wsp. (wg 2), która polega na ocenie stopnia redukcji substratu - TTC do nierozpuszczalnego formazanu, przeprowadzanej przez drobnoustroje aktywne metabolicznie. Wykazano, że szczepy E. coli znamiennie częściej adherowały do cewników L i cewników z PCV niż do cewników LS. Podobne wyniki uzyskali inni autorzy dla pałeczek E. coli (11), Acinetobacter sp. (5) i gronkowców koagulazoujemnych (ang. Coagulase Negative Staphylococci, CNS) (1). W dostępnym piśmiennictwie znaleziono prace, których autorzy oceniali adhezję bakterii do innych polimerów niż ujęte w niniejszej pracy. Paduch i Niedzielski (8) podjęli próbę oceny adhezji pałeczek E. coli do najczęściej używanych na rynku amerykańskim cewników moczowych, w układzie przepływowym. W badaniach wykorzystali cewniki z czystego silikonu, ze zmodyfikowanego poliuretanu oraz wykonane z materiału chronionego patentem, składającego się z polietylenu i polipropylenu z zewnętrzną warstwą heparynizowaną. Autorzy wykazali różną zdolność adhezji pałeczek E. coli w zależności od zastosowanego biomateriału. Najmniejsza podatność na adhezję szczepów E. coli cechowała cewniki wykonane ze zmodyfikowanego poliuretanu. Ci sami autorzy, na podstawie wyników własnych oraz doniesień innych autorów, stwierdzili, że powyższych cewników powinno używać się w przypadku, gdy zamierza się osiągnąć najniższe ryzyko powikłań w postaci zakażeń.

340 P. Zalas-Więcek, E. Gospodarek, K. Piecyk Nr 4 Wolska i wsp. (12) oceniali zdolność adhezji i tworzenia biofilmu szczepów P. aeruginosa do powierzchni cewników stosowanych w medycynie wykonanych z LS, poliuretanu i z PCV, z zastosowaniem metody Richardsa i wsp. (wg 2), w modyfikacji Różalskiej i wsp. (9). Autorzy stwierdzili, że pałeczki ropy błękitnej częściej adherowały do powierzchni cewników z PCV i LS niż do cewników wykonanych z poliuretanu. Najwyższy odsetek (42,3%) szczepów silnie adherujących stwierdzono w grupie szczepów wykazujących adhezję do cewników z PCV. Podobnych obserwacji dokonano w niniejszej pracy. Wobec wzrostu częstości zakażeń związanych ze stosowaniem polimerów w medycynie, rozpoczęto poszukiwanie nowych sposobów zapobiegania im. Dzięki osiągnięciom chemii polimerów zwiększył się wybór tworzyw sztucznych, które można by zastosować do produkcji cewników stosowanych w medycynie i jednocześnie uzyskać cewniki o pożądanych cechach, czyli takich, których właściwości fizyko-chemiczne nie będą sprzyjały adhezji drobnoustrojów i tworzeniu przez nie biofilmu (4). Przeszkodą w postępie badań nad zjawiskiem adhezji i tworzenia biofilmu na powierzchni biomateriałów jest fakt, że materiały, z których są wykonane, a także modyfikacja ich powierzchni, są chronione prawami patentowymi i większość producentów nie informuje o ich składzie chemicznym (wg 8). Jednym z rozwiązań jest pokrywanie biomateriałów związkami hamującymi adhezję drobnoustrojów, np. jonami srebra, których przeciwbakteryjne właściwości znane są od wieków (7). Proponowano także pokrywanie biomateriałów specyficznymi przeciwciałami i tlenkiem azotu (4). Inną strategią jest impregnowanie biomateriałów związkami przeciwdrobnoustrojowymi takimi, jak antybiotyki i chemioterapeutyki, które są uwalniane z powierzchni biomateriałów, chroniąc je przed adhezją mikroorganizmów (4). Interesującym wydaje się być pomysł ingerencji w system komunikowania się drobnoustrojów - quorum sensing. Zakłócanie sygnałów chemicznych wprowadza dezinformację wśród komórek bakteryjnych, co w konsekwencji może zapobiec utworzeniu biofilmu na powierzchni biomateriału (3). Szczepy E.coli wyosobnione z krwi w wyższym odsetku adherowały do polistyrenu, cewników L i cewników z PCV. Trudno jednak podjąć dyskusję wobec braku w dostępnym piśmiennictwie prac, w których porównywano właściwości adhezyjne szczepów E. coli odpowiedzialnych za zakażenia układu moczowego i bakteriemię. W przyszłości należałoby poświęcić temu zagadnieniu więcej uwagi. Niektóre z badanych laktozo-ujemnych szczepów E. coli adherowały do cewników moczowych, jednak wszystkie spośród adherujących wykazywały słabą adhezję. W najmniejszym stopniu szczepy te adherowały do cewników LS. W dostępnym piśmiennictwie nie udało się znaleźć prac, których autorzy opisywaliby zdolność adhezji do polimerów laktozo-ujemnych pałeczek E. coli. WNIOSKI 1. Istnieje zależność pomiędzy częstością i intensywnością adhezji pałeczek E. coli, a rodzajem polimeru. 2. W praktyce klinicznej należałoby rozważyć stosowanie cewników lateksowych silikonowanych w celu ograniczenia kolonizacji biomateriałów przez pałeczki E. coli, a tym samym zapobieganiu zakażeniom z ich udziałem.

Nr 4 Adhezja E. coli do cewników moczowych 341 P. Zalas-Więcek, E. Gospodarek, K. Piecyk ADHESION OF ESCHERICHIA COLI RODS TO UROLOGICAL CATHETERS SUMMARY The aim of this study was evaluation of adhesion of E. coli rods to urological catheters made of different synthetic materials. This study included 74 of E. coli strains isolated from urine and blood samples. All of these strains were isolated in the Clinical Microbiology Department of dr A. Jurasz University Hospital in 2003-2006. Analized strains significantly more often adhered to latex catheters than latex catheters covered by silicon and significantly more often adhered to PCV catheters than latex catheters covered by silicon. Four strains were characterized by a strong adhesion to all kinds used urological catheters, used in this study. Among E. coli strains isolated from the blood a higher percentage of strains demonstated adhesion to latex and PCV catheters than in the group of E. coli strains isolated from urine samples (79,3% vs 68,9% and 69,0% vs 55,6%, respectively). Out of strains demonstrating the adhesion to urological catheters, the most came from the patients from Clinic of the Nephrology, of Arterial Hypertension and Internal Diseases with the Station of Dialyses. All of lactose-negative E. coli strains adhered weakly to urological catheters. PIŚMIENNICTWO 1. Bartoszewicz M, Nowicka J, Przondo-Mordarska A. Zdolność produkcji śluzu gronkowców koagulazo-ujemnych w zakażeniach odcewnikowych. Mikrobiol Med 2003; 1: 20-3. 2. Gallimore B, Gagnon RF, Subang R. Natural history of chronic Staphylococcus epidermidis foreign body infection in a mouse model. J Infect Dis 1991; 164: 1220-3. 3. Hentzner M, Givskov M. Pharmacological inhibition of quorum sensing for the treatment of chronic bacterial infections. J Clin Ivest 2003; 112: 1300-7. 4. Hetrick EM, Schoenfisch MH. Reducing implant-related infections: active release strategies. Chem Soc Rev 2006; 35: 780-9. 5. Kraśnicki K. Adhezja pałeczek Acinetobacter spp. do polimerów. Akademia Medyczna im. L. Rydygiera Bydgoszcz 2002; rozprawa doktorska. 6. Krysicki W, Bartos J, Dyczka W, Królikowska K, Wasilewska M. Rachunek prawdopodobieństwa i statystyka matematyczna w zadaniach cz. II. Statystyka matematyczna. Warszawa: PWN 2002. 7. Lee D, Cohen RE, Rubner MF. Antibacterial properties of Ag nanoparticle loaded multilayers and formation of magnetically directed antibacterial microparticles. Langmuir 2005; 21: 9651-9. 8. Paduch DA, Niedzielski J. Materiały biomedyczne: Część II: Ocena przyczepności pałeczki okrężnicy do materiałów biomedycznych w oryginalnym dynamicznym układzie przepływowym. Chir Pol 2005; 7: 252-66. 9. Różalska B, Sadowska B, Więckowska M, Rudnicka W. Wykrywanie biofilmu bakteryjnego na biomateriałach medycznych. Med Dośw Mikrobiol 1998; 50: 115-22. 10. Stanisz A. Przystępny kurs statystyki w oparciu o program STATISTICA PL na przykładach z medycyny. Kraków: StatSoft Polska 2001. 11. Sugerman B. Adherence of bacteria to urinary catheters. Urol Res 1982; 10: 37-40. 12. Wolska K, Jakubczak A. Wykrywanie biofilmu Pseudomonas aeruginosa na biomateriałach medycznych. Med Dośw Mikrobiol 2003; 55: 371-8. Otrzymano: 15 IX 2009 r. Adres Autora: 85-094 Bydgoszcz, ul. M. Curie-Skłodowskiej 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii, Collegium Medicum im. Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet M. Kopernika w Toruniu