SPRAWOZDANIE Z DZIAŁALNOŚCI INSTYTUTU GRUŹLICY I CHORÓB PŁUC

SPRAWOZDANIE Z DZIAŁALNOŚCI INSTYTUTU GRUŹLICY I CHORÓB PŁUC w roku 2011 1

SPIS TREŚCI 1. STRUKTURA INSTYTUTU GRUŹLICY I CHORÓB PŁUC STAN NA DZIEŃ 31.12.2011r.. 4 1.1. Dyrekcja IGiChP w Warszawie. 4 1.2. Struktura Organizacyjna IGiChP w Warszawie. 5 1.3. Dyrekcja IGiChP w Rabce Zdrój. 7 1.4. Struktura Organizacyjna IGiChP w Rabce Zdrój. 8 1.5. Pracownicy IGiChP w Warszawie. 10 1.6. Pracownicy IGiChP w Rabce Zdrój. 12 1.7. Pracownicy IGiChP Warszawa i Rabka Zdrój. 13 1.8. Samodzielni pracownicy naukowo-badawczy. 14 2. DZIAŁALNOŚĆ NAUKOWA. 15 2.1. Działalność Rady Naukowej. 15 2.2. Studia Doktoranckie..... 21 2.3. Członkostwo pracowników naukowych w Akademiach Naukowych. 21 2.4. Członkostwo pracowników naukowych w Radach Redakcyjnych czasopism 22 2.5. Członkostwo pracowników naukowych w międzynarodowych organizacjach naukowych 26 2.6. Członkostwo pracowników naukowych w Radach Naukowych. 27 2.7. Prace badawcze realizowane w ramach działalności statutowej. 28 2.8. Projekty badawcze realizowane w IGiChP. 146 2.9. Sprawozdanie z działalności Komisji Bioetycznej. 148 2.10. Sprawozdanie ze współpracy z zagranicą. 150 2.11. Wykaz referatów wygłoszonych przez pracowników Instytutu w Polsce 159 2.12. Publikacje pracowników Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc.. 187 2.12.1. Zestawienie ilościowe publikacji pracowników IGiChP.. 188 2.12.2. Publikacje, które ukazały się w recenzowanych wydawnictwach 189 2.12.3. Prace oryginalne w czasopismach nie posiadających IF.. 195 2.12.4. Prace kazuistyczne 197 2.12.5. Prace poglądowe 198 2.12.6. Popularno naukowe 200 2.12.7. Zalecenia, wytyczne, rekomendacje 201 2

2.12.8. Artykuły redakcyjne 201 2.12.9. Raporty 201 2.12.10. Książki, podręczniki, poradniki 202 2.12.11. Monografie 202 2.12.12. Rozdziały 202 2.12.13. Streszczenia w czasopismach zagranicznych 205 2.12.14. Streszczenia w czasopismach krajowych 211 2.12.15. Streszczenia w materiałach zjazdowych. 212 2.13. Biblioteka naukowa w Warszawie 215 2.14. Biblioteka naukowa w Rabce Zdrój 216 3. DZIAŁALNOŚĆ SZKOLENIOWA I DYDAKTYCZNA 218 4. SPRAWOZDANIE Z DZIAŁALNOŚCI KLINICZNEJ 220 5. SPRAWOZDANIE Z DZIAŁALNOŚCI ADMINISTRACYJNO-GOSPODARCZEJ 5.1. Dział administracyjny 235 5.2. Dział zaopatrzenia 239 5.3. Ochrona przeciwpożarowa, obrona cywilna i ochrona informacji niejawnych 243 5.4. Informacja o stanie BHP 244 6. SPRAWOZDANIE DYREKTORA DS. EKONOMICZNYCH ORAZ DZIAŁU EWIDENCJI ROZLICZANIA ŚWIADCZEŃ MEDYCZNYCH 247 6.1. Sprawozdanie z działalności działu organizacji i zarządzania jakością. 251 7. SEKCJA SOCJALNA 256 8. SPRAWOZDANIE Z DZIAŁALNOŚCI AUDYTU WEWNĘTRZNEGO 257 9. SPRAWOZDANIE Z DZIAŁU ZAMÓWIEŃ PUBLICZNYCH. 257 3

1. STRUKTURA INSTYTUTU GRUŹLICY I CHORÓB PŁUC STAN NA DZIEŃ 31.12.2011r. 1.1. DYREKCJA INSTYTUTU GRUŹLICY I CHORÓB PŁUC W WARSZAWIE DYREKTOR INSTYTUTU prof. dr hab. n. med. Kazimierz Roszkowski-Śliż ZASTĘPCA DYREKTORA DS. LECZNICTWA dr hab. n. med. Stefan Wesołowski profesor nadzwyczajny IGiChP ZASTĘPCA DYREKTORA DS. NAUKI dr hab. n. med. Joanna Chorostowska-Wynimko, profesor nadzwyczajny IGiChP ZASTĘPCA DYREKTORA DS. EKONOMICZNYCH mgr Marek Ziegman ZASTEPCA DYREKTORA DS. TECHNICZN0-ADMINISTRACYJNYCH mgr inż. Włodzimierz Pomianowski GŁÓWNA KSIĘGOWA Jadwiga Łęczycka 4

1.2. STUKTURA ORGANIZACYJNA INSTYTUTU GRUŹLICY I CHORÓB PŁUC W WARSZAWIE (kierownicza obsada personalna na dzień 31.12.2011r.) I Klinika Chorób Płuc II Klinika Chorób Płuc III Klinika Chorób Płuc Klinika Chorób Wewnętrznych Klatki Piersiowej Klinika Chirurgii Samodzielny Oddział Anestezjologii i Intensywnej Terapii Zakład Diagnostyki i Leczenia Niewydolności Oddychania Samodzielna Pracownia Diagnostyki Molekularnej Zakład Fizjopatologii Zakład Mikrobiologii Zakład Patomorfologii Zakład Radiologii Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Zakład Epidemiologii i Organizacji Walki z Gruźlicą Samodzielna Pracownia Rehabilitacji Naczelna Pielęgniarka Przychodnia Przykliniczna Apteka Komórki działalności podstawowej 5 prof. dr hab. n. med. Jan Kuś prof. dr hab. n. med. Dorota Górecka prof. dr hab. n. med. Kazimierz Roszkowski- Śliż prof. dr hab. n. med. Adam Torbicki prof. dr hab. n. med. Tadeusz Orłowski lek. med. Jacek Prokopowicz prof. dr hab. n. med. Paweł Śliwiński dr hab. n. med. Joanna Chorostowska- Wynimko, prof. nadzw. IGiChP dr hab. n. med. Stefan Wesołowski, prof. nadzw. IGiChP dr hab. n. med. Ewa Augustynowicz-Kopeć, prof. nadzw. IGiChP dr n. med. Renata Langfort, p.o. Kierownika Zakładu lek. med. Iwona Bestry, p.o. Kierownika Zakładu mgr Beata Broniarek-Samson dr hab. n. med. Maria Korzeniewska-Koseła, prof. nadzw. IGiChP mgr Marek Kram mgr Lucyna Tomkiewicz dr n. med. Krystyna Maszkowska-Kopij, p.o. Kierownika Przychodni mgr Władysława Tondys

Audytor Wewnętrzny Biblioteka Naukowa Dział Administracyjny Dział Spraw Pracowniczych Dział ds. Ewidencji i Rozliczeń Świadczeń Medycznych Dział Planowania Naukowego i Dokumentacji Dział Techniczny Dział Zamówień Publicznych oraz Pozyskiwania Środków Finansowych ze Źródeł Zagranicznych Dział Zaopatrzenia i Transportu Inspektor P-Poż i Obrony Cywilnej Dział Organizacji i Zarządzania Jakością Pełnomocnik ds. Ochrony Informacji Niejawnych Radca Prawny Specjalista ds. BHP Komórki działalności pomocniczej mgr Joanna Zwierowicz Stella Fronczak mgr Paweł Niemczura Mirosława Górska mgr Dorota Żegota mgr Marta Pozorońska mgr inż. Marek Marszałkowski mgr Łukasz Nowak Jolanta Maksent mgr Krzysztof Chudy mgr Małgorzata Pacuszka Marzena Skwarek mgr Jolanta Paziewicz-Laskowska mgr inż. Daniel Koper 6

1.3. DYREKCJA INSTYTUTU GRUŹLICY I CHORÓB PŁUC ODDZIAŁ TERENOWY IM. JANA I IRENY RUDNIKÓW W RABCE-ZDRÓJ DYREKTOR dr n. med. Joachim Buchwald SEKRETARZ NAUKOWY dr hab. inż. Waldemar Tomalak profesor nadzwyczajny IGiChP Z-CA DYREKTORA DS. LECZNICTWA vacat Z-CA DYREKTORA DS. LOGISTYCZNYCH mgr Maria Dunaj GŁÓWNY KSIĘGOWY mgr Maciej Witwicki RADCA PRAWNY mgr Jan Kołodziej 7

1.4. STRUKTURA ORGANIZACYJNA INSTYTUTU GRUŹLICY I CHORÓB PŁUC ODDZIAŁ TERENOWY IM. JANA I IRENY RUDNIKÓW W RABCE-ZDRÓJ (kierownicza obsada personalna na dzień 31.12.2011 roku) Komórki działalności podstawowej oraz samodzielne stanowiska Klinika Alergologii i Pneumonologii Klinika Chirurgii Klatki Piersiowej Klinika Pneumonologii i Mukowiscydozy Klinika Pneumonologii Oddział Laryngologii Opieki Krótkoterminowej Przychodnia Przyzakładowa Specjalistyczne Poradnie Przykliniczne Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Pracownia Analityki Medycznej Pracownia Immunologii Pracownia Mikrobiologii Samodzielna Pracownia Elektrodiagnostyki Zakład Fizjopatologii Układu Oddechowego Pracownia Ergospirometrii Pracownia Polisomnorgafii Pracownia Psychologii Zakład Rehabilitacji Dział Planowania Badań i Informacji Naukowej Apteka Dział Współpracy z NFZ Naczelna Pielęgniarka Pielęgniarka Epidemiologiczna prof. dr hab. med. Ryszard Kurzawa dr n. med. Joachim Buchwald dr hab. med. Henryk Mazurek, prof. nadzw. IGiChP dr hab. med. Zbigniew Doniec, prof. nadzw. IGiChP lek. med. Magdalena Król lek. med. Ludmiła Radlińska vacat dr n. przyr. Józef Gaweł mgr Elżbieta Kossek dr n. przyr. Józef Gaweł mgr Ewa Działek-Smętek vacat dr hab. inż. Waldemar Tomalak, prof. nadzw. IGiChP dr hab. inż. Waldemar Tomalak, prof. nadzw. IGiChP vacat vacat dr n. kult. fiz. Jarosław Prusak mgr Anna Pękala mgr Piotr Maciejewski mgr Izabela Kapustianyk mgr Helena Janczak - Gaweł mgr Bożena Pustułka 8

Komórki działalności pomocniczej oraz samodzielne stanowiska Dział Księgowości Finansowej Dział Spraw Pracowniczych Dział Administracyjno - Eksploatacyjny Dział Zaopatrzenia Dział Żywienia Dział Informatyki Pralnia Specjalista ds. zamówień publicznych Główny Specjalista ds. kosztów i pozyskiwania środków Pełnomocnik ds. Jakości Administrator bezpieczeństwa informacji Specjalista ds. bhp Specjalista ds. obrony cywilnej i obronnych Pełnomocnik ds. ochrony informacji niejawnych Archiwista mgr Maciej Witwicki mgr Maria Dunaj inż. Marek Ziemianin Marian Wajda Bogusława Świder dr n. tech. Wojciech Latawiec Ewa Łabuz mgr Ewa Maczuga dr n. fiz. Grzegorz Willim dr n. fiz. Grzegorz Willim vacat mgr inż. Jerzy Pflaum mgr inż. Jerzy Pflaum vacat mgr Bernadetta Słuszkiewicz 9

1.5. PRACOWNICY INSTYTUTU GRUŹLICY I CHORÓB PŁUC W WARSZAWIE 1. Profesorowie zwyczajni 8 2. Profesorowie nadzwyczajni 9 3. Pozostali pracownicy naukowo badawczy 45 Razem (w tym niepełnozatrudnieni) 62 Przyjęci w 2011r. Zwolnieni w 2011r. Stan na 31.12.2011r. Pracownicy pełnozatrudnieni ogółem I + II + III + IV + V 77 68 736 I. Pracownicy naukowo-badawczy 8 5 61 w tym: profesorowie i prof. nadzw. pracownicy naukowo-badawczy w tym: adiunkci asystenci 1 7 3 4-5 3 2 17 44 38 6 II. Pracownicy inżynieryjno techniczni 2 2 11 III. Pracownicy służby zdrowia 70 44 603 w tym: pielęgniarki salowe administracja pozostali 31 9 3 27 19 3 2 20 250 113 40 200 IV. Pracownicy biblioteki - - 3 V. Administracja inżynieryjny 2 1 11 VI. Rezydenci 2 5 17 VII. Lekarze stażyści 10 9 11 Pracownicy niepełnozatrudnieni ogółem 14 21 54 I + II + III+ IV I. Pracownicy naukowo- badawczy - - 1 II. Pracownicy inżynieryjno-techniczni - - 2 III. Pracownicy służby zdrowia 12 18 39 IV. Pracownicy administracyjni 2 3 11 Uwzględniono ruch pracowników wynikający ze zmiany stanowiska i siatki płac 10

ZMIANY PERSONALNE KOMÓRKI DZIAŁALNOŚCI PODSTAWOWEJ: Zastępca Dyrektora ds. Lecznictwa dr n. med. Adam Radomyski do 28.06.2011r. dr hab. n. med. Stefan Wesołowski od 06.10.2011r. Kierownik Działu Spraw Pracowniczych Dorota Szmigrodzka do 13.09.2011r. Kierownik Zakładu Mikrobiologii prof. dr hab. Zofia Zwolska do 31.12.2010r. dr hab. n. med. Ewa Augustynowicz- Kopeć od 01.01.2011r. PRZYCHODNIA PRZYKLINICZNA Kierownik Przychodni Przyklinicznej dr n. med. Dorota Michałowska-Mitczuk do 28.11.2011r. p.o. Kierownika Przychodni Przyklinicznej dr n. med. Krystyna Maszkowska Kopij od 1.10 2011r. KOMÓRKI DZIAŁALNOŚCI POMOCNICZEJ: Kierownik Działu Administracyjnego inż. Zbigniew Chudy do 31.03.2011r. inż. Paweł Niemczura od 01.04.2011r. PROFESOROWIE NADZWYCZAJNI: dr hab. n. med. Grzegorz Małek SPECJALIZACJE UZYSKANE W 2011r. 1. dr n. med. Bednarek Michał choroby płuc 2. dr n. med. Bieleń Przemysław choroby płuc 3. lek. med. Buraczewska Agnieszka onkologia kliniczna 4. dr n. med. Fijołek Justyna choroby płuc 5. lek. med. Jędrych Małgorzata choroby płuc 6. dr n. med. Jonczak Luiza choroby płuc 7. lek. med. Targowska Monika choroby wewnętrzne 8. dr n. med. Winek Jolanta choroby płuc 11

1.6. PRACOWNICY INSTYTUTU GRUŹLICY I CHORÓB PŁUC ODDZIAŁ TERENOWY IM. JANA I IRENY RUDNIKÓW W RABCE-ZDRÓJ Pracownicy naukowo-badawczy Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc Oddział Terenowy im. Jana i Ireny Rudników w Rabce Zdroju zatrudnieni w pełnym wymiarze godzin: 1. profesorowie zwyczajni i nadzwyczajni: 4 2. pozostali pracownicy naukowo-badawczy: 9 Razem: 13 Przyjęci w 2011r. Zwolnieni w 2011r. Stan na 31.12.2011r. Pracownicy pełnozatrudnieni ogółem I + II + III + IV + V 15 10 280 I. Pracownicy naukowo-badawczy 2 3 13 w tym: profesorowie i prof. nadzw. pracownicy naukowo-badawczy w tym: adiunkci asystenci - 2 2 - - 3 2 1 4 9 6 3 II. Pracownicy inżynieryjno techniczni - - - III. Pracownicy służby zdrowia 13 7 264 w tym: pielęgniarki salowe administracja pozostali 3 2 1 7 2 1 1 3 88 37 21 118 IV. Pracownicy biblioteki - - 1 V. Administracja i inni - - 2 Pracownicy niepełnozatrudnieni ogółem 9 3 18 I + II + III+ IV I. Pracownicy naukowo-badawczy 1-1 II. Pracownicy inżynieryjno-techniczni - - - III. Pracownicy służby zdrowia 6 3 12 IV. Pracownicy administracyjni 2-5 SPECJALIZACJE UZYSKANE W 2011r. 1. Lek. med. Adam Wójcik alergologia 2. Lek. med. Katarzyna Gregorczyk-Maślanka pediatria 12

1.7. PRACOWNICY INSTYTUTU GRUŹLICY I CHORÓB PŁUC WARSZAWA I RABKA ZDRÓJ Przyjęci w 2011r. Zwolnieni w 2011r. Stan na 31.12.2011r. Pracownicy pełnozatrudnieni ogółem I + II + III + IV + V 92 78 1016 I. Pracownicy naukowo-badawczy 10 8 74 w tym: profesorowie i prof. nadzw. pracownicy naukowo-badawczy w tym: adiunkci asystenci 1 9 5 4-8 5 3 21 53 44 9 II. Pracownicy inżynieryjno techniczni 2 2 11 III. Pracownicy służby zdrowia 83 51 867 w tym: pielęgniarki salowe administracja pozostali 34 11 4 34 21 4 3 23 338 150 61 318 IV. Pracownicy biblioteki - - 4 V. Administracja i inni 2 1 13 Pracownicy niepełnozatrudnieni ogółem 23 24 72 I + II + III+ IV I. Pracownicy naukowo-badawczy 1-2 II. Pracownicy inżynieryjno-techniczni - - 2 III. Pracownicy służby zdrowia 18 21 51 IV. Pracownicy administracyjni 4 3 16 13

1.8. SAMODZIELNI PRACOWNICY NAUKOWO-BADAWCZY Profesorowie zwyczajni: Prof. dr hab. n. med. Dorota Górecka Prof. dr hab. n. med. Ryszard Kurzawa Prof. dr hab. n. med. Jan Kuś Prof. dr hab. n. med. Tadeusz Orłowski Prof. dr hab. n. med. Kazimierz Roszkowski-Śliż Prof. dr hab. n. med. Paweł Śliwiński Prof. dr hab. n. med. Witold Tomkowski Prof. dr hab. n. med. Adam Torbicki Prof. dr hab. n. med. Elżbieta Wiatr Prof. dr hab. n. biol. Zofia Zwolska Profesorowie nadzwyczajni Dr hab. n. med. Ewa Augustynowicz-Kopeć Dr hab. n. med. Joanna Chorostowska-Wynimko Dr hab. n. med. Zbigniew Doniec Dr hab. n. med. Anna Fijałkowska Dr hab. n. med. Bogdan Hajduk Dr hab. n. med. Maria Korzeniewska-Koseła Dr hab. n. med. Marcin Kurzyna Dr hab. n. med. Grzegorz Małek Dr hab. n. med. Henryk Mazurek Dr hab n. med. Robert Pływaczewski Dr hab. n. med. Monika Szturmowicz Dr hab. n. med. Waldemar Tomalak Dr hab. n. med. Liliana Wawrzyńska Dr hab. n. med. Stefan Wesołowski 14

2. DZIAŁALNOŚĆ NAUKOWA 2.1. DZIAŁALNOŚĆ RADY NAUKOWEJ Skład Rady Naukowej Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc kadencja od 23 października 2008r. do 22 października 2012r. 1. Prof. dr hab. n. med. Witold Tomkowski Przewodniczący Rady Naukowej 2. Prof. dr hab. n. med. Elżbieta Wiatr Zastępca Przewodniczącego 3. Dr hab. n. med. Henryk Mazurek, prof. nadzw. IGiChP Zastępca Przewodniczącego 4. Dr hab. n. med. Robert Pływaczewski, prof. IGiChP Sekretarz Rady Naukowej 5. Lek. Iwona Bestry 6. Lek. Jerzy Bogdan 7. Prof. dr hab. n. med. Ryszarda Chazan 8. Prof. dr hab. n. med. Anna Dobrzańska 9. Dr hab. n. med. Zbigniew Doniec, prof. IGiChP 10. Prof. dr hab. n. med. Wacław Droszcz 11. Dr n. med. Monika Franczuk 12. Prof. dr hab. n. med. Zbigniew Gaciong 13. Lek. Dariusz Gawryluk 14. Dr n. med. Juliusz Gątarek 15. Prof. dr hab. n. med. Dorota Górecka 16. Prof. dr hab. n. med. Karina Jahnz-Różyk 17. Prof. dr hab. n. med. Ewa Jassem 18. Prof. dr hab. n. med. Jacek Jastrzębski 19. Prof. dr hab. n. med. Janusz Kowalski 20. Prof. dr hab. n. med. Maciej Krzakowski 21. Dr n. med. Paweł Kuca 22. Prof. dr hab. n. med. Marek Kulus 23. Dr n. med. Włodzimierz Kupis 24. Prof. dr hab. n. med. Ryszard Kurzawa 25. Prof. dr hab. n. med. Jan Kuś 26. Lek. Elżbieta Mazurek 27. Prof. dr hab. n. med. Ewa Niżankowska-Mogilnicka 15

28. Prof. dr hab. n. med. Tadeusz Orłowski 29. Prof. dr hab. n. med. Władysław Pierzchała 30. Prof. dr hab. n. med. Tadeusz Płusa 31. Prof. dr hab. n. med. Jacek Przybylski 32. Dr n. med. Piotr Rudziński 33. Lek. Iwona Sak 34. Dr hab. n. med. Monika Szturmowicz, prof. IGiChP 35. Prof. dr hab. n. med. Paweł Śliwiński 36. Dr hab. inż. Waldemar Tomalak, prof. IGiChP 37. Prof. dr hab. n. med. Adam Torbicki 38. Dr hab. n. med. Stefan Wesołowski, prof. IGiChP 39. Lek. Adam Wójcik 40. Prof. dr hab. n. biol. Zofia Zwolska Skład Prezydium Rady Naukowej Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc Prof. dr hab. n. med. Witold Tomkowski Przewodniczący Rady Naukowej Prof. dr hab. n. med. Elżbieta Wiatr Zastępca Przewodniczącego Dr hab. n. med. Henryk Mazurek, prof. IGiChP Zastępca Przewodniczącego Dr hab. n. med. Robert Pływaczewski, prof. IGiChP Sekretarz Rady Naukowej Terminy odbytych posiedzeń Rady Naukowej: 1 posiedzenie: 17 marca 2 posiedzenie: 12 maja 3 posiedzenie: 9 czerwca 4 posiedzenie: 28 czerwca 5 posiedzenie: 6 października 6 posiedzenie: 15 grudnia Terminy odbytych posiedzeń Prezydium Rady Naukowej: 1 posiedzenie: 1 marca 2 posiedzenie: 18 kwietnia 16

W czasie posiedzeń Rady Naukowej: Uchwalono Statut Instytutu 17.03.2011r. Uchwalono Regulamin Rady Naukowej 17.03.2011r. Uchwalono Regulamin Komisji Kwalifikacyjnej 17.03.2011r. Uchwalono Regulamin Studiów Doktoranckich 17.03.2011r. Zatwierdzono Plan Działalności Naukowej na rok 2011 17.03.2011r. Przeprowadzono Konkurs na stanowisko Dyrektora Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc 6.10.2011r. Zaopiniowano kandydaturę prof. nadzw. dr hab. n. med. Stefana Wesołowskiego na stanowisko Zastępcy Dyrektora ds. Lecznictwa 6.10.2011r. Zatwierdzono Sprawozdanie z działalności Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc za rok 2010 6.10.2011r. Powołania na stanowiska etatowe: profesora nadzwyczajnego - dr hab. n. med. Marcina Kurzynę 17.03.2011r. dr hab. n. med. Grzegorza Małka 6.10.2011r. dr hab. n. med. Bogdana Hajduka 15.12.2011r. adiunkta - dr n. med. Marię Wieteskę 17.03.2011r. dr n. med. Annę Zabost 17.03.2011r. 17

STOPNIE NAUKOWE DOKTORA NAUK MEDYCZNYCH Wszczęcie przewodu doktorskiego L.p. Imię i nazwisko Data wszczęcia przewodu Tytuł rozprawy doktorskiej Promotor Recenzenci 1. Beata Broniarek- Samson 12 maja 2011r. Test uwalniania interferonu gamma w rozpoznawaniu ukrytego zakażenia prątkiem gruźlicy u pracowników służby zdrowia prof. Urszula Demkow 2. Adriana Roży 12 maja 2011r. Rola inhibitora aktywatora plazminogenu typu 1 w regulacji aktywności biologicznej in vitro komórek nowotworowych dr hab. Joanna Chorostowska- Wynimko, prof. nadzw. IGiChP 3. Anna Kempisty 9 czerwca 2011r. Relacja pomiędzy odczynem tuberkulinowym i testami wydzielania interferonu gamma pod wpływem antygenów swoistych dla M. tuberculosis u chorych na sarkoidozę prof. Jan Kuś 4. Agnieszka Napiórkowska 6 października 2011r. Charakterystyka fenotypowa i molekularna szczepów Mycobacterium tuberculosis opornych na pyrazinamid (PZA) wyizolowanych od chorych na gruźlicę w Polsce w latach 2000 2011 dr hab. Ewa Augustynowicz Kopeć, prof. nadzw. IGiChP 18

L.p. Imię i nazwisko Zakończenie przewodu doktorskiego - nadanie stopnia naukowego doktora nauk medycznych Data nadania stopnia naukowego 1. Lucyna Opoka 15 kwietnia 2011r. 2. Małgorzata Dybowska 3. Monika Czystowska 4. Monika Kozińska 6 października 2011r. 5. Katarzyna Błasińska - Przerwa Tytuł rozprawy doktorskiej Promotor Recenzenci Diagnostyka raka płuca i ocena zaawansowania metodą tomografii komputerowej i FDG PET/CT 9 czerwca 2011r. Ocena wpływu zwiększonej świadomości dotyczącej zagrożeń związanych z żylną chorobą zakrzepowozatorową na częstość rozpoznanych i potwierdzonych badaniem ultrasonograficznym epizodów objawowej zakrzepicy żył głębokich kończyn dolnych. 9 czerwca 2011r. Ocena związku polimorfizmu genów dla TNF-alfa i TGF-beta u chorych na sarkoidozę z kliniczną postacią choroby. 6 października 2011r. 6. Jacek Grudny 15 grudnia 2011r. 7. Adam Szpechciński 15 grudnia 2011r. Molekularne dochodzenie epidemiologiczne wśród chorych na gruźlicę blisko spokrewnionych oraz ocena przydatności zastosowanych metod typowania. Zastosowanie wielorzędowej tomografii komputerowej w diagnostyce urazów klatki piersiowej. Uwarunkowania genetyczne koincydencji raka płuca i przewlekłej obturacyjnej choroby płuc Analiza molekularna wolnych krążących kwasów nukleinowych we krwi obwodowej chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca perspektywa zastosowania w praktyce klinicznej prof. Kazimierz Roszkowski-Śliż prof. Witold Tomkowski prof. Dorota Górecka dr hab. Ewa Augustynowicz Kopeć, prof. nadzw. IGiChP prof. Ryszard Pacho prof. Kazimierz Roszkowski-Śliż dr hab. n. med. Joanna Chorostowska-Wynimko, prof. nadzw. IGiChP prof. Leszek Królicki prof. Bogdan Pruszyński prof. Janusz Kłoczko prof. Maciej Skórski prof. Urszula Demkow dr hab. Alicja Siemińska prof. Kazimierz Roszkowski - Śliż prof. Jarosław Dziadek prof. Tadeusz Orłowski dr hab. Elżbieta Czekajska - Chehab prof. Dorota Górecka prof. Tomasz Targowski prof. Ewa Jassem prof. Kazimierz Roszkowski-Śliż 19

STOPNIE NAUKOWE DOKTORA HABILITOWANEGO NAUK MEDYCZNYCH Zakończenie przewodu habilitacyjnego L.p. Imię i nazwisko Data nadania stopnia naukowego Tytuł rozprawy habilitacyjnej Recenzenci 1. Grzegorz Małek 17 marca 2011r. Ocena tętniczej i żylnej części układu naczyniowego w zespole antyfosfolipidowym - związki miażdżycy z zakrzepicą żylną 2. Bogdan Hajduk 9 czerwca 2011r. Prospektywna ocena losów chorych z implantowanymi na stałe filtrami do żyły głównej dolnej prof. Jan Baron prof. Jacek Musiał prof. Olgierd Rowiński prof. Krystyna Zawilska prof. Paweł Chęciński prof. Arkadiusz Jawień prof. Piotr Pruszczyk prof. Krzysztof Ziaja WSZCZĘCIE POSTĘPOWANIA O NADANIE TYTUŁU PROFESORA NAUK MEDYCZNYCH L.p. Imię i nazwisko Data wszczęcia postępowania 1. Monika Szturmowicz 15 grudnia 2011r. 20

W roku 2011 studia doktoranckie rozpoczęły: mgr Beata Popławska 01.02.2011r. lek. Anna Bilska-Sobecka 01.04.2011r. 2.2. STUDIA DOKTORANCKIE 2.3. CZŁONKOSTWO PRACOWNIKÓW NAUKOWYCH W AKADEMIACH NAUKOWYCH IMIĘ I NAZWISKO UCZESTNIKA prof. dr hab. n. med. Dorota GÓRECKA prof. dr hab. n. med. Jan KUŚ prof. dr hab. n. med. Ryszard KURZAWA prof. dr hab. n. med. Kazimierz ROSZKOWSKI-ŚLIŻ prof. dr hab. n. med. Paweł ŚLIWIŃSKI dr hab. inż. Waldemar TOMALAK, prof. nadzw. prof. dr hab. n. med. Witold TOMKOWSKI prof. dr hab. n. biol. Zofia ZWOLSKA AKADEMIE NAUKOWE PAN Wydział Nauk Medycznych Komitet Patofizjologii Klinicznej, Komisja Chorób Układu Oddechowego PAN Wydział Nauk Medycznych Komitet Patofizjologii Klinicznej, Komitetu Immunologii i Etiologii Zakażeń PAN Wydział Nauk Medycznych Komitet Patofizjologii Klinicznej, Komisja Chorób Układu Oddechowego, PAN Wydział Nauk Medycznych Komitet Patofizjologii Klinicznej, Komisja Chorób Układu Oddechowego PAN Wydział Nauk Medycznych Komitet Patofizjologii Klinicznej, Komisja Chorób Układu Oddechowego PAN Wydział Nauk Technicznych Komitet Metrologii i Aparatury Naukowej, Sekcja Aparatury i Systemów Pomiarowych Komitetu Metrologii PAN Wydział Nauk Humanistycznych i Społecznych - Komitet Naukoznawstwa PAN Wydział Nauk Medycznych - Komitet Terapii i Nauk o Leku, Komisja Mikrobiologii i Immunologii PAN Wydział Nauk Biologicznych i Rolniczych - Komitet Mikrobiologii 21

2.4. CZŁONKOSTWO PRACOWNIKÓW NAUKOWYCH W RADACH REDAKCYJNYCH CZASOPISM dr n. med. Joachim BUCHWALD Kardiochirurgia i Chirurgia Polska Rada Redakcyjna dr hab. n. med. Joanna CHOROSTOWSKA-WYNIMKO, prof. nadzw. dr hab. n. med. Zbigniew DONIEC, prof. nadzw. Gruźlica, choroby płuc, infekcje HIV (Białoruś) Georgian Respiratory Journal Central European Journal Immunology Ukraińskie Naukowe Czasopismo Młodzieżowe Journal of Pediatric Pulmonology and Related Research Pneumonologia i Alergologia Polska The Open Obesity Journal The Open Biomarker Journal Acta Pneumonologica et Allergologica Pediatria Alergoprofil Journal of Pediatric Pulmonology and Related Research 22 Rada Redakcyjna Rada Redakcyjna Rada Redakcyjna Rada Redakcyjna Rada Naukowa Rada Redakcyjna Rada Redakcyjna Rada Redakcyjna Z-ca Redaktora Naczelnego Rada Naukowa Redaktor Naczelny dr hab. n. med. Anna FIJAŁKOWSKA, prof. nadzw. Kardiologia po Dyplomie Rada Redakcyjna dr n. med. Monika FRANCZUK Pneumonologia i Alergologia Polska Redaktor prof. dr hab. n. med. Dorota GÓRECKA Pneumonologia i Alergologia Polska Current Opinion Pulm Medicine wydanie polskie Pnumonologia Info Chronic Respiratory Diseases Medycyna Praktyczna Rada Redakcyjna Rada Redakcyjna Rada Redakcyjna Rada Redakcyjna Rada Naukowa prof. dr hab. med. Ryszard KURZAWA Acta Pneumonologica et Allergologica Pediatrica Rada Redakcyjna

Alergia Astma Immunologia Przegląd Kliniczny Rada Redakcyjna Przegląd Lekarski Rada Redakcyjna Pneumonologia i Alergologia Polska Rada Redakcyjna Klinika Pediatryczna Rada Redakcyjna Nowa Klinika Rada Redakcyjna Przegląd Pediatryczny Rada Redakcyjna Postępy Dermatologii i Alergologii Rada Redakcyjna Standardy Medyczne Rada Redakcyjna Terapia Rada Redakcyjna Pediatria i Medycyna Rodzinna Rada Redakcyjna Alergoprofil Rada Redakcyjna Współczesna Alergologia Info Rada Redakcyjna Przegląd Chirurgii Dziecięcej Rada Redakcyjna Medycyna Praktyczna - Pediatria Rada Redakcyjna Polskie Archiwum Medycyny Wewnętrznej Rada Naukowa Medycyna Praktyczna Rada Naukowa prof. dr hab. n. med. Jan KUŚ Pneumonologia i Alergologia Polska Rada Redakcyjna Nowa Klinika Rada Naukowa Medycyna po Dyplomie Rada Naukowa dr n. med. Renata LANGFORT Polish Journal of Pathology Rada Redakcyjna dr hab. n. med. Grzegorz MAŁEK Ultrasonografia Polska Rada Redakcyjna dr hab. n. med. Henryk MAZUREK, prof. nadzw. Pneumonologia i Alergologia Polska Rada Redakcyjna 23

Medycyna Praktyczna Pediatria Rada Redakcyjna Pediatria po Dyplomie Rada Redakcyjna Postępy Dermatologii i Alergologii Rada Naukowa Pediatria Polska Rada Naukowa Science Medical Monitor Komitet Redakcyjny Annals of Thoracic and Cardiovascular Surgery Komitet Redakcyjny Pneumonologia i Alergologia Polska Rada Redakcyjna prof. dr hab. n. med. Tadeusz ORŁOWSKI Polski Merkuriusz Lekarski Komitet Redakcyjny Medycyna Praktyczna Komitet Redakcyjny Kardiochirurgia i Torakochirurgia Polska Z-ca Redaktora Naczelnego Polimery w Medycynie Komitet Redakcyjny dr n. med. Elżbieta PUŚCIŃSKA Pneumonologia i Alergologia Polska Redaktor dr n. tech. Jakub RADLIŃSKI Acta Pneumonologica et Allergologica Pediatrica Sekretarz Redakcji dr n med. Elżbieta RADZIKOWSKA Pneumonologia i Alergologia Polska Rada Redakcyjna Pneumonologia i Alergologia Polska Rada Redakcyjna prof. dr hab. n. med. Kazimierz ROSZKOWSKI-ŚLIŻ Służba Zdrowia Rada Programowa Current Pneumonology Rada Redakcyjna Polski Merkuriusz Lekarski Rada Redakcyjna dr hab. n. med. Monika SZTURMOWICZ, prof. nadzw. Pneumonologia i Alergologia Polska Redaktor Naczelny Pneumonologia i Alergologia Polska Rada Redakcyjna prof. dr hab. n. med. Paweł ŚLIWIŃSKI Klinika Nowa Rada Naukowa Polski Merkuriusz Lekarski Rada Redakcyjna 24

dr hab. inż. Waldemar TOMALAK, prof. nadzw. Acta Pneumonologica et Allergologica Pediatria Redaktor Naczelny Hematologia Rada Naukowa prof. dr hab. n. med. Witold TOMKOWSKI Pneumonologia i Alergologia Polska Rada Redakcyjna Acta Angiologica Komitet Redakcyjny Kardiologia Polska Rada Naukowa Polski Przegląd Kardiologiczny Rada Redakcyjna Kardiologia po Dyplomie Rada Redakcyjna Kardiologia Oparta na Faktach Rada Naukowa Current Opinions in Cardiology wydanie polskie Rada Redakcyjna prof. dr hab. n. med. Adam TORBICKI Hematologia Rada Naukowa Pneumonologia i Alergologia Polska Rada Redakcyjna Medycyna po Dyplomie Rada Redakcyjna Polski Merkuriusz Lekarski Rada Redakcyjna European Heart Journal Rada Redakcyjna European Journal of Echocardiography Rada Redakcyjna Experimental and Clinical Cardiology Rada Redakcyjna prof. dr hab. n. med. Elżbieta WIATR Pneumonologia i Alergologia Polska Rada Redakcyjna Pneumonologia i Alergologia Polska Rada Redakcyjna prof. dr hab. n. biol. Zofia ZWOLSKA Medycyna Doświadczalna i Mikrobiologia Komitet Redakcyjny Epidemiologia Zakażeń Szpitalnych Rada Programowa 25

2.5. CZŁONKOSTWO PRACOWNIKÓW NAUKOWYCH W MIĘDZYNARODOWYCH ORGANIZACJACH NAUKOWYCH IMIĘ I NAZWISKO UCZESTNIKA dr n. med. Łukasz Błażowski dr n. med. Joachim Buchwald dr hab. n. med. Joanna Chorostowska- Wynimko, prof. nadzw. dr n. med. Paweł Kuca dr hab. n. med. Marcin Kurzyna, prof. nadzw. dr hab. n. med. Henryk Mazurek, prof. nadzw. prof. dr hab. n. med. Tadeusz Orłowski dr n. med. Andrzej Pogorzelski dr n. med. Elżbieta Radzikowska dr hab. n. med. Monika Szturmowicz, prof. nadzw. prof. dr hab. n. med. Witold Tomkowski dr hab. inż. Waldemar Tomalak, prof. nadzw. prof. dr hab. n. med. Adam Torbicki MIĘDZYNARODOWE ORGANIZACJE The American Academy of Allergy Asthma and Immunology EAACI European Academy of Allergy and Clinical Immunology Słowackie Stowarzyszenie Pediatryczne European Respiratory Society zarząd główny Member at Large Ekspert ERS Evaluation Committee at the Scientific Committee AIR Alpha One International Registry przedstawiciel polski European Respiratory Society Audytor Zarządu European Society of Cardiology European Respiratory Society The American Broncho-Esophagological Association The International Association for the Study of Lung Cancer The European Society of Thoracic Surgeons The European Board of Cardiothoracic Surgery Międzynarodowe Towarzystwo Naukowe European Cystic Fibrosis Society Histiocytosis Association ACCP - American College of Clinical Pharmacy The American College of Chest Physicians European Society of Cardiology ICTOM - International Clinical Trial Organisation And Management European Respiratory Society European Society of Cardiology członek zarządu wiceprezydent członek Congress Program Committee członek European Relation Committee World Health Organization Meksykańskie Towarzystwo Kardiologiczne członkostwo honorowe 26

2.6. CZŁONKOSTWO PRACOWNIKÓW NAUKOWYCH W RADACH NAUKOWYCH INSTYTUCJI NAUKOWYCH POZA IGICHP IMIĘ I NAZWISKO dr hab. n. med. Ewa AUGUSTYNOWICZ- KOPEĆ, prof. nadzw. RADY NAUKOWE Krajowa Rada Diagnostów Laboratoryjnych Narodowe Centrum Nauki prof. dr hab. n. med. Adam TORBICKI Instytut Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka Instytut Hematologii Instytut Kardiologii prof. dr hab. n. med. Jan KUŚ Centralna Komisja ds. Tytułu Naukowego i Stopni Naukowych Konsultant krajowy w dziedzinie chorób płuc od roku 2004 Prezydium Rady Naukowej przy Ministerstwie Zdrowia Wojskowy Instytut Medyczny prof. dr hab. n. med. KAZIMIERZ ROSZKOWSKI-ŚLIŻ Narodowy Instytut Leków Instytut Hematologii Centrum Zdrowia Dziecka Centralna Komisja Do Spraw Stopni i Tytułów Narodowe Centrum Badań i Rozwoju Członek Zespołu Eksperckiego do prac nad Centralną Bazą Świadczeń Opieki Zdrowotnej 27

2.7. Prace badawcze realizowane w ramach działalności statutowej w latach 1997-2011 oraz planowane na 2012r. 180 160 158 143 liczba 140 120 100 80 120 117 108 113 125 119 108 99 117 108 111 112 119 118 60 40 20 15 13 13 12 12 12 12 12 12 11 11 11 11 11 11 11 0 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 lata zadania tematy 28

Temat 1: BADANIA NAD ULEPSZENIEM METOD ROZPOZNAWANIA I LECZENIA GRUŹLICY I INNYCH ZAKAŻEŃ UKŁADU ODDECHOWEGO Kierownik tematu: prof. zw. dr hab. Zofia Zwolska Zastępca tematu: dr hab. n. med. Ewa Augustynowicz-Kopeć, prof. nadzw. Celem badań kontynuowanych w 2011 roku dotyczących oceny przydatności nowych metod genetycznych w mikrobiologicznym diagnozowaniu gruźlicy było potwierdzenie bądź wykluczenie obecności materiału genetycznego prątków w preparatach z obrazem histopatologicznym nasuwającym podejrzenie gruźlicy (zad.1.2). Badania wykonano z 30 materiałów tkankowych zatopionych w bloczkach parafinowych, pobranych od chorych z podejrzeniem gruźlicy. W obrazie histopatologicznym analizowanych przypadków widoczna była ziarnina lub organizująca się martwica ze zwapnieniami. Omówienie wyników: W badanej puli dla 19 chorych (64 %) uzyskano potwierdzenie obecności DNA prątków, w 11 przypadkach wynik badania genetycznego był ujemny. Dla 19 pacjentów znane były wyniki barwienia preparatów histopatologicznych metodą Z-N. Metodą tą uzyskano wynik dodatni dla 6 preparatów, w tym w 4 (67%) z nich wykazano obecność DNA prątków metodą genetyczną. W badanej grupie pacjentów wynik ujemny barwienia Z-N preparatów histopatologicznych uzyskano w 13 przypadkach, z czego w 6 (46%) wynik ten był zgodny z badaniem molekularnym wykonanym z tkanek utrwalonych w parafinie. Dla pozostałych pacjentów (11) z wykonanym badaniem genetycznym nie posiadano danych na temat barwienia Z-N preparatów. Z grupy 30 pacjentów dla których wykonano badanie molekularne, dla 20 chorych uzyskaliśmy dodatnie wyniki badań histologicznych. W preparatach widoczna była: ziarnina zapalna, zwapnienia bądź martwica. Badanie molekularne umożliwiło potwierdzenie obecności materiału genetycznego Mycobacterium tuberculosis complex w materiale utrwalonym w parafinie od 19 chorych z podejrzeniem gruźlicy. Wyniki te w 100% korelowały z wynikiem badania histopatologicznego i barwienia Z-N. Zadanie 1.2 Publikacje: D. Michałowska - Mitczuk, S. Brzezińska, E. Augustynowicz - Kopeć, R. Langfort Ziarnina stwierdzona w najądrzu chorego leczonego dopęcherzowymi wlewkami BCG - powikłanie leczenia BCG czy gruźlica? Pneumonol. Alergol. Pol. 2011; 79, 4, 305-308. Kontynuowano badania nad zastosowaniem metody HPLC w diagnostyce gruźlicy, które dotyczą różnic w dynamice metabolizowania INH w grupie szybkich i wolnych acetylatorów. Różnice te determinują stężenia leków i jego metabolitów. Celem zadania 1.3 było określenie związku pomiędzy częstością występowania niepożądanych objawów podczas leczenia gruźlicy INH a typem acetylacji u chorych. Przeprowadzono analizę genotypu N-acetylotransferazy 2 u 28 chorych z gruźlica u których podczas leczenia izoniazydem doszło do wystąpienia objawów niepożądanych.. Wśród 116 chorych na gruźlicę leczonych w Mazowieckim Centrum Leczenia Chorób Płuc i Gruźlicy w Otwocku objawy 29

niepożądane stwierdzono u 28 (24 %) chorych. W badanej grupie z objawami hepatotoksyczności przeważały kobiety 18 (64,3%). Dla wszystkich chorych z objawami hepatotoksycznymi wykonano oznaczenia stężenia izoniazydu oraz określono polimorfizm genu N-acetylotransferazy 2. Średnie wartości biodostępności INH we krwi chorych z objawami niepożądanymi ze strony wątroby wynosiły: po 1h od podania leku - 7,7µg/ml (w zakresie stężeń 2,5 13,1µg/ml) po 3h - 5,4µg/ml, (w zakresie 1,4-3,6) a po 6 h 2,8µg/ml (0,5 do 4,3µg/ml). Wśród 28 chorych z objawami niepożądanymi u 23 pacjentów stężenie leku po 6 godzinach przekraczało dawkę 2,0 µg/ml (Tabela 1).W badanej grupie chorych wartość AUC 0-6 wahała się w zakresie od 9,8 do 49,1 (średnio 29,39 ± 8,61). Wskaźnik biodostępności I 3 wynosił średnio 1,16 w zakresie od 0,4 do 1,8. Stężenie maksymalne wynosiło średnio 7,7 ± 2,64 µg/ml, szybkość eliminacji leku z organizmu K e wynosiła 0,26 ± 0,12 (Tabela nr 1). Dawka izoniazydu w grupie badanych należący do wolnego fenotypu acetylacji wynosiła średnio 5,2 mg/kg.c.c., w zakresie 4,1-7,2 mg/kg.c.c. Wnioski: W analizowanych wynikach 28 chorych na gruźlicę z objawami hepatotoksycznymi 22 (78,6%) należało do grupy wolnej acetylacji. Wśród wolnych acetylatorów dominowały dwa genotypy NAT2*5/5 i NAT2*5/6. Ponieważ objawy hepatotoksyczności podczas leczenia gruźlicy (wszyscy leczeni INH) obserwowano u blisko 80 % chorych z wolnym typem acetylacji, chorzy ci powinni być poddawani szczegółowej obserwacji w celu zminimalizowania niepożądanych objawów. Wygłoszono: Anna Zabost Znaczenie określania typu acetylacji INH w leczeniu gruźlicy. Krajowa Konferencja Pulmonologów i Mikrobiologów Zakopane 15-17.06.2011 Anna Zabost Correlation between genotype and acetylation phenotype in polish patients. XII Conference DIAGMOL 2011 Molecular biology in diagnostic of infectious diseases and biotechnology 24.09.2011 Warszawa Opublikowano: Anna Zabost, Ewa Augustynowicz-Kopeć Znaczenie określania typu acetylacji INH w leczeniu gruźlicy. Krajowa Konferencja Pulmonologów i Mikrobiologów Zakopane 15-17.06.2011. Materiały konferencyjne. Anna Zabost, Monika Kozińska, Sylwia Brzezińska, Agnieszka Napiórkowska, Maria Błachnio, Jacek Jagodziński, Zofia Zwolska, Ewa Augustynowicz-Kopeć, Correlation between genotype and acetylation phenotype in Polish patients. XII Conference DIAGMOL 2011 Molecular biology in diagnostic of infectious diseases and biotechnology 24.09.2011r. Warszawa. Materiały konferencyjne. Anna Zabost, Zofia Zwolska, Ewa Augustynowicz-Kopeć Genotyp I fenotyp acetylacji u chorych na gruźlicę. Postępy Nauk Medycznych 2011, XXIV(10);831-835 30

Anna Zabost, Zofia Zwolska, Ewa Augustynowicz-Kopeć Rola biologiczna prokariotycznych i eukariotycznych N-acetylotransferaz. Postępy Mikrobiologii. Praca oddana do druku. Celem pracy zadania badawczego 1.4. było porównanie wyników testów lekowrażliwości na cztery podstawowe leki przeciwprątkowe (SM, INH, RMP oraz EMB) uzyskiwanych w automatycznym aparacie Bactec MGIT 960 z metodą konwencjonalną rutynowo stosowaną w Polsce oraz porównanie czasu oczekiwania na wynik lekowrażliwości w/w metodami. Wśród 640 wykonanych oznaczeń lekooporności zgodność wyników dla wszystkich leków (SM, INH, RMP i EMB) wyniosła 95,8%, wyniki niezgodne stwierdzono dla 27 (4,2%). Uzyskano następujące wyniki zgodne: dla INH i RMP - 157/160 (98,1%), dla SM 154/160 (96,3%) dla EMB 145/160 (90,6%). Czułość metody Bactec MGIT 960 (zdolność do wykrycia oporności) wyniosła 100% dla INH, 94,1% dla RMP, 94,3% dla SM oraz 50,0% dla EMB. Specyficzność metody Bactec MGIT 960 (zdolność do wykrycia wrażliwości) wyniosła 100% dla RMP, 97,2% dla INH, 96,8% dla SM oraz 93,9% dla EMB. Średni czas oczekiwania na wyniki testów wrażliwości na pożywce jajowej L-J wynosił dla wszystkich badanych szczepów 34,17 dnia (w zakresie od 21-42 dni), dla szczepów wrażliwych 33,70 dnia (w zakresie 21 42 dni), dla szczepów opornych 34,89 dnia (w zakresie 21 42 dni) (tabela 2). Średni czas oczekiwania na wyniki testów wrażliwości w systemie Bactec MGIT 960 wynosił dla wszystkich badanych szczepów 8,89 dnia (w zakresie od 4,6 do 13,1 dnia), dla szczepów wrażliwych 8,11 dnia (w zakresie 4,6 13,1 dni), dla szczepów opornych 10,09 dnia (w zakresie 6,13 13,1 dnia). Wnioski: Automatyczny aparat Bactec MGIT 960 pozwala na szybsze uzyskanie wyniku lekowrażliwości Mycobacterium tuberculosis niż metoda oparta na pożywkach jajowych L- J. Wyniki uzyskiwane w tym systemie są wiarygodne, zwłaszcza dla szczepów wrażliwych; zgodność wyników dla dwóch najważniejszych leków przeciwprątkowych RMP i INH wynosiła 98,1%. Wszystkich wyników niezgodnych było 27/640-4 %. Należy dążyć do szerszego wprowadzenia testów oporności na pożywkach płynnych do rutynowej diagnostyki w Laboratoriach Prątka w Polsce. Pozwoli to na skrócenie czasu oczekiwania na wynik i szybsze włączenie prawidłowego leczenia, szczególnie w przypadkach gruźlicy wywołanej prątkami opornymi na leki. Wygłoszone referaty: M. Klatt, E. Augustynowicz-Kopeć: Porównanie wyników testów lekooporności dla Mycobacterium tuberculosis na cztery podstawowe leki przeciwprątkowe w automatycznym systemie Bactec MGIT 960 i na stałej pożywce jajowej Löwensteina Jensena. Krajowa Konferencja Pulmonologów i Mikrobiologów, Zakopane 15 17.06.2011r. 31

Publikacje: M. Klatt, Z. Zwolska, A. Napiórkowska, E. Augustynowicz-Kopeć: Wiarygodność testów lekooporności Mycobacterium tuberculosis jako istotny element nadzorowanego leczenia gruźlicy. Post N Med. 2011, XXIV, 10, 811-818 Kontynuowano badania dotyczące analizy molekularnej szczepów Mycobacterium tuberculosis w 2011r. W ramach zadania przeprowadzono analizę genetyczną szczepów prątków gruźlicy wyhodowanych od osób bezdomnych Do algorytmu dochodzeń epidemiologicznych włączono metodę molekularną MIRU-VNTR. Celem pracy była analiza genetyczna szczepów gruźlicy wyizolowanych od osób bezdomnych, identyfikacja rodzin molekularnych oraz określenie pokrewieństwa wzorów DNA analizowanej puli szczepów. Materiałem do badań były szczepy prątków gruźlicy wyizolowane w latach 2009-2011 od 27 ludzi bezdomnych. Chorzy pochodzili z Polski (Kraków i Chorzów), Czech (Cieszyn) i Słowacji (Ostrawa). Wśród chorych były 2 kobiety i 25 mężczyzn w wieku 36-64 lat. W analizie genetycznej szczepów wykorzystano metodę spoligotyping oraz MIRU-VNTR. Metoda spoligotyping została opisana w sprawozdaniu 1.5 z roku 2006, a zasadę metody MIRU-VNTR przedstawiono w sprawozdaniu 1.5 z roku 2010. Wśród analizowanej puli szczepów zidentyfikowano 18 spoligotypów 16 zarejestrowanych i 2 nie zarejestrowane w bazie SpolDB4. Piętnaście (56%) szczepów tworzyło klastery, a 12 (44%) posiadało indywidualne profile DNA. Metoda Analiza molekularna metodą MIRU-VNTR wykazała, że jedenaście (41%) szczepów tworzyło 5 (A-E) klasterów molekularnych, a 16 (59%) szczepów posiadało wzory unikatowe. Zestawiając wyniki spoligotypowania oraz analizy MIRU- VNTR, w obrębie 6 klasterów genetycznych stwierdzono pokrewieństwo filogenetyczne 11 szczepów. W klasterach A, B i C zidentyfikowano po 2 szczepy wyhodowane od bezdomnych mężczyzn z Krakowa. Klaster C składał się z 3 szczepów wyhodowanych w 2010 roku od chorego z Krakowa, kobiety z Chorzowa i bezdomnego z Ostrawy. Klaster E tworzyły 2 szczepy wyizolowane w roku 2010 i 2011 od 2 mężczyzn z Chorzowa. Wnioski: Wśród analizowanej puli szczepów zidentyfikowano 18 spoligotypów 16 zarejestrowanych i 2 nie zarejestrowane w bazie SpolDB4. Piętnaście (56%) szczepów tworzyło klastery, a 12 (44%) posiadało indywidualne profile DNA. W analizie MIRU-VNTR liczba uzyskanych wzorów molekularnych wzrosła do 21. Jedenaście (41%) szczepów tworzyło 5 (A-E) klasterów molekularnych, a 16 (59%) szczepów posiadało wzory unikatowe. Zidentyfikowano 5 potencjalnych ognisk epidemiologicznych, w obrębie których miała miejsce prawdopodobna transmisja gruźlicy. Trzy grupy chorych pochodziły z Krakowa, jedna z Chorzowa, a w trzeciej grupie znajdowali się bezdomni z Krakowa, Chorzowa i Ostrawy. Środowisko osób bezdomnych jest niebezpiecznym rezerwuarem dla rozwoju i transmisji gruźlicy (zadanie.1.5). 32

W ramach zadania badawczego wygłoszono: M. Kozińska, E. Augustynowicz-Kopeć. Analiza fenotypu oporności i wzoru molekularnego szczepów pre-xdr wyhodowanych od chorych na gruźlicę w latach 2004-2011. XV Sympozjum Naukowe Postępy w medycynie zakażeń. 9-10 grudnia 2011r., Warszawa, materiały konferencyjne M. Kozińska, Z. Zwolska, D. Krawiecka, E. Augustynowicz-Kopeć. Stabilność wzoru molekularnego szczepów prątków gruźlicy wyizolowanych w różnym czasie od członków dwóch rodzin. XV Sympozjum Naukowe Postępy w medycynie zakażeń. 9-10 grudnia 2011r., Warszawa, materiały konferencyjne. M. Kozińska, Z. Zwolska, E. Augustynowicz-Kopeć. Transmisja gruźlicy lekoopornej wśród osób blisko spokrewnionych. Postępy Nauk Medycznych 2011; XXIV: 824-830 M. Kozińska, Z. Zwolska, E. Augustynowicz-Kopeć. Ocena stabilności wzoru molekularnego szczepów Mycobacterium tuberculosis complex wyhodowanych na przestrzeni 7 lat od osób blisko spokrewnionych. Konferencja naukowa Mikrobiologia w Medycynie, Przemyśle i Ochronie Środowiska. 22-23 października 2011r., Łódź, materiały konferencyjne. W ramach zadania badawczego 1.6 w 2011 roku oceniano zgodność rejestrów mikrobiologicznych gruźlicy z formularzami zachorowań na gruźlicę, które zgłaszane są do KRZG. Analizie poddano zachorowania zarejestrowane w I kwartale 2011 roku w trzech województwach: podlaskim, lubelskim i kujawsko - pomorskim. W I kwartale 2011r. z trzech ocenianych województw zgłoszono do IGiChP 317 nowych zachorowań na gruźlicę. Stwierdzono 187 (59%) przypadków gruźlicy potwierdzonej mikrobiologicznie., które nie były zgłoszone do KRG w IGiCHP. Z placówkami terenowymi wymieniono korespondencje w celu ustalenia przyczyn nie zgłaszania przypadków gruźlicy do Krajowego Rejestru Gruźlicy. Wśród przypadków niedorejestrowanych znaleźli się: chorzy zgłoszeni do IGiChP w 2010r. (26 osób) chorzy zgłoszeni do Krajowego Rejestru z opóźnieniem tzn. w II-gim kwartale (97 osób) chorzy, u których lekarz zdecydował o nie włączaniu leczenia i jednocześnie nie zgłosił przypadku gruźlicy (23) osoby mieszkające w innych niż badane województwa (zakład diagnostyki mikrobiologicznej wykonywał badania na zlecenie jednostek zewnętrznych) 19 chorych chorzy, którzy nie zostali zgłoszeni i nie figurują w Wojewódzkim Rejestrze Gruźlicy (w tym osoby hospitalizowane, których wynik posiewu prawdopodobnie został nadesłany po wypisie ze szpitala) 22 osoby. 33

Przeprowadzona wstępna analiza dotychczasowych danych wskazuje, że należy położyć szczególny nacisk na poprawę kompletności dokumentów i szybkości przesyłania formularzy do Krajowego Rejestru Gruźlicy. Kontynuowano badania dotyczące roli nowych testów serologicznych IGRA opartych na pomiarze interferonu w diagnostyce utajonego zakażenia prątkami gruźlicy. (zad.1.21). Celem badań podjętych w 2011 roku było porównanie wyników badań w kierunku diagnostyki utajonego zakażenia prątkiem gruźlicy przy użyciu testów IGRA i próby tuberkulinowej. Badaniem objęto 78 osób, które podzielono na dwie grupy: I 25 zdrowych pracowników ochrony zdrowia i II 53 chorych hospitalizowanych w Instytucie Gruźlicy i Chorób Płuc, u których wykluczono aktywną postać gruźlicy na podstawie ujemnych wyników badań mikrobiologicznych i diagnostyki różnicowej zmian płucnych. W grupie 25 pracowników stwierdzono 5 (24%) pozytywnych wyników testu T-SPOT.TB, 6 (20%) QuantiFERON-TbGold i 10 (40%) próby tuberkulinowej. W grupie 53 chorych hospitalizowanych w IGiChP było 6 (11,3%) pozytywnych wyników zarówno testu T- SPOT.TB i QuantiFERON-Tb Gold oraz 12 (22,6%) TST. Najwięcej pozytywnych wyników dla trzech porównywanych testów, przy uznaniu za punkt odcięcia nacieku o średnicy 10 mm, dawał test TST. W grupie 25 zaobserwowano więcej pozytywnych wyników testów IGRA i TST. Z grupy 53 chorych hospitalizowanych w IGiChP wyłączono z analizy 1 osobę z nieokreślonym wynikiem testu QFT-Gold. W grupie 52 osób, 3 (5,7%) chorych miało pozytywne wyniki wszystkich 3 testów i 38 (73,1%) negatywne. W analizowanej grupie 6 (24%) wyników testów IGRA było rozbieżnych: 3 TSPOT.TB-/QFT-G+ i 3 T.SPOT.TB+/QFT-G-. Tylko dwóch z trzech chorych, którzy uzyskali niezgodne wyniki typu T.SPOT.TB-/QFT-G+ miało negatywne wyniki TST. Wśród badanych 5 (9,5%) chorych miało pozytywne wyniki TST przy T.SPOT.TB /QFT-G-. Stwierdzono, że wyniki testów T- SPOT.TB i QFT-G są zgodne w 92% w grupie HCWs i w 88,5% w grupie chorych leczonych w IGiChP. Wyniki TST są w wyższym odsetkach zgodne z wynikami T-SPOT.TB zarówno w grupie HCWs (72%) jak i w grupie chorych IGiChP (90%). W grupie HCWs zgodność testów QFT-G i TST wynosiła 64%, a w grupie chorych hospitalizowanych w IGiChP 80,8%. Wnioski: Stwierdzono, wysoką zgodność wyniki testów IGRA w obu grupach badawczych 92% i 88,5%. Stwierdzono wyższą zgodność pomiędzy wynikami testów TST i T-SPOT.TB zarówno w grupie HCWs (72%) jak i w grupie chorych hospitalizowanych w IGiChP (90%). Zgodność pomiędzy wynikami TST i QuantFERON-Tb Gold wynosiła odpowiednio 64% i 80,8%. Wyniki testów stwierdzających LTBI mogą być niezgodne, dlatego rozpoznanie utajonego zakażenia prątkiem gruźlicy nie może opierać się jedynie na pojedynczym wyniku testu IGRA lub TST. Na obecnym poziomie wiedzy nie wszystkie przyczyny niezgodności wyników pomiędzy testami są wytłumaczalne. W przypadku wyników niezgodnych należy powtórzyć badanie. 34

Wygłoszono: D. Borkowska, Z. Zwolska, D. Michałowska - Mitczuk, M. Korzeniewska - Koseła, A. Zabost, A. Napiórkowska, M. Kozińska, S. Brzezińska, E. Augustynowicz Kopeć. Nowy test IGRA w diagnostyce zakażenia prątkiem gruźlicy XXI Spotkanie Polskiej Grupy European Respiratory Society. Szczyrk 3-6. 03. 2011r. Opublikowano: D. Borkowska, Z. Zwolska, D. Michałowska - Mitczuk, M. Korzeniewska - Koseła, A. Zabost, A. Napiórkowska, M. Kozińska, S. Brzezińska, E. Augustynowicz - Kopeć Interferonowy test T-SPOT.TB w diagnostyce latentnego zakażenia prątkiem gruźlicy: Pneumonologia i Alergologia Polska 2011; 79, 4: 264-271. D. Borkowska, Z. Zwolska, B. Broniarek-Samson, D. Michałowska - Mitczuk, A. Kempisty, P. Radwan - Rohrenschef, E. Augustynowicz - Kopeć: Porównanie testów IGRA i próby tuberkulinowej w rozpoznaniu utajonego zakażenia prątkiem gruźlicy. Postępy Nauk Medycznych 2011; t. XXIV, nr.10, 836-841. Opublikowano w materiałach konferencyjnych: D. Borkowska, Z. Zwolska, D. Michałowska - Mitczuk, M. Korzeniewska - Koseła, A. Zabost, A. Napiórkowska, M. Kozińska, S. Brzezińska, E. Augustynowicz-Kopeć Nowy test IGRA w diagnostyce zakażenia prątkiem gruźlicy XXI Spotkanie Polskiej Grupy European Respiratory Society. Szczyrk 3-6 03. 2011r. D. Borkowska, Z. Zwolska, E. Augustynowicz - Kopeć: Antygeny ESAT-6 i CFP 10 w rozpoznaniu zakażenia M. tuberculosis Mikrobiologia w Medycynie, Przemyśle i Ochronie Środowiska. Łódź 22-23 10. 2011r. D. Borkowska, Z. Zwolska, E. Augustynowicz - Kopeć: Diagnostyka utajonego zakażenia prątkiem gruźlicy. XV Sympozjum pt. Postępy w Medycynie Zakażeń. Warszawa 9-10 12.2011r. W 2011 roku kontynuowano badania w ramach zadania 1.20 nad polimorfizmem genów kodujących wybrane lektyny na podatność na zachorowanie na gruźlicę W ramach projektu prowadzone są badania poszukiwań korelacji pomiędzy zapadalnością na gruźlicę a poziomem ekspresji wybranych białek lektynowych. Prace prowadzone są na poziomie genów poprzez identyfikację wybranych polimorfizmów oraz na poziomie ich produktu białkowego poprzez określenie stężeń badanych lektyn. Opracowano metodykę badań polimorfizmu trzech genów SFTPA-1, SFTPA-2, SFTPD, polimorfizmu w regionie promotorowym oraz w genie MBL-2, a także w genach MASP-2, FCN-3, TLR-1, TLR-2, TLR-4. Dla genu MBL-2 badano polimorfizm w regionie promotorowym (pozycje -550, H/L i -221, Y/X) oraz w kodonach 52 (A/D), 54 (A/B) i 57 (A/C). Defektywne allele D, B i C określane są wspólnie jako O. Wśród osób chorych na gruźlicę oznaczono genotypy: 104 homozygoty A/A, 71 heterozygot A/O (w tym 20 LXA/O), 5 homo- lub heterozygot O/O. 35

W grupie kontrolnej oznaczono odpowiednio: 75 homozygot A/A, 41 heterozygot A/O (w tym 10 LXA/O), 1 heterozygota O/O (B/D). Dotychczasowe badania wykazały brak istotnych statystycznie różnic częstości występowania mutacji genu MBL2 (genotypy A/O i O/O) oraz częstości występowania genotypów związanych z niedoborem MBL (LXA/O i O/O) pomiędzy grupą pacjentów i grupą kontrolną. W 2011r. rozpoczęto badania dotyczące mechanizmu oporności na pirazynamid wśród szczepów Mycobacterium tuberculosis izolowanych od chorych na gruźlicę. Analizie poddano szczepy M. tuberculosis o różnym fenotypie oporności na 4 podstawowe leki wyizolowane od 462 chorych. Szczepy były wyhodowane według standardowych metod, miały wykonaną identyfikację gatunkową z zastosowaniem testu niacynowego. Wszystkie analizowane szczepy należały do gatunku Mycobacterium tuberculosis, nie stwierdzono ani jednego szczepu należącego do gatunku M.bovis oraz M.bovis BCG. Fenotyp oporności na PZA określono metodą radiometryczną Bactec 460-TB. Wśród opornych na PZA określono MIC dla następujących stężeń PZA: 100, 300, 600, 900 µg/ml. W grupie 462 chorych, od których wyizolowano prątki gruźlicy u 34 (7,4%) stwierdzono szczepy oporne na PZA, w tym u nowo wykrytych u 22 chorych (5,8%), a w grupie wcześniej leczonych u 12 (14%). W grupie nowo wykrytych połowa chorych wydalała prątki oporne na 4 inne leki przeciwprątkowe. U pozostałych chorych oporność na PZA towarzyszyła oporności na SM+INH+RMP+EMB, SM+INH+RMP, INH+RMP 3 chorych (13,6%) oraz oporności na SM 2 chorych (5,9%). W analizowanej grupie było 3 chorych z opornością typu pre-xdr (pre-extensively drug-resistant) W grupie 11 chorych wcześniej leczonych oporność na PZA towarzyszyła oporności na SM+INH+RMP+EMB, SM+INH+RMP 3 chorych (27,3%). Oporność na PZA występowała również skojarzeniu z opornością na INH+RMP+EMB i INH+RMP 2 chorych (18,2%). W grupie chorych wcześniej leczonych stwierdzono dwóch, u których prątki gruźlicy były oporne wyłącznie na PZA (18,2%). Wśród 34 szczepów opornych na PZA wartość MIC wynosiła w przypadku: 8 szczepów (23,5%) 100 µg/ml, 6 szczepów (17,6%) 300 µg/ml, 5 szczepów (14,7%) MIC 600 µg/ml. Wartość MIC powyżej 900 µg/ml stwierdzono u 14 szczepów (44,1%). Wnioski: Test oporności na PZA powinien należeć do antybiogramu podstawowego. Monooporność na PZA w grupie chorych nowo wykrytych, świadczy o ich transmisji i wymaga dalszych badań molekularnych. Wygłoszone referaty: A. Napiórkowska: Algorytm oznaczania oporności na PZA wśród szczepów M.tuberculosis, Zakopane, 16 czerwiec 2011r. 36

Opublikowane prace: A. Napiórkowska, Z. Zwolska, E. Augustynowicz - Kopeć: Oporność na pirazynamid (PZA) wśród prątków gruźlicy wyizolowanych od chorych z województwa mazowieckiego w latach 2008-2010. Postępy Nauk Medycznych 2011, XXIV; 819-823 A. Napiórkowska, S. Brzezińska, M. Konińska, A. Zabost, D. Borkowska, Z. Zwolska, E. Augustynowicz - Kopeć: Algorytm oznaczania oporności na PZA wśród szczepów M.tuberculosis. Materiały Konferencyjne, Krajowa Konferencja Pulmonologów, Zakopane 15-17 czerwiec 2011. W kolejnych zadaniach zajmowano się monitorowaniem częstości występowania głównych gatunków bakterii patogennych izolowanych z układu oddechowego, ich fenotypem lekooporności oraz analizowano mechanizmy oporności ESBL, MRSA i KPC. Celem badań podjętych w ramach zadania badawczego 1.7 było monitorowanie najczęściej izolowanych patogenów dróg oddechowych i ich lekowrażliwość. Analizie poddano 3 letni okres w latach 2009-2011. W roku sprawozdawczym wykonano 13.716 posiewów materiałów od chorych w tym z dróg oddechowych 5235 (38,2%), podobnie jak w roku poprzednim 5023 (37,2%) posiewów. Wśród wyhodowanych patogenów dominowały, podobnie jak w latach ubiegłych pałeczki gramujemne (49%) i Staphylococcus aureus (31,1%). Analizując częstość występowania paciorkowców beta-hemolizujących na przestrzeni ostatnich trzech lat stwierdzono: najniższe wartości w 2009r., 3-krotnych ich wzrost w 2010r. i utrzymujące się wartości w 2011r. Inne gatunki bakterii występowały z tą samą częstością. Wśród pałeczek gramujemnych z rodz. Enterobacteriaceae zauważono spadek wrażliwości na penicyliny (głównie piperacylinę) i monobaktamy (aztreonam), a także na antybiotyki beta-laktamowe z inhibitorami (amoksycylinę z kw. klawulonowym i piperacylinę z tazobaktamem). Największą aktywność wobec szczepów Staphylococcus aureus wykazywały podobnie jak w latach ubiegłych antybiotyki glikopeptydowe (wankomycyna, teikoplanina), kotrimoksazol i gentamycyna. Badania wykazały, że największą aktywność wobec szczepów pałeczek Gram-ujemnych z rodziny Enterobaceriaceae (tab. III) wykazywały karbapenemy (imipenem, meropenem) oraz aminoglikozydy (amikacyna, gentamycyna). Od kwietnia 2011r. zostały wprowadzone nowe europejskie zalecenia interpretacji wyników oznaczeń lekowrażliwości wg EUCAST. Nowe kryteria spowodowały zmianę interpretacji wyników wrażliwości na leki. W związku z tym zaobserwowano: spadek wrażliwości pałeczek z rodz. Enterobacteriaceae na amoksycylinę z kw. klawulanowym. Większość szczepów uważanych dawniej za szczepy wrażliwe, wg zaleceń Eucast należy traktować jako średniowrażliwe. spadek o około 10 % liczby szczepów wrażliwych pałeczek niefermentujących na karbapenemy (głównie na imipenem) oraz monobaktamy (aztreonam). według zaleceń CLSI, które obowiązywały do kwietnia 2011 szczepy ESBL (+) traktowane były z definicji jako szczepy oporne na wszystkie penicyliny (bez połączeń z inhibitorami), cefalosporyny (z wyj. cefamycyn) i monobaktamy. 37

Nowe wskazania wg. EUCAST zalecają, aby przy wykryciu ESBL nie wykluczać zastosowania cefalosporyn III i IV generacji oraz aztreonamu w przypadku stwierdzenia na nie wrażliwości. Zalecenia EUCAST nakazują raportować wyniki oznaczenia lekowrażliwości szczepu zgodnie z wynikiem antybiogramu, a szczepy ESBL dodatnie są rejestrowane do celów epidemiologicznych i kontroli zakażeń. Referaty: Kształcenie podyplomowe pielęgniarek epidemiologicznych 7-10 czerwiec 2011r., IGiChP Warszawa: Zakażenia dolnych dróg oddechowych, zasady pobierania materiału, badania mikroskopowe, mechanizmy oporności Violetta Petroniec (2 godz.) Zasady interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów EUCAST Violetta Petroniec (2 godz.) Publikacje: Plakat i doniesienie na XV Sympozjum Naukowe Postępy w Medycynie Zakażeń, 9-10 grudzień 2011r., Warszawa, Hotel Marriott: Wyniki badań mikrobiologicznych i rozpoznania kliniczne u chorych z wysiękiem opłucnowym hospitalizowanych w IGiChP w okresie 01.01.2002r. - 31.12.2010r J. Nowak, A. Pacholczyk, V. Petroniec, B. Dziedzicka, E. Augustynowicz - Kopeć. Plakat i doniesienie na XV Sympozjum Naukowe Postępy w Medycynie Zakażeń, 9-10 grudzień 2011, Warszawa, Hotel Marriott: Analiza występowania szczepów paciorkowców beta-hemolizujących izolowanych z materiałów klinicznych od chorych hospitalizowanych w IGiChP w okresie 01.01.2008-30.06.2011 V. Petroniec, B. Dziedzicka, A. Pacholczyk, J. Nowak, E. Augustynowicz - Kopeć. Wyniki badań mikrobiologicznych i rozpoznania kliniczne u chorych z wysiękiem opłucnowym hospitalizowanych w IGiChP w okresie 01.01.2002r. - 31.12.2010r. J. Nowak, A. Pacholczyk, E. Radzikowska, R. Jagiełło, Z. Zwolska, E. Augustynowicz-Kopeć. Postępy Nauk Medycznych t. XXIV, nr 10, 2011. Celem zadania 1.8 w 2011 roku było monitorowanie występowania szczepów pałeczek Gram-ujemnych z rodziny Enterobacteriaceae produkujących β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) i pałeczek z rodzaju Pseudomonas spp. opornych na karbapenemy. Analizowane szczepy wyizolowane zostały z materiałów pochodzących od chorych hospitalizowanych i leczonych w IGiChP w okresie od 15.10.2010r. do 14.10.2011r. W analizowanym okresie wykonano 13.716 posiewów, które wykonywano zgodnie z ogólnie przyjętymi procedurami mikrobiologicznymi. Wytwarzanie β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym typu ESBL u pałeczek z rodz. Enterobacteriaceae oraz oporność na karbapenemy szczepów Pseudomonas spp wykrywano w automatycznym systemie Vitek 2 Compact i potwierdzano za pomocą E- 38

testów i/lub metodą dwóch krążków (DDST) wg rekomendacji Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów. Zgodnie ze wskazaniami Konsultanta Krajowego w dziedzinie mikrobiologii lekarskiej, od kwietnia 2011 zostały wprowadzone zalecenia interpretacji wyników oznaczeń lekowrażliwości drobnoustrojów wg Europejskiego Komitetu ds. Oznaczeń Lekowrażliwości - EUCAST. Zastąpiły one stosowane dotychczas zalecenia amerykańskie CLSI. W naszych badaniach stwierdzono w porównaniu z rokiem 2010 znaczny wzrost liczby chorych o 38 % (z 52 do 72) zakażonych szczepami z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzającymi ESBL. Dominującym gatunkiem była Klebsiella pneumoniae 71,1% (tabela 1). Najwięcej szczepów ESBL (+) pochodziło od chorych hospitalizowanych w Oddziale Anestezjologii i Intensywnej Terapii-39,1% (tabela 2). Ponad 50% szczepów wyizolowano z moczu i materiału bronchoskopowego (tabela 1). W analizowanym okresie szczepy pałeczek Pseudomonas aeruginosa opornych na karbapenemy wyhodowano od 94 pacjentów w tym najwięcej od chorych na mukowiscydozę leczonych w PP -35,8% oraz w I Klinice Chorób Płuc- 22,2% (tabela 4). Referaty: Kształcenie podyplomowe pielęgniarek epidemiologicznych 7-10 czerwiec 2011r., IGiChP, Warszawa: Zakażenia dolnych dróg oddechowych, zasady pobierania materiału, badania mikroskopowe, mechanizmy oporności Violetta Petroniec (2 godz.) Zasady interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów EUCAST Violetta Petroniec (2 godz.) Publikacje: Plakat i doniesienie w materiałach zajazdowych XII Konferencji Biologia molekularna w diagnostyce chorób zakaźnych i biotechnologii dla uczczenia profesora Karola Maramoroscha, 24 września 2011, SGGW Warszawa: Prevalence and antimicrobial susceptibility of microorganism isolated from sputa of adults patients with cystic fibrosis treated in the Institute of Tuberculosis and Lung Diseases in Warsaw in 2008-2011 A. Pacholczyk, J. Nowak, E. Augustynowicz-Kopeć. Plakat i doniesienie na XV Sympozjum Naukowe Postępy w Medycynie Zakażeń, 9-10 grudzień 2011, Warszawa, Hotel Marriott: Wyniki badań mikrobiologicznych i rozpoznania kliniczne u chorych z wysiękiem opłucnowym hospitalizowanych w IGiChP w okresie 01.01.2002r. - 31.12.2010r J. Nowak, A. Pacholczyk, V. Petroniec, B. Dziedzicka, E. Augustynowicz-Kopeć. Publikacja w Postępach Nauk Medycznych: Wyniki badań mikrobiologicznych i rozpoznania kliniczne u chorych z wysiękiem opłucnowym hospitalizowanych w IGiChP w okresie 01.01.2002-31.12.2010 J. Nowak, A. Pacholczyk, E. Radzikowska, R. Jagiełło, Z. Zwolska, E. Augustynowicz-Kopeć. Postępy Nauk Medycznych 2011; 10 (XXIV): 869-875. W zadaniu badawczym 1.9 kontynuowano badania nad monitorowaniem częstości występowania szczepów Staphylococcus aureus opornych na antybiotyki β-laktamowe 39

(MRSA). W analizowanym okresie wykonano 13.716 posiewów materiałów diagnostycznych od chorych hospitalizowanych i leczonych w Przychodni Przyklinicznej (w tym 5257 badań w kierunku nosicielstwa MRSA). Posiewy wykonywano zgodnie z obowiązującymi standardami mikrobiologicznymi. Kontrola nosicielstwa obejmowała pacjentów: przebywających wcześniej w innym szpitalu hospitalizowanych w ciągu ostatnich 3 miesięcy w innym szpitalu ze stwierdzona kolonizacją MRSA w wywiadzie po przebyciu zakażenie MRSA Mechanizm oporności na metycylinę (MRSA) wykrywano w automatycznym systemie Vitek, metodą krążkowo-dyfuzyjną z cefoksytyną, posiewając materiał na płytki chrom agar MRSA oraz testem aglutynacji lateksowej Slidex MRSA Detection (biomerieux). Z nadesłanych do badań bakteriologicznych materiałów wyizolowano 1052 szczepów Staphylococcus aureus. Oporność na metycylinę stwierdzono u 164 szczepów -15,6% (tabela 1). Badania częstości występowania szczepów Staphylococcus aureus MRSA w IGiChP są prowadzone od 1994 roku. Wśród szczepów S. aureus izolowanych z materiałów klinicznych oraz z materiałów w kierunku nosicielstwa MRSA (lata 2008-2011) odsetek szczepów opornych na metycylinę (MRSA) pozostaje na podobnym poziomie ( tabela 2). Wnioski: 1. Częstość występowania szczepów MRSA w różnych materiałach klinicznych, w stosunku do lat ubiegłych, pozostaje na tym samym poziome. 2. W latach 2008-2011 w naszym Instytucie nie zarejestrowano ogniska epidemicznego związanego z Staphylococcus aureus MRSA. 3. Badania w kierunku nosicielstwa MRSA są konieczne w celu monitorowania skali zagrożenia na oddziałach naszego szpitala. Referaty: Kształcenie podyplomowe pielęgniarek epidemiologicznych 7-10 czerwiec 2011, IGiChP Warszawa: Zakażenia dolnych dróg oddechowych, zasady pobierania materiału, badania mikroskopowe, mechanizmy oporności Violetta Petroniec (2 godz.), Zasady interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów EUCAST Violetta Petroniec (2 godz.) Publikacje: Plakat i doniesienie na XV Sympozjum Naukowe Postępy w Medycynie Zakażeń, 9-10 grudzień 2011, Warszawa, Hotel Marriott: Publikacja w Postępach Nauk Medycznych: Wyniki badań mikrobiologicznych i rozpoznania kliniczne u chorych z wysiękiem opłucnowym hospitalizowanych w IGiChP w okresie 01.01.2002-31.12.2010 J. Nowak, A. Pacholczyk E. Radzikowska, R. Jagiełło, Z. Zwolska, E. Augustynowicz-Kopeć. Postępy Nauk Medycznych 2011; 10 (XXIV): 869-87 40

Celem zadania1.10 kontynuowanego od roku 2005 jest badanie fenotypu, pokrewieństwa genetycznego i częstości występowania pałeczek niefermentujących z rodzaju Pseudomonas aeruginosa. Analizowane szczepy wyizolowane zostały z materiałów pochodzących od chorych leczonych w IGiChP w okresie od 15.10.2010 do 14.10.2011. Celem zadania było badanie fenotypu, pokrewieństwa genetycznego i częstości występowania pałeczek niefermentujących z rodzaju Acinetobacter spp. oraz Pseudomonas aeruginosa. Materiał do badań stanowiło 520 szczepów Pseudomonas aeruginosa uzyskanych od 218 chorych hospitalizowanych we wszystkich oddziałach IGiChP oraz leczonych w P.P. (tabela1). Posiewy wykonano zgodnie ze standardowymi procedurami mikrobiologicznymi. Szczepy identyfikowano rutynowymi metodami diagnostycznymi. Lekowrażliwość szczepów określano w systemie automatycznym Vitek 2 Compact. W wyniku trudności z uzyskaniem homogennej zawiesiny szczepów P. aeruginosa fenotypu śluzowego izolowanego od chorych na mukowiscydozę wrażliwość na badane antybiotyki określano metodą dyfuzyjno-krążkową Kirby-Bauera. Interpretację lekowrażliwości do 30.04.2011 prowadzono w oparciu o wytyczne CLSI, od kwietnia 2011 zgodnie z zaleceniami EUCAST. Podstawę molekularnego dochodzenia epidemiologicznego stanowiły szczepy izolowane od chorych hospitalizowanych w OIOM. Spośród 2725 szczepów drobnoustrojów izolowanych z materiałów klinicznych uzyskanych od chorych leczonych w IGiChP w analizowanym okresie, wyhodowano 520 szczepów P. aeruginosa -19,1% (tabela2).wszystkie szczepy wyizolowane były wrażliwe na kolistynę. Odsetek szczepów P. aeruginosa wrażliwych na aminoglikozydy wynosił od 34,8% (na gentamycynę) do 45,3% (na tobramycynę). Wrażliwość na antybiotyki beta-laktamowe kształtowała się od 25,9% (na ceftazydym) do 50,0% (na cefepim). Odsetki szczepów wrażliwych na karbapenemy wynosiły odpowiednio: 46,9% (imipenem), 49,0% (meropenem). Ponad 30% wszystkich badanych szczepów wrażliwa była na ciprofloksacynę (tabela3). Analizie genetycznej poddano 12 szczepów P. aeruginosa wyhodowanych od chorych hospitalizowanych w OIOM w badanym okresie. Analiza pokrewieństwa genetycznego 12 szczepów izolowanych od chorych OIT wykazała istnienie 7 genotypów (ryc. 1): genotyp I występował u 3 chorych (ścieżka nr 1, 2, 3) genotyp II występował u 3 chorych (ścieżka nr 6, 7, 8) genotyp III występował u 2 chorych (ścieżka nr 5 i 11) genotypy IV, V, VI i VII miały niepowtarzalne wzory genetyczne Szczepy należące do genotypu I (trzech chorych leczonych w OIOM) miały jednakowy genotyp i fenotyp (jeden szczep różnił się wrażliwością na cefepim i amikacynę). Szczepy należące do genotypu II (izolowane od trzech chorych) i genotypu III (dwóch chorych) cechowała odmienna wrażliwość na antybiotyki. Z danych zebranych przez Zespół Zakażeń Szpitalnych IGiChP wynika, iż w roku naukowym 2010/2011 nie zanotowano ogniska epidemicznego. Wnioski: Lekiem o największej aktywności in vitro wobec wyizolowanych szczepów P. aeruginosa jest kolistyna (100% wrażliwości). 2.Powszechne występowanie w materiałach klinicznych i 41

szybkie nabywanie lekooporności narzuca konieczność monitorowania występowania szczepów Pseudomonas aeruginosa w środowisku szpitalnym oraz ocenę wrażliwości na antybiotyki. 4. Wykonanie badań na poziomie molekularnym jest bardzo przydatne w analizie epidemiologicznej zakażeń szpitalnych. Wśród chorych w OIOM nie można wykluczyć transmisji szczepów P. aeruginosa o podobnych wzorach amplifikacyjnych. Referaty: Kształcenie podyplomowe pielęgniarek epidemiologicznych 7-10 czerwiec 2011, IGiChP, Warszawa: Zakażenia dolnych dróg oddechowych, zasady pobierania materiału, badania mikroskopowe, mechanizmy oporności Violetta Petroniec (2 godz.) Zasady interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów EUCAST Violetta Petroniec (2 godz.) Publikacje: Plakat i doniesienie w materiałach zajazdowych XII Konferencji Biologia molekularna w diagnostyce chorób zakaźnych i biotechnologii dla uczczenia profesora Karola Maramoroscha, 24 września 2011, SGGW Warszawa: Prevalence and antimicrobial susceptibility of microorganism isolated from materials of adults patients with cystic fibrosis treated in the Institute of Tuberculosis and Lung Diseases in Warsaw in 2008-2011 A. Pacholczyk, J. Nowak, E. Augustynowicz-Kopeć. Plakat i doniesienie na XV Sympozjum Naukowe Postępy w Medycynie Zakażeń, 9-10 grudzień 2011, Warszawa, Hotel Marriott: Wyniki badań mikrobiologicznych i rozpoznania kliniczne u chorych z wysiękiem opłucnowym hospitalizowanych w IGiChP w okresie 01.01.2002-31.12.2010 J. Nowak, A. Pacholczyk, V. Petroniec, B. Dziedzicka, E. Augustynowicz-Kopeć. Wyniki badań mikrobiologicznych i rozpoznania kliniczne u chorych z wysiękiem opłucnowym hospitalizowanych w IGiChP w okresie 01.01.2002-31.12.2010r J. Nowak, A. Pacholczyk, E. Radzikowska, R. Jagiełło, Z. Zwolska, E. Augustynowicz-Kopeć. Postępy Nauk Medycznych t. XXIV, nr 10, 2011 Mukowiscydoza - problemy diagnostyki mikrobiologicznej J. Nowak, A. Pacholczyk, W. Skorupa, E. Augustynowicz-Kopeć. Diagnosta laboratoryjny, nr 3, 2011 W ramach zadania badawczego 1.14 kontynowano badania nad rolą Staphylococus aureus w chorobie Wegenera oraz wpływu superantygenów na przebieg kliniczny choroby. W 2011r kontynuowano badanie rozpoczęte w ub roku. W 2 poprzednich latach obecność superantygenu gronkowcowego określano metodą genetyczną. W br zastosowano metodę odwróconej biernej aglutynacji lateksowej (RPLA), która jest uważana za bardziej czułą. Nową metodą wykonano 70 oznaczeń u 31 chorych. U 10 (32 %) chorych nie wykryto superantygenu mimo, że troje z nich było hospitalizowanych w tym czasie z powodu klinicznej progresji choroby. U 7 (22 %) nieobecność superantygenu korelowała z remisją choroby. Najczęściej wykrywano superantygeny: sea, see, sed. Rzadziej (6/70) stwierdzono 42

antygen tsst-1 uważany za najbardziej wskaźnikowy. Nie znaleziono korelacji pomiędzy obecnością antygenu tsst-1 a stanem klinicznym chorego. Trudności w korelacji wynikają m.in. z faktu, że obecne metody leczenia pozwalają osiągnąć długotrwałe remisje, podczas których chorzy są rzadziej monitorowani. W ciągu 3 kolejnych lat liczba zbadanych chorych wynosi 61, z czego u 22 chorych test na wykrycie superantygenu wykonano co najmniej 2 x na różnym etapie choroby/remisji. Badanie będzie kontynuowane. Publikacje: V. Petroniec, E. Augustynowicz - Kopeć: Czy znamy czynniki ryzyka w chorobie Wegenera? Diagnosta laboratoryjny. 4 (25) 2011, 11-12. Kontynuowano monitorowanie zakażeń bakteryjnych u chorych na mukowiscydozę. (zad.1.11). W 2011 roku (do końca listopada) miały miejsce 84 hospitalizacje z powodu mukowiscydozy. Dotyczyły one 40 chorych. Ta dysproporcja jest spowodowana powtarzającymi się hospitalizacjami wśród najciężej chorych. W roku 2011 rozpoznano mukowiscydozę u 4 chorych 3 mężczyzn i jednej kobiety, najstarszy z chorych miał 46 lat. W jednym przypadku, u 20 letniego chorego, rozpoznano mukowiscydozę, alergiczną aspergillozę oskrzelowo płucną i astmę oskrzelową. W 2011 roku (do końca listopada) miało miejsce 87 hospitalizacji z powodu mukowiscydozy. Dotyczyły one 37 chorych. Ta dysproporcja jest spowodowana powtarzającymi się hospitalizacjami wśród najciężej chorych. U dwóch chorych przeszczepiono płuca (1 w Wiedniu, 1 w Paryżu). Jedna chora jest na liście oczekujących na przeszczep w Wiedniu. Jeden chory jest na liście oczekujących na przeszczep w Zabrzu, kolejny jest w trakcie kwalifikacji do przeszczepienia płuc (u tego chorego mukowiscydozę rozpoznano w 23 roku życia, obecnie chory ma 36 lat). W mijającym roku zmarły 4 chore. Jedna ze zmarłych chorych była zakwalifikowana do przeszczepienia płuc w Wiedniu. W 2 przypadkach chore nie kwalifikowały się do przeszczepienia płuc (jedna chora z nie poddającą się leczeniu mykobakteriozą wywołaną M.abscessus, druga ze znaczną deformacją klatki piersiowej i powikłaniami neurologicznymi po operacji kyfoskoliozy przed laty). Jedna chora, w trakcie kwalifikacji do przeszczepienia płuc, zmarła nagle w domu. Rozpoznano ponadto dwa nowe przypadki mykobakteriozy u chorych na mukowiscydozę. W pierwszym przypadku było to zakażenie Mycobacterium abscessus, W drugim Mycobacterium kansasii. Obie chore są obecnie leczone (w pierwszym przypadku leczenie jest jak do tej pory skuteczne, w drugim chora dopiero rozpoczęła leczenie). Konferencje: Przewodniczący sesji Kazuistyka na X Konferencji Polskiego Towarzystwa Mukowiscydozy w Karpaczu (20-22.10.2011) Prezentacja ustna: Powikłanie po wszczepieniu portu naczyniowego u chorej na mukowiscydozę. Publikacje: K. Jończyk-Potocka, P. Sosnowski, M. Warzywoda, S. Stężowska-Kubiak, A. Lisowska, Sz. Cofta, A. Pogorzelski, W. Skorupa, A. Minarowska, A. Antczak, M. Biczysko, J. Walkowiak: 43

Genotyp a morfologia trzustki u chorych na mukowiscydozę. Fam. Med. 2011; 13 (2): 161-164. (KBN/MniI: 6.000) K. Jończyk-Potocka, P. Sosnowski, M. Warzywoda, S. Stężowska-Kubiak, A. Lisowska, J. Goździk-Spychalska, A. Pogorzelski, W. Skorupa, A. Minarowska, A. Antczak, M. Biczysko, J. Walkowiak: Badania rezonansu magnetycznego u chorych na mukowiscydozę: wielkość trzustki. Fam. Med. 2011; 13 (2): 157-160. (KBN/MniI: 6.000) A. Lisowska, A. Pogorzelski, G. Oracz, W. Skorupa, Sz. Cofta, J. Szydłowski, J. Socha, J. Walkowiak: Antibiotic therapy and fat digestion and absorption in cystic fibrosis. Acta Bioch. Pol. 2011; 58 (3): 345-347. (IF: 1.234; KBN/MniI: 6.000) Kolejne zadanie badawcze 1.16 dotyczy określenia roli zakażeń wirusowych, grzybiczych i drobnoustrojami atypowymi w zaostrzeniach choroby oskrzelowo- płucnej u chorych na mukowiscydozę. Badanie rozpoczęto 01.03.2010r. W drugim roku badania od 26.11.2010r. do 27.11.2011r. włączono 10 chorych na mukowiscydozę hospitalizowanych w I Klinice Chorób Płuc IGiCHP z powodu zaostrzenia choroby oskrzelowo-płucnej (7 kobiet i 3 mężczyzn), w wieku od 19 do 33 lat (średnia wieku: 23,2±5,12), niepalących papierosów. Dwóch pacjentów miało wykonywane badania 2- krotnie, jedna chora 3-krotnie, podczas kolejnych epizodów zaostrzeń choroby w tym okresie. Dwoje chorych było już objętych badaniem w pierwszym okresie badania w 2010r. Wśród grupy badanej w obecnym roku zmarły 2 pacjentki jedna włączona do badania w 2010r a druga w 2011r. U jednej z nich stwierdzano w posiewach plwociny Mycobacterium abscessus. Wszyscy pacjenci włączeni do badania podczas pierwszych 48 godzin od początku hospitalizacji, mieli pobieraną krew, w celu oznaczenia parametrów stanu zapalnego. Leukocytoza wynosiła od 8 do 19 x 10 \S\ 9/l, średnia 12±3,6; CRP-przed rozpoczęciem leczenia było w granicach 5-78 mg/l, średnia 33,4±21,4; Prokalcytonina była ujemna u wszystkich osób tylko w jednym przypadku była niespecyficznie podwyższona do 0,13 ng/ml., w pozostałych wynosiła <0,05 ng/ml. Oznaczano również CRP po zakończeniu antybiotykoterapii zakres wartości był od 5 do 54mg/ml., średnia 11,8 ±14,5. Na początku hospitalizacji od wszystkich chorych pobierano plwocinę do badania w celu określenia rodzaju hodowanych bakterii. Po kilku dniach od włączenia antybiotykoterapii pobierano drugą plwocinę na podłoża do wzrostu prątków. Od 10 chorych pobrano łącznie 28 próbek plwociny. Wykonano 14 posiewów z zastosowaniem systemu BACTEC, w 2 posiewach pochodzących od jednej pacjentki stwierdzono wzrost 2 typów prątków niegruźliczych (Mycobacterium chelonae i Mycobacterium abscessus). W 2 próbkach wystąpiła kontaminacja florą bakteryjną a u pozostałych chorych posiewy na obecność prątków były ujemne. Wstępne obserwacje wskazują, że u chorych na mukowiscydozę zaostrzeniom związanym z infekcją bakteryjną często towarzyszy zakażenie wirusami. Wśród wykrytych wirusów nie było wirusa grypy typu A i B, dla 6 chorych stwierdzono dodatnie wyniki na obecność wirusów oddechowych. Celem zadania badawczego 1.18 który jest kontynuacją zadania rozpoczętego w ubiegłym roku jest ocena efektywności i przydatności wykrywania najczęstszych patogenów 44

wirusowych układu oddechowego metodami immunofluorescencji pośredniej w porównaniu z metoda muliplex PCR.W tym roku do badań dołączoną nowy test diagnostyczny wykrywajacy wirusy grypy z grupy A i B metoda Real Time PCR. Badania wykonano w grupie 59 chorych z objawami infekcji dróg oddechowych. Metodą immunofllurescencji pośredniej wirusy RSV lub Grypy A lub B, Paragrypy 1 lub 2 lub 3, Adenowirus wykryto w 52 materiałach (88%). Metodą imunofllorescencji bezposredniej wirus A u 28 chorych 45,8%,wirus B u 31 chorych 52,5. Przy użyciu metody multiplex PCR, dodatni wynik testu obserwowano w 14 z 59 materiałów (23,7%), w tym: grypa A w 6 materiałach, grypa B w 1, RSV w 4, coronawirus w 8 i rhinowirus A/B w 1. Metodą Real Time PCR potwierdzono infekcję wirusem grypy A w 14 z 59 (23,7%) materiałów a grypy B w 3 (5,1%). W 6 próbach, w których uzyskano wynik ujemny metodą fluorescencji bezpośredniej przy użyciu testu Real Time PCR wykryto obecność wirusa grypy A. Wnioski: Między metodami immunofluorescencji i PCR widoczna jest znaczna rozbieżność, która może być wynikiem: małej specyficzności i czułości immunofluorescencji, w przypadku wyników fałszywie dodatnich w preparatach diagnozowanych przy użyciu immunofluorescencji, reakcją krzyżową przeciwciał,degradacją kwasów nukleinowych w próbach izolowanych, źle pobranego materiału:, otrzymanie preparatów skąpokomórkowych, kontaminacja śliną mogła spowodować degradację RNA Wyniki dodatnie w kierunku obecności wirusów grypy A i B uzyskane za pomocą metody Real Time i multiplex PCR są dodatnie w grupie tych samych 7 pacjentów, jednak test wykorzystujący Real Time PCR wykrył obecność wirusa grypy A u 8 a B u 2 dodatkowych pacjentów co wskazuje na jego znacznie większa czułość. Publikacje: Paulina Jaguś, Joanna Chorostowska-Wynimko. Szybka Diagnostyka laboratoryjna zakażeń wirusowych układu oddechowego. Diagnosta laboratoryjny 2011; 3 (24): 7-9. Kontynuowano badania w ramach zadania badawczego 1.18. W ciągu ostatniego roku (2011) wyizolowano i zamrożono materiał genetyczny pochodzący z tkanek i preparatów cytologicznych ponad 300 pacjentów przebadanych m. in. pod kątem mutacji genu EGFR oraz AAT1. Obecnie bank DNA zawiera ponad 800 indywidualnych próbek DNA, w tym 300 próbek DNA wyizolowanego z tkanek guzów nowotworowych lub materiałów cytologicznych, 200 próbek DNA genomowego wyizolowanego z krwi odwodowej oraz 300 próbek wolnego-krążącego DNA pozakomórkowego izolowanego z osocza. W celu oceny przydatności długo przechowywanego materiału do badań genetycznych, bankowane DNA wyizolowane z fragmentów tkanki raka płuca typu gruczolakoraka od 15 pacjentów, przechowywane ponad 2 lata zamrożone w temperaturze poniżej -20 C zostało wykorzystane do oznaczenia statusu mutacji L858R w eksonie 21 genu EGFR metodą genotypowania sondami hydrolizującymi techniką PCR w czasie rzeczywistym oraz metodą sekwencjonowania. Stwierdzono że, bankowane DNA jest zamrożone w temperaturze ok. - 20 C, co zapewnia stabilność jego przechowywania nawet przez kilka lat. Dla 15/15 45

analizowanych preparatów (100%) uzyskano poziom amplifikacji pozwalający na wykonanie genotypowania przy użyciu techniki PCR w czasie rzeczywistym (Rycina 1) oraz sekwencjonowanie produktu amplifikacji eksonu 21 (Rycina 2). Mutację L858R wykryto obiema metodami u 1/15 pacjentów (8%). Zamrożone preparaty DNA zachowują użyteczność diagnostyczną do testów jakościowych, takich jak genotypowanie przez okres kilku lat. Opracowany system bankowania DNA jest obecnie rutynowo stosowany w naszej Pracowni. Rosnąca ilość preparatów DNA pozwala na ich wykorzystanie do retrospektywnego oznaczenia markerów genetycznych przy użyciu technik niedostępnych w czasie bankowania materiału a także skorelowania tych danych z charakterystyką kliniczną pacjentów czy histologią preparatów nowotworowych. Wniosek: Opracowany system bankowania zapewnia trwałość przechowywanych preparatów DNA i ich dostępność oraz wysoką jakość niezbędną do celów przyszłych oznaczeń. W zadaniu badawczego 1.21 ocenie poddano wartości prognostyczne biomarkerów stanu zapalnego w postępowaniu klinicznym u pacjentów hospitalizowanych z powodu zapalenia płuc. Przeprowadzono analizę porównawczą biomarkerów o udokumentowanej, jak również postulowanej wartości klinicznej (prekursorowa postać peptydu natriuretycznego typu B (pro-bnp), prokalcytonina (PCT), pro-adrenomedulina (pro-adm), kopeptyna (CP) w odniesieniu do stanu klinicznego chorych ocenianego wg skali CURB-65, czasu hospitalizacji oraz pobytu w oddziale OIOM, śmiertelności, charakteru powikłań i terapii. Badaniem objęto grupę 20 pacjentów z zewnątrzszpitalnym zapaleniem płuc (CAP) klasy 4, 5 wg skali CURB-65 (wiek 49,5±17), grupę kontrolną stanowiło 16 zdrowych ochotników. Zgodnie z protokołem surowica chorych była zabezpieczana w -20 o C w 1 i 8 dobie hospitalizacji. Stężenia surowicze wymienionych biomarkerów zostały oznaczone metodą ELISA (CP, pro-bnp, pro-adm) lub turbidymetryczną (PCT). Analiza statystyczna wykazała ujemną korelację pomiędzy stopniem ciężkości CAP a stężeniem PCT w 8 dobie (r=-0,74; p=0,05). Również poziom PCT w surowicy był istotnie różny u chorych ze stopniem ciężkości 4 i 5 wg skali CURB. Dodatkowo wykonano analizę badanej grupy pod kątem ewentualnych zaburzeń czynności gruczołu tarczowego (trijodotyronina-t3 i tyroksyna-t4), które obserwowane są w szeregu schorzeń o ciężkim przebiegu klinicznym pomimo braku pierwotnej patologii tarczycy. Zjawisko to jest nazywane "syndromem choroby nietarczycowej" (ang. non-thyroidal illness syndrome, NTIS) lub sick euthyroid syndrome (SES). Wniosek: Wydaje się, że analiza w/w czynników może wskazać na biomarkery przydatne w identyfikacji grupy chorych z niekorzystnym rokowaniem. Aktualnie prowadzona jest analiza statystyczna oceny przydatności analizowanych markerów dla określenia rokowania u chorych hospitalizowanych na IIOM z powodu CAP. 46

Temat 2: SYTUACJA EPIDEMIOLOGICZNA I DOSKONALENIE PROGRAMU ZWALCZANIA GRUŹLICY W POLSCE. Kierownik tematu: prof. nadzw. dr hab. n. med. Maria Korzeniewska - Koseła Wykonawcy tematu: Renata Szostak, Bożena Mieczkowska, Krystyna Woźniak, Janina Górska, Anna Nieścieruk oraz zadanie badawcze nr 3: prof. nadzw. dr hab. n. med. Ewa Augustynowicz - Kopeć z zespołem Wyniki uzyskane w zadaniach badawczych realizowanego tematu pozwalają na sformułowanie następujących wniosków: Nie nastąpiły istotne zmiany w sytuacji epidemiologicznej gruźlicy i realizacji programu jej zwalczania stąd w pełni zachowują swoją aktualność wnioski i zalecenia z lat poprzednich. W zakresie oceny sytuacji epidemiologicznej W ocenianym 2010r. po minimalnym wzroście w roku 2007 i 2009, w roku bieżącym nastąpił spadek zachorowań. Taka zmienność w krótkim okresie świadczyć może o utrzymującym się braku stabilności w zakresie wykrywania i/lub rejestracji w poszczególnych województwach. Średnie roczne tempo spadku zapadalności w ocenianej dekadzie wynosiło 2,9% i było nieco wyższe niż w poprzednich dekadach. W skali europejskiej było to średnie tempo spadku w analizowanym okresie. Utrzymują się znaczne różnice w zapadalności między województwami. Najwyższą zapadalność zarejestrowano w województwach: łódzkim, lubelskim i śląskim, a najniższą w województwach: opolskim, wielkopolskim i podlaskim. Występująca w kilku województwach znaczna zmienność roczna zapadalności wskazuje na występujące tam zakłócenia w wykrywaniu i/lub rejestracji zachorowań. Udział przypadków potwierdzonych bakteriologicznie wśród zachorowań na gruźlicę jest porównywalny do przeciętnej w innych krajach europejskich. Na niskim poziomie utrzymują się wskaźniki udziału chorych z lekoopornością w tym także z wielolekową opornością stwierdzone wśród ogółu chorych. Konieczne jest stałe monitorowanie tego zjawiska. Skala zachorowań na gruźlicę wśród więźniów i cudzoziemców nie stanowi zagrożenia dla sytuacji epidemiologicznej. Wysokie prawdopodobieństwo zwiększenia imigracji zarobkowej do Polski z krajów o wysokiej zapadalności na gruźlicę w tym wielolekooporną i o wysokim ryzyku HIV/AIDS nakazują dokładniejsze monitorowanie sytuacji wśród tych grup. Polska nadal należy do krajów, w których zapadalność na gruźlicę należy do wysokich w skali Unii Europejskiej, i w tym rankingu Polska zajmowała 22 miejsce wyprzedzając tylko Portugalię, Bułgarie, Estonię, Litwę, Łotwę i Rumunię. Taka sytuacja sprawia, że gruźlica w Polsce jest nadal ważnym problemem zdrowotnym wymagającym działań całej służby zdrowia. W zakresie realizacji podstawowych składowych programu zwalczania gruźlicy. W zakresie wykrywania chorych na gruźlicę dominującą metodą, o tendencji wzrostowej, pozostaje wykrywanie z objawów. Największy w tym udział mają lekarze podstawowej opieki zdrowotnej/ lekarze rodzinni. Dlatego intensyfikacja promocji wiedzy o gruźlicy w społeczeństwie z jednej strony i szkolenia lekarzy p.o. w zakresie objawów i wczesnej diagnostyki gruźlicy z drugiej strony zachowuje swoją aktualność. Pozwoli to na wcześniejsze wykrycie choroby i wyleczenie chorego bez inwalidztwa oddechowego, a jego trwałe odprątkowanie jest gwarancją zmniejszenia się problemu gruźlicy. Należy kontynuować działania zmierzające do poprawy kompletności rejestru zachorowań na gruźlicę zwłaszcza wśród cudzoziemców i zakażonych HIV. 47

Uczestnictwo Polski w systemie nadzorowania chorób zakaźnych w krajach Unii Europejskiej wymaga dostosowania formy elektronicznej i formularza zgłoszenia zachorowania na gruźlicę do standardów obowiązujących (wprowadzonych przez ECDC) w krajach UE. Ocena skuteczności leczenia przeciwprątkowego, przeprowadzona w skali kraju jak i poszczególnych województw wykazała średni i niepoprawiający się w skali europejskiej poziom skuteczności leczenia przeciwprątkowego. Odbiega on od poziomu zalecanego przez ŚOZ. W ostatnich latach nie osiągnięto poprawy skuteczności leczenia. Zbyt wysoki jest odsetek chorych przerywających leczenie. Jednocześnie zbyt duży jest także odsetek chorych leczonych za długo. Nie poprawia się raportowanie o wynikach leczenia. Powoduje to, że w Polsce jest jeden z największych w Europie odsetek chorych, których leczenie nie jest monitorowane. Konieczne jest utrzymanie funkcjonującego systemu monitorowania wyników leczenia i dostosowania go do zaleceń ECDC. Nowy formularz zgłoszeń, zgłoszony przez Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc do Ministerstwa Zdrowia do akceptacji, w którym umieszczone będą dane o wynikach lekowrażliwości poprawić może rejestracje przypadków z opornością na leki. Publikacje 1. Biuletyn Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc gruźlica i choroby układu oddechowego w Polsce w roku 2010 (Red. Maria Korzeniewska-Koseła), Warszawa 2011 2. Maria Korzeniewska-Koseła : Wytyczne na polskim gruncie. Infekcje.mp.pl,Nr 1/2011,2-3 3. Maria Korzeniewska-Koseła: Gruźlica. W: Chorostowska-Wynimko J., Domagała- Kulawik J., Fijałkowska A., Korzeniewska-Koseła M., Kuca P., Radzikowska E., Szturmowicz M.: Nowości z Kongresu ERS w Barcelonie, 18-22 wrzesnia 2010 (część I). Pneumonol Alergol Pol 2011,79,2,151-164 (156-159) 4. Maria Korzeniewska-Koseła: Postępowanie wobec osób z kontaktu z chorym na gruźlicę aktualne zalecenia dla krajów o małej częstości występowania gruźlicy i polska perspektywa. Medycyna Praktyczna 2011,2(240),37-49 5. Maria Korzeniewska-Koseła: Postępowanie wobec osób z kontaktu z chorym na gruźlicę. Zalecenia europejskie i polska perspektywa z uwzględnieniem zagadnień pediatrycznych. Medycyna Praktyczna Pediatria. 2011,6(78),34-44 6. Grzelewska-Rzymowska I., Korzeniewska-Koseła M., Kruczak K.: Gruźlica i mykobakteriozy. Choroby wewnętrzne. Stan wiedzy na 2010 rok. Red. A.Szczeklik. Wyd. Medycyna Praktyczna Kraków 2011,676-687 7. Borkowska D., Zwolska Z., Michałowska-Mitczuk D., Korzeniewska-Koseła M., Zabost A., Napiórkowska A., Kozinska M., Brzezińska S., Augustynowicz-Kopeć E.: Interferonowy test T-SPOT.TB w diagnostyce latentego zakażenia prątkiem gruźlicy. Pneumonol Alergol Pol 2011,79,4,264-271 8. Korzeniewska-Koseła M.: Gruźlica w Polsce w 2009 roku. Przegl Epidemiol 2011,65,301-305 9. Kuś J., Demkow U., Korzeniewska-Koseła M., Rabczenko D., Siemion-Szczesniak I., Białas-Chromiec B., Filewska M., Sapigórski P., Maciejewski J.: Ocena częstości występowania zakażenia prątkiem gruźlicy w populacji województwa mazowieckiego na podstawie wyniku testu mierzącego uwalnianie interferonu gamma po stymulacji swoistymi antygenami ESAT-6 i CFP-10. Pneumonol Alergol Pol 2011,79(6),407-418 48

Temat 3: BADANIA NAD PATOGENEZĄ, ROZPOZNAWANIEM I LECZENIEM CHORÓB NOWOTWOROWYCH KLATKI PIERSIOWEJ Kierownik tematu: prof. dr hab. n. med. Kazimierz Roszkowski-Śliż Zastępca tematu: prof. dr hab. n. med. Elżbieta Wiatr W mijającym roku w zakresie tematu zespoły badawcze zajmowały się zagadnieniami biologicznych właściwości raka płuca i innych nowotworów układu oddechowego, optymalizacji diagnostyki wstępnej i monitorowania wyników leczenia oraz optymalizacji samego leczenia. 3.1. Guzy zapalne płuc spektrum obrazów morfologicznych i korelacja z fenotypem immunohistochemicznym. W ciągu ostatniej dekady pseudoguz zapalny (inflamatory pseudotumor IPT) we wszystkich lokalizacjach przesunął się z grupy zmian odczynowych do nowotworowych. Zmiana ta dokonała się na podstawie głównie badań genetycznych jak również immunohistocemicznych i obserwowanych niekorzystnych przebiegów klinicznych. W ostatnim czasie klasyfikacja guzów zapalnych uległa zmianie. W edycji WHO z 2004 roku IPT płuc traktowane są jako grupa zmian o różnej etiologii, zarówno odczynowej jak i nowotworowej, natomiast o podobnym obrazie histologicznym. Mikroskopowo są to rozrosty z komórek miofibroblastycznych z towarzyszącym naciekiem zapalnym z komórek plazmatycznych, limfocytów i granulocytów kwasochłonnych. Z tej grupy guzów został wyodrębniony inflammatory myofibroblastic tumor IMT jako rozrost nowotworowy o łagodnym lub pośrednim stopniu złośliwości z odrębnym obrazem klinicznym, mofrologicznym i molekularnym. Grupa ta została wyróżniona w oparciu o prace wykazujące klonalną naturę proliferacji miofobroblastów. W 50-80% przypadków IMT u dzieci wykazano obecność antygenu ALK-1. W różnych opracowaniach autorzy powołują się także na obecność białka p53 oraz nieprawidłową ploidię DNA, głównie poliploidię. W opracowaniach dotyczących IMT opisano występowanie wznów w 25% przypadków poza płucnych oraz <2% płucnych. Na podstawie obrazu mikroskopowego wyróżniane są następujące podtypy guzów zapalnych: myksoidny/naczyniowy, zwarty wrzecionowatokomórkowy, ubogokomórkowy, włóknisty. Typ przypominający organizujące się zapalenie płuc został wyłączony z grupy IMT, gdyż jest procesem odczynowym w przebiegu zapalenia. Leczeniem z wyboru jest resekcja chirurgiczna i ewentualne dalsze leczenie oparte o środki sterydowe bądź niesterydowe przeciwzapalne oraz w rzadkich przypadkach chemioterapię. Na podstawie jedynie obrazu mikroskopowego prognoza jest trudna do przewidzenia. Celem badania była ocena wybranych parametrów histopatologicznych i immunohistochemicznych związanych z bardziej agresywnym przebiegiem guzów zapalnych oraz reklasyfikacja z obecnie obowiązującym podziałem. Badaną grupę stanowiły 21 przypadki rozpoznane jako IPT. Po reklasyfikacji zgodnie z nowymi zaleceniami w 9 49

przypadkach rozpoznano guz nowotworowy IMT, w pozostałych organizujący się proces zapalny. W przypadkach IMT podtyp zwarty wrzecionowatokomórkowy był najczęstszy 5 przypadków. Pozostałe podtypy myksoidny (2 przypadki) i ubogokomórkowy (2 przypadki) występowały z taką samą częstością. W żadnym przypadku nie ustalono rozpoznania przed zabiegiem operacyjnym.wykonane reakcje immunohistochemiczne wykazały, że badane guzy są zmianami zbudowanymi z komórek mioepitelialnych, stanowiących podstawowy element utkania W IMT stanowią element nowotworowy. Towarzyszą im komórki plazmatyczne i histiocytarne w różnych proporcjach. Komórki plazmatyczne są komórkami odczynowymi o poliklonalnej produkcji łańcuchów lekkich kappa i lambda. Obecność białka ALK1 i p53 wykazana odpowiednio w 4 i 8 przypadkach. Dodatnia reakcja przeciwciałem p53 oceniana ilościowo znaczyła 3-50% komórek. W dwóch przypadkach wystąpiły wznowy. W jednym z nich agresywny przebieg korelował z wysokimi odczynami MIB1 (15%) i p53(50%). W drugim przypadku odczyny MIB1 i p53 wynosiły odpowiednio 1% i 3%. Obecnie uważa się, iż wśród IPT płuc u dorosłych większość stanowią zmiany zapalne odczynowe. Gleason BC, Hornick JL w swojej pracy zwracają uwagę na istotne cechy histologiczne pozwalające rozróżnić IMT od zmian zapalnych. Badania immunohistochemiczne, zwłaszcza u dorosłych w średnim i starszym wieku, mają niewielkie znaczenie. Badanie obecności białka ALK1 jest pomocne, ale praktycznie tylko w przypadku guzów u dzieci. Badanie zostało zakończone. Wyniki badań będą opublikowane w artykule, który jest przygotowywany do druku. Piśmiennictwo: Coffin CM, Hornick JL, Fletcher CD. Inflammatory myofibroblastic tumor: comparison of clinicopathologic, histologic, and immunohistochemical features including ALK expression in atypical and aggressive cases. Am J Surg Pathol 2007;31:509 20. Gleason BC, Hornick JL. Inflammatory myofibroblastic tumours: where are we now?, J. Clin. Pathol. 61 (4) (2008) 428 437. 3.2. Ocena zmian mikroskopowych w rakach niedrobnokomórkowych płuca (NSCLC) po leczeniu chemioterapią neoadjuntową. W mijającym, 2011 roku zoperowano 12 raków płuca, wcześniej leczonych chemioterapią neoadjuwantową lub chemio-radioterapią. Wszystkie guzy oceniane były jak dotychczas pod kątem regresji nowotworu, zmian mikroskopowych, w oparciu o klasyfikację zaproponowaną przez Junkera i wsp. (Chest 120, 1584-1591, 2001). W badanej grupie było 8 mężczyzn, w wieku od 51 do 72 lat (średnia wieku 61,3) oraz 4 kobiety, w wieku od 54 do 67 lat (średnia wieku 57,3). W dwóch przypadkach chorzy otrzymali obok chemioterapii również radioterapię, w jednym chory otrzymał tylko radioterapię. W 4 przypadkach wykonano lobektomię (górną prawą -2, górną lewą -2), w 2 bilobektomię (usunięcie płata dolnego i środkowego), w 2 pneumonektomię prawostronną i w 4 pneumonektomię lewostronną. 50

Wśród usuniętych nowotworów rozpoznano 5 raków płaskonabłonkowych, 4 raki gruczołowe, 2 o utkaniu głównie brodawkowatym, w tym jeden z komponentem drobnobrodawkowatym, jeden lity, w 1 przypadku drobne ognisko raka gruczołowego znaleziono w węźle chłonnym. Jeden rak wykazywał utkanie złożone, płaskonabłonkowogruczołowe (adenosquamosum), 2 raki wielkokomórkowe neuroendokrynne. W 2 przypadkach stwierdzono naciek nowotworowy w marginesie chirurgicznym (R1-2). W jednym przypadku, u chorego po pulmonektomii, z usuniętym fragmentem worka osierdziowego widoczny był naciek raka w brzegu chirurgicznym naczyniowym oraz w worku osierdziowym. Rak wykazywał cechy różnicowania płaskonabłonkowego, z małymi zmianami zwyrodnieniowymi po leczeniu. U drugiego chorego, po bilobektomii, również z usuniętym fragmentem worka osierdziowego znaleziono naciek raka wielkokomórkowego neuroendokrynnego, przekraczający torebkę konglomeratu przerzutowo zmienionych węzłów z okolicy brzegu chirurgicznego oskrzela. Nie stwierdzono cech uszkodzenia komórek raka po leczeniu. Zatory w naczyniach limfatycznych (L1) stwierdzono w 4 przypadkach, w 6 przypadkach znaleziono zatory z komórek raka w naczyniach krwionośnych (V1). W 5 przypadkach stwierdzono naciekanie pasm włókien nerwowych. Średnica widocznego makroskopowo guza wynosiła od 1,3 do 9,5 cm, średnio 4,3 cm. W 3 przypadkach widoczne były nasilone zmiany wsteczne związane z leczeniem, głównie pod postacią rozlanego włóknienia podścieliska guza, z niewielkim fragmentem zachowanego utkania nowotworowego. W 2 przypadkach zmiany dotyczyły neoadjuwantowej chemioterapii w raku wielkokomórkowym neuroendokrynnym i płaskonabłonkwym, w 1 dotyczyły chorego z rakiem gruczołowym po radioterapii. W 3 przypadkach naciek nowotworowy zajmował opłucną płucną, bez jej przekraczania (pp2), w 5 przekraczał ciągłość opłucnej, w 3 naciekał osierdzie. W 2 przypadkach znaleziono dodatkowe ognisko raka (satelitarne). W 2 przypadkach stwierdzono zaawansowanie raka w stopniu IA, w 1 w stopniu IB, w 3 w stopniu IIA, w 6 w IIIA. W 3 przypadkach zmiany po leczeniu określono jako duże, z wyraźną remisją guza, z zaawansowanymi zmianami wstecznymi ze strony podścieliska. W 3 przypadkach zmiany miały średni stopień nasilenia, w 3 mały i w 3 nie stwierdzono cech uszkodzenia komórek po leczeniu. Zmiany po leczeniu klasyfikowano, jako dotyczące komórek guza, jego podścieliska (włóknienie, zwapnienia, ziarniniaki resorpcyjne, odczyn histiocytarny, złogi pylicze, obliteracja naczyń krwionośnych) lub obu komponentów. W zdecydowanej większości przypadków widoczna była przede wszystkim odpowiedź ze strony podścieliska nowotworu, pod postacią włóknienia, z nasiloną obliteracja światła naczyń krwionośnych. Martwica nie była cechą typową dla zmian związanych z leczeniem. W 2 przypadkach nie występowała, w pozostałych stanowiła od 5% do 60% przebadanej powierzchni nowotworu, średnio 18%. 51

We wszystkich przypadkach wykonywano barwienia histochemiczne (wykazujące istnienie śluzu śródcytoplazmatycznego) i immunohistochemiczne (TTF1, CK34BE12, p63) w celu potwierdzenia typu histologicznego raka. Stopień regresji zmian wg klasyfikacji Junkera i wsp. 2 rak płaskonabłonkowy G2 T1aN0L1V1R0 IA rak płaskonabłonkowy G3 T3N1L0V1R0 IIIA brak reakcji na leczenie lub niewielka 1 1 rak płaskonabłonkowy G2 T3N1L1V1R1 IIIA rak gruczołowy G2 T2N1L1V1R0 IIA rak płaskonabłonkowogruczołowy G3 T3N1L1V1R0 IIIA rak wielkokomórkowy neuroendokrynny G3 T3N2L0V0R1 IIIA IIa częściowa regresja, ponad 10% 1 rak gruczołowy G2 T2aN1L0V0R0 IIA rak gruczołowy G3 T3N1L0V1R0 IIIA rak płaskonabłonkowy G2 T1aN0L0V0R0 IA II b częściowa regresja z pozostawieniem poniżej 10%) 1 2 rak wielkokomórkowy neuroendokrynny G3 T2aN0L0V0R0 IB rak gruczołowy G2 T3N1L0V0R0 IIIA rak płaskonabłonkowy G2 T2aN1L0V0R0 IIA Raki niedrobnokomórkowe płuca po leczeniu neoadjuwantowym (2011) 12 przypadków M: 8; rozpiętość wieku: 51-72, śr. 61,3 Pneumonektomia prawostronna: 2 Pneumonektomia lewostronna: 4 Lobektomia górna prawa: 2 Lobektomia górna lewa: 2 Bilobektomia: 2 Lokalizacja guza: centralna: 7 K: 4; rozpiętość wieku: 54-67, śr. 57,3 obwodowa: 5 Średnica guza: 1,3 9,5 cm, śr. 4,3cm Typ histologiczny: rak płaskonabłonkowy: 5 52

rak gruczołowy: 4 rak wielokomórkowy neuroendokrynny: 2 rak płaskonabłonkowo-gruczołowy: 1 Stopień zaawansowania pt1an0 IA 2 pt2an0 IB 1 pt2an1 IIA 3 pt3n1, pt3n2 IIIA 6 3.3. Różnicowanie między łagodnym a złośliwym charakterem płynów z jam ciała przy użyciu cytometrii przepływowej. W ramach kontynuacji tematu spośród wszystkich 295 płynów z jamy opłucnej i osierdzia, które były poddane ocenie mikroskopowej w naszym Zakładzie w 2011 r., do badania w cytometrze przepływowym zakwalifikowano 32 przypadki (patrz Tab.1). 10 przypadków stanowiły płyny, w których we wcześniejszym badaniu mikroskopowym nie stwierdzono obecności komórek nowotworowych i które stanowiły ujemną kontrolę. W 20 płynach w ocenie mikroskopowej rozpoznano obecność komórek nowotworowych. Większość stanowiły pierwotne raki płuca, w tym 7 raków gruczołowych, 3 raki niskozróżnicowane, 1 rak płaskonabłonkowy i 4 raki niedronokomórkowe nieokreślonego typu. Pozostałe płyny nowotworowe pochodziły od pacjentów z przerzutami raków sutka (3 przypadki), jeden od pacjenta z międzybłoniakiem złośliwym i jeden od pacjanta z nieokreślonym nowotworem epitelioidnym (rakiem lub międzybłoniakiem). W 2 płynach z opłucnej, stwierdzono obecność nieprawidłowych komórek o niejednoznacznym charakterze i określono je jako atypowe. Tabela 1. Rodzaje materiałów poddanych analizie ROZPOZNANIA LICZBA BADAŃ kontrola ujemna 10 płyny nowotworowe: raki rak gruczołowe rak niskozróżnicowane rak niedrobnokomórkowy nieokreślonego typu rak płaskonabłonkowy raki przerzutowe międzybłoniak opłucnej nowotwór złośliwy epitelioidny (rak/międzybłoniak) komórki atypowe 2 20 15 7 3 4 1 3 1 1 53

Rozpoznania typów histologicznych nowotworów były ustalane na podstawie wyników reakcji immunohistochemicznych w materiale z bloczków parafinowych lub dodatkowo pobranych wycinków z opłucnej. W cytometrze przepływowym oceniano ploidię komórek przy użyciu jodku propidyny, a także ekspresję antygenów cytokeratynowych, CD45 (LCA), p53 i Ki67. W bieżącym roku dokupiono, zgodnie z harmonogramem badania ustalonym na ten rok, przeciwciała przeciwko CD45 oraz p53 i Ki-67 wraz z negatywnymi kontrolami, które stosowano celem uniknięcia wyników fałszywie dodatnich. Cytokeratyny oraz antygen CD45 ułatwiają identyfikację i odróżnienie komórek nabłonkowych lub mezotelialnych (prawidłowych i nowotworowych) od komórek odczynu zapalnego. Podwyższona ekspresja białka p53, a także wysoki indeks proliferacyjny wyrażony ekspresją Ki-67, przemawiają za nowotworowym charakterem wysięku. W większości płynów zawierających komórki raków oraz tzw. komórki atypowe wykryto obecność piku aneuploidalnego. W materiale pochodzącym od pacjenta z międzybłoniakiem otrzymano obraz charakterystyczny dla populacji diploidalnej. Na największe trudności techniczne natrafiono w ocenie płynów kontrolnych. Większość płynów z jam ciała uzyskanych od pacjentów bez choroby nowotworowej charakteryzuje się niewielką liczbą komórek, co utrudnia analizę, ponieważ brakuje reprezentatywnego materiału do oceny. Płyny pochodzące od pacjentów z nowotworem są zwykle bogatokomórkowe, ale istnieje ryzyko, że zawierają komórki raka nie wykryte w badaniu mikroskopowym, a więc nie są wiarygodną kontrolą negatywną. W części przebadanych przez nas w tym roku płynów kontrolnych, mimo braku komórek nowotworowych w badaniu mikroskopowym, uzyskano w badaniu cytometrycznym wynik aneuploidalny. Ponieważ były to przypadki pacjentów z rakiem w wywiadzie, można przypuszczać, że materiał ten nie był w pełni wolny od komórek nowotworowych. Ocena ekspresji p53 i Ki-67 wymaga dokładniejszej analizy, która będzie przeprowadzona na kolejnych etapach badania. We wstępnej analizie wyników nie wykryto istotnych różnic między obrazem w płynach kontrolnych i nowotworowych. 3.4. Ocena skuteczności skojarzonego leczenia niedrobnokomórkowego raka płuca w III (N 2 ) stopniu zaawansowania choroby. W roku 2011 leczono chirurgicznie z powodu niedrobnokomórkowego raka płuca 433 chorych. W okresie pooperacyjnym zmarło 5 chorych co stanowi 1,15%. Dominowała postać gruczołowa raka. Dokładny rozkład postaci histopatologicznych i stopień zaawansowania był następujący: 54

Tabela nr 1. HIST_PAT Total inny 4 ognisko ponowotworowe 1 rak drobnokomórkowy 3 rak gruczołowotorbielowaty (ca adenoides cysticum) 1 rak gruczołowy 150 rak mieszany (płaskonabłonkowy/gruczołowy) 25 rak płaskonabłonkowy 178 rak pleomorficzny 8 rak wielkokomórkowy 36 rakowiak atypowy 14 rakowiak typowy 9 Grand Total 429 W leczeniu skojarzonym standardem jest terapia pooperacyjna. Tabela nr 2. Stopień zaawansowania. STADIUM_NOWE Total 0 1 IA 69 IB 129 IIA 95 IIB 46 IIIA 86 IIIB 2 IV 1 Grand Total 429 55

Tabela nr 3. Wykaz operacji. RODZAJ OPERACJI Total BiLD - bilobektomia dolna 20 BiLG - bilobektomia górna 8 LŚ - lobektomia środkowa 15 LDL - lobektomia dolna lewa 55 LDP - lobektomia dolna prawa 75 LGL - lobektomia górna lewa 107 LGP - lobektomia górna prawa 101 Lingulectomia - res. języczka 1 Pleuropneumonektomia 1 PNL - pneumonektomia lewa 36 PNP - pneumonektomia prawa 11 Segmentektomia 2 Wycięcie mankietu oskrzela 1 Grand Total 433 Liczba pacjentów, którym podano chemioterapię pooperacyjną jest trudna do podania ponieważ nie wszyscy pacjenci zgłaszają się do tutejszej przychodni na kontrole. Przypuszczalnie ok. 40% pacjentów po lobektomii z cechą N1 otrzymało terapię adjuwantową. Z województwa mazowieckiego leczonych było ok. 75% pacjentów, 25% są to pacjenci z pozostałych województw. 56

Tabela nr 4. Województwo Łódzkie 13 Dolnośląskie 4 Kujawsko-pomorskie 6 Lubelskie 25 Lubuskie 1 Mazowieckie 323 Podkarpackie 3 Podlaskie 15 Pomorskie 1 Śląskie 26 Świętokrzyskie 2 Warmińsko-mazurskie 7 Wielkopolskie 7 Grand Total 433 3.5. Ocena wartości klinicznej wybranych czynników angiogennych u chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca. W 2011 roku kontynuowano zbieranie materiału do oznaczeń interleukiny 8 i osteopontyny metodą ELISA w surowicach i osoczach uzyskanych od chorych na raka niedrobnokomórkowego płuca leczonych chemioterapią zawierającą jako lek podstawowy cisplatynę. Wyniki dotychczasowych oznaczeń zebrano i przedstawiono w formie doniesienia zjazdowego i plakatu Serum levels of IL-8 and plasma levels of OPN in patients with nonsmall cell lung cancer during chemotherapy na Kongresie European Respiratory Society, który odbył się we wrześniu 2011r. Wstępne wyniki oznaczeń nie wykazały istotnego wpływu leczenia cytostatycznego na poziom Il-8 i OPN. Średnia wartość stężeń tych czynników wzrastała w przypadku progresji choroby, co może być związane z gorszym rokowaniem. Planowana jest kontynuacja badań w roku 2012. 57

3.6. Ocena wartości klinicznej wybranych molekularnych markerów nowotworowych u chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca. W roku 2011 kontynuowano badanie, którego celem badawczym jest ocena przydatności płynu z opłucnej do diagnostyki molekularnej raka płuca. Materiał i metody W poprzednim sprawozdaniu opisano metodykę i pomyślne wyniki izolacji kwasów nukleinowych, DNA i RNA z frakcji komórkowej płynu opłucnowego. W niniejszym badaniu genomowe DNA izolowane z płynów opłucnowych od 15 chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca (NDRP) wykorzystano do molekularnej oceny statusu genu EGFR z użyciem wysokoczułych technik fluorescencyjnych opartych na real-time PCR. Diagnostyka molekularna mutacji somatycznych EGFR oparta na sondach molekularnych i technice PCR w czasie rzeczywistym pozwala na osiągniecie wyższej niż w przypadku klasycznego sekwencjonowania kapilarnego czułości detekcji. Genotypowanie eksonu 21 genu EGFR przeprowadzono dwoma metodami: 1. przy użyciu sond hydrolizujących typu TaqMan (metoda pozwala na wykrycie zmutowanego allelu w próbce DNA nawet jeśli obecny jest w zaledwie 5% komórek w analizowanym fragmencie tkanki guza), 2. metodą PNA-LNA PCR clamp (metoda pozwala na bardzo wyraźne odróżnienie preparatów zawierających jedynie DNA typu dzikiego od tych, które zawierają nawet poniżej 1% zmutowanego allelu. Umożliwia to wykorzystanie tej metody do detekcji mutacji EGFR w heterogennych, zawierających niski odsetek komórek nowotworowych materiałach tkankowych i cytologicznych). Wyniki: W 13 próbach genomowego DNA izolowanego z płynów opłucnowych chorych na NDRP nie stwierdzono mutacji w eksonie 21 genu EGFR (mutacja L858R). Wyniki konwencjonalnej techniki real-time PCR opartej na użyciu sond hydrolizujących typu TaqMan zweryfikowano ultraczułą metodą PNA-LNA PCR clamp: obydwie metody potwierdziły dziki typ EGFR w badanych próbach, osiągając 100% zgodność. Badana cecha ekson 21 EGFR (mutacja L858R) Metoda Ilość oznaczeń pozytywne Wyniki negatywne Genotypowanie TaqMan 13 0 13 PNA-LNA PCR clamp 13 0 13 58

Wniosek: Pomimo powszechnego stosowania technik opartych na sondach hydrolizujących TaqMan w analizie mutacyjnej EGFR w materiałach tkankowych (świeżych, mrożonych lub utrwalanych w formalnie/parafinie), użycie techniki PNA-LNA PCR clamp może być uzasadnione w tych przypadkach diagnostyki chorego na NDRP, gdy dostępny jest jedynie materiał cytologiczny, np. płyn opłucnowy. Z uwagi na skąpą i zwykle niemożliwą do dokładnego oszacowania zawartość komórek nowotworowych w materiale stosowanie metody wzbogacającej allel zmutowany w próbie, o ile w niej występuje, skutkuje podwyższoną czułością detekcji. Wskazane jest dalsze zbieranie materiału i kontynuowanie niniejszych badań. 3.7. Stężenie rozpuszczalnego receptora dla interleukiny - 2 w surowicy krwi u chorych na raka płuca. W ramach tematu 3.7 w 2011 roku, w grupie 15 chorych na drobnokomórkowego raka płuca z oznaczonym stężeniem IL-2R w surowicy krwi pobranej przed rozpoczęciem leczenia cytostatykami, wykonano obliczenia statystyczne korelacji poziomu IL2R i czasu przeżycia. Nie stwierdzono żadnej uporządkowanej zależności miedzy czasem przeżycia i poziomem receptora IL2R. Współczynnik korelacji (liniowej) r=-0.172, I p- value = 0.573, wiec nie jest on statystycznie różny od zera (Pearson correlation). Ogólnie nie ma zależności miedzy poziomem receptora i czasem przeżycia. 3.8. Ocena skuteczności różnych skojarzeń leków cytostatycznych w chemioterapii niedrobnokomórkowego raka płuca-kontynuacja. W 2011 roku prowadzono obserwację chorych zakwalifikowanych do leczenia w latach poprzednich i prowadzono nabór nowych chorych z nieoperacyjną postacią niedrobnokomórkowego raka płuca do leczenia chemicznego. Jednocześnie kontynuowano badania nad znaczeniem różnicowania neuroendokrynnego raka płuca i wpływie tego zjawiska na wyniki leczenia. Łącznie oceniono ekspresję markerów neuroendokrynnych chromograniny A i synaptofizyny w wycinkach z guzów u 155 leczonych chorych. Dla lepszej oceny typu histologicznego wykonano również barwienia mucikarminem na obecność śluzu. Ekspresję badanych markerów neuroendokrynnych oceniano metodą półilościową i określono ją jako brak ekspresji, słabą ekspresję lub wyraźną ekspresję. W badanej grupie było 155 chorych w wieku od 26 do 74 lat. U wszystkich oceniono wstępnie stan sprawności w skali WHO 0-4. W stanie sprawności 0 było 12 chorych, w stanie sprawności 1 było 77 chorych, w stanie sprawności 2 było 60 chorych i w stanie sprawności 3 było 6 chorych. 59

Na podstawie rutynowych badań oceniających rozległość procesu chorobowego stwierdzono u 106 chorych stadium zaawansowania IIIB a u 49 chorych stadium zaawansowania IV. U wszystkich chorych prowadzono skojarzoną chemioterapię opartą na cisplatynie. Ocenę odpowiedzi na leczenie przeprowadzono po 2 kursach leczenia według ogólnie przyjętych zasad. W tabeli 1 przedstawiono ekspresję markerów neuroendokrynnych w zależności od typu histologicznego raka. Tabela nr 1. Typ histologiczny Razem Ekspresja markerów neuroendokrynnych Brak Słaba Wyraźna Rak gruczołowy 58 18 21 19 Rak płaskonabłonkowy 50 43 7 0 Rak wielkokomórkowy 4 3 0 1 Rak niedrobno komórkowy 26 17 6 3 Rak niedrobnokomórkowy źle zróżnicowany 17 2 3 12 Razem 155 (100%) 83(53.5%) 37(23.9%) 35(22.6%) Wyraźną ekspresję badanych markerów neuroendokrynnych stwierdzono ogółem u 35 spośród 155 chorych, co stanowi 22.6%, słabą u 37 chorych (23.9%) a brak ekspresji u 83 (53.5%) w grupie 155 chorych. Brak ekspresji wykazywało większość raków płaskonabłonkowych 86%, natomiast wyraźną ekspresję markerów neuroendokrynnych stwierdzono w 70,5% przypadków raka niedrobnokomórkowego źle zróżnicowanego. Ponadto wykonano dodatkowe barwienia na śluz, co pozwoliło na dokładniejszą ocenę typu histologicznego. W badanej grupie rozpoznano raka gruczołowego u 58/155 (37.4%) chorych. Bez tego barwienia u większości z tych chorych rozpoznawano niedrobnokomórkowego raka płuca. W tabeli 2 przedstawiono wyniki leczenia w zależności od zróżnicowania neuroendokrynnego raka. 60

Tabela nr 2. Ekspresja markerów neuroendokrynnych Razem Odpowiedź na leczenie PR SD PD Brak 83 26 42 15 Słaba 37 10 22 5 Wyraźna 35 14 14 7 Razem 155 50 78 27 W badanej grupie u żadnego chorego nie stwierdzono całkowitej regresji zmian, u 50 chorych wyniki leczenia oceniono jako częściową regresję zmian, u 78 chorych stwierdzono stabilizację a u 27 chorych rozpoznano progresję po 2 kursach leczenia. Nie zaobserwowano wyraźnej zależności stopnia odpowiedzi na leczenie od różnicowania neuroendokrynnego raka w poszczególnych grupach. U 102 obserwowanych chorych możliwa była ocena czasu przeżycia. W grupie chorych w stadium zaawansowania IIIB mediana czasu przeżycia była 11 miesięcy a w grupie chorych w stadium zaawansowania IV 6 miesięcy. W obserwowanej grupie 102 chorych wyraźną ekspresję markerów neuroendokrynnych obserwowano jedynie u 20 co nie pozwoliło na ocenę ewentualnego wpływu zróżnicowania neuroendokrynnego na przeżycie leczonych chorych. Badanie będzie kontynuowane w następnym roku na większej grupie chorych. 3.9. Ocena skuteczności chirurgicznego leczenia niedrobnokomórkowego raka płuc. W okresie od stycznia do końca grudnia 2011 wykonano 433 resekcje miąższu płucnego z powodu pierwotnego raka płuca. Gromadzono informacje dotyczące stopnia zaawansowania raka, rozległości wykonanej resekcji i częstości występowania powikłań pooperacyjnych. 61

RODZAJ HIST-PAT L % rak gruczołowy 150 34,9 rak płaskonabłonkowy 178 41,5 rak wielkokomórkowy 36 8,4 rak mieszany (płaskonabłonkowy/gruczołowy) 25 5,8 rakowiak atypowy 14 3,2 rak pleomorficzny 8 1,9 rakowiak typowy 9 2,1 ognisko ponowotworowe (po Ctx) 1 0,2 rak drobnokomórkowy 3 0,7 rak gruczołowotorbielowaty (adenoides cysticu) 1 0,2 Inny 4 0,9 RAZEM 429 100 RODZAJ OPERACJI L % LGP - lobektomia górna prawa 101 23,3 LGL - lobektomia górna lewa 107 24,8 LDL - lobektomia dolna lewa 55 12,7 LDP - lobektomia dolna prawa 75 17,3 PNP - pneumonektomia prawa 11 2,5 PNL - pneumonektomia lewa 36 8,3 BiLD - bilobektomia dolna 20 4,6 LŚ - lobektomia środkowa 15 3,4 BiLG - bilobektomia górna 8 1,8 Segmentektomia 2 0,5 Wyc. Mankietu oskrzela 1 0,2 Pleuropneumonektomia 1 0,2 Resekcja języczka 1 0,2 RAZEM 433 100 62

STADIUM ZAAWANSOWANIA (stary system) 0 IA IB IIA IIB IIIA IIIB IV Liczba 1 64 165 12 103 58 18 7 429 % 0,2 14,9 38,5 2,8 24,0 13,5 4,2 1,6 100 * 1 x stadium O (T is) STADIUM ZAAWANSOWANIA TNM (nowy system) 0 IA IB IIA IIB IIIA IIIB IV Liczba 69 129 95 46 86 2 1 429 % 16,1 30,1 22,1 10,7 20 0,5 0,2 100 W powyższych tabelach przedstawiono charakterystykę operowanych pacjentów obejmującą rodzaj wykonanych operacji, rozpoznanie histopatologiczne oraz stadium zaawansowania. Zarejestrowano 5 zgonów szpitalnych. W 2011r kontynuowano biopsję igłową węzłów chłonnych śródpiersia drogą fiberobronchosonografi (EBUS). W przypadku uzyskania wyniku dodatniego (meta w węzłach chłonnych śródpiersia) odstępowano od wykonania mediastinoskopii. Na tej podstawie ustalano stopień zaawansowania raka płuca jako N2 i kierowano chorego do leczenia zachowawczego (chemio/radioterapia). W równie szerokim zakresie stosowano badanie PET-CT w celu oceny rozległości zmian nowotworowych (zajęcie węzłów chłonnych, zmiany satelitarne). Wartość obu w/w metod diagnostycznych a co za tym idzie możliwość rezygnacji z metod inwazyjnych nadal wymagają analizy. 3.10. Nowotwory neuroendokrynne płuc analiza czynników prognostycznych i predykcyjnych w guzach resekowanych operacyjnie. W mijającym roku w Zakładzie Patomorfologii, wśród pierwotnych nowotworów płuca leczonych operacyjnie rozpoznano 27 rakowiaków, w tym 9 przypadków rakowiaka typowego (TC) i 17 rakowiaka atypowego (AC). U jednego chorego stwierdzono współwystępowanie TC i AC. 63

Analizę przypadków TC i AC z roku 2011 przedstawiono w tabeli. Rakowiaki typowe (TC) Rakowiaki atypowe (AC) Rakowiak typowy i atypowy Rakowiaki typowe Rakowiaki atypowe 9 17 Kobiety: 8 - wiek od 33 do 77, śr. 54 l Mężczyźni: 1; 66 l Położenie centralne: 8 obwodowe: 1 Wielkość guza: od 0,9 do 3,2 cm, średnio 1,8 cm Lobektomia: 7 Pneumonektomia: 1 Resekcja oskrzela: 1 Stopień zaawansowania: pt1an0; IA - 4 przypadki 1 pt1bn0; IA - 2 przypadki pt2an0; IB - 2 przypadki pt2an1; IIA - 1 przypadek Zatory z komórek raka w naczyniach chłonnych (L) - 1 przypadek Zatory z komórek raka w naczyniach krwionośnych (V) - 0 przypadków Naciekanie pasm włókien nerwowych - 2 przypadki Zmiany zapalne w miąższu płuca - 2 przypadki Naciekanie opłucnej płucnej (PP) - 1 przypadek Kobiety: 11, wiek od 30 do 80, śr. 50 l Mężczyźni: 6, wiek od 18 do 66, śr. 46,5 l Położenie centralne: 14, obwodowe: 3 Wielkość guza: od 1,2 do 4,7 cm, średnio 2,3 cm Lobektomia: 14 Pneumonektomia: 1 Segmenetektomia: 1 Bilobektomia: 1 Stopień zaawansowania: pt1an0; IA - 4 przypadki pt1bn0; IA - 2 przypadki pt2an0; IB - 9 przypadków 64

pt1bn2; IIIA - 1 przypadek pt2an2; IIIA - 1 przypadek Zatory z komórek raka w naczyniach chłonnych (L) - 4 przypadki Zatory z komórek raka w naczyniach krwionośnych (V) - 3 przypadki Naciekanie pasm włókien nerwowych - 5 przypadków Hyperplazja kk neueroendokrynnych 3 przypadki Naciekanie opłucnej płucnej - 1 przypadek Rakowiak typowy i atypowy Kobieta: 1; 79 l Położenie: centralne Segmentektomia Wielkość guzów: TC: 0,8; AC: 2,5 Stopień zaawansowania pt1bn0; I A Zatory z komórek raka w naczyniach krwionośnych (pv1) Hyperplazja komórek NE W żadnym spośród TC nie stwierdzono nacieku nowotworowego w marginesie chirurgicznym oskrzela i naczyniowym, tylko w 1 przypadku znaleziono naciekanie opłucnej płucnej, bez jej przekraczania. Współczynnik proliferacji oznaczany Ki67 wynosił od 2% do 10%, średnio 4%. W żadnym przypadku nie stwierdzono dodatniej reakcji z TTF-1 ani CD117. We wszystkich przypadkach reakcja IHC z markerami neuroendokrynnymi była wybitnie dodatnia. W żadnym przypadku nie stwierdzono współistniejącej hyperplazji komórek neuroendokrynnych. W grupie rakowiaków atypowych w 1 przypadki stwierdzono naciek nowotworowy w marginesie chirurgicznym oskrzela (R1), w 1 przypadku naciekanie opłucnej płucnej bez jej przekraczania. W 3 przypadkach widoczne były zatory nowotworowe w naczyniach krwionośnych i w 4 przypadkach w naczyniach limfatycznych. Współczynnik proliferacji wynosił od 1% do 30%, średnio 8,1%. Dodatnią, słabą reakcję z TTF-1 stwierdzono w 4 przypadkach, w tym w 2 zlokalizowanych obwodowo. W 6 przypadkach reakcja z CD117 była dodatnia. Porównanie TC i AC wykazuje częstsze występowanie obu rozrostów wśród kobiet. AC częściej związane są z przerzutami w węzłach chłonnych, nawet N2, z zatorami w naczyniach limfatycznych i krwionośnych. W AC zwraca uwagę zwiększony współczynnik proliferacji i sporadycznie słabo dodatnia reakcja z TTF-1, której nie wykazano w żadnym przypadki TC. 65

Aktualnie liczba rakowiaków płuca operowanych w IGiChP wynosi 228 przypadków. Rezultatem dotychczasowego opracowywania nowotworów neuroendokrynnych płuca jest praca oryginalna na temat Hiperplazja reaktywna i rozlany samoistny rozrost komórek neuroendokrynnych (DIPNECH) w płucach, którą przekazano do oceny współautorom. 3.11. Ocena czynności płuc u chorych kwalifikowanych do zabiegu operacyjnego z powodu raka płuc. W roku 2011 kontynuowano zadanie badawcze w zakresie oceny czynności płuc u chorych z rozpoznaniem raka płuca. W kwalifikacji do leczenia operacyjnego chorych z rozpoznaniem raka płuca badania czynnościowe płuc są jednym z ważnych elementów ewaluacji. Ocena taka pozwala oszacować ryzyko okołooperacyjne, w szczególnych zaś przypadkach może mieć wpływ na modyfikowanie zakresu resekcji. W oparciu o zakres planowanego leczenia (liczba resekowanych segmentów) i wynik badania bronchofiberoskopowego możliwe jest wyliczenie przewidywanych wartości pooperacyjnych wskaźników czynnościowych (ppofev 1, ppodl CO ). Jednak zgodność tych estymacji z realnymi wartościami wskaźników czynności płuc po resekcji jest nadal przedmiotem dyskusji. Celem prowadzonego badania jest ocena czynności płuc u chorych z rozpoznaniem raka płuca i ewaluacja zmian w pooperacyjnej ambulatoryjnej obserwacji. Analiza została zaprojektowana jako prospektywne badanie chorych zakwalifikowanych do leczenia operacyjnego, ocenianych w warunkach Poradni Chirurgicznej IGiChP na kolejnych wizytach w 3, 6 i 12 miesięcy po resekcji aktualne wyniki dotyczą pierwszych dwóch wizyt po hospitalizacji czyli 3 i 6 miesięcy. Chorzy, u których włączano inne formy terapii radioterapię, chemioterapię jako potencjalnie wpływające na czynność układu oddechowego nie byli włączeni do analizy. Również pacjenci, u których wystąpiły płucne powikłania okołooperacyjne lub pooperacyjne (zapalenie płuc, niedodma, krwotok, konieczność reoperacji) nie zostali włączeni do analizowanej grupy w niniejszym opracowaniu. Po uwzględnieniu kryteriów wyłączenia dalszemu opracowaniu poddano grupę 42 kolejnych chorych, z potwierdzonym histopatologicznie rozpoznaniem niedrobnokórkowego raka płuca, w tym 23 mężczyzn. Średni wiek w analizowanej grupie wynosił 64,3 ± 8,8 lat. Dwudziestu trzech chorych było aktualnymi lub byłymi palaczami, z ekspozycją na dym papierosowy wynoszącą 44,8 ± 28,7 paczkolat. U 39 pacjentów wykonano lobektomię, u 3 pneumonektomię. U 10 chorych stwierdzono w spirometrii wyjściowej cechy obturacji oskrzeli (FEV1%FVC < DGN), średnie wyniki dla całej grupy przedstawiono w tabeli 1. 66

Tabela nr 1. N 42 Płeć M/K 23/19 Wiek (lata) 64,3±8.8 FEV 1 L (% nal.) 2,36±0,49 (88,0±18,3) FVC L (% nal.) 3,45±0,86 (101,6±18,0) FEV1%FVC 69,2±9,5 FEV1%VC < LLN 10 (23,8%) Przy kwalifikacji do leczenia operacyjnego, w oparciu o zakres planowanej resekcji i wynik FOB, wyliczano przewidywaną wartość pooperacyjną FEV 1 (ppofev1) dla każdego pacjenta korzystając z wzoru: ppofev1 = FEV1 act x (19- n res/19- n obt) Tabela nr 2. Przed ppo 3 m-ce 6 m-cy FEV1 L 2,36±0,49 1,93±0,55 1,79±0,45 1,84±0,47 FEV1 (%) 88,0±18,3 73,1±18,3 67,2±18,6 68,9±18,1 r 0,72* 0,76* W tabeli 2 przedstawiono wartości wyjściowe FEV1 w całej grupie, przewidywane wartości pooperacyjne oraz wartości zmierzone w czasie kolejnych wizyt ambulatoryjnych 3 I 6 miesięcy po leczeniu operacyjnym. Uwzględniono także korelację między przewidywanymi wartościami pooperacyjnymi FEV1 a zmierzonymi w trakcie kolejnych wizyt. W analizowanej grupie nie było osób, które w zakresie ppo FEV1 znalazłyby się poniżej progu 30% wartości należnej (zalecenia ERS/ESCS 2009), oznaczającej wysokie ryzyko powikłań okołooperacyjnych. Średnie wartości FEV1 w badaniu wykonanym w 3 i 6 miesięcy po operacji wynosiły odpowiednio 1,79±0,45 L (67,2±18,6%) i 1,84±0,47 L (68,9±18,1%). Dla uzyskanych pomiarów wykazano istotną statycznie korelację z ppofev 1 (1,93±0,55 L, 73,1±18,3%), która wyniosła 0,72 i 0,76 odpowiednio dla badania po 3 i 6 miesiącach od operacji (ryc. 1). 67

2,8 ppofev 1 vs. 1 FE V 1 r =,72188 3,2 ppofev 1 vs. vi sit II FEV 1 r =,7617 2,6 3,0 2,4 2,8 2,2 2,6 visit I FEV 1 [L] 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 visit II FEV 1 [L] 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,0 1,2 0,8 1,0 0,6 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 0,8 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 ppofe V 1 [L] 95% p.ufności ppo FEV 1 [L] 95% p.ufności Tematyka i wyniki badań prowadzonych w ramach zadania badawczego Ocena czynności płuc u chorych kwalifikowanych do zabiegu operacyjnego z powodu raka płuca, zostały zaprezentowane w postaci doniesień wstępnych na następujących konferencjach naukowych: Spotkanie Polskiej Grupy ERS Szczyrk 2011 Ocena czynności płuc chorych po leczeniu operacyjnym raka płuca w kontroli ambulatoryjnej. Doniesienie wstępne. Monika Franczuk, Jerzy Usiekniewicz, Piotr M. Rudziński, Stefan Wesołowski, Tadeusz M. Orłowski. Kongres European Respiratory Society Amsterdam 2011 Postoperative predicting value of lung function indices - fortune-telling or reality? Evaluation patients with NSCLC after surgical treatment. Preliminary report. Monika Franczuk, Jerzy Usiekniewicz, Piotr M. Rudzinski, Stefan Wesołowski, Tadeusz M. Orłowski. 3.12. Przydatność oznaczania markerów nowotworowych w płynie osierdziowym w diagnostyce wysiękowego zapalenia osierdzia. W roku 2011 rozpoczęto prospektywną walidację opisanej w 2010 roku skali punktowej oceniającej prawdopodobieństwo nowotworowego wysięku osierdziowego u chorych leczonych zabiegowo z powodu zagrażającej tamponady serca. Według krzywej ROC optymalny punkt odcięcia w celu rozpoznania nowotworowego zapalenia osierdzia wynosił 3 pkt (81% czułości i 95% swoistości). Do badania włączono w 2011 roku 6 chorych: 4 kobiety i 2 mężczyzn w wieku 22-74 lat. W 3 przypadkach chorych poddano perikardioskopii, w pozostałych perikardiocentezie. Oceniono prawdopodobieństwo nowotworowego zapalenia osierdzia na podstawie skali punktowej opisanej w 2010 roku. 68

BADANI CHORZY KM ZK LJ CK WK AJ TK klp ww. chłonne >1cm tak (1 pkt) 1-2 1 1-2 -2 nie (-2 pkt) Tachykardia >90/min tak (1 pkt) -1 1 1 1-1 -1 nie (-1 pkt) Zagraż. tamponada (echo) tak (1 pkt) -1 1 1 1 1-1 nie (-1 pkt) Krwisty płyn tak (1 pkt) 1-2 1 1-2 -2 nie (-1 pkt) CEA (ng/ml) płyn >5 (3 pkt) 0 3 3-1 3-1 <5 (-1 pkt) Cyfra (ng/ml) płyn >95(3 pkt) 35.5-95(2 pkt) 2-1 2 2-1 3 <35.5 (-1 pkt) Razem pkt. 2 3 9 5-2 -1 Rozpoznanie neo susp neo neo neo łag łag W 3 przypadkach rozpoznano nowotworową etiologię wysięku osierdziowego na podstawie badania cytologicznego płynu i/lub na podstawie nacieku nowotworowego w wycinku pobranym z worka osierdziowego. W 1 przypadku rozpoznano najprawdopodobniej nowotworowy wysięk osierdziowy (chory z negatywnym wynikiem badania cytologicznego płynu osierdziowego, u którego rozpoznano raka niedrobnokomórkowego płuca prawego). W 2 przypadkach rozpoznano łagodne zapalenie osierdzia. Przeprowadzona wstępna weryfikacja skali punktowej wykazała jej wysoką przydatność w prognozowaniu nowotworowego wysięku osierdziowego. Wszyscy chorzy z nowotworowym zapaleniem osierdzia uzyskali >=3 pkt, 1 chory z podejrzeniem 69

nowotworowego zapalenia osierdzia -2 pkt, 2 chorych z łagodnym zapaleniem osierdzia -1 pkt i -2 pkt. Na podstawie wstępnych wyników walidacji w/w skali punktowej zadecydowano o konieczności dalszej jej weryfikacji w następnych latach obserwacji. Opracowano doniesienie zjazdowe na 14 Światowy Kongres Raka Płuca organizowany przez IASLC w dniach 3-7 lipca 2011 w Amsterdamie: Szturmowicz M., Pawlak-Cieślik A., Fijałkowska A., Kupis W., Langfort R., Błasińska K., Broniarek-Samson B., Gralec R., Skoczylas A., Tomkowski W.: Metastatic pericardial involvement as the first sign of neoplastic disease diagnostic significance of mediastinal lymph nodes enlargement on chest CT and increased tumor markers concentration in pericardial fluid. J. Thorac. Oncol. 2011; 6(suppl 2): 1126 3.13. Zastosowanie wybranych markerów nowotworowych dla oceny odpowiedzi na leczenie i rokowania u chorych na raka płuca. W roku 2011 oceniano znaczenie rokownicze wstępnego surowiczego stężenia CEA, Cyfra 21-1, ferrytyny a także CRP u chorych na operacyjnego niedrobnokomórkowego raka płuca w obserwacji pięcioletniej. Badana grupa: 47 chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca 36 mężczyzn, 11 kobiet, mediana wieku 63 lata (42-78) Podtyp histologiczny: Gruczolakorak 24 chorych, Rak płaskonabłonkowy 15 chorych Typ mieszany (adenosquamous) 3 chorych Rak wielkokomórkowy 3 chorych Bez określenia podtypu (nonmicro) 3 chorych Stężenie CEA, Cyfra 21-1 i Ferrytyny w surowicy - Elecsys Roche Stężenie CRP w surowicy Roche Hitachi Leczenie operacyjne: lobektomia 40 chorych bilobektomia 2 chorych pneumonektomia 4 chorych czas obserwacji 60 miesięcy Odsetki chorych przeżywających 2 lata, 3 lata, 4 lata i 5 lat w badanej grupie wynosiły odpowiednio: 70%, 56%, 51% i 50%. 70

Tabela nr 1. Znaczenie rokownicze przedoperacyjnego surowiczego stężenia CEA i Cyfra 21-1 Przeżycie m-ce CEA (ng/ml) Mediana (zakres) Cyfra 21-1 (ng/ml) mediana (zakres) <60 m-cy 3.17 (0.87-72.7) 2.27 (0.8-7.6) >= 60 m-cy 2.46 (1-30.9) 1.9 (0.7-6.2) p ns ns Tabela nr 2. Znaczenie rokownicze wstępnego surowiczego stężenia ferrytyny i CRP. Przeżycie m-ce Ferrytyna (ng/ml) CRP (mg/l) Mediana (zakres) mediana (zakres) <60 m-cy 229 (26.3-535.5) 23.0 (0.0-122.6) >= 60 m-cy 162 (27.13-698.3) 4.1 (0.0-65.8) p ns <0.05 Rokownicze znaczenie przedoperacyjnego stężenia CRP u chorych poddanych leczeniu operacyjnemu z powodu niedrobnokomórkowego raka płuca w obserwacji 5 letniej. 120 100 PRZEŻYCIE 80 60 40 20 CRP<10 CRP>10 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 MIESIĄCE P=0.02 Wśród chorych poddanych leczeniu operacyjnemu z powodu niedrobnokomórkowego raka płuca obserwowano istotnie dłuższe lepsze rokowanie odległe w grupie, której przedoperacyjne stężenie CRP było niższe niż 10 mg/l niż u pozostałych. 71

Przedoperacyjne stężenie antygenu rakowopłodowego oraz fragmentów cytokeratyny 19 w surowicy nie posiadało znaczenia rokowniczego w obserwacji odległej (5 lat). Jakkolwiek obserwowano niższe stężenie ferrytyny w grupie chorych, którzy przeżyli 5 lat od operacji niż w grupie chorych, którzy zmarli w tym czasie, to jednak z uwagi na duże zróżnicowanie wartości tego parametru, obserwowana różnica nie była istotna statystycznie. 3.14. Raki płuca z pleomorficznymi, sarkomatoidalnymi lub sarkomatycznymi elementami (CPSS) Korelacja kliniczno-patologiczna. Ocena immunofenotypu i markerów biologicznych (badania retro i prospektywne). W mijającym roku 2011 w materiale operacyjnym ocenianym w Zakładzie Patologii rozpoznano 9 raków z grupy sarcomatoid carcinoma, w tym było 7 raków pleomorficznych, 1 olbrzymiokomórkowy (carcinoma gigantocellulare) i 1 carcinosarcoma. W jednym przypadku wykonano pulmonektomię, w pozostałych lobektomię. W 2 przypadkach lobektomię poszerzono o resekcję fragmentu przepony (1 przypadek) i fragment ściany klatki piersiowej z żebrami (1 przypadek). Wśród operowanych chorych było 5 mężczyzn, w wieku od 54 do 70 lat, średnia wieku 64,6 i 4 kobiety w wieku od 47 do 67 lat, średnia wieku 58,8 lat. Sześć guzów było zlokalizowanych obwodowo, trzy centralnie. Średnica guzów kształtowała się od 15 mm do 70 mm, średnio 50 mm. We wszystkich przypadkach oceniano rozległość martwicy nowotworowej, istnienie zatorów w naczyniach chłonnych i krwionośnych, naciekanie pasm włókien nerwowych, naciekanie opłucnej płucnej oraz elementy utkania histologicznego, stopień zaawansowania. Wyniki przedstawiono w tabeli. 72

Raki sarkomatyczne 9 Pulmonektomia lewostronna 1 Lobektomia górna prawa 2 Lobektomia dolna lewa 3 Lobektomia dolna prawa 2 Lobektomia górna lewa 1 Rozległość martwicy 29% (0-65%) Zatory w naczyniach krwionośnych 4 Zatory w naczyniach chłonnych 2 Przerzuty w węzłach chłonnych N1 Naciekanie opłucnej P2 P3 (płucnej i ściennej) Komponent utkania histologicznego rak płaskonabłonkowy rak gruczołowy złożony z kilku komponentów: wielkokomórkowy, olbrzymiokomórkowy, gruczołowy rak olbrzymiokomórkowy rak z komponentem heterologicznym mięsaka 2 2 4 3 1 5 1 1 1 1 pt1an0 ; pt2an0; pt2bn0; pt2an1; pt2bn1; pt3n0; IA IB IIA IIA IIB IIB 1 2 1 1 1 3 We przebadanych rakach stwierdzono utkanie pleomorficzne, w 5 przypadkach zawierające komponent raka płaskonabłonkowego, w 1 gruczołowego, w 1 złożonego z kilku komponentów; wielkokomórkowego, olbrzymiokomórkowego i gruczołowego litego, w 1 73

przypadku rak wykazywał utkanie olbrzymiokomórkowe i w 1 złożone z raka i płaskonabłonkowego z elementami heterologicznymi mięsaka (carcinosarcoma). W każdym przypadku wykonywano wykonano reakcje immunohistochemiczne z cytokeratyną, wimentyną, TTF1. We wszystkich przypadkach widoczna była koekspresja cytokeratyny (CKAE1/AE3) z wimentyną. W żadnym przypadku w badaniu mikroskopowym nie stwierdzono nacieku raka w brzegu chirurgicznym oskrzela. W 1 przypadkach zabieg chirurgiczny wymagał usunięcia fragmentu ściany klatki piersiowej, w 1 fragmentu przepony. W żadnym przypadku nie stwierdzono naciekania pasm włókien nerwowych, natomiast w 4 przypadkach znaleziono zatory z komórek raka w naczyniach krwionośnych, w 2 w naczyniach chłonnych. Aktualna liczba raków z grupy sarcomatoid carcinoma, ocenianych w Zakładzie Patologii od 2000 roku wynosi 73. Raki te należą do rzadkiej grupy pierwotnych nowotworów nabłonkowych płuca, w związku z tym niewiele jest publikacji dotyczących ich rokowania, ewentualnego dalszego leczenia, dlatego wydaje się istotna korelacja czasu przeżycia chorych z rakami o różnicowaniu sarkomatoidnym. Badanie będzie kontynuowane w 2012 roku. 3.15. Ocena stężeń wybranych czynników pro- i antyangiogennych oraz ocena aktywności angiogennej guza u chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca leczonych metodą skojarzoną. W niniejszym projekcie podjęto próbę zweryfikowania przydatności klinicznej analizy wybranego panelu markerów molekularnych w diagnostyce niedrobnokomórkowego raka płuca (NDRP) obecnych we krwi obwodowej, przede wszystkim stopnia nieprawidłowej metylacji promotora genu APC (adenomatous polyposis coli), promotora genu p16 INK4a oraz RASSF1A (Ras association domain family 1a). Zjawisko metylacji DNA stanowi ważny mechanizm regulacji ekspresji genów zaangażowanych zarówno w procesy rozwoju choroby nowotworowej (onkogeny) jak i naturalne mechanizmy kontroli apoptozy i proliferacji komórek oraz przeciwdziałania ich kanceryzacji (geny supresorowe). Techniki analizy metylacji genów, rozwinięte w ostatniej dekadzie, stosuje się powszechnie w badaniach naukowych wykorzystujących tkanki guza uzyskane w trakcie zabiegu operacyjnego (resekcja) lub biopsji. Dotychczas dowiedziono, że metylacja genów jest jednym z najwszcześniejszych zjawisk molekulranych zachodzących w procesie nowotworzenia. Materiał i Metody: Badania prowadzono na grupie 15 chorych na NDRP oraz 15 zdrowych ochotników. Izolacja DNA z osocza była wykonywana za pomocą standardowych zestawów zgodnie z zaleceniami producenta. Celem konwersji niemetylowanych nukleotydów cytozyny do uracylu (metylowana cytozyna nie podlega zmianie), DNA (2 ug) będzie poddane działaniu 0.2 M NaOH przez 10 w temp 37 0 C. Następnie po dodaniu odpowiednich ilości 10mM hydrochinonu (30ul) i 3M dwusiarczku sodu (ph 5.0) (520ul) inkubowane będzie przez 16 godzin w temp 50 0 C, oczyszczone, oddane działaniu 0.3 NaOH, precypitacji w alkoholu. a 74

następnie rozpuszczone w 30 ul H 2 O. W celu detekcji wariantów metylacji genów badanych zastosowano technikę real-time PCR w oparciu o startery i sondy fluorescencyjne. Wyniki: Nie wykazano cech metylacji któregokolwiek z badanych genów w materiale izolowanym z krwi obwodowej pacjentów ani osób zdrowych. Wnioski: Niska frekwencja detekcji metylowanych wariantów genów w osoczu wynikają przede wszystkim z trudności metodologicznych związanych z analizą tego zjawiska. Pomimo wyboru najczulszego zestawu do konwersji DNA (Qiagen, 1 ng 2 ug DNA) oraz powszechnie stosowanej techniki real-time PCR do detekcji śladowych ilości materiału genetycznego, stopień amplifikacji DNA po konwersji był bardzo niski. Sądzimy, że wzmocnienie sygnału poprzez dodatkowy etap amplifikacji, taki jak w nested PCR, umożliwiłoby skuteczna detekcję metylowanego DNA w osoczu. Technika Real-time PCR z użyciem sond fluorescencyjnych rzadko bywa wykonywana w formacie nested. Konieczne są dalsze badania nad optymalizacją metody detekcji metylowanego DNA w osoczu. 3.16. Wartość rokownicza zawartości DNA w komórkach zlokalizowanych guzów włóknistych opłucnej LFTs. W mijającym, 2011 roku kontynuowano zadanie badawcze według metody ustalonej w poprzednich latach. W badaniu mikroskopowym określano komórkowość guza, atypię komórkową i liczbę figur podziału, cechy mikroskopowe podścieliska (obrzęk, włóknienie, szkliwienie) oraz łożyska naczyniowego, rozległość pól martwicy, a także inwazyjność rozrostu w stosunku do otaczających tkanek. Kontynuowano ocenę reakcji immunohistochemicznych z przeciwciałami przeciwko cytokeratynie AE1/AE3, wimentynie, CD34, CD117, mezotelium, S-100, desminie, CD99 oraz Bcl-2. Indeks proliferacyjny guza oceniano w reakcji z przeciwciałem przeciwko Ki-67 (Mib-1) określając liczbę dodatnich jąder komórkowych na 1000 badanych komórek. W utworzonej w ubiegłych latach bazie danych, sukcesywnie uzupełniano informacje zebrane z historii chorób dotyczące charakteru i czasu trwania objawów klinicznych, okoliczności rozpoznania choroby, chorób towarzyszących, zastosowanego leczenia. W sumie przebadano dziewięć nowych przypadków. Rozpoczęto również wstępną ocenę wyników badań cytometrycznych zawartości DNA w komórkach nowotworowych w przypadkach przebadanych w ubiegłych latach. 3.17. Ocena przydatności reakcji immunohistochemicznych w diagnostyce różnicowej odczynowego i nowotworowego rozrostu międzybłonka. W ramach tematu 3.17 w roku sprawozdawczym zebrano materiał histologiczny rozmazy z osadu uzyskiwanego podczas odwirowywania płynu opłucnowego w cytowirówce oraz bloczki parafinowe wykonane z pozostałej części materiału po utrwaleniu formaliną. W Zakładzie Patomorfologii Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc w roku 2011 zbadano 320 płynów z opłucnej. W 79 przypadkach wykonano barwienia immunohistochemiczne na preparatach specjalnie do tego celu odwirowanych w cytowirówce. Standardowo wykonywane były reakcje z przeciwciałami wykorzystywanymi w ubiegłym roku - EMA, HBME1, CKMNF116, D2-40, i dodatkowo TTF1 i CEA. 75

W przebadanym materiale rozpoznano: komórki rakowe w 32 przypadkach, komórki atypowe w 10 przypadkach, komórki mezotelialne w 31 przypadkach, komórki nowotworowe, bez określenia typu nowotworu 4 przypadkach, w jednym przypadku barwienia wszystkie immunohistochemiczne były niemiarodajne. W 61 przypadkach barwienia wykonywane były z rozmazów, w 9 przypadkach z bloczków parafinowych oraz w 8 przypadkach z obu materiałów (rozmazów i bloczków). W 36 przypadkach materiał diagnostyczny obecny był zarówno w rozmazach jak i w bloczkach z osadu odwirowanego płynu; w 18 przypadkach brak materiału diagnostycznego w bloczku oraz w 7 przypadkach brak materiału diagnostycznego w rozmazach. W następnym roku planujemy nadal zbierać materiał z płynów z opłucnej i osierdzia, które w barwieniu HE budzą podejrzenie nowotworu, oraz porównać jakość materiału i wykonanych reakcji immunohistochemicznych w rozmazach i bloczkach parafinowych z osadu odwirowanego płynu. Wykonywane będzie porównanie obrazu mikroskopowego oraz wyników barwień immunohistochemicznych w różnego rodzaju materiałach (rozmazy cytologiczne, bloczki parafinowe z osadu odwirowanego płynu i wycinki histopatologiczne) oraz ocena przydatności wykonywanych barwień immunohistochemicznych. W roku 2012 planujemy zakup przeciwciał, szkiełek silanizowanych oraz zestawu wywołującego. Wyniki przeprowadzonych badań zostaną opublikowane w formie sprawozdania, publikacji i doniesień zjazdowych. Planowany termin zakończenia badań grudzień 2013r. Do przedstawionego zadania badawczego wykorzystany będzie sprzęt Zakładu Patomorfologii: mikroskop świetlny Olympus, aparat Cadenza oraz sprzęt do wykonywania barwień immunohistochemicznych, Cytometr przepływowy, odczynniki immunohistochemiczne. Zadanie będzie realizowane w Zakładzie Patomorfologii Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc. 3.18. Wartość kliniczna oceny biomarkerów w osoczu/surowicy pacjentów z NSCLC. Celem badań planowanych w ramach niniejszego zadania była ocena klinicznej przydatności analizy ilościowej i jakościowej wolnych kwasów nukleinowych krążących we krwi obwodowej, a zwłaszcza ich frakcji pochodzących bezpośrednio z komórek guza, u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NDRP). Materiał i metody: Badania prowadzono na grupie chorych na NDRP zróżnicowanej pod względem morfologii (31 rak gruczołowy, 32 płaskonabłonkowy, 22 inny) i stopnia zaawansowania: 50 chorych leczonych operacyjnie (I-IIIA), 35 chorych poddanych chemioterapii (IIIB-IV) oraz grupie 40 zdrowych ochotników, od których pobierano krew (9 ml) do próbówek hematologicznych zawierających EDTA lub aktywator krzepnięcia celem separacji 76

odpowiednio osocza i surowicy. Wolne-krążące DNA/RNA izolowano z prób osocza i surowicy za pomocą wystandaryzowanej metody kolumienkowej. W analizie ilościowej i jakościowej DNA wykorzystano przede wszystkim techniki oparte na fluorescencyjnym barwieniu i detekcji dwuniciowego DNA, tj. real-time PCR oraz PicoGreen. W analizie RNA zastosowano metodę odwrotnej transkrypcji RNA do cdna sprzężoną z amplifikacją i detekcją real-time PCR za pomocą specyficznych sond fluorescencyjnych. Wyniki: Analiza ilościowa wolnego krążącego DNA w osoczu chorych na NDRP i zdrowych metodą real-time PCR Wyniki: analiza statystyczna wykazała, że średnie stężenia DNA w próbach osocza zebranych od osób zdrowych (2,65 ng/ml) było istotnie niższe od wartości obserwowanych w grupie nieleczonych chorych na NDRP (6,67 ng/ml; p<0,0001), średnie stężenie wolnego-krążącego DNA w osoczu chorych na NDRP w stadium I- IIIA było istotnie wyższe niż u chorych na NDRP w stadium IIIB-IV (p=0,0009), brak istotnych różnic między grupami chorych na NDRP o różnej morfologii (płaskonabłonkowy vs. gruczołowy vs. nieokreślony) pod względem stężenia wolnego-krążącego DNA (p=0,0728). Wnioski: Poziom wolnego krążącego DNA w osoczu istotnie odzwierciedla stan fizjologiczny (zdrowy-chory). Średni poziom wolnego krążącego DNA w osoczu, oznaczony metodą real-time PCR, okazał się kilkukrotnie wyższy u osób chorych na raka płuca, niż zdrowych, potwierdzając dane literaturowe. Ocena przydatności wolnego krążącego DNA osocza w monitorowaniu chorych na NDRP podczas leczenia i w okresie obserwacji. Wyniki: wykazano istotny wzrost stężenia DNA w osoczu w 7 dniu po zabiegu u wszystkich chorych na NDRP poddanych zabiegowi operacyjnemu. Poziom wolnego-krążącego DNA wzrastał z wartości średniej 8,02 ng/ml przed leczeniem do 51,25 ng/ml w 7 dniu po zabiegu (p=0,0000), w okresie obserwacji po zabiegu operacyjnym (3-6 miesięcy) u 11 spośród 20 (55%) chorych bez cech wznowy obserwowano znaczący spadek poziomu wolnegokrążącego DNA w osoczu poniżej wartości notowanej przed leczeniem. U pozostałych 7 (35%) pacjentów bez cech wznowy stężenie DNA w osoczu obniżyło się po resekcji do poziomu bliskiemu wartości stwierdzonej przed leczeniem. W przypadku dwóch chorych, jednego z progresją choroby i drugiego z potwierdzoną klinicznie wznową wartości stężenia DNA w osoczu mierzone w okresie obserwacji wielokrotnie przewyższały te, notowane u nich przed leczeniem (p=0,0000), 77

u chorych na NDRP poddanych chemioterapii obserwowano wzrost stężenia DNA w osoczu w 24 i 48 godzin po podaniu leków. Poziom wolnego-krążącego DNA wzrastał z wartości średniej 4,25 ng/ml przed leczeniem do 13,90 ng/ml w pierwszej dobie leczenia i utrzymywał się na podobnym poziomie przez kolejną dobę (10,68ng/ml, p=0,3012). Wnioski: wzrost zawartości wolnego krążącego DNA w osoczu chorych na NDRP notowany tydzień po leczeniu resekcyjnym jest efektem urazu śródoperacyjnego w obrębie klatki piersiowej i zachodzących tam procesów apoptozy/nekrozy tkanek. u chorych na zaawansowaną postać NDRP wysoki poziom wolnego-krążącego DNA obserwowany 24-48 h po podaniu cytostatyku odzwierciedla komórkową odpowiedź organizmu na działanie leku. Należy kontynuować badania, aby zweryfikować hipotezę, że im wyższa wartość stężenia DNA w osoczu w pierwszych dniach po podaniu chemii, tym lepsza odpowiedź pacjenta na leczenie. u pacjentów bez cech wznowy choroby poziom wolnego krążącego DNA w osoczu obniżał się w odniesieniu do stanu mierzonego przed leczeniem, podczas gdy u chorych ze stwierdzoną wznową stężenie DNA kilkakrotnie przekraczało wartość bazową. Wskazane jest kontynuowanie kontrolnych pomiarów DNA w osoczu co 3-6 miesięcy celem weryfikacji hipotezy, że wzrost zawartości wolnego krążącego DNA po leczeniu koreluje ze wznową choroby. Analiza ekspresji mrna genu telomerazy TERT w osoczu chorych na NDRP względem genu normalizującego B-aktyny. Wyniki: wolne-krążące RNA izolowane z osocza 10 chorych na NDRP metodą kolumienkową udało się wykryć jedynie 3 próbach. nie udało się skutecznie oznaczyć poziomu ekspresji genu TERT w wolnym-krążącym mrna w żadnej z prób badanych. Wnioski: Konieczne jest zwiększenie wyjściowej objętości osocza do izolacji RNA powyżej 3 ml. Z uwagi na ekstremalnie niską zawartość wolnego-krążącego RNA w osoczu wskazane jest zastosowanie i wypróbowanie innych odczynników - o wyższej czułości detekcji i kontynuacja niniejszych badań. 78

Prace opublikowane: 1. Joanna Chorostowska Wynimko, Michał Skroński, Adam Szpechciński. Markery molekularne w diagnostyce raka płuca fakty i nadzieje. Onkologia Info 2011; 3(40):152-159. 2. Joanna Chorostowska Wynimko, Michał Skroński, Adam Szpechciński. Molekularne markery prognostyczne i predykcyjne w diagnostyce niedrobnokomórkowego raka płuca. Onkologia Info 2011; 3(40):160-167. 3. Michał Skroński, Joanna Chorostowska-Wynimko, Ewa Szczepulska, Adam Szpechciński, Piotr Rudziński, Tadeusz Orłowski, Renata Langfort. PNA-LNA PCR clamp method reveals rare mutations in EGFR gene codon L858 in non-small cell lung cancer. Advances in Experimental Medicine and Biology - in press Wygłoszone referaty: 1. 7 TH INTERNATIONAL CONFERENCE ON CIRCULATING NUCLEIC ACIDS IN PLASMA AND SERUM (CNAPS VII), 24-25.10.2011, MADRYT, HISZPANIA. Adam Szpechciński, Krystyna Maszkowska-Kopij, Włodzimierz Kupis, Elżbieta Puścińska, Jolanta Załęska, Elżbieta Radzikowska, Tadeusz Orłowski, Paweł Śliwiński, Kazimierz Roszkowski-Śliż, Joanna Chorostowska-Wynimko. Quantification of free-circulating DNA in plasma of respiratory patients: NSCLC versus chronic inflammation. Journal of Nucleic Acids Investigation 2011; 2 (s1):21. 2. 21 ST ERS ANNUAL CONGRESS, 24-28.09.2011, AMSTERDAM, HOLANDIA. Adam Szpechciński, Krystyna Maszkowska-Kopij, Włodzimierz Kupis, Jolanta Załęska, Elżbieta Radzikowska, Radosław Struniawski, Elżbieta Puścińska, Tadeusz Orłowski, Paweł Śliwiński, Joanna Chorostowska-Wynimko. The clinical significance of plasma DNA quantification in NSCLC. Eur Res J 2011;38(supp55):339s. 3. ANNUAL CONGRESS OF THE AUSTRIAN SOCIETY ON PNEUMOLOGY; 8-10.09.2011, WIEDEŃ, AUSTRIA. Adam Szpechcinski, Krystyna Maszkowska-Kopij, Włodzimierz Kupis, Elżbieta Puścińska, Jolanta Załęska, Elżbieta Radzikowska, Tadeusz Orłowski, Paweł Śliwiński, Kazimierz Roszkowski-Śliż, Joanna Chorostowska-Wynimko. Quantification of free-circulating DNA in plasma of NSCLC patients. Wiener Klinische Wochenschrift (The Central European Journal of Medicine) 2011; 17-18: A30. 4. 214 TH WORLD CONFERENCE ON LUNG CANCER; 3-7.07.2011, AMSTERDAM, HOLANDIA. A. Szpechciński, M. Skroński, K. Maszkowska-Kopij, W. Kupis, J. Załęska, E. Radzikowska, E. Puścińska, P. Śliwiński, T. Orłowski, K. Roszkowski- Śliż, J. Chorostowska-Wynimko. The clinical significance of plasma DNA quantification in NSCLC. Journal of Thoracic Oncology 2011; 6(Supp. 2): S714. Nagrody: International Poster Bursary na konferencji Annual Congress of the Austrian Society on Pnemonology; 8-10.09.2011, Wiedeń, Austria. 79

Najważniejszy wniosek: Otrzymane wyniki potwierdzają celowość podjętych badań i pozostają w zgodzie z doniesieniami innych autorów, zachęcając tym samym do kontynuowania niniejszego zadania badawczego w kierunku wczesnej diagnostyki oraz monitorowania skuteczności leczenia raka płuca w oparciu o markery genetyczne we krwi obwodowej. 3.19. Weryfikacja histologiczna zajęcia węzłów chłonnych wnęki i śródpiersia u chorych operowanych z powodu niedrobnokomórkowego raka płuca z kliniczną oceną zaawansowania N1. Materiał i metoda: retrospektywna analiza dokumentacji 143 chorych operowanych w okresie od stycznia 2003 do lipca 2011 z powodu niedrobnokomórkowego raka płuca ze wstępną kliniczną cechą N1. Wśród analizowanych chorych było 45 kobiet i 98 mężczyzn w wieku od 40 do 83 lat. Kliniczne przedoperacyjne zaawansowanie choroby u 31 badanych chorych oceniono na IIA (T1N1), u 107 na IIB (T2N1), i u 5 na IIIA (T3N1), oceny dokonywano na podstawie badania CT kl piersiowej. Następnie analizie poddano wyniki pooperacyjnego badania histopatologicznego, w zależności od pozytywnej lub negatywnej weryfikacji chorych podzielono na 2 grupy (w grupie zweryfikowanej pozytywnie wyodrębniono dodatkowo podgrupę chorych, u których cecha N1 zmieniła się na N2). Wyniki: W grupie zweryfikowanej negatywnie (56 osób) u 27 chorych ustalono ostatecznie rozpoznanie raka płaskonabłonkowego (u 13 rogowaciejącego, u 11 nierogowaciejącego i u 3-ch raka płaskonabłonkowego mieszanego), u 23 chorych raka gruczołowego, u 4-ch wielkokomórkowego i u 2-ch chorych raka pleomorficznego. Chorzy z rakiem płaskonabłonkowym w 55,5% mieli rozpoznane zatory z komórek rakowych w naczyniach krwionośnych i limfatycznych guza oraz nacieki zapalne (z mikroropniami) w guzie i wokół guza, u 62,9% z nich obecna była martwica w guzie. Wśród chorych z rakiem gruczołowym 91,3% miało zatory z komórek raka i 69,5% martwicę w guzie. W całej grupie zweryfikowanej negatywnie u 9 chorych stwierdzono w CT niedodmę płata lub segmentu, u 16-tu cechy rozedmy płuc, u 4-ch rozstrzenie oskrzeli, 6-ciu chorych miało cukrzycę a 21 choroby układu krążenia. W grupie chorych zweryfikowanych pozytywnie z potwierdzoną cechą N1 znalazło się 69 osób. U 34 chorych z tej grupy rozpoznano raka płaskonabłonkowego (u 20-tu rogowaciejącego, u 12-tu nierogowaciejącego i u 2-ch płaskonabłonkowego mieszanego), u 25 chorych raka gruczołowego, u 5-ciu chorych wielkokomórkowego i u 5-ciu mieszanego. Chorzy z rakiem płaskonabłonkowym w 61,7% mieli zatory z komórek rakowych w naczyniach krwionośnych i limfatycznych guza oraz w 79,4% martwicę w guzie. Ponadto 26,4% z nich miało nacieki zapalne wokół guza a kolejne 32,3% niedodmę części płuca. Chorzy z rakiem gruczołowym w 88,0% mieli obecne zatory z komórek rakowych w naczyniach oraz w 60,0% cechy martwicy w guzie. Tylko 1 chory w tej grupie miał nacieki zapalne wokół guza (chory z rakiem gruczołowym niskozróżnicowanym) a 3-ch niedodmę części płuca, w tym ten jeden wspomniany chory. Choroby układu krążenia (z 80

uwzględnieniem wywiadu) występowały u 62,1% chorych w tej grupie a 23,1% miało cechy POChP. W grupie osób zweryfikowanych pozytywnie, u których w ocenie pooperacyjnej cecha zaawansowania N1 uległa zmianie na cechę N2, znalazło się18 chorych. Przerzuty nowotworowe stwierdzano w węzłach grupy 1,4,5,6,7, 9 i 11. U 4-ch chorych rozpoznano raka płaskonabłonkowego, u 12-tu raka gruczołowego, u 1-go wielkokomórkowego i u 1-go mieszanego. U 66,6% tych chorych stwierdzono obecność zatorów z komórek rakowych w naczyniach krwionośnych i limfatycznych guza, natomiast 72,2% miało cechy martwicy w guzie. Wnioski: W grupie osób zweryfikowanych negatywnie w znacznym odsetku badań pooperacyjnych obecne były zmiany zapalne w guzie (zarówno chorzy z rakiem płaskonabłonkowym jak i gruczołowym, w tym pierwszym przypadku z mikroropniami), ponadto u części chorych w tej grupie we wstępnej ocenie radiologicznej obecne były cechy niedodmy (9 osób). Odsetek zmian niedodmowych w grupie zweryfikowanej pozytywnie był nieco niższy, dodatkowo wyraźnie mniej było zmian zapalnych w badaniu pooperacyjnym. Podobnie jak poprzednio, tak i teraz w rozszerzonej grupie analizowanych chorych, wydaje się potwierdzać założenie iż obecność zmian zapalnych najprawdopodobniej wpływa na powiększanie się węzłów wnękowych i kliniczną klasyfikację jako cecha N1. Niedodma fragmentu płuca częściej występowała w przypadku raka płaskonabłonkowego. Nieco częściej obserwowano występowanie martwicy w guzie w grupie chorych zweryfikowanych pozytywnie w porównaniu z grupą zweryfikowaną negatywnie. Sugeruje to, iż obecność martwicy w guzie w mniejszym stopniu niż zmiany zapalne i niedodma wpływa na kliniczną ocenę cechy N1. Nieistotna wydaje się być dla powiększenia węzłów wnękowych obecność schorzeń układu krążenia. W grupie osób zweryfikowanych pozytywnie, które pooperacyjnie zmieniły cechę z N1 na N2, najczęściej rozpoznawano raka gruczołowego Ostateczne wyniki badania zostaną przedstawione w piśmiennictwie medycznym. 3.20. Walidacja molekularnych metod oznaczania mutacji w genie EGFR, w oparciu o fluorescencyjne sondy DNA oraz materiał tkankowy, biopsyjny i cytologiczny, celem optymalizacji procedury diagnostycznej. Walidacja molekularnych metod oznaczania mutacji w genie EGFR, w oparciu o fluorescencyjne sondy DNA oraz materiał tkankowy, biopsyjny i cytologiczny, celem optymalizacji procedury diagnostycznej. Skuteczna diagnostyka mutacji somatycznych genu EGFR w heterogennych materiałach tkankowych i cytologicznych pobranych od chorych na raka płuca, wymaga stosowania wiarygodnych metod molekularnych o możliwie najwyższej czułości detekcji. Od początku roku 2010 przeanalizowano pod kątem diagnostyki statusu mutacji EGFR ponad 250 preparatów DNA. Diagnostyka mutacji EGFR w oparciu o preparaty tkanek mrożonych i parafinowanych została w 2011 roku poszerzona o preparaty cytologiczne. 81

Użycie referencyjnej metody sekwencjonowania zalecane jest w preparatach zawierających przynajmniej 50% komórek nowotworowych, a procedura wymaga dużego nakładu pracy i czasu. Metody oparte o sondy molekularne i PCR w czasie rzeczywistym charakteryzują się wysoką czułością i specyficznością, pozwalając na ich stosowanie w preparatach o niskim odsetku komórek nowotworowych, zarówno tkankowych jak i cytologicznych. Ich zalety to również relatywnie niskie koszty wykonania badania, szybkość i kompleksowość oznaczenia oraz łatwość porównania wyników przy użyciu metody referencyjnej. Metoda diagnostyczna wykorzystywana w diagnostyce preparatów o niskim odsetku komórek nowotworowych powinna cechować się wysoką czułością i specyficznością, na poziomie 1% zmutowanego allelu na tle allelu typu dzikiego. Optymalizacja procedury diagnostyki EGFR poprzez ewaluację i wybór metod o najwyższej czułości i specyficzności, które pozwolą na skuteczną ocenę genetyczną materiału skąpokomórkowego, m.in. biopsji cienkoigłowych, skrawków tkanki parafinowanej oraz rozmazów cytologicznych, pozyskanych od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca, umożliwi obniżenie kosztów i skrócenie czasu procedury diagnostycznej, a przez to i czasu oczekiwania pacjenta na wynik. Celem pracy było określenie czułości detekcji alleli z mutacją punktową kodonu L858 w eksonie 21 oraz delecją w eksonie 19 genu EGFR przez metodę PNA-LNA PCR clamp oraz określenie jej czułości i specyficzności diagnostycznej względem referencyjnej metody sekwencjonowania kapilarnego. W warunkach naszego laboratorium najbardziej ekonomicznie uzasadnione wydaje się stosowanie metodyki opartej na PCR w czasie rzeczywistym i sondach molekularnych, a metodą, którą wybrano i zwalidowano jako najbardziej odpowiednią do diagnostyki i badań naukowych jest PNA-LNA PCR clamp. 3.21. Walidacja wysokoczułej metody PNA-LNA PCR clamp do diagnostyki mutacji kodonu L858 genu EGFR u pacjentów z gruczolakorakiem płuca. Materiały i metody: Linia komórkowa H1975, heterozygotyczna pod względem endogennej mutacji punktowej L858R, była hodowana w pożywce RPMI-1640 wzbogaconej 10% FBS w warunkach standardowych (inkubacja w temperaturze 37 C oraz atmosferze 5% CO2). DNA izolowane z komórek H1975 zostało zmieszane z DNA typu dzikiego w serii 10-krotnych rozcieńczeń 100%, 10% i 1% oraz 100% DNA typu dzikiego, które zostały wykorzystane do określenia czułości detekcji allelu L858R przez metodę PNA-LNA PCR clamp. DNA izolowane z materiałów tkankowych, mrożonych (n=74) oraz utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (n=38), pozyskanych od chorych na gruczołowego raka płuca, zostało zanalizowanych pod kątem występowania mutacji kodonu L858 genu EGFR przy użyciu sekwencjonowania oraz PNA-LNA PCR clamp. 82

Wyniki: Metoda PNA-LNA PCR clamp umożliwia detekcję zmutowanego allelu na poziomie 1% heterozygotycznego DNA linii komórkowej H1975. W 9 z 112 (8%) przebadanych materiałów tkankowych chorych na gruczolakoraka płuca stwierdzono obecność mutacji L858R przy użyciu metody klasycznego sekwencjonowania oraz PNA-LNA PCR clamp. W jednym z badanych materiałów obie metody potwierdziły obecność rzadkiej podwójnej mutacji L858M i L861Q, natomiast w 2 materiałach obecność mutacji L858R oraz L858P (c.2573c>t) została potwierdzona jedynie metodą PNA-LNA PCR clamp. Czułość i swoistość analizy mutacji kodonu L858 genu EGFR metodą PNA-LNA PCR clamp określono jako, odpowiednio, 100% i 97%. Wnioski: PNA-LNA PCR clamp jest bardzo czułą i specyficzną metodą diagnostyczną, zapewniającą wiarygodną i szybką detekcję mutacji kodonu L858 genu EGFR w materiałach tkankowych. Wysoka czułość detekcji, pozwalająca na wykrycie 1 kopii zmutowanego allelu wśród tła 200 genomów zawierających allel typu dzikiego, pozwala na wykorzystanie do wiarygodnej diagnostyki mutacji genu EGFR. 3.22. Wykorzystanie metody PNA-LNA PCR clamp do oznaczenia mutacji w eksonie 19 genu EGFR. Materiały i metody: DNA kontrolne wyizolowane z linii komórkowej hetoerozygotycznej pod względem delecji dele746-a750 zostało zmieszane z DNA typu dzikiego w serii rozcieńczeń zawierających 50%, 25%, 10% oraz 1% allelu typu dzikiego, które zostały wykorzystane do określenia czułości detekcji zmutowanego allelu przez metodę PNA- LNA PCR clamp. DNA izolowane z materiałów tkankowych utrwalonych w formalinie/parafinie (n=38) oraz cytologicznych (n=15), pozyskanych od chorych na gruczołowego raka płuca, zostało zanalizowanych pod kątem występowania delecji eksonu 19 genu EGFR przy użyciu metody PNA-LNA PCR clamp. Wyniki: Metoda PNA-LNA PCR clamp umożliwia detekcję zmutowanego allelu na poziomie 1% heterozygotycznego DNA linii komórkowej zawierającej endogenną delecję dele746- A750 oraz L858R W 7 z 56 (13%) przebadanych materiałów tkankowych i cytologicznych chorych na gruczolakoraka płuca PNA-LNA PCR clamp stwierdzono aktywujące delecje w eksonie 19 genu EGFR. Wszystkie pozytywne wyniki (7/7 100%) zostały potwierdzone przez sekwencjonowanie produktu reakcji PNA-LNA PCR clamp. 83

Wnioski: Wysoka czułość i specyficzność wykrywania delecji w eksonie 19 genu EGFR pozwala na szybkie i wiarygodne wykrycie mutacji w analizowanym materiale tkankowym i cytologicznym, Unikatowa możliwość bezpośredniego sekwencjonowania produktu reakcji PNA-LNA PCR clamp pozwala na weryfikację wyniku diagnostycznego oraz precyzyjne określenie typu aktywującej delecji. Nagrody: Komitet naukowy 21ST ERS ANNUAL CONGRESS, AMSTERDAM uhonorował nagrodą Silver ERS Sponsorship pracę: Skroński M, Tanaka T, Szpechcinski A, Lagfort R, Orłowski T, Hagiwara K and Chorostowska-Wynimko J Evaluation of highly sensitive PNA-LNA PCR clamp method for EGFR L858R mutation detection in lung adenocarcinoma patients Skroński M, Tanaka T, Szpechcinski A, Lagfort R, Orłowski T, Hagiwara K and Chorostowska-Wynimko J. Publikacje: Praca oryginalne: Michał Skroński, Joanna Chorostowska-Wynimko, Ewa Szczepulska, Adam Szpechciński, Piotr Rudziński, Tadeusz Orłowski, Renata Langfort, PNA-LNA PCR clamp method reveals rare mutations in EGFR gene codon L858 in non-small cell lung cancer. Advances in Experimental Medicine and Biology w druku Prace poglądowe: Krawczyk P, Kucharczyk T, Chorostowska-Wynimko J, Skroński M, Wojas- Krawczyk K, Mlak R, Sura S i Milanowski J (2011) Czy oznaczanie mutacji w genie EGFR we krwi obwodowej zrewolucjonizuje kwalifikację do terapii inhibitorami kinazy tyrozynowej? Onkologia Polska 2011; 14(2): 93-98 Konferencje: Powyższe wyniki badań nad zastosowaniem markerów molekularnych w diagnostyce raka płuc były prezentowane w formie plakatów na konferencjach krajowych i zagranicznych: 21ST ERS ANNUAL CONGRESS, 24-28 WRZEŚNIA, AMSTERDAM, HOLANDIA M. Skroński, T. Tanaka, A. Szpechcinski, R. Lagfort, T. Orłowski, K. Hagiwara and J. Chorostowska-Wynimko Evaluation of highly sensitive PNA-LNA PCR clamp method for EGFR L858R mutation detection in lung adenocarcinoma patients 14TH WORLD CONFERENCE ON LUNG CANCER 2 5 LIPCA 2009, AMSTERDAM, HOLANDIA M. Skroński, T. Tanaka, A. Szpechcinski, R. Lagfort, T. Orłowski, K. Hagiwara and J. Chorostowska-Wynimko Evaluation of highly sensitive PNA-LNA PCR clamp method for EGFR codon L858 mutations detection in lung adenocarcinoma patients. V KONFERENCJA POLSKIEJ GRUPY RAKA PŁUCA, 4-5 LISTOPADA 2011, WARSZAWA 84

Michał Skroński, Tomoaki Tanaka, Adam Szpechciński, Renata Langfort, Koichi Hagiwara, Tadeusz Orłowski, Joanna Chorostowska-Wynimko Walidacja wysokoczułej metody PNA-LNA PCR clamp do diagnostyki mutacji kodonu L858 genu EGFR u pacjentów z gruczolakorakiem płuca. Michał Skroński, Joanna Chorostowska-Wynimko, Ewa Szczepulska, Adam Szpechciński, Piotr Rudziński, Tadeusz Orłowski, Renata Langfort Zastosowanie metody PNA-LNA PCR clamp do identyfikacji rzadkich mutacji kodonu L858 genu EGFR u chorych na NDRP. 85

Temat 4: OPTYMALIZACJA DZIAŁANIA DIAGNOSTYCZNEGO I LECZNICZEGO W SCHORZENIACH TCHAWICY I DUŻYCH OSKRZELI Kierownik tematu: Prof. dr hab. n. med. Tadeusz Orłowski Temat Optymalizacja działania diagnostycznego i leczniczego w schorzeniach tchawicy i dużych oskrzeli obejmuje szeroką grupę zagadnień dotyczących diagnostyki i leczenia chorób tchawicy, dużych oskrzeli i śródpiersia. Analizuje wyniki paliatywnego leczenia chorych z nowotworowymi zwężeniami dróg oddechowych jak i grupy pacjentów poddanych radykalnemu leczeniu z powodu łagodnych zwężeń dróg oddechowych. W obrębie tego tematu znalazła się również analiza dużej grupy pacjentów, u których za pomocą technik endoskopowych dokonano diagnostyki układu limfatycznego śródpiersia. Protezowanie dróg oddechowych jest metodą z wyboru u wszystkich chorych, u których niemożliwe jest przeprowadzenie leczenia radykalnego lub z przyczyn ogólnych w danym momencie leczenie operacyjne stanowiłoby zbyt duże ryzyko dla pacjenta. Doświadczenie kliniki liczące sobie ponad 20 lat pozwoliło na ustalenie precyzyjnych wskazań do tego typu zabiegów. Na podstawie prowadzonych obserwacji ustalono, że efekt założenia stentu jest najlepszy jeżeli stent stanowi pomost pomiędzy normalnymi odcinkami drzewa oskrzelowego. Wyjątkiem od tej reguły mogą być przypadki, w których po udrożnieniu drzewa oskrzelowego zakładany jest stent w celach paliatywnych ażeby trzymać drożność objętego procesem nowotworowym odcinka tak ażeby zalegająca na obwodzie wydzielina mogła być ewakuowana. Jej zaleganie w wielu przypadkach jest przyczyną powstawania ropni płuca oraz niewydolności oddechowej. Celem tematu badawczego Wczesna diagnostyka zmian wewnątrzoskrzelowych w schorzeniach nowotworowych klatki piersiowej była ocena skuteczności technik endoskopowych w diagnostyce raka płuca. W roku 2011 wykonano 1415 bronchoskopie diagnostyczne oraz 1581 bronchoskopie autofluorescencyjne. Ponadto w roku 2011 wprowadzono do diagnostyki badanie ultrasonografii przezoskrzelowej (EBUS), które znacznie zwiększyło wartość diagnostyczną badań endoskopowych. W roku 2011 wykonano 1190 badania EBUS. Badanie to dedykowane jest precyzyjnej ocenie stopnia zaawansowania w oparciu o stwierdzone zmiany przerzutowe w węzłach chłonnych. W oparciu o zebrany materiał stwierdzono, że bronchoskopia autofluorescencyjna pozwoliła na wykrycie wczesnych postaci raka płuca u 7% badanych, w tym u 2,5% przypadków stwierdzono drugi pierwotny nowotwór płuca. Analizując materiał w grupie chorych, u których wykonano badanie EBUS stwierdzono znamienny spadek liczby wykonywanych operacji diagnostycznych (mediastinoskopia, mediastionotomia przymostkowa), na rzecz diagnostyki endoskopowej. Oceniany spadek wyniósł 42%. Jednocześnie skuteczność badania EBUS w ocenie stopnia zaawansowania raka płuca wyniosła 93%. Uzyskane wyniki pozostają zbliżone do danych przedstawianych w piśmiennictwie światowym. Uzyskane wyniki dowodzą dużej skuteczności wykonywanych w Instytucie Gruźlicy i Chorób Płuc badań endoskopowych. W celu optymalizacji omawianych metod i dokładnej oceny skuteczności niezbędne jest kontynuowanie badań w roku 2012. W projekcie badań na następny rok planuje się wykonanie 1800 bronchoskopii autofluorescencyjnych oraz 1400 ultrasonografii 86

przezoskrzelowych. Uzyskany materiał posłuży do dalszej oceny skuteczności omawianych metod. W 2011 roku założono 41 stentów u chorych z nowotworowymi zwężeniami tchawicy i oskrzeli głównych oraz 6 stentów u chorych ze zwężeniami łagodnymi będącymi następstwem przedłużonej intubacji bądź restenozy związanej z leczeniem operacyjnym. We wszystkich przypadkach uzyskano zadowalający efekt doraźny, około 30% pacjentów wymagało wspomaganego leczenia polegającego na bronchospiracji, po 2 5 zabiegach nie było konieczne dalsze leczenie. U 3 chorych doszło do przesunięcia stentu, co wymagało korekcji endoskopowej. Poczynione obserwacje jednoznacznie wskazują, że jest to w chwili obecnej metoda z wyboru u wszystkich tych chorych, u których inne metody leczenia nie mogą być zastosowane. W sposób radykalny leczono 22 chorych ze zwężeniem tchawicy, u większości pacjentów (20) było to następstwem przedłużonej intubacji lub zabiegów związanych z koniecznością prowadzenia wentylacji zastępczej. 28 chorych leczono usuwając zwężony odcinek i zespalając zdrowe odcinki tchawicy, niemal połowa chorych maiła zlokalizowane zwężenie w odcinku podgłośniowym, co wymagało rekonstrukcji tego odcinka. U dwóch chorych doszło do rozejścia się zespolenia, co wymagało założenia sentu silikonowego na okres gojenia się tej okolicy. U wszystkich chorych uzyskano zadowalający efekt leczenia. 87

Temat 5. PRZEWLEKŁA NIEWYDOLNOŚĆ ODDYCHANIA PATOGENEZA, PROFILAKTYKA I LECZENIE Kierownik tematu: prof. dr hab. Paweł Śliwiński W roku 2011 w ramach tematu 5 prowadzono badania nad: oceną czynników prognostycznych w POChP; oceną zmienności wybranych parametrów czynnościowych układu oddechowego w przebiegu POChP; oceną czynności nerek u chorych na POChP i OBS z uwzględnieniem nowego biomarkera - cystatyny C; oceną wpływu desaturacji w czasie snu na profil glikemii; oceną rozpowszechnienia i optymalizacją rozpoznawania niedoboru alfa1- antytrypsyny u chorych na POChP; wpływem zaburzeń elektrolitowych na rokowanie w niewydolności serca. Jednym z najistotniejszych czynników rokowniczych u chorych na POChP są zaostrzenia choroby, zwłaszcza, te które wymagają hospitalizacji. W latach 2005-2009 włączono do badania prospektywnego oceniającego czynniki prognostyczne w tej grupie chorych blisko 500 pacjentów leczonych w warunkach szpitalnych z powodu zaostrzenia. Analiza zgromadzonych danych pozwoliła na ocenę wpływu chorób współistniejących na długość leczenia szpitalnego chorych na POChP hospitalizowanych z powodu zaostrzenia (praca przyjęta do druku w PiAP) oraz ryzyko ponownej hospitalizacji po pierwszym zaostrzeniu (prezentacja na kongresie ERS w Amsterdamie w 2011 roku). Oceniono także wpływ anemii na duszność w czasie wysiłku i tolerancję wysiłku u chorych na POChP (prezentacja na kongresie ERS w Amsterdamie w 2011 roku). Kolejnym istotnym czynnikiem rokowniczym w POChP jest wielkość FEV 1. Zmiany tego parametru monitorowano wśród chorych leczonych tlenem w domu z powodu przewlekłej niewydolności oddychania. Wyniki tych obserwacji w grupie 93 chorych pokazują, że średni spadek FEV 1 w ciągu roku to 20 ml, a więc mniejszy niż spadek FEV 1 opisywany w podobnej populacji chorych na POChP nie leczonych tlenem (30 ml). W kolejnym zadaniu badawczym (5.3) wykazano, że monitorowanie pojemności wdechowej (IC) u chorych na POChP może być bardziej czułym wskaźnikiem progresji choroby niż tradycyjne monitorowanie FEV 1. W ramach realizacji zadań w temacie 5 opracowano i wdrożono dwie nowe techniki diagnostyczne: pomiar stężenia cystatyny C w celu monitorowania wydolności nerek, ciągły pomiar stężenia glikemii z wykorzystaniem elektrody podskórnej. Realizacja zadań badawczych wykorzystujących te techniki jest na etapie zbierania danych do analizy. 88

W zadaniu 5.8 opracowano algorytm postępowania diagnostycznego przy podejrzeniu niedoboru alfa1-antytrypsyny (A1-AT). Wśród zbadanych 581 chorych z przewlekłymi chorobami płuc u 70 (12%) wykryto różne postacie fenotypowe niedoboru A1-AT, w tym u 13 chorych zidentyfikowano ciężką postać niedoboru A1-AT. Ważniejsze wyniki badań z tematu 5: 1. Wdrożenie dwóch nowych technik diagnostycznych: pomiar stężenia cystatyny C w celu monitorowania wydolności nerek, ciągły pomiar stężenia glikemii z wykorzystaniem elektrody podskórnej. 2. Opracowanie algorytmu postępowania diagnostycznego przy podejrzeniu niedoboru alfa1-antytrypsyny. 89

Temat 6: OCENA WPŁYWU ZABURZEŃ ODDYCHANIA W CZASIE SNU NA CZYNNOŚĆ PŁUC I SERCA Kierownik tematu: dr hab. Robert Pływaczewski, prof. nadzw. Zastępca tematu: prof. dr hab. n. med. Paweł Śliwiński W 2011 roku realizowano 10 zadań badawczych, które dotyczyły następujących zagadnień: 1. Kardiologiczne następstwa zaburzeń oddychania w czasie snu (ZOCS). 2. Wpływ ZOCS na metabolizm i funkcję hormonalną. 3. Patofizjologia i klinika ZOCS. 4. Centralny bezdech senny. Ad.1. Zadania 1,4,5,7 poświęcone były ocenie wpływu obturacyjnego bezdechu sennego na układ krążenia. W zadaniu 6.1 Powikłania sercowo-naczyniowe u chorych z zespołem nakładania (obturacyjny bezdech senny + przewlekła obturacyjna choroba płuc) (ZN) i obturacyjnym bezdechem sennym (OBS), w 2011 roku zbadano dodatkowo 207 chorych na OBS. Łącznie grupa poddana analizie wyniosła 1138 chorych na OBS (AHI 39,6±21,6, BMI 34,2±6,4 kg/m 2, średnie SaO 2 90.8±5.8%, punktacja w skali Epworth - 11,3±5,8). Zespół nakładania stwierdzono u 142 chorych (12.5%), pozostali pacjenci - 996 osób (87.5%) Wnioski: Pacjenci z zespołem nakładania mieli wyższy BMI i częściej występowały u nich niewydolność serca i choroba niedokrwienna serca w porównaniu z chorymi z czystym OBS. Zadanie 6.4 - Ocena przydatności pomiaru probnp jako dodatkowego czynnika kwalifikacji do leczenia CPAP u chorych na OBS Obturacyjny bezdech senny jest czynnikiem ryzyka chorób sercowo-naczyniowych. Mózgowy peptyd sodopędny (brain natriuretic peptide - BNP) jest hormonem wydzielanym przez komórki mięśnia sercowego w odpowiedzi na wzrost ciśnienia lub objętości w komorach serca. Celem pracy była ocena stężenia NT-proBNP (nieaktywna forma hormonu) w surowicy krwi u chorych na OBS przed zastosowaniem leczenia aparatem CPAP oraz związków pomiędzy NT-proBNP oraz występowaniem powikłań sercowo-naczyniowych. Stężenia NT-proBNP <125 pg/ml uznawano za prawidłowe. Zbadano łącznie 1118 chorych na OBS (w 2011 roku zbadano 204 nowych chorych na OBS). Średnia wieku wynosiła 56,4±10,4 lat, badani charakteryzowali się umiarkowanymi i ciężkimi postaciami choroby średni AHI 39,6±21,6 oraz otyłością - BMI 34,2±6,4 kg/m 2. Na podstawie uzyskanych wyników badanych podzielono na 2 grupy: pierwszą z podwyższonym NT-proBNP (287 osób, 25,7%) i drugą, u której NT-proBNP było prawidłowe (831 osób, 74,3%). 90

Wnioski: Podwyższone stężenie NT-proBNP w surowicy u chorych na OBS związane było z współistnieniem powikłań sercowo-naczyniowych. Nie stwierdzono związków pomiędzy nasileniem OBS, otyłości i stężeniem NT-proBNP. Zadanie 6.5 Ocena związków pomiędzy obturacyjnym bezdechem sennym (OBS) i migotaniem przedsionków OBS jest czynnikiem ryzyka zaburzeń rytmu serca, w tym migotania przedsionków. W poprzednich badaniach stwierdzono, że otyłość i niedotlenienie w nocy były niezależnymi czynnikami ryzyka występowania migotania przedsionków u chorych na OBS. Celem pracy była ocena związków pomiędzy nasileniem OBS, masą ciała, niedotlenieniem w nocy oraz migotaniem przedsionków. Zbadano 1138 chorych na OBS (205 w 2011 roku) zakwalifikowanych do leczenia CPAP (wiek 56.3 10.4 lat, AHI 39.6 21.6, BMI 34.2 6.4 kg/m 2, średnie SaO 2-90.8 5.8%, skala Epworth - 11.3 5.8 punktów). Badanych podzielono na 2 grupy: pierwszą napadowym lub utrwalonym migotaniem przedsionków (92 chorych, 8.1%) i drugą bez migotania przedsionków (1046 chorych, 91.9%). Wnioski: Migotanie przedsionków u chorych na OBS było związane z występowaniem choroby wieńcowej, niewydolności serca, udaru mózgu oraz starszym wiekiem. Nasilenie choroby (AHI i BMI) były podobne w obydwu grupach chorych z oraz bez migotania przedsionków. W zadaniu 6.7 analizowano wpływ podwyższonego stężenia CRP na wystąpienie powikłań sercowo - naczyniowych u chorych na OBS. W 2011 roku do dotychczasowej grupy 834 chorych OBS, u których badano CRP i powikłania sercowo-naczyniowe dołączono kolejnych 174 chorych. Poniżej przedstawiono analizę wyników u 1008 chorych na OBS (średnie: AHI 39,6±21,7, BMI 34±6,3 kg/m 2, wiek 56,2±10,5 lat, średnie SaO 2 90.9±5.9 %, T90-25,8±28,2%, punktacja w skali Epworth - 11,2±5,7). Podwyższone stężenie CRP (>10mg/l) stwierdzono u 117 chorych (11,6%). Wnioski: Niewydolność serca, POChP, cukrzyca i choroba wieńcowa występowały częściej u chorych na OBS z podwyższonym stężeniem CRP. Poza tym chorzy na OBS z podwyższonym stężeniem CRP mieli wyższe: AHI i BMI oraz charakteryzowali się gorszym utlenowaniem w nocy (niższe średnie SaO2 i dłuższy czas spędzony w niedotlenieniu nocnym - T90). Ad 2. W zadaniu 6.3 oceniano związki pomiędzy OBS i zaburzeniami lipidowymi. Celem pracy była ocena częstości występowania hipercholesterolemii (cholesterol całkowity > 200mg%), hipertriglicerydemii (TG > 160mg%) oraz hiperlipidemii mieszanej u chorych na OBS. 91

Zbadano 1136 chorych na OBS (wiek 56,3±10,4 lat, AHI 39,6±21,6, BMI 34,2±6,4 kg/m 2, średnie SaO 2 90,9±5,2%, T90 26,5±28,7%, punktacja w skali Epworth - 11,3±5,8). Hipertriglicerydemię stwierdzono u 209 chorych (18,4% - gr.2), hipercholesterolemię u 218 chorych (19,2% - gr.1), hiperlipidemię mieszaną u 280 badanych (24,6% - gr.3), pozostali chorzy bez zaburzeń lipidowych stanowili gr. 0 (429 badanych -37.8%). Wnioski: Zaburzenia lipidowe stwierdzono u większości chorych na OBS. Najczęściej rozpoznawano u chorych hiperlipidemię mieszaną (badani z tej grupy byli najmłodsi, mieli wyższy AHI). Nadciśnienie tętnicze i cukrzycę najczęściej rozpoznawano u chorych z hipertriglicerydemią. Chorobę wieńcową, niewydolność serca i migotanie przedsionków najczęściej stwierdzano w grupie bez zaburzeń lipidowych. W ramach realizacji zadania 6.6 - badano wpływ niedoczynności tarczycy na zaawansowanie OBS. Niedoczynność tarczycy jest czynnikiem ryzyka obturacyjnego bezdechu sennego (wyniki poprzednich badań ujawniły częste występowanie OBS u chorych z niedoczynnością tarczycy). Celem pracy była ocena częstości występowania niedoczynności tarczycy u chorych na OBS oraz wpływu tej choroby na nasilenie obturacyjnego bezdechu sennego. Zbadano 1138 chorych na OBS (w 2011 roku zbadano 205 nowych chorych z umiarkowaną i ciężką postacią choroby) zakwalifikowanych do leczenia CPAP (wiek 56.3 10.4 lat, AHI 39.6 21.6, BMI 34.2 6.4 kg/m 2, średnie SaO 2-90.8 5.8%, T90-26.5 28.7%, skala Epworth - 11.3 5.8 punktów). Niedoczynność tarczycy (podwyższone TSH) stwierdzono u 68 chorych (6%). Wnioski: Częstość występowania niedoczynności tarczycy u chorych na OBS była niska (6% chorych). Nasilenie OBS (AHI), BMI oraz występowanie powikłań krążeniowych było podobne u chorych z niedoczynnością i bez niedoczynności tarczycy (częstość występowania choroby wieńcowej i cukrzycy w grupie z niedoczynnością tarczycy była wyższa ale z uwagi na małą liczebność grupy nie osiągnęła znamienności statystycznej). W ramach zadania 6.8 Analiza związków pomiędzy cukrzycą i obturacyjnym bezdechem sennym (OBS) W ramach zadania w 2011 roku zbadano 135 chorych na OBS (łącznie grupa chorych u których wykonano OGTT wyniosła 255 osób). Wyniki pracy przedstawiono w sesji plakatowej podczas zjazdu ERS w Amsterdamie, 24-28/09/2011 (streszczenie w załączeniu) P2234 Association between arterial hypertension and impaired glucose tolerance (IGT) in obtructive sleep apnoea patients Obturacyjny bezdech senny jest czynnikiem ryzyka zespołu metabolicznego i cukrzycy. Celem pracy była ocena wyników testu obciążenia glukozą u chorych na OBS. Zbadano 255 92

chorych na OBS [195 mężczyzn (76.5%) i 60 kobiet (23.5%)] w średnim wieku 56.8±10.7 lat. Badani charakteryzowali się umiarkowanymi i ciężkimi postaciami choroby - AHI 42.3±20.5 oraz nadwagą i otyłością - BMI 33.1±5.5 kg/m 2. Upośledzoną tolerancję glukozy (stężenie glukozy w surowicy 140 mg% pod 2 godzinach od obciążenia 75 gramami glukozy test OGTT) stwierdzono u 69 chorych (27.1%). U 11 pacjentów (4.3%) wyniki testu OGTT potwierdziły rozpoznanie cukrzycy (glukoza 200 mg%). Wnioski: Upośledzona tolerancja glukozy występuje często u chorych na OBS (> 25% badanych). Chorzy na OBS z upośledzoną tolerancją glukozy częściej mieli rozpoznawane nadciśnienie tętnicze oraz mieli wyższe stężenia glukozy na czczo oraz HbA1c. Ad 3. W ramach realizacji zadania 6.2 oceniono występowanie hiperkapnii u chorych na OBS. Współistnienie OBS i POChP (Zespół Nakładania) lub otyłość znacznego stopnia może wpływać na wystąpienie hipoksemii dziennej lub nawet całkowitej niewydolności oddychania. Celem pracy była ocena częstości występowania hiperkapnii w ciągu dnia u chorych na OBS przed zastosowaniem leczenia aparatem CPAP oraz związków pomiędzy zaawansowaniem OBS, otyłością, chorobami współistniejącymi i PaCO 2. Zbadano 1123 chorych na OBS (845 mężczyzn- 75,2% i 278 kobiet 24,8%) w średnim wieku 56,3 10,4 lat. Pacjenci charakteryzowali się nadwagą i otyłością (BMI 34,2 6,4 kg/m 2 ) oraz umiarkowanymi i ciężkimi postaciami OBS (AHI 39,6 21,6). Hiperkapnię w ciągu dnia (PaCO 2 > 45 mmhg) stwierdzono u 64 chorych (5,7%). Wnioski: Hiperkapnia w ciągu dnia u chorych na OBS była związana dłuższym czasem spędzonym w niedotlenieniu nocnym (T90), częstszym występowaniem POChP oraz niższymi wartościami: dziennego PaO 2, FVC (% należnej), FEV 1 (% należnej) i FEV 1 %FVC. Chorzy na OBS z hiperkapnią mieli wyższe: BMI i AHI. Zadanie 6.9 Ocena zaawansowania obturacyjnego bezdechu sennego u chorych ze współistniejącą astmą w porównaniu chorymi na czysty OBS. Zbadano 32 chorych na OBS z współistniejącą astmą. Astma była dobrze kontrolowana u większości chorych. Parametry czynnościowe płuc były następujące: FVC (%należnej) - 94,7±21,9%, FEV1 (% należnej) 81,3±24,7%, FEV1%FVC 69,3±12,2%. Wyniki chorych z astmą i OBS porównano z badanymi z czystym OBS. Szczegółowe porównanie 32 chorych na astmę i OBS oraz 32 chorych z czystym OBS losowo wybranych z grupy 1106 chorych zakwalifikowanych do leczenia CPAP. Wnioski: Chorzy z astmą i OBS mieli wartości AHI, BMI oraz punktację w skali Epworth w porównaniu z chorymi z czystym OBS. Czas spędzony w niedotlenieniu nocnym T90 był 93

znamiennie dłuższy u chorych z czystym OBS. Częstość występowania powikłań krążeniowych i cukrzycy była podobna w obydwu grupach chorych. Ad 4. Zadanie 6.10 - Ocena częstości występowania i nasilenia centralnego bezdechu sennego u chorych skierowanych na badania diagnostyczne do Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc. Centralny bezdech senny nie jest chorobą jednolitą. U dorosłych wyróżnia się postać idiopatyczną, związaną z oddychaniem Cheyne a-stokesa, oddychaniem okresowym związanym z wysokością i innymi chorobami neurologicznymi, a także ze stosowaniem leków i innych substancji. Celem pracy była także ocena związków pomiędzy bezdechem centralnym a występowaniem chorób sercowo-naczyniowych. W 2011 roku zdiagnozowano 19 chorych CBS, 3 kobiet, 16 mężczyzn, u wszystkich badanych występowały powikłania sercowo-naczyniowe, u 2 neurologiczne. AHI 49,4±18, BMI 34,2±6,5 kg/m 2, wiek 56,2±10,3 lat, średnie SaO 2 91.9±5.9%, minimalne SaO 2 76.8±9.8%, CI- 30,4±16,1, punktacja w skali Epworth - 9,6±5,1. U wszystkich badanych zastosowano leczenie aparatem CPAP, obserwowano poprawę kliniczną. U jednej osoby nasiliły się bezdechy centralne w trakcie stosowania leczenia CPAP. 94

Temat 7. BADANIA NAD ULEPSZENIEM METOD ROZPOZNAWANIA I LECZENIA CHORÓB ŚRÓDMIĄŻSZOWYCH PŁUC Kierownik tematu: prof. dr hab. n. med. Jan Kuś Zastępca tematu: prof. dr hab. n. med. Elżbieta Wiatr W wieloletnich badaniach dużej grupy chorych na sarkoidozę wykazano, że przy poszukiwaniu zaburzeń objętościowych (restrykcyjnych), w przypadkach niewystępowania cech obturacji, wystarczające są informacje z badania DLCO (w czasie pomiaru DLCO określa się objętość pęcherzykową VA, która jest surogatem TLC). Prawidłowa wartość VA z dużym prawdopodobieństwem wyklucza restrykcję objętościową. U chorych z obturacją obniżone VA mierzone podczas testu DLCO nie jest wiarygodnym wskaźnikiem restrykcji i wymaga weryfikacji badaniem pletyzmograficznym. Badania nad znaczeniem dodatniego odczynu u chorych na sarkoidozę wykazały, że test Quantiferon TB Gold jest pomocny w wykluczeniu zakażenia prątkiem gruźlicy u chorych na sarkoidozę z dodatnim odczynem tuberkulinowym. Duże znaczenie praktyczne mają wyniki badań w których wykazano, że metoda cytometrii przepływowej z zastosowaniem panelu przeciwciał standaryzowanych dla krwi oraz bramkowaniem limfocytów CD3 + w układzie trójbarwnym zapewnia tanie, wiarygodne i szybkie określanie wartości CD4/CD8 w BAL, pozwala też unikać błędów technicznych i interpretacyjnych typowych dla metody immunoenzymatycznej w fenotypowaniu limfocytów CD4 + /CD8 +. W oparciu o wyniki tych badań wdrożono w Instytucie do rutynowej praktyki diagnostycznej cytometryczną analizę BAL. Znaczenie badań czynnościowych układu oddechowego w diagnostyce oraz monitorowaniu przebiegu i leczenia chorób śródmiąższowych płuc. Kontynuowano zadanie przeprowadzając badania czynnościowe układu oddechowego u chorych na choroby śródmiąższowe płuc. Zgodnie z założeniami harmonogramu wykonano kolejne ok. 1000 badań u takich chorych. Trwa także pozyskiwanie danych potrzebnych do oceny prognostycznej wartości wskaźników czynności płuc w chorobach śródmiąższowych. Dołączono kolejnych 450 przypadków ze zidentyfikowaną sarkoidozą do grupy analizowanej pod kątem wpływu palenia tytoniu. We współpracy z III Kliniką Chorób Płuc zgłoszono do publikacji (praca przyjęta do druku w Sarcoidosis 2012) wyniki badań nad nadreaktywnością oskrzeli u chorych na sarkoidozę płuc. (M. Martusewicz-Boros, P. Boros, S. Wesołowski, E. Wiatr, K. Roszkowski-Śliż: Bronchial hyperreactivity in sarcoidosis patients: correlation with airflow limitation indices. Sarcoidosis 2012 in press). Kontynuowano współpracę międzynarodową (Paul Enright USA, Philip Quanjer Holandia) w celu lepszego wykorzystania posiadanego materiału i przedstawiono analizę dotyczącą wskaźników objętościowych u 830 chorych z sarkoidozą: streszczenie na kongresie ATS w Denver: (Boros PW, Martusewicz-Boros MM, Wesolowski SP, Quanjer PH, Enright PL: Why put patients with sarcoidosis in a body box? Am J Respir Crit Care Med 183;2011:A5645) oraz na kongresie ERS w Amsterdamie (P. Boros, M. Martusewicz-Boros, P. Quanjer, P. Enright, S. Wesołowski: Sarcoidosis patient: Do we need to perform 95

plethysmography when spirometry and DLCO were done? ERJ 38(suppl 55); 2011:647s (P3608) Uzyskane dotychczas wyniki badań pomocne były w opracowaniu rozdziału Zaburzenia czynności płuc w chorobach śródmiąższowych w przygotowywanej monografii Choroby śródmiąższowe płuc. (Zad 7.1) Ocena odpowiedzi limfocytów krwi obwodowej na antygeny swoiste dla Mycobakterium tuberculosis (ESAT-6, CFP 10) u chorych z sarkoidozę (BBS), oznaczaną testem Quantiferon TB Gold. W 2011r. z grupy 74 chorych hospitalizowanych w I Klinice z klinicznym podejrzeniem sarkoidozy wstępnie do badania zakwalifikowano 60 osób, od których pobrano krew żylną celem wykonania testu QFT TB Gold in Tube oraz wykonano skórny odczyn tuberkulinowy. Ostatecznie w opracowywaniu uwzględniono wyniki uzyskane od 51 chorych. 9 chorych zostało na tym etapie wykluczonych z badania. U 6 chorych nie uzyskano potwierdzenia histopatologicznego (3 chorych nie wyraziło zgody na dalszą diagnostykę, 3 jest w trakcie diagnostyki), u 1 chorego postawiono rozpoznanie gruźlicy, 2 osoby okazały się być zdrowe. Wśród 51 chorych było 36 mężczyzn i 25 kobiet. Średnia wieku wynosiła 37,8±9,5, mediana 35.W zebranej grupie 24 chorych (47,1%) miało sarkoidozę w stadium I, 24 chorych miało rozpoznaną sarkoidozę w stadium II, 3 chorych miało sarkoidozę w stadium IV. Wśród 51 chorych 35 chorych (68,6%) miało ujemny odczyn tuberkulinowy (odpowiadający naciekowi 0 mm), 6 chorych (11,8%) miało dodatni odczyn tuberkulinowy (>=10 mm) Wynik testu Quantiferon TB Gold był ujemny u 47 (88,2%) chorych, u 4 był dodatni.tylko w przypadku 1 osoby z dodatnim wynikiem OT wynik QFT był także dodatni. Wniosek:Test Quanitiferon TB Gold może być pomocny w wykluczeniu zakażenia prątkiem gruźlicy u chorych na sarkoidozę z dodatnim odczynem tuberkulinowym. Badania stanowią podstawę pracy na stopień doktora medycyny lek. med. A Kempisty. Przewód doktorski z tego tematu został otwarty w 2011r. (Zad 7.2) Ocena aktywności prozapalnych interleukin w BAL- u chorych na samoistne organizujące się zapalenie płuc oraz ich związek z odpowiedzią na leczenie klarytro- mycyną. W okresie od 1999 do 2011, 35 chorych na kryptogenną postać OZP (25 kobiet i 10 mężczyzn) było leczonych klarytromycyną (KLA). Wiek chorych wahał się granicach od 42-74 lat i wynosił średnio 56 lat. Dwudziestu ośmiu chorych nigdy nie paliło tytoniu, 5 było expalaczami a 2 osoby paliły papierosy. Rozpoznanie ustalono na podstawie badania klinicznego, radiologicznych oraz biopsji otwartej płuca u 17 chorych, zaś u 18 na podstawie biopsji taransbronchialnej płuca. Najczęściej notowanymi objawami były: duszność (82%), kaszel (90%), osłabienie (62%), gorączka (80%), utrata masy ciała (21%), poty (39%), bóle w klatce piersiowej (32%). Badaniami radiologicznymi uwidoczniono w 33 przypadkach obustronne nacieki zapalne z obszarami matowej szyby, w jednym przypadku chory miał zlokalizowany naciek w górnym polu płuca lewego, 5-u miało zmiany guzkowe zaś u 6 chorych stwierdzono powiększone węzły chłonne. Migrowanie nacieków płucnych obserwowano u 22 chorych (66%). 96

U wszystkich chorych podano KLA w dawce 0,5g b.i.d, uzyskując ustąpienie choroby w 25 przypadkach (80%). Całkowitą regresję zmian po 3-miesięcznym leczeniu KLA stwierdzono w 21 przypadkach oraz 4 dodatkowych po wydłużeniu leczenia do czterech miesięcy. W siedmiu przypadkach nie obserwowano poprawy po leczeniu KLA co było powodem wdrożenia prednizonu, na którym to uzyskano ustąpienie objawów choroby, 3 chorych jest w trakcie leczenia z poprawą. Czas obserwacji wynosił średnio 46 mies. i wahał się w granicach od 2 do 124 miesięcy. U 28 chorych wykonano BAL. Wszyscy chorzy nie palili tytoniu ale 6 było ex-palaczami. Średni wiek chorych wynosił 57,3 lat (41-76 lat). Otwarta biopsja płuca była podstawą diagnozy u 16 chorych a transbronchialna u 12 chorych. Najczęściej zgłaszanymi objawami były: duszność (80%), kaszel (84%), osłabienie (60%), gorączka (64%), utrata masy ciała (64%), poty (30%), ból w klatce piersiowej (18%). Radiologicznie stwierdzano obustronne zagęszczenia zapalne z powietrznym bronchogramem oraz ogniska matowej szyby u 27 chorych a u 1 chorego jednostronne zmiany zlokalizowane w górnym polu płuca prawego. Zmiany o typie siateczki wykryto u 4 chorych, guzkowe u jednego chorego oraz u 5 osób powiększenie węzłów chłonnych. Migrowanie nacieków uwidoczniono u 20 chorych (71%). Dwudziestu chorych leczono Klaritromycyną (CLA) w dawce 2x0,5/d przez 3 miesiące a siedmiu prednizonem (P). U jednej osoby obserwowano samoistną spontaniczną regresję choroby. U 2 chorych leczonych CLA i 5 leczonych prednizonem (P) obserwowano nawrót choroby. W jednym przypadku BAL był w granicach normy. Obniżoną liczbę makrofagów i limfocytozę w BAL stwierdzono u 6 (86%) chorych z nawrotem i 16 (76%) chorych z jednym epizodem OZP. Eozynofile w liczbie pomiędzy 3% do 20% w BAL wykazano u 4 (57%) chorych z nawrotem i 18 (86%) bez nawrotu. Ośmiu chorych miało podwyższoną liczbę neutrofili w BAL, 3 (41%) w grupie z nawrotem i 5 (24%) w grupie bez nawrotu choroby. Obniżony wskaźnik CD4/CD8 poniżej 0,7 wykazano u jednego chorego 1 (14%) w grupie z nawrotem choroby i u 5 (24%) chorych bez nawrotów. Nawroty COP obserwowano częściej wśród chorych na COP leczonych prednizonem. Obserwowano zróżnicowanie charakterystyki komórkowej BAL u chorych z nawrotami i bez, nie osiągnęły one jednak różnicy statystycznej materiał i wyniki przedstawiono tabeli 1 i 2. (Zad. 7.3) Rola procesów immunologicznych w patomechanizmie śródmiąższowych chorób płuc ze szczególnym uwzględnieniem ich roli w progresji procesu chorobowego w układzie oddechowym. W ramach niniejszego tematu opublikowano pracę analizującą wartość diagnostyczną cytometrycznego oznaczenia expresji markerów CD4 + i CD8 + oraz ich stosunku w komórkach izolowanych z materiału uzyskanego z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) od pacjentów z chorobami śródmiąższowymi płuc. Wykazano, że metoda cytometrii przepływowej z zastosowaniem panelu przeciwciał standaryzowanych dla krwi oraz bramkowaniem limfocytów CD3 + w układzie trójbarwnym zapewnia tanie, wiarygodne i szybkie określanie wartości CD4/CD8 w BAL, pozwala też unikać błędów technicznych i interpretacyjnych typowych dla metody immunoenzymatycznej w fenotypowaniu limfocytów 97

CD4 + /CD8 +. Wnioski metodologiczne wypływające z niniejszej publikacji zostały zastosowane w rutynowej analizie materiału diagnostycznego w laboratorium Instytutu. W ramach zadania analizowano również expresję liganda Fas (FasL) w dolnych drogach oddechowych chorych na śródmiąższowe choroby płuc przebiegające z włóknieniem. Ocenie poddano zarówno frakcję błonową na powierzchni makrofagów pęcherzykowych (MF) i limfocytów (L), jak również frakcję rozpuszczalną obecną bezpośrednio w nadsączu BAL (sfasl). W materiale pozyskanym od chorych na samoistne śródmiąższowe włóknienie płuc (IPF) wykazano istotny wzrost stężenia sfasl, odsetka M FasL + oraz komórek CD8 + FasL +. Podwyższony odsetek tych frakcji komórkowych był również obecny w azbestozie. U chorych na alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych (AZPP) obserwowano istotnie wyższy poziom sfasl oraz obniżony odsetek M FasL +. Stwierdzono zależności w analizie korelacji, gdzie wykazano związek pomiędzy expresją CD4 + FasL + oraz CD8 + FasL + a neutrofilią w BAL, która jest niekorzystnym czynnikiem rokowniczym w przebiegu włóknienia płuc. Powyższa analiza wydaje się wskazywać na istotny udział układu Fas - FasL w regulacji aktywności populacji makrofagów pęcherzykowych i limfocytów, zwłaszcza cytotoksycznych, w patomechanizmie IPF. (Zad 7.4) Analiza wyników otwartych biopsji płuca w chorobach śródmiąższowych. Zadanie badawcze jest kontynuacją przedsięwzięcia z poprzednich lat. W 2011r uzupełniono ewidencję chorych z lat 2010-2011 o 85 przypadków (około 40 zabiegów rocznie). Wynika z tego, że liczba chorych kierowanych na otwartą biopsje płuca w celach diagnostycznych choroby śródmiąższowej płuc nie zmienia się istotnie od kilkunastu lat. W dalszym ciągu część chorych jest kierowana bezpośrednio z innych szpitali do Kliniki Chirurgii, skąd po wykonaniu badań diagnostycznych są odsyłani do rodzimego ośrodka z wynikiem badania histologicznego. Chorzy, u których wynik badania histologicznego nie jest jednoznaczny wracają do Instytutu Gruźlicy w celu ustalenia rozpoznania klinicznego i wdrożenia leczenia. W przeciwieństwie do tendencji ostatnich lat, w latach 2010 i 2011 największą grupę (16/85) stanowili chorzy na sarkoidozę. Z dostępnej dokumentacji radiologicznej wynika, że zmiany były tak nietypowe, że otwarta biopsja płuca była niezbędna dla ustalenia ostatecznego rozpoznania. W 12 przypadkach rozpoznano organizujące się zapalenie płuc- dalszego dochodzenia wymaga sprawdzenie, czy podejmowano próby ustalenia rozpoznania biopsją przezoskrzelową. Do najciekawszych i chyba najmniej spodziewanych należą przypadki zakażeń oportunistycznych- grzybiczego, promieniczego i pneumocystowego, nie wspominając o gruźliczym. Odpowiedź na pytanie o miejsce otwartej biopsji płuca w diagnostyce chorób śródmiąższowych w dobie staje się trudne wobec uznawania coraz większej roli badania radiologicznego np. w rozpoznawania samoistnego włóknienia płuc. Wydaje się, że dalsza analiza pozwoli przede wszystkim określić, które dane z wyniku badania histologicznego (takie jak jednoczasowość czy odwracalność zmian) są istotne dla dalszego postępowania 98

w przypadkach opisywanych jako NSIP, czy OP. Będzie to przedmiotem badania w przyszłym roku. (Zad 7.5) Zajęcie serca w przebiegu sarkoidozy. W roku 2011 głównym celem była kontynuacja zbierania materiału, czyli wyodrębnienie grupy chorych na sarkoidozę, u której doszło do zajęcia serca w przebiegu choroby podstawowej. Od 1 listopada 2010 roku do końca października 2011 roku w IGICHP hospitalizowano z rozpoznaniem sarkoidozy 807 chorych. W tej grupie rozpoznanie sarkoidozy wielonarządowej (D86.8) dotyczyło 131 osób (16.2%), co stanowi nieco wyższy odsetek niż w latach poprzednich. W tej grupie chorych u 16 osób rozpoznano zajęcie serca w przebiegu sarkoidozy udokumentowane badaniem rezonansu magnetycznego (MRI) serca. W grupie tej było 10 mężczyzn (62.5%) i 6 kobiet. W obecnej chwili trwa dalsza analiza danych klinicznych wyselekcjonowanej grupy chorych. (Zad 7.6) Rola cytokin w immunopatogenezie sarkoidozy. Oceniono zależności miedzy nasileniem miejscowego stanu zapalnego, mierzonego stężeniem TNF α w popłuczynach oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) pobranych od chorych na przewlekłą postać sarkoidozy a fenotypem choroby. U 184 chorych na sarkoidozę rozpoznaną na podstawie obrazu klinicznego, radiologicznego oraz potwierdzoną badaniem histopatologicznym wykonano oznaczenie stężenia TNFα w popłuczynach pęcherzykowo-oskrzelikowych. Oceniono korelacje między TNFα w BALu a innymi cytokinami w BALu (IL2, IL2R, IL12, IL10, TGFβ), cytokinami w surowicy (IL12, IL10, TGFβ), surowiczymi markerami biologicznymi stanu zapalnego (ACE, CRP, proteinogramem), markerami osoczowymi stanu układu krzepnięcia krwi (Ddimery, fibrynogen), wskaźnikami aktywności metabolicznej choroby (Ca, P w surowicy i dobowej zbiórce moczu) oraz wskaźnikami klinicznego przebiegu choroby: wiekiem, pacjentów, czasem trwania choroby, wskaźnikami czynnościowymi płuc (zmierzonym w 6MWT oraz w mechanice oddychania), lokalizacją pozapłucną (zajęcie wątroby, śledziony) Analizując zależność między stężeniem TNFα w BALu a stężeniami innych cytokin w BAL i surowicy stwierdzono statystycznie istotne silne korelacje dodatnie z receptorem dla IL2 w BAL (r=0,4676, p=0,0001), IL12 w BAL (r=0,4545, p=0,0001) i surowicy (r=0,26, p=0,001) oraz IL10 (r=0,2832, p=0,001) i TNFα (r=0,1871, p=0,12) w surowicy. Wyższe stężenia TNFα w BAL kojarzą się z nasileniem niespecyficznego stanu zapalnego: stwierdzono dodatnią korelację z białkiem CRP (r=0,2427, p=0,003), ujemną z poziomem albumin (r=-0,1746, p=0,024) i dodatnią z poziomem gammaglobulin w surowicy (r=0,1648, p=0,033). 99

Stwierdzono także dodatnią korelację z Ddimerami osoczowymi (r=0,1685, p=0,035), bez związku z poziomem fibrynogenu. Stężenie TNFα w BAL nie miało wpływu na metabolizm wapnia i fosforu. Stwierdzono statystycznie istotną korelację dodatnią miedzy wiekiem pacjentów a stężeniem TNFα w BAL (r=0,16, p=0,029), ale nie znaleziono związku z długością trwania choroby. Stężenie TNF α w BAL nie miało wpływu na wskaźniki pojemnościowe płuc oraz na dyfuzję dla CO. Stwierdzono statystycznie istotną korelację ujemną z wartością FEV1 (r=-0,1464, p=0,05), bez wpływu na występowanie obturacji oskrzeli (wsk Tiffeneau). Jednocześnie nie obserwowano zależności między tolerancją wysiłku (występowaniem duszności, długością przebytego dystansu, saturacją końcową i początkową, stopniem desaturacji podczas 6min testu marszu), a stężeniem TNFα w BAL. Nie obserwowano korelacji między wielkością wątroby, śledziony, stężeniem enzymów wątrobowych w surowicy, wielkością wskaźnika protrombinowego a TNFα w BAL. Stwierdzono słabą ale statystycznie istotną korelację ujemną z limocytozą (r=-0,1532, p=0,098) i monocytozą (r=-0,1788, p=0,015) krwi obwodowej. W zbadanej grupie chorych na przewlekłą postać sarkoidozy stwierdzono, że: Nasilenie miejscowe stanu zapalnego, mierzone poziomem TNFα w BAL, współistnieje z nasileniem stanu zapalnego na obwodzie (mierzonego stężeniem cytokin oraz niespecyficznych markerów biologicznych stanu zapalnego). Nasilenie miejscowe stanu zapalnego mierzone stężeniem TNFα w BAL, nie ma wpływu na aktywność metaboliczną choroby (gospodarkę wapniowo fosforanową), czynność układu oddechowego (wskaźniki czynnościowe płuc, tolerancje wysiłku) oraz na rozległość procesu chorobowego (lokalizacje pozapłucną) (Zad 7.7) Wczesne wykrywanie nadciśnienia płucnego i jego kliniczne znaczenie u chorych na śródmiąższowe choroby płuc. Zadanie badawcze rozpoczęto od 06.2008r. W okresie od 01.01.2009r. do 31.10.2010r. włączono do badania 40 pacjentów na choroby śródmiąższowe płuc. W 2011r. do badania włączono kolejnych 8 pacjentów. Badana grupa liczy obecnie 48 chorych (7 kobiet i 41 mężczyzn; średni wiek: 48,75±13,91 lat, mediana 50, zakres 24-77 lat, 21 niepalących, 14 ex palaczy i 11 palących papierosy) kolejno przyjmowanych do I Kliniki Chorób Płuc IGiChP, u których w trakcie badań diagnostycznych rozpoznano sarkoidozę (n=23; stadium 1 7; stadium 2 13; stadium 3-2 chorych, stadium 4 1 chory), AZPP (n=9) lub SWP (n=13) i DIP (n=3) oraz którzy spełniali kryteria włączenia/wyłączenia. W trakcie badań diagnostycznych wykonywano badania radiologiczne klatki piersiowej, w tym tomografię komputerową klatki piersiowej, gazometrię spoczynkową, platyzmografię oraz pomiar DLco, 6-minutowy test marszu, jak również badanie echokardiograficzne (ECHO) z oceną cech przeciążenia prawej komory serca i oszacowaniem skurczowego ciśnienia w tętnicy płucnej w ciągu 24 godzin od badania ECHO serca pobierano krew na oznaczenie probnp. 100

U 47 chorych wykonano 6-minutowy test marszu; średni dystans wyniósł: 538,04±101,35 m, średnia saturacja w spoczynku wyniosła 95,85±2,34% (zakres 86 do 99%); natomiast średnia saturacja w 6 minucie wysiłku wyniosła 90,89±6,12% (zakres od 74 do 98%); średni spadek saturacji wyniósł: 4,96±4,39%, mediana 3 (zakres od 0 do 19%). Każdy chory miał ponadto wykonane badanie spirometryczne + pletyzmografię i ocenę zdolności dyfuzji dla tlenku węgla. U 6 pacjentów stwierdzono obturacyjne zaburzenie wentylacji, u 10 pacjentów stwierdzono restrykcję, natomiast upośledzenie DLCO wykazano u 36 pacjentów; średnie DLCO wyniosło 62,96±23,02% wartości należnej, mediana 66% w.n. (zakres od 15 do 111% w.n.). W wykonanym ECHO serca stwierdzano następujące nieprawidłowości: powiększenie prawej komory serca u 12 pacjentów, poszerzenie pnia płucnego u 3, dyssynchronię skurczu przegrody międzykomorowej u 5 pacjentów, spłaszczenie przegrody międzykomorowej u 2, przerost LK u 6 pacjentów, nieznaczne powiększenie LK u 4 chorych, powiększenie prawego przedsionka u 9, a lewego u 5 badanych oraz dyskretną hipokinezę ściany dolnej u 2 chorych na sarkoidozę. Oszacowanie skurczowego ciśnienia w tętnicy płucnej było możliwe u 41 pacjentów; średnie TVPG max. wynosiło 29,29±8,28 mmhg; mediana 27 mmhg (zakres 17 do 65 mmhg). Średnia wartość oznaczonego probnp wyniosła 104,42 ±271,12 pg/ml; mediana 42,16 pg/ml (zakres od 5 do 1833 pg/ml). (Zad 7.8) Zespół włóknienia płuc i rozedmy częstość występowania, znaczenie kliniczne oraz czynniki rokownicze. Zadanie badawcze prowadzone jest od 04.01.2010. W 2011r. wyodrębniono grupę 70 chorych (23 kobiety, 47 mężczyzn) na śródmiąższowe włóknienie płuc, u których możliwa była ocena zmian w tomografii komputerowej płuc techniką wysokiej rozdzielczości (TKWR). Średnia wieku w badanej grupie wyniosła 62,77±9,38, okres obserwacji wahał się od 0,5 miesiąca do 128 miesięcy, średnio 32,99±26,69 miesięcy. W badanej grupie było aktualnych 15 palaczy papierosów, 27 ex palaczy oraz 23 osoby niepalące; średnia liczba paczkolat wynosiła 19,9±21,65. Najczęstszym zaburzeniem w badaniach czynnościowych było upośledzenie DLCO; średnie DLCO wynosiło 42,4±13,55% w.n., Średnie TLC 78,94±16,08 w.n., VC 84,33±22,35. W oparciu o badanie TKWR podzielono chorych na następujące grupy: chorzy z pewnym rozpoznaniem samoistnego włóknienia płuc bez rozedmy (25 pacjentów), chorzy z pewnym rozpoznaniem samoistnego włóknienia płuc i rozedmą (17 chorych), chorzy na inne śródmiąższowe zapalenie płuc bez rozedmy (18 pacjentów) oraz chorzy na inne śródmiąższowe zapalenie płuc z rozedmą (10 pacjentów). Badanie ECHO serca wykonano u 48 pacjentów w okresie 1 roku od ustalenia rozpoznania. Ocena TVPG możliwa była u 41 pacjentów; średnie TVPG wyniosło 32,02±8,85. W ocenianej grupie chorzy z pewnym rozpoznaniem samoistnego włóknienia płuc w oparciu o TKWR i kryteria kliniczne stanowili 60% grupy chorych z rozpoznaniem śródmiąższowego włóknienia płuc. Stosunkowo często w badanej grupie stwierdzono obecność rozedmy zajmującej 10% miąższu płuc w ocenie radiologa chorzy z cechami śródmiąższowego włóknienia płuc i rozedmą stanowili 39%. W dalszym etapie planowane jest uzupełnianie grupy chorych oraz analiza statystyczna porównująca poszczególne podgrupy. (Zad 7.9) 101

Ocena parametrów epidemiologicznych, klinicznych oraz prognostycznych u chorych na histiocytozę z komórek Langerhansa Zebrano dane dotyczące 62 chorych na histiocytozę z komórek Langerhansa z zajęciem płuc (31 kobiet i 31 mężczyzn), zdiagnozowanych i leczonych w III Klinice IGICHP w okresie ostatnich 13 lat. Średnia wieku wynosiła 34,3+/-13 lat. Wszyscy chorzy byli palaczami tytoniu aktualnymi lub ex- palaczami (7 osób zaprzestało palenia na 1-8 miesięcy przed przyjęciem) i palili, 5-60 paczkolat (średnio 15,4-/-4,2 paczkolat). Rozpoznanie opierało się na badaniu histologicznym specimenów z biopsji otwartej płuca w przypadku 54 chorych, 2 z biopsji żuchwy, 1z biopsji kości, 2 biopsji wątroby i w jednym przypadku z biopsji węzłów chłonnych. Charakterystyczny obraz HRCT oraz obecność powyżej 16% komórek CD1a dodatnich w BAL był podstawą diagnozy u dwóch chorych. Tylko w 2 przypadkach młodych mężczyzn postawiono prawdopodobne rozpoznanie PLCH na podstawie charakterystycznego obrazu klinicznego i radiologicznego. Czas obserwacji wahał się od 2 do 228 miesięcy, średnio 64,4 +/- 54,2 mies. U 7 (11,3%) chorych wykryto zmiany kostne, a u 10(16,3%) moczówkę prostą, u 2 chorych cholagitis sclerosans, u 2 zmiany skórne, 2 w obrębie OUN. Najczęściej notowanymi objawami były: kaszel (94%), osłabienie (94%), duszność wysiłkowa (53%), ból w klatce piersiowej (20%) i utrata masy ciała (5%). Odmę opłucnową w przebiegu choroby zanotowano u 27% chorych. W HRCT klatki piersiowej zmiany guzkowe stwierdzono u wszystkich chorych w natomiast cysty i różnokształtne torbielki najbardziej nasilone w górnych i środkowych polach płucnych u 61 (98%) chorych zaś zmiany siateczkowate w 5 (9%) przypadkach, u jednego chorego tylko zmiany guzkowe. Upośledzenie parametrów wentylacyjnych stwierdzono u 36 (55%) chorych, FVC<80%n- u 21 chorych, FEV1,80%n,- u 36 chorych, TLC <80%n-9 chorych, a TLC > 120% u kolejnych 6 chorych. Wskaźnik dyfuzji dla CO poniżej 80% n. zanotowano w 53 (85%) przypadkach. Pięciu chorych nie przeszło zamierzonego dystansu w 6MWT a 15 desaturowało znacząco w tym teście. W chwili diagnozy cechy niewydolności oddechowej stwierdzono u 3 chorych a w okresie obserwacji u kolejnych 8 chorych. Obserwowano bez leczenia 38 osób zalecając jedynie zaprzestanie palenia tytoniu. W przypadku 35 chorych nastąpiła samoistna poprawa z następową stabilizacją, a u 3 chorych pogorszenie. W przypadku 24 osób zastosowane było leczenie immunosupresyjne. Enkortonem ogólnie lub u 2 osób miejscowo -injekcje sterydu do zmian kostnych. U 11 osób zastosowano leczenie zgodnie ze schematem LCH-ADULT-1. U dwóch chorych na tym leczeniu doszło do pogorszenia. Jedną chorą leczono 2-CdA z poprawą, zaś w jednym przypadku z dominującą niewydolnością wątroby przekazano do ośrodka zajmującego się przeszczepianiem wątroby i szpiku, ale niestety w okresie oczekiwania na przeszczep chory zmarł. Dwoje chorych zmarło w przebiegu zaostrzenia niewydolności oddechowej związanej z progresją POCHP i towarzyszącego zakażenia. Jeden chory poddany był jednostronnemu 102

przeszczepowi płuca z sukcesem. Zabezpieczono BAL oraz surowice celem pogłębienia badań immunologicznych. Prowadzone badania przyczyniają się do znacznie częstszego diagnozowania chorób rzadkich w tym histiocytozy i stanowią wsparcie idei organizowania rejestru chorób rzadkich. Stanowią implikacje do rozważania nowych schematów leczenia postaci wieloogniskowej. (Zad 7.10) Zmiany oczne u chorych na sarkoidozę Celem pracy było wykazanie częstości zmian ocznych u chorych na sarkoidozę. Każdy chory miał wykonane badanie okulistyczne, w tym badanie dna oka, badanie tonometryczne, test Schirmera i badanie w lampie szczelinowej, radiogram klatki piersiowej, USG j. brzusznej, EKG, mechanikę oddychania lub spirometrię. Przebadano zaplanowaną liczbę 20 chorych w tym 6 chorych w stadium I, 10 w stadium II sarkoidozy, 4 osób w stadium III. U 2 osób wykryto zmiany oczne 1 miała nawrotowe zapalenie tęczówek obu oczu, zmiany w siatkówce z ubytkiem pola widzenia OL przebiegu procesu zapalnego błony naczyniowej oraz zapalenie n. II, 1 jaskrę i zaćmę obu oczu po przebytym zapaleniu naczyniówki. 1 osoba wymagała leczenia miejscowego kroplami sterydowymi i Encortonem 40mg/d z powodu zajęcia narządu wzroku z współistniejącymi zaburzeniami gospodarki Ca-P (hiperkalciuria), 1 osoba w przeszłości leczona miejscowo sterydami teraz wymagała tylko objawowego leczenia jaskry. Przy okazji badań wykryto u chorych na sarkoidozę przyczyny zaburzeń widzenia niezwiązane z sarkoidozą: 1 zmiany w siatkówce zagrażające odwarstwieniem wymagające laserowania, u 1 osoby czasowy ubytek w polu widzenia związany z TIA (RM, CT głowy wykluczyły zajęcie OUN, badanie okulistyczne zajęcie oczu). W ramach zadania badawczego przebadano 320 chorych w wieku 22-68 lat. 150 chorych było w stadium I, 141 w II, 29 w III. U 50 chorych, czyli u 15% stwierdzono zmiany w narządzie wzroku (guzki w powiekach i spojówkach, zespół suchego oka, przewlekłe zapalenie błony naczyniowej, zarówno w przednim, jak i tylnym odcinku oka, jaskrę wtórną, zaćmę, zapalenie żył siatkówki, obrzęk tarczy nerwu wzrokowego, guz oczodołu). U 5 osób zmiany w narządzie wzroku poprzedzały pojawienie się zajęcia innych narządów w tym klatki piersiowej, u 2 rozpoznanie sarkoidozy z różnoczasowymi zmianami w klatce piersiowej sugerowali okuliści -1 osoba trafiła do Instytutu wm po wykonaniu biopsji z guza oczodołu w Klinice Okulistycznej AM (rozpoznanie histologiczne sarkoidozy potwierdzone w IGiChP) z sarkoidozą w fazie I w RTG klatki piersiowej, potwierdzone w CT COMBINE klatki piersiowej powiększenie węzłów chłonnych wnęk i śródpiersia i 2 ogniska zagęszczeń w miąższu płuca prawego, 6 osoba trafiła z ciężkim zapaleniem błony naczyniowej obu oczu z jaskra wtórną, z sarkoidozą w fazie I w RTG kl. piersiowej (rozpoznanie histologiczne postawiono na podstawie mediastinoskopii). Zajęcie narządu wzroku jest jednym z istotnych narządów zajmowanych w przebiegu sarkoidozy. W przypadku zagrożenia widzenia jest jednym ze wskazań do wdrożenia sterydów w dużych dawkach. Zmiany te w większości przypadków udaje się skutecznie 103

leczyć i zabezpieczyć chorego przed utratą lub osłabieniem ostrości wzroku. Dlatego każdy chory z sarkoidozą powinien mieć szczegółowe badanie okulistyczne. (Zad 7.11) Ocena ryzyka wystąpienia osteoporozy u chorych na sarkoidozę płuc. Wśród chorych na sarkoidozę, u około 10-15% pacjentów stwierdza się hiperkalcemię i związane jest to z ektopowym wydzielaniem 1,25 hydroksykalcyferolu (kalcitriolu) produkowanego przez makrofagi w miejscu ziarniakowego zapalenia. Hiperkalcemia może być zjawiskiem przejściowym, ale może też utrzymywać się przez dłuższy okres czasu, w zależności od aktywności choroby. Biorąc pod uwagę możliwość zaburzeń gospodarki wapniowej w przebiegu sarkoidozy i ewentualne ich nasilenie w przypadku konieczności zastosowania leczenia steroidami, badanie mające na celu ustalenia czynników ryzyka wystąpienia osteopenii/osteporozy w przebiegu naturalnej historii choroby jest niezwykle interesujące. W kilku ostatnio opublikowanych pracach wykazano, że leptyna (LP), hormon wytwarzany przede wszystkim przez komórki białej tkanki tłuszczowej, może wpływać na metabolizm tkanki kostnej. Wiadomo, że wpływ na układ kostny poza kalcytoniną, parathormonem, witaminą D 3, estrogenami i androgenami, hormonem wzrostu, mają również substancje o działaniu parakrynnym takie jak: czynnik martwicy nowotworów (TNF-α), czy interelukiny 1 i 6 (Il-1, Il-6). Przyjmuje się, że we wczesnym okresie życia LP może bezpośrednio stymulować wzrost kości na długość i grubość, natomiast w dojrzałym szkielecie może pośrednio hamować tworzenie tkanki kostnej (działając na podwzgórze) lub bezpośrednio pobudzać kościotworzenie i/lub hamować resorpcję kości za pośrednictwem systemu RANKL/RANK/OPG. Celem pracy jest ocena wpływu różnych czynników na występowanie osteopenii lub osteoporozy, u chorych na sarkoidozę. Do badania zakwalifikowano 100 nie spokrewnionych, chorych na sarkoidozę. Wszyscy badani to pacjenci, którzy pozostawali pod opieką lekarską w Poradni Sarkoidozy, Przychodni Przyklinicznej przy Instytucie Gruźlicy i Chorób Płuc lub pacjenci hospitalizowani w IGiChP. Kryteria wykluczenia obejmowały: unieruchomienie, choroby szpiku kostnego, choroby przewodu pokarmowego, trzustki, wątroby, przewlekłe choroby nerek, choroby nowotworowe, spichrzeniowe, leczenie w przeszłości steroidami doustnymi, wziewnymi, dożylnymi, rozpoznana u pacjenta osteopenia i/lub osteoporoza, kobiety w okresie pomenopauzalnym, wiek > 65 roku życia, nadczynność i niedoczynność kory nadnerczy, nadczynność i niedoczynność tarczycy, cukrzyca, nadczynność przytarczyc, niedoczynność gruczołów płciowych (jądra, jajniki), niedobory hormonu wzrostu, choroby narządu ruchu i tkanki łącznej, przysadki, przewlekłe stosowanie niektórych leków (padaczkowych, cholestyraminy, heparyny, cyklosporyny, metotrexatu, leków prątkowych), nadużywanie alkoholu, kawy, herbaty, niedożywienie. Zbierano wywiad odnośnie historii palenia. 104

Pomimo przygotowania materiału od 100 chorych na sarkoidozę pełne oznaczenia czyli leptyny, TNF-α, IL-1 i IL-6 udało się wykonać u 85 osób. Najczęstszą przyczyną niepowodzenia była zła jakość zamrożonego materiału. Do badanej grupy zakwalifikowano 85 chorych (46 i 39 ) na sarkoidozę, u których rozpoznanie ustalono na podstawie badania histopatologicznego. Średnia wieku wynosiła 41±9 lat i nie różniła się w grupie kobiet i w grupie mężczyzn. Średni czas obserwacji to 27 ± 31 miesięcy i był podobny w obu grupach. Średnie stężenie leptyny w surowicy 539 ± 273 pg/ml, w grupie kobiet wynosiło ono 483,4 pg/ml, a w grupie mężczyzn 584 pg/ml. Średnie stężenie TNF-α 3,2 ± 3,9 pg/ml, w tym w grupie kobiet 3,73 pg/ml, a wśród mężczyzn 2,79 pg/ml. Średnie stężenie IL-1 4,7 ± 1,8 pg/ml, w grupie kobiet 4,67 pg/ml, mężczyzn 4,72 pg/ml, a średnie stężenie IL-6 to 1,2 ± 3,0 pg/ml, przy czym w grupie kobiet było to 2,0 pg/ml i 0,68 pg/ml w grupie mężczyzn. Wszyscy pacjenci mieli wykonane badanie radiologiczne klatki piersiowej, badania czynnościowe oraz ultrasonograficzne jamy brzusznej. Oznaczono stężenia osteokalcyny, crosslinków, hormonu tyreotropowego, wapnia, fosforu i magnezu w surowicy oraz dobowe wydalanie tych elektrolitów, stężenia fosfatazy alkalicznej, kreatyniny. Wszyscy badani chorzy mieli wykonaną densytometrię. Wskaźnik masy ciała (BMI) u 32 chorych był prawidłowy (18,5 24,5 kg/m²), u 32 osób stwierdzono nadwagę (25-29,9 kg/m²), u 20 otyłość (> 30 kg/m² ), a u jednej niedowagę BMI < 18 kg/m². Ze wstępnej analizy statystycznej wynika, że im wyższe BMI, tym wyższe stężenie leptyny (ryc 1.), jest to zgodne z wynikami innych badań. Wykazano również, że im wyższe stężenie leptyny, tym wyższy poziom fosfatazy zasadowej w surowicy (p= 0,03) oraz niższe T score (masa kostna). Słabą, dodatnią korelację stwierdzono pomiędzy stężeniem leptyny, a stężeniem wydalanego wapnia, fosforu i magnezu w dobowej zbiórce moczu. Jesteśmy w trakcie analizy statystycznej zebranego materiału. Zgodnie z harmonogramem planujemy przygotować abstrakt pracy na konferencję ERS w 2012. (Zad 7.12) 105

Ryc.1 (7.12). Rola metotrexatu w leczeniu sarkoidozy. Spośród chorych zakwalifikowanych w latach 2006-2009 do leczenia metotrexatem (MTX) 43 chorych na przewlekłą postać sarkoidozy zostało zakwalifikowanych do wstępnego podsumowania wyników terapii. W badaniu uczestniczyli chorzy, u których rozpoznano przewlekłą postępującą postać sarkoidozy na podstawie następujących kryteriów: rozpoznanie choroby ustalono na podstawie typowego obrazu radiologicznego i klinicznego oraz potwierdzono badaniem histopatologicznym wycinków z zajętego przez sarkoidozę narządu. czas trwania choroby do chwili włączenia leczenia wynosił najmniej 5 lat. w trakcie obserwacji stwierdzono utrzymywanie się zmian śródmiąższowych w płucach lub progresje zmian w badaniu TK klp, któremu towarzyszyło pogorszenie wskaźników czynnościowych płuc w mechanice oddychania: VC lub TLC o przynajmniej 10% w stosunku do badania wyjściowego, lub DLCO o przynajmniej 20% w stosunku do badania wyjściowego. chorzy zgłaszali subiektywne pogarszanie się tolerancji wysiłku lub inne dolegliwości ze strony układu oddechowego, które w Ich ocenie wpływały niekorzystnie na jakość życia. U wszystkich chorych wykonano badanie TK klp z oceną zmian węzłowych i śródmiąższowych oraz zmian o charakterze włóknienia płuc. U wszystkich chorych wykonano badania oceniające czynność układu oddechowego: mechanikę oddychania oraz u części chorych wykonano 6 minutowy test chodu. Oceniono obecność obturacji oskrzeli, restrykcji oraz upośledzenia zdolności dyfuzyjnej płuc. Nieprawidłową tolerancję wysiłku rozpoznano u chorych, u których dystans marszu podczas 6 minutowego test marszu był krótszy niż oczekiwany i/lub u których saturacja końcowa była <90% i/lub w trakcie marszu spadek saturacji krwi tętniczej był >4%. U wszystkich chorych wykonano badania dodatkowe: laboratoryjne badanie krwi oraz badanie obrazowe, celem oceny rozległości procesu chorobowego-wykrycie sarkoidozy układowej. Chorzy, u których na podstawie obrazu ultrasonograficznego lub badań biochemicznych krwi podejrzewano sarkoidozę 106