ROŚLINY OLEISTE OILSEED CROPS 34 (2): 187-204 2013 Magdalena Walkowiak, Maria Ogrodowczyk Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin Państwowy Instytut Badawczy, Oddział w Poznaniu Autor korespondencyjny M. Walkowiak, e-mail: magda@nico.ihar.poznan.pl DOI: 10.5604/12338273.1101233 Wstępne badania nad optymalizacją warunków indukowania mutacji dla uzyskania nowej zmienności u maku (Papaver somniferum L.) * Preliminary investigation on optimum condition to induce mutation for development new variability in opium poppy (Papaver somniferum L.) Słowa kluczowe: mak (Papaver somniferum L.), mutageneza chemiczna i fizyczna, zawartość alkaloidów, morfina, kodeina, tebaina Streszczenie Celem prowadzonych badań było znalezienie optymalnych metod indukowania mutagenezy dla uzyskania nowej zmienności głównych alkaloidów maku: morfiny, tebainy i kodeiny. Materiał do badań stanowiły genotypy linii hodowlanych pochodzące z rekombinantów różnych form maku wysokomorfinowego z kolekcji IHAR-PIB oraz wysokomorfinowa odmiana Lazur. Badania prowadzono w trzech sezonach wegetacyjnych. Zastosowano czternaście sposobów indukowania mutagenezy stosując zróżnicowane stężenia mutagenu chemicznego i ultradźwięków oraz różny czas ekspozycji mutagenem. Nasiona traktowano metanosulfonianem etylu (EMS) oraz ultradźwiękami (UD) w celu ułatwienia wnikania substancji mutagennej do nasion. Stężenia mutagenu wynosiły: 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 i 1,6% EMS. Nasiona wytypowanych genotypów maku pozostawały w roztworze trzy lub cztery godziny w zależności od stężenia mutagenu. Przeprowadzono również badania wpływu ultradźwięków na zwiększenie działania mutagenezy chemicznej na nasiona maku odmiany Lazur. Czas ekspozycji nasion na działanie ultradźwięków wynosił 5 lub 25 minut. Po zdekantowaniu roztworu nasiona wymywano pod bieżącą wodą i osączano na bibule. Nasiona poddane mutagenezie i linie kontrolne rozmnażano w szkółkach selekcyjnych. Zastosowanie mutagenezy pozwoliło na uzyskanie zmienności zawartości morfiny, kodeiny i tebainy. Poszerzenie zmienności zawartości alkaloidów w makowinach maku potwierdza, że EMS jest wydajnym mutagenem chemicznym stosowanym do tworzenia nowych zmienności. Key words: opium poppy (Papaver somniferum L.), chemical and physical mutagenesis, alkaloid content, morphine, codeine, thebaine * Badania wykonano w ramach programu wieloletniego IHAR PIB Ulepszanie Roślin dla Zrównoważonych AgroEkoSystemów, Wysokiej Jakości Żywności i Produkcji Roślinnej na Cele Nieżywnościowe w Zakładzie Genetyki i Hodowli Roślin Oleistych IHAR PIB w Poznaniu, zadanie nr 4:8:3.
188 Magdalena Walkowiak Abstract The aim of the studies was to identify optimum method for inducing mutagenesis to obtain new variation alkaloid in poppy. The study material consisted of breeding lines derived from high-morphine recombinants of various forms of poppy from the IHAR-PIB collection, and the high-morphine Lazur variety. The studies were carried out over three vegetation seasons. A total of 14 methods of mutagen treatment were employed, using varying concentrations of the chemical and ultrasounds, and different mutagen exposure times. Seeds were treated with ethyl methanesulphonate (EMS) and ultrasounds (US) in order to facilitate the penetration of mutagenic substances into the seeds. Mutagen concentrations were: 0.4; 0.6; 0.8; 1.0; 1.2; 1.4 and 1.6% EMS. Seeds of selected poppy genotypes were kept in the solution for three or four hours depending on mutagen concentration. The study also involved investigation of the effect of ultrasound treatment on the increase in effectiveness of chemical mutagenesis in poppy seeds of the Lazur variety. The duration of seed exposure to ultrasound treatment was 5 or 25 minutes. Following decantation, the seeds were washed under running water and dried on tissue paper. The seeds that had been subjected to mutagen treatment and control lines were then propagated in selection nurseries. It was possible to achieve higher variation in the content of morphine, codeine or thebaine. Extended range of variation in alkaloid content in poppy capsules demonstrates that EMS is an efficient chemical mutagen suitable for the development of new genotypes. Wstęp Mak (Papaver somniferum L.) jest jedną z najstarszych roślin uprawnych znanych człowiekowi (Bernáth 1998, Duke 1973, Mărculescu i Bobit 2001). Najprawdopodobniej wywodzi się od dziko rosnącego gatunku Papaver setigerum DC (2n = 22), który występuje w rejonie śródziemnomorskim (Muśnicki 2003). Podstawowymi produktami uzyskiwanymi z maku są nasiona i olej makowy wykorzystywane na cele spożywcze i w przemyśle chemicznym (Appelqvist 1963, Bernáth i in. 2003) oraz makowiny źródło 23 alkaloidów (Listowski i in. 1960), z których trzy najważniejsze: morfina, kodeina i tebaina syntetyzowane są w roślinach już 2 3 dni po przekwitnięciu (Vašák 2010). Mak należy do wyjątkowych roślin, które dzięki zawartości alkaloidów mają duże znaczenie w przemyśle farmaceutycznym (Rumińska 1973, Németh i in. 2002, Lovkova i in. 2006, Acharya i Sharma 2009, Yadav i in. 2009, Shukla S. i in. 2010). Wyizolowane z maku alkaloidy nazywane są opioidami o działaniu odurzającym i uzależniającym (Janicki i Rzepecki 2009). Jak podaje Vašák (2010) morfina gromadzona jest głównie w makówkach (makowinach) i stanowi do 75% ogólnej zawartości wszystkich alkaloidów znajdujących się w makowinach. Mărculescu i Bobit (2001), Yadav i in. (2006) oraz Bajpai i in. (2000) podają, że zawartość morfiny w makówkach waha się w zakresie od 0,02 do 1,05%, natomiast w szypułkach kwiatowych jej zawartość może być 9-krotnie niższa (maleje wraz z odległością od makówki). Kodeina, podobnie jak morfina, zaliczana jest do opioidów, czyli leków o działaniu przeciwbólowym, które działają na ośrodkowy układ nerwowy (Janicki i Rzepecki 2009). Tebaina
Badania nad optymalizacją warunków indukowania mutacji 189 to alkaloid, który może być wykorzystywany do produkcji półsyntetycznej morfiny. Światowy popyt na tebainę w 2008 roku wynosił 140 ton, a w 2009 roku 160 ton i większość zapotrzebowania zaspokajała produkcja opium w Indiach (Shukla i in. 2010). Zawartość tebainy w surowym opium wynosi 0,1 0,6% (Vašák i in. 2010). Jedną z metod pozyskiwania nowych źródeł zmienności dla hodowli jest indukowanie mutacji, a więc zmian w sekwencji DNA (Brown 2001), które mogą powstawać nie tylko w wyniku błędów w procesie replikacji, ale również na skutek działania różnych czynników chemicznych lub fizycznych powstających zarówno w wyniku przemian metabolicznych zachodzących w komórkach, jak i docierających z zewnątrz komórek (Węgleński i in.1998). W oparciu o mechanizm działania na DNA mutagenne czynniki chemiczne można podzielić na cztery grupy (Snyder i in. 1997). Są to analogi zasad (purynowe i pirymidynowe), czynniki interkalujące, deaminujące i środki alkilujące wykorzystane w badaniach, a powodujące mutacje punktowe DNA (Brown 2001). Do najsilniejszych mutagenów chemicznych zaliczane są: metanosulfonian etylu (EMS), siarczan dietylowy (DES), etyloamina (EI), N-nitrozo-N-etylomocznik (NEU), azydek sodu (AS) (Rogalska i in. 1999). Częstotliwość występowania mutacji można również zwiększyć poprzez działanie czynnikami fizycznymi. Do fizycznych środków mutagennych zaliczamy szoki termiczne, zranienia, promieniowanie jonizujące (X, α, β, γ), neurony (Ruebenbauer i in. 1985), promieniowanie ultrafioletowe (UV) (Ruebenbauer i in. 1985, Rogalska i in.1999) oraz radioaktywne izotopy pierwiastków: radu, siarki, fosforu (Rogalska i in. 1999). Najsilniejszymi mutagenami fizycznymi są: promieniowanie ultrafioletowe o długości fali 260 mm i promieniowanie jonizujące powstałe w czasie rozpadu pierwiastków radioaktywnych (Węgleński i in. 1998). Metodę mutagenezy chemicznej dla uzyskania nowej zmienności genetycznej gatunków roślin zaczęto stosować w pierwszej połowie XX wieku. Wzrost zainteresowania mutagenezą u roślin oleistych zapoczątkowały prace Rakowa (1973), dotyczyły one zmiany składu kwasów tłuszczowych w oleju rzepakowym. W Polsce Byczyńska i in. (1996) uzyskali zmutowane rośliny rzepaku o podwyższonej zawartości kwasu oleinowego i obniżonej zawartości kwasów wielonienasyconych. Kolejne lata badań zaowocowały opublikowaniem prac dotyczących mutantów rzepaku ozimego o wysokiej zawartości kwasu oleinowego i obniżonej zawartości kwasów linolowego i linolenowego oraz o wysokiej zawartości kwasu linolowego i obniżonej zawartości kwasu linolenowego (Spasibionek i in. 2000). Obniżenie zawartości kwasu linolenowego u lnu na drodze mutagenezy uzyskali Green i Marshall (1984). Wykorzystanie chemicznych środków mutagennych przyczyniło się również do powstania zmutowanych roślin słonecznika (Osorio i in. 1995) i morfologicznych mutantów soi (Sodkiewicz 2000). Współcześnie podejmuje się hodowlę maku o nowych cechach: wysokiej zawartości morfiny dla potrzeb farmaceutycznych lub całkowicie pozbawionych morfiny i innych alkaloidów (Liersch in. 1997, Liersch in. 2000, Némethi in. 2002).
190 Magdalena Walkowiak Celem pracy było opracowanie warunków indukcji mutacji działając metanosulfonianem etylu (EMS) oraz ultradźwiękami (UD) na nasiona maku. Materiał i metody Do badań nad mutagenezą indukowaną chemicznie użyto nasion wysokomorfinowych linii wyhodowanych w Zakładzie Genetyki i Hodowli Roślin Oleistych IHAR PIB w Poznaniu oraz odmiany Lazur. Procentowa zawartość morfiny wynosiła w makowinach linii: 102/4i/09 0,960%, 130/2i/09 1,036%, 138/2i/10 1,256%, a u odmiany Lazur około 1% (tab. 1). Do indukowania mutacji zastosowano EMS (metanosulfonian etylu) oraz ultradźwięki (UD). W trakcie prowadzonych badań zastosowano czternaście różnych wariantów użycia tych czynników do indukowania mutagenezy. Stosowano różne stężenia mutagenu, zróżnicowany czas ekspozycji na mutagen chemiczny i UD oraz różny czas wymywania nasion pod bieżącą wodą (tab. 2). Nasiona były wstępnie moczone w wodzie destylowanej o temperaturze 20 o C, w ciągu 12 godzin. Po odsączeniu nasion na bibule jedną ich część zalewano roztworem EMS. Roztwór EMS przygotowywano w buforze fosforanowym o ph = 7. W pierwszym etapie badań nasiona pozostawały w roztworze mutagenu przez 3 lub 4 godziny wariant I i II (tab. 3). Po zdekantowaniu roztworu nasiona wymywano przez 2 i 4 godziny pod bieżącą wodą i osączano na bibule. Nasiona poddane mutagenezie kiełkowano, a następnie określano procent przeżywalności. Charakterystyka odmiany Lazur i linii maku poddanych mutagenezie Characteristic of the variety and lines of poppy subjected mutagenesis Odmiana/linia Cultivar/line Zawartość morfiny w makowinach Morphine content in capsules [%] Kwiaty Flowers Barwa płatków Colour of petals Lazur 0,800 1,100 białe z fioletowym oczkiem white with violet eye 102/4i/09 0,960 białe z fioletowym oczkiem white with violet eye 130/2i/09 1,036 białe z fioletowym oczkiem white with violet eye 138/2i/10 1,256 białe z fioletowym oczkiem, jasnoróżowe z fioletowym oczkiem white with violet eye, brightly pink with violet eye Kształt płatków Shape of petals całobrzegie smooth całobrzegie smooth całobrzegie smooth całobrzegie smooth Tabela 1 Kształt makówek Capsule shape okrągłe globose okrągłe globose okrągłe globose okrągłe i lekko wydłużone globose and elongated slightly
Warunki traktowania mutagenem Conditions of mutagen treatment Tabela 2 Rok Year Obiekty traktowane mutagenem Mutagen treated objects Wariant Variant Wstępne moczenie nasion w wodzie destylowanej [temp./czas] Presoaking in distilled water Stężenie mutagenu Mutagen concentration [%] Ekspozycja [czas] Exposition [time] ultradźwięki mutagen ultrasounds mutagen [UD] Czas wymywania mutagenu Washing out of mutagen time 1 2 3 4 5 6 7 8 2011 2012 odmiana Lazur, linia 102, 130, 138 Lazur variety, lines 102, 130, 138 odmiana Lazur, linia 102, 130, 138 Lazur variety, lines 102, 130, 138 I 0,6 4 h 2 h II 0,8 3 h 4 h odmiana Lazur Lazur variety III 0,6 4 h 25 min 2 h odmiana Lazur Lazur variety IV 0,8 3 h 25 min 4 h nasiona po zastosowaniu I wariantu w 2011 seeds after employment I variant in 2011 wyselekcjonowane rośliny z odm. Lazur pokolenie M 2 selected plants from change Lazur variety generation M 2 wyselekcjonowane rośliny z odmiany Lazur i linii 102, 130, 138 pokolenie M 2 selected plants from change Lazur variety and breeding lines generation M 2 wyselekcjonowane rośliny z odmiany Lazur pokolenie M 2 selected plants from change Lazur variety generation M 2 V 0,8 4 h 2 h 20 o C/12 h VI 1,0 4 h 2 h VII 1,2 4 h 1 h
c.d. tabeli 2 1 2 3 4 5 6 7 2012 2013 nasiona po zastosowaniu II wariantu w 2011 seeds after employment II variant in 2011 wyselekcjonowane rośliny z odmiany Lazur pokolenie M 2 selected plants from change Lazur variety generation M 2 wyselekcjonowane rośliny z odmiany Lazur i linii 102, 130, 138 pokolenie M 2 selected plants from change Lazur variety and breeding lines generation M 2 VIII 1,0 4 h 1 h IX 1,2 4 h 1 h odmiana Lazur Lazur variety X 0,8 4 h 5 min 1 h wyselekcjonowane rośliny z odmiany Lazur pokolenie M 2 po I metodzie działania selected plants from change Lazur variety generation M 2 active variant I wyselekcjonowane rośliny z odmiany Lazur pokolenie M 2 po II metodzie działania selected plants from change Lazur variety generation M 2 active variant II odmiana Lazur, linia 102, 130, 138 Lazur variety, lines 102, 130, 138 odmiana Lazur, linia102, 130, 138 Lazur variety, lines 102, 130, 138 XI 1,0 4 h 5 min 1 h 20 o C/12 h XII 1,2 4 h 5 min 1h XIII 1,4 3 h 1 h XIV 1,6 3 h 1 h odmiana Lazur Lazur variety XV 1,4 3 h 5 min 1 h odmiana Lazur Lazur variety XVI 1,6 3 h 5 min 1 h
Badania nad optymalizacją warunków indukowania mutacji 193 Tabela 3 Zmiany zawartości morfiny, kodeiny i tebainy w makowinach roślin otrzymanych z nasion traktowanych mutagenem w porównaniu z formą dziką w 2011 roku Changes in morphine content in capsules of plants obtained from seeds treated with mutagen in comparison to the wild form Wariant Variant Morfina Morphine Kodeina Codeine Tebaina Thebaine wsp. zm. wsp. zm. wsp. zm. coef. of var. coef. of var. coef. of var. Lazur 10 0,625 4,56 9 0,035 8,32 9 0,003 2,30 I 30 0,758 9,26 25 0,006 1,84 25 0,005 0,53 II 20 0,908 xx 11,0 20 0,003 0,10 20 0,003 0,07 F obl. 3,31 1,41 1,84 Linia Line 102/4i//09 10 0,786 9,72 8 0,105 6,43 8 0,010 0,47 I 10 0,858 11,69 7 0,206 3,67 7 0,003 0,93 II 8 1,165 x 7,61 6 0,137 27,47 6 0,108 9,56 F obl. 4,40* 1,51 7,54* Linia Line 130/2i/09 Wildl form 10 0,736 6,67 7 0,033 21,38 7 0,062 2,37 I 9 0,795 17,44 8 0,137 65,45 6 0,037 1,48 II 10 0,550 x 5,22 9 0,014 2,61 9 0,040 4,35 F obl. 3,56 0,10 0,02 Linia Line 138/2i/10 10 0,489 31,93 9 0,040 6,08 8 0,009 0,24 I 10 0,398 38,76 10 0,048 6,19 10 0,004 0,63 II 10 0,624 65,95 9 0,062 28,03 9 0,020 3,83 F obl. 0,90 1,38 3,31 n liczba obiektów number of object x, xx istotność między zawartością alkaloidów w formie dzikiej a makowinach potraktowanych mutagenem (wariant) na poziomie α = 0,05 i α = 0,01 significant between alkaloid content in wild form and capsules after mutagen treatment (variant) at α = 0.05 and α = 0.01 F obl istotność między wariantami na poziomie α = 0,05 i α = 0,01 significant between variants at α = 0.05 and α = 0.01 Do rozmnożeń w szkółkach selekcyjnych wybrano tylko te kombinacje, w których przeżywalność skiełkowanych nasion po działaniu mutagenem zbliżona była do 50%. Makówki roślin pokolenia M 1 omłócono indywidualnie, a następnie w rozdrobnionych makowinach oznaczano skład alkaloidów. Na podstawie analiz biochemicznych zawartości głównych alkaloidów przeprowadzono selekcję i wybrano
194 Magdalena Walkowiak zróżnicowane obiekty, których nasiona poddano powtórnej mutagenezie w 2012 roku (tab. 2). W 2012 roku dla zwiększenia częstotliwości występowania mutacji zaostrzono warunki traktowania mutagenem. Zastosowano wyższe stężenia mutagenu: 0,8% wariant V; 1,0% wariant VI; 1,2% wariant VII oraz wydłużono czas ekspozycji nasion w mutagenie do 4 godzin. Mimo tego zabiegu nadal nie uzyskano wysoce istotnych zmian zawartości alkaloidów. Wobec tego w 2013 roku powtórzono zabieg indukowania mutagenezy jeszcze bardziej zaostrzając warunki stosowania czynnika mutagennego. Stężenie EMS wynosiło 1,4% wariant XIII i 1,6% wariant XIV. Działanie czynnika mutagennego trwało 3 godziny, przepłukiwanie pod bieżącą wodą 1 godzinę. Podjęto również próbę wywołania zmian mutacyjnych składu alkaloidów w nasionach wysokomorfinowej odmiany Lazur łącząc działanie ultradźwięków z mutagenem chemicznym (tab. 2). W pierwszym roku prowadzenia badań w celu ułatwienia wnikania mutagenu do nasion stosowano 25-minutowe działanie UD i 0,6% EMS wariant III oraz 0,8% EMS wariant IV. W kolejnym roku czas działania ultradźwięków skrócono do 5 minut, natomiast zwiększono stężenia mutagenu do 1,0% wariant XI, 1,2% wariant XII, aż do stężenia EMS 1,4% wariant XV i 1,6% wariant XVI w 2013 roku. Zawartość morfiny w makowinach oznaczono metodą kolorymetryczną (Czernik-Kołodziej i in. 1999), a kodeiny i tebainy metodą chromatograficzną (Singh i in. 2000) przy użyciu chromatografu gazowego HP 5890. Wyniki opracowano statystycznie wykorzystując arkusz kalkulacyjny Excel. Wyniki i dyskusja Morfina Średnia zawartość morfiny w makowinach odmiany Lazur i badanych linii zależała od stężenia środka mutagennego zastosowanego w danym roku oraz sposobu jego działania i oscylowała na poziomie charakterystycznym dla maku wysokomorfinowego (tab. 3, 4). Przeprowadzona analiza statystyczna w 2011 roku wykazała wysoce istotne i istotne różnice pomiędzy zawartością morfiny w makowinach w wyniku traktowania mutagenem według wariantu II a zawartością tego alkaloidu w obiektach nie traktowanych mutagenem. W roślinach odmiany Lazur po mutagenezie procentowa zawartość morfiny kształtowała się na poziomie 0,908 xx, linii 102/4i/09 1,165 xx i linii 130/2i/09 0,550 x (tab. 3). Natomiast w 2013 roku wystąpiły istotne różnice w zawartości morfiny w stosunku do roślin odmiany Lazur nie traktowanych mutagenem 0,906 x (wariant XIII), a wysoce istotne różnice w zawartości morfiny w roślinach traktowanych chemomutagenem z dwóch linii hodowlanych: 130/2i/09 0,839 xx (wariant IX) i 138/2i/10 1,043 xx
Badania nad optymalizacją warunków indukowania mutacji 195 Tabela 4 Zmiany zawartości morfiny w makowinach roślin otrzymanych z nasion traktowanych mutagenem w porównaniu z formą dziką Changes of morphine content in capsules of plants obtained from seeds treated with mutagen in comparison to wild form Wariant Variant 2012 2013 wsp. zm. zakres wsp. zm. coef. of var. range coef. of var. Lazur zakres range 5 0,743 5,58 0,570 1,037 5 1,117 2,66 0,837 1,277 V 12 0,625 10,00 0,235 0,963 25 1,094 5,30 0,716 1,585 VI 15 0,704 9,61 0,313 1,062 25 1,042 9,35 0,584 1,588 VII 17 0,681 9,34 0,169 1,004 20 1,207 4,11 0,741 1,699 VIII 20 0,825 7,92 0,465 1,477 31 0,944 7,64 0,021 1,287 IX 20 0,693 8,71 0,369 1,153 20 1,124 4,72 0,640 1,578 XIII 5 0,906 x 0,83 0,819 1,025 XIV 5 1,325 4,58 1,025 1,623 F obl. 1,45 3,61* Linia Line 102/4i/09 5 0,739 3,86 0,587 0,976 5 1,022 19,19 0,243 1,312 VI 20 0,779 8,18 0,331 1,363 40 0,984 4,58 0,667 1,509 IX 20 0,842 9,40 0,313 1,360 39 1,032 5,19 0,440 1,494 XIII 5 1,240 13,86 0,554 1,618 XIV 5 1,029 11,16 0,632 1,451 F obl. 0,58 1,74 Linia Line 130/2i/09 5 0,736 5,77 0,437 0,913 5 1,151 0,97 1,032 1,312 VI 20 0,792 8,17 0,367 1,272 30 1,005 4,40 0,625 1,345 IX 20 0,714 11,89 0,131 1,163 45 0,839 xx 13,61 0,121 1,381 XIII 5 0,863 10,22 0,448 1,130 XIV 5 1,064 0,78 0,936 1,176 F obl. 0,82 2,54 Linia Line 138/2i/10 5 0,679 10,84 0,303 0,989 5 0,753 0,31 0,693 0,819 VI 15 0,528 4,48 0,283 0,824 25 0,782 6,89 0,101 1,255 IX 13 0,300 x 13,79 0,010 0,559 18 0,753 10,24 0,152 1,388 XIII 5 0,980 8,99 0,736 1,338 XIV 5 1,043 xx 3,07 0,893 1,345 F obl. 7,76** 2,62 Objaśnienia jak w tabeli 3 See Table 3
196 Magdalena Walkowiak (wariant XIV). Analiza statystyczna wykazała wysoce istotne różnice w zawartości morfiny w wyniku stosowania różnych dawek mutagenu (7,76 ** ) na nasiona linii hodowlanej 138/2i/10 w 2012 roku oraz istotne różnice (3,61 * ) w przypadku stosowania różnych dawek mutagenu na nasiona odmiany Lazur w 2013 roku (tab. 4). Działanie EMS i ultradźwięków na nasiona odmiany Lazur spowodowało wysoce istotne obniżenie zawartości morfiny na poziomie istotności α = 0,01, w stosunku do form nie traktowanych UD i EMS w pierwszym roku badań, tj. przy zastosowaniu IV wariantu, gdy stosowano 25-minutowe działanie UD i 0,8% stężenie EMS (tab. 5). W tym samym roku badań analiza statystyczna wykazała również wysoce istotne zróżnicowanie zawartości morfiny między stosowanymi wariantami traktowania mutagenem. Zintegrowaną mutagenezę, czyli połączenie mutagennych czynników fizycznych i chemicznych, zastosowali na nasiona maku Chauhaniin i in. (1993) oraz Chatterjee in. (2011). Wysoce skuteczne okazało się zastosowanie przez Chauhana i in. (1993) promieniowania γ i metanosulfonianuetylu (EMS), w wyniku czego uzyskali zwiększenie zawartości morfiny z 0,64% w formach nie traktowanych mutagenem do 0,98% w mutantach. Tabela 5 Zmiany zawartości morfiny w makowinach roślin odmiany Lazur otrzymanych z nasion traktowanych mutagenem EMS i UD w porównaniu z formą dziką Changes of morphine content in capsules of plants cv. Lazur obtained from seeds treated with mutagen EMS and UD in comparison to wild form Wariant Variant 2012 2013 wariancja zakres wariancja variance range variance zakres range 5 0,679 4,46 0,536 0,941 5 0,942 2,39 0,779 1,082 X 5 0,677 7,89 0,455 1,067 5 0,939 3,91 0,738 1,120 XI 18 0,693 10,00 0,235 1,072 30 1,033 5,98 0,367 1,423 XII 16 0,945 7,88 0,440 1,461 20 1,017 4,52 0,630 1,421 XV 5 1,011 1,24 0,827 1,115 XVI 5 1,169 2,67 0,951 1,325 F obl. 4,41* 0,72 Objaśnienia jak w tabeli 3 See Table 3 Jak podaje Chatterjee i in. (2011) już niewielka dawka EMS w połączeniu z innym czynnikiem mutagennym może spowodować zróżnicowanie zawartości alkaloidów. Spadek zawartości morfiny do 0,300% uzyskano w traktowanych mutagenem nasionach linii hodowlanej 138/2i/10 po zastosowaniu IX wariantu indukcji mutagenezy (nasiona traktowano 1,2% roztworem EMS przez 4 godziny i wymywano pod bieżącą wodą przez 1 godzinę). Natomiast wyraźny wzrost zawartości morfiny wystąpił w roślinach linii 102/4i/09 po zastosowaniu II
Badania nad optymalizacją warunków indukowania mutacji 197 wariantu traktowania mutagenem w 2012 roku. Chatterjee i in. (2012) na podstawie prowadzonych badań stwierdzili, że wykorzystanie zintegrowanej metody działania czynników mutagennych, polegające na napromieniowywaniu nasion promieniami γ i działaniu EMS, przyczyniło się do wystąpienia różnic w zawartości morfiny między pokoleniami M 2 i M 3. Ci sami autorzy podają, że powodem zmian w zawartości morfiny mogą być mikromutacje. Kodeina Zawartość kodeiny stanowi od 0,3 do 4,0% ogólnej zawartości alkaloidów w opium (Vašák i in. 2010), a w badaniach prowadzonych przez Prajapatiego i in. (2001) spektrum zawartości kodeiny wahało się od 0,003 do 0,189%. Zastosowanie w 2011 roku roztworu 0,6 i 0,8% EMS (wariant I i II) spowodowało istotne obniżenie zawartości kodeiny w makowinach roślin otrzymanych z nasion odmiany Lazur traktowanych mutagenem i istotny wzrost w zmutowanych formach linii hodowlanej 102/4i/09 (tab. 3). Jak podaje Bajpai i in. (2000) zawartość kodeiny w szypułkach może wahać się od 0,003 do 0,13%, a w makówkach od 0,006 do 0,130%. Zastosowanie II wariantu działania czynnikiem mutagennym spowodowało również wyraźny spadek zawartości tego alkaloidu w makowinach do podobnego poziomu jaki w swojej publikacji podaje Bajpai i in. (2000). W badaniach prowadzonych przez Vlka w 2009 roku zawartość kodeiny w makowinach odmiany Florian wynosiła od 0,018 do 0,271% w odmianie Postomi, a w odmianie Lazur zawartość tego alkaloidu kształtowała się na poziomie 0,061%. W badaniach prowadzonych w trzech sezonach wegetacyjnych zawartość kodeiny w formach kontrolnych odmiany Lazur wahała się od 0,0 do 0,105%. Zastosowanie w 2013 roku wysokich dawek mutagenu spowodowało wystąpienie istotnych różnic na poziomie istotności α = 0,05 w makowinach zmutowanych genotypów linii 102/4i/09: 0,036 x wariant XIII i 0,053 x wariant XIV w porównaniu z formą nie traktowaną EMS oraz różnic pomiędzy efektywnością działania poszczególnych wariantów mutagenezy na odmianę Lazur 5,63 ** i linię 102/4i/09 6,16 ** (tab. 6). Uzyskane wyniki dowodzą, że już niewielkie dawki czynnika mutagennego przyczyniają się do powstania zmienności w zawartości tego alkaloidu. Znalazło to również potwierdzenie w badaniach własnych z wykorzystaniem ultradźwięków i mutagenezy chemicznej, gdzie zastosowane warianty mutagenezy spowodowały wystąpienie istotnych zmian w zawartości kodeiny 0,006% x (wariant XII) w porównaniu z zawartością w formach nie traktowanych UD i EMS (tab. 7). Najprawdopodobniej dawki ultradźwięków w połączeniu z wysokimi dawkami EMS spowodowały wystąpienie istotnych różnic (2,89 * ) pomiędzy efektywnością mutagenezy w 2013 roku.
198 Magdalena Walkowiak Tabela 6 Zmiany zawartości kodeiny w makowinach roślin otrzymanych z nasion traktowanych mutagenem w porównaniu z formą dziką Changes of codeine content in capsules of plants obtained from seeds treated with mutagen in comparison to wild form 2012 2013 Wariant Variant wsp. zm. zakres wsp. zm. zakres coef. of var. range coef. of var. range Lazur 5 0,047 3,65 0 0,080 5 0,013 5,98 0 0,064 V 10 0,015 x 1,92 0,001 0,054 25 0,001 3,10 0 0,031 VI 15 0,016 x 0,64 0 0,033 22 0,012 4,51 0 0,081 VII 17 0,023 2,47 0 0,076 19 0,018 2,48 0 0,064 VIII 19 0,021 1,85 0 0,054 31 0,027 6,71 0 0,211 IX 19 0,017 x 3,24 0 0,101 19 0,0001 x 0,20 0 0,002 XIII 5 0,000 0 XIV 1 0,102 x 0,102 F obl. 0,43 5,63** Linia Line 102/4i/09 5 0,013 2,13 0 0,040 5 0,000 VI 18 0,027 6,22 0 0,129 30 0,024 4,01 0 0,096 IX 18 0,009 6,03 0 0,096 29 0,006 2,82 0 0,051 XIII 4 0,036 x 2,00 0 0,062 XIV 4 0,053 x 2,61 0 0,080 F obl. 2,87 6,16** Linia Line 130/2i/09 5 0,007 1,56 0 0,023 5 0 0,10 0 0,001 VI 16 0,007 1,98 0 0,038 20 0,016 6,85 0 0,093 IX 17 0,009 9,18 0 0,118 41 0,028 11,49 0 0,344 XIII 3 0,026 2,67 0 0,053 XIV 4 0,000 0 F obl. 0,09 0,590 Linia Line 138/2i/10 4 0,000 0 5 0,000 0,08 0 0,001 VI 15 0,003 5,00 0 0,050 24 0,016 1,89 0 0,055 IX 10 0,008 2,97 0 0,036 13 0,005 1,38 0 0,026 XIII 4 0,000 0 XIV 5 0,024 4,60 0 0,066 F obl. 0,57 2,68 Objaśnienia jak w tabeli 3 See Table 3
Badania nad optymalizacją warunków indukowania mutacji 199 Tabela 7 Zmiany zawartości kodeiny w makowinach roślin odmiany Lazur otrzymanych z nasion traktowanych mutagenem EMS i UD w porównaniu z formą dziką Changes of codeine content in capsules of plants cz. Lazur obtained from seeds treated with mutagen EMS and UD in comparison to wild form Wariant Variant 2012 2013 wariancja zakres wariancja variance range variance zakres range 4 0,002 0,80 0 0,008 5 0,029 1,52 0,004 0,058 X 5 0 0 4 0,013 0,70 0,002 0,025 XI 18 0,066 7,08 0 0,223 16 0,021 4,40 0 0,083 XII 13 0,088 7,70 0 0,238 15 0,006 x 5,69 0 0,075 XV 5 0,028 0,35 0,012 0,038 XVI 4 0,048 0,63 0,033 0,072 Fobl 2,86 2,89* Objaśnienia jak w tabeli 3 See Table 3 Tebaina Zawartość tebainy w makowinach roślin traktowanych EMS zależała od stężenia stosowanego mutagenu. Najsilniejsza reakcja na EMS wystąpiła w genotypie odmiany Lazur traktowanej mutagenem w 2012 roku po zastosowaniu VI i VIII wariantu indukowania mutagenezy (tab. 8), gdy zastosowano powtórne działanie mutagenem w wyższych dawkach niż w 2011 roku. Nastąpił spadek zawartości tebainy do poziomu 0,007% xx i zawartość tego alkaloidu okazała się wysoce istotnie różna w porównaniu z formami nie traktowanymi mutagenem, charakteryzującymi się zawartością tebainy na poziomie 0,024%. Jak podaje Vlk (2009) typowy poziom zawartości tebainy w makowinach odmiany Lazur wynosi 0,023%. W prowadzonym doświadczeniu zawartość ta była zmienna w poszczególnych latach. Zastosowanie zróżnicowanych dawek EMS w latach prowadzenia badań przyczyniło się do wystąpienia zmian w zawartości tebainy w stosunku do zawartości w grupie kontrolnej na poziomie istotności α = 0,01 i α = 0,05. Statystycznie udowodniono istotne różnice w zawartości tebainy w wyniku działania różnych dawek EMS stosowanych na odpowiednio przygotowane nasiona odmiany Lazur 3,40 * i linii hodowlanej 102/4i/09 7,54 * w 2011 i 2012 roku. Natomiast w 2012 roku wystąpiły istotne różnice (9,04 ** ) w zawartości tebainy w wyniku zastosowania VI i IX wariantu indukowania mutagenezy chemicznej na nasiona linii 130/2i/09. Również wysoce istotne różnice (5,44 ** ) pomiędzy zastosowanymi wariantami odnotowano w 2013 roku w roślinach linii 138/2i/10 po działaniu EMS (tab. 8).
200 Magdalena Walkowiak Tabela 8 Zmiany zawartości tebainy w makowinach roślin otrzymanych z nasion traktowanych mutagenem w porównaniu z formą dziką Changes of thebaine content in capsules of plants obtained from seeds treated with mutagen in comparison to wild form Wariant Variant 2012 2013 wsp. zm. zakres wsp. zm. coef. of var. range coef. of var. Lazur zakres range 5 0,024 1,79 0,006 0,059 5 0,058 7,07 0 0,129 V 10 0,024 2,56 0 0,084 18 0,042 19,29 0 0,390 VI 15 0,007 xx 0,29 0 0,016 18 0,026 2,99 0 0,100 VII 17 0,010 1,55 0 0,047 19 0,019 x 1,50 0 0,064 VIII 19 0,007 xx 0,61 0 0,018 23 0,035 3,36 0 0,140 IX 19 0,009 2,10 0 0,051 17 0,034 9,19 0 0,235 XIII 5 0,033 1,56 0 0,073 XIV 4 0,004 1,60 0 0,016 F obl. 3,40 * 0,61 Linia Line 102/4i/09 5 0,017 0,69 0,007 0,034 5 0,004 2,10 0 0,021 VI 18 0,029 4,50 0 0,136 30 0,025 2,44 0 0,106 IX 18 0,027 11,39 0 0,238 29 0,013 3,25 0 0,085 XIII 4 0,027 6,27 0 0,086 XIV 3 0,021 x 0,01 0,020 0,023 F obl. 0,02 Linia Line 130/2i/09 5 0,028 6,47 0 0,104 4 0,000 0,10 0 0,001 VI 16 0,011 0,31 0 0,020 20 0,016 6,85 0 0,093 IX 17 0,023 0,99 0 0,057 41 0,028 11,49 0 0,344 XIII 3 0,036 x 1,54 0,018 0,063 XIV 4 0,000 0 F obl. 9,04 ** 0,66 Linia Line 138/2i/10 4 0,000 0 5 0,002 0,38 0 0,005 VI 15 0,007 1,23 0 0,026 24 0,001 0,60 0 0,008 IX 10 0,015 1,80 0 0,056 13 0,000 0,60 0 0,006 XIII 4 0,005 0,67 0 0,010 XIV 5 0,043 11,35 0 0,160 F obl. 2,68 5,44 ** Objaśnienia jak w tabeli 3 See Table 3
Badania nad optymalizacją warunków indukowania mutacji 201 Jednocześnie w badaniach gdzie zastosowano UD i mutagen chemiczny wystąpiły istotne różnice w zawartości tebainy w zależności od zastosowanego wariantu (tab. 9). Najsilniejsza reakcja na UD i EMS wystąpiła po zastosowaniu XII wariantu w 2013 roku i spowodowała istotny wzrost zawartości tebainy 0,021 x w porównaniu z formami nie traktowanymi UD i EMS 0,002%. W ostatnim roku prowadzenia badań nad indukcją mutagenezy wystąpiły istotne różnice (3,27 * ) pomiędzy efektami działania mutagenu w różnych wariantach na poziomie istotności α = 0,05. Jak podaje Chatterjee i in. (2011), dawka 0,2% EMS w połączeniu z czynnikiem fizycznym może prowadzić do zmian zawartości alkaloidów, a w szczególności przyczynia się do zmian zawartości tebainy. Tabela 9 Zmiany zawartości tebainy w makowinach roślin odmiany Łazur otrzymanych z nasion traktowanych mutagenem EMS I UD w porównaniu z formą dziką Changes of thebaine content in capsules of plants cv. Lazur obtained from seeds treated with mutagen EMS and UD in comparison to wild form Wariant Variant 2012 2013 wariancja zakres wariancja variance range variance zakres range 4 0,027 3,50 0,009 0,073 5 0,002 0,80 0 0,008 X 5 0,016 2,95 0 0,055 4 0,000 0 XI 18 0,075 12,15 0 0,391 18 0,015 2,07 0 0,066 XII 13 0,048 29,42 0 0,427 15 0,021 x 1,22 0 0,050 XV 5 0,000 0 XVI 4 0,004 1,60 0 0,160 F obl. 0,77 3,27* Objaśnienia jak w tabeli 3 See Table 3 Otrzymane wyniki pokazują, że indukowana mutageneza może być skutecznym i wydajnym narzędziem do tworzenia nowej zmienności genetycznej u roślin. Wprowadzenie hodowli mutacyjnej z wykorzystaniem mutagenezy fizycznej i chemicznej może przyczynić się do wyhodowania odmian maku o zmienionych proporcjach alkaloidów (Sharma i in. 1999). Chatterjee i in. (2011) uzyskali wzrost zawartości alkaloidów w wyniku stosowania w badaniach różnych dawek promieniowania γ. Badania chemicznych substancji mutagennych wykazały, że EMS jest efektywnym chemomutagenem (Kumar i Gupta 2009). Niemniej ze względu na małe istotności różnic w zawartości alkaloidów, zwłaszcza kodeiny i tebainy, występujących w makowinach należy zbadać otrzymane pożądane mutanty w następnych pokoleniach w różnych warunkach agronomicznych, zwłaszcza, że zmiany nie były zawsze jednokierunkowe, zależały od wariantu stosowanej mutagenezy i roku zbioru mutantów.
202 Magdalena Walkowiak Wnioski 1. Opracowano warunki traktowania mutagenem chemicznym i ultradźwiękami nasion maku, jednak wybór optymalnej metody jest jeszcze trudny i wymaga dalszych badań. 2. W wyniku działania mutagenem chemicznym metanosulfonianem etylu (EMS) i ultradźwiękami (UD) uzyskano zwiększenie zmienności w zawartości alkaloidów gromadzonych w makowinach, co potwierdza, że EMS może być wydajnym mutagenem chemicznym stosowanym do tworzenia nowych zmienności u maku. 3. Przebadano różne sposoby traktowania nasion maku mutagenem chemicznym EMS przy współudziale ultradźwięków. Uzyskane wyniki nie są jednoznaczne, jednak sugerują dalsze kierunki prac nad uzyskaniem mutantów maku o zróżnicowanej zawartości alkaloidów w makówkach. 4. Kombinacje, w których uzyskano wyraźne zwiększenie zmienności w zawartości alkaloidów powinny stanowić materiał wyjściowy do poszukiwań mutantów na drodze selekcji indywidualnej. Literatura Acharya H.S., Sharma V. 2009. Molecular characterization of opium poppy (Papaver somniferum) germplasm. American Journal of Infectious Diseases, 5 (2): 155-160. Appelqvist L.Ǻ. 1963. Quality Problems in Cruciferous Oilcrops, pp. 301-332. In E. Ǻkerberg et al. (eds.), Rec. Pl. Breed. Res. Svalöf, 1946-1961, Almqvist and Wiksell, Stockholm. Bajpai S., Grupa A.P., Grupta M.M., Sharma S., Govil C.M., Kumar S. 2000. Inter-relation between descriptions and morphine field in Asian germplasm of opium poppy Papaver somnifeerum. Genet. Res. Drop Evol., 47: 315-322. Bernáth J. 1998. Poppy The Genus Papaver, Harwood Academic Publisher, Amsterdam. XIV: 352. Bernáth J., Németh É., Petheõ F. 2003. Alkaloid accumulation in capsules of the selfed and crosspollinated poppy. Plant Breeding, 122: 263-267. Byczyńska B., Spasibionek S., Krzymański J. 1996. Zmniejszenie zawartości kwasów wielonienasyconych w oleju rzepakowym w wyniku mutacji chemicznej. Rośliny Oleiste Oilseed Crops, XVII (1): 133-140. Brown T.A. 2001. Genomy. Przekład pod red. P. Węgleńskiego. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa: 339-349. Chatterjee A., Shukla S., Rastogi A., Mishra B.K., Ohri D., Singh S.P. 2011. Impact of mutagenesis on cytological behavior in relation to specific alkaloids in Opium Poppy (Papaver somniferum L.). Caryologia, 64, 1:14-24.
Badania nad optymalizacją warunków indukowania mutacji 203 Chatterjee A., Shukla S., Rastogi A., Mishra B.K., Singh S.P. 2012. Induction of variability and selection of elite lines for specific alkaloids from a population of induced mutagenesis in Opium Poppy (Papaver somniferum L.). Bioremediation, Biodiversity and Biovailability. Global Science Books: 94-102. Chauhan S.P., Patra N.K. 1993. Mutagenic effects of combined and single doses of gamma rays and EMS in opium poppy. Plant Breeding, 110: 342-345. Czernik-Kołodziej K., Krzymański J., Michalski K. 1999. Modyfikacja oznaczania morfiny w makowinach metodą kolorymetryczną w postaci związku dwuazowego. Rośliny Oleiste Oilseed Crops, XX (2): 591-598. Duke J.A. 1973. Utilization of Papaver. Econ. Bot., 27 (4): 390-400. Green A.G., Marshall D.R. 1984. Isolation of induced mutants in linseed (Linum usitatissimum) having reduced linolenic acid content. Euphytica, 33: 321-328. Janicki B., Rzepecki M. 2009. Substancje uzależniające i dopingujące oraz podstawy ich działania. Wydawnictwa Uczelniane Uniwersytetu Technologiczno-Przyrodniczego w Bydgoszczy: 5-111. Kumar G., Gupta P., 2009. Induced karyomorphological variations in three phenodeviants of Capsicum annum L. Turkish Journal of Biology. 33: 12-128. Liersch J., Krzymański J. 2000. Nowe odmiany maku hodowli IHAR w Poznaniu. Rośliny Oleiste Oilseed Crops, XXI (2): 621-624. Liersch J., Szymanowska E., Krzymański J. 1997. Ocena stabilności i wartości nowych rodów maku niskomorfinowego w 1996 roku. Rośliny Oleiste Oilseed Crops, XVIII (1): 159-167. Listowski A., Barbacki S., Birecki M. 1960. Szczegółowa uprawa roślin. Państwowe Wydawnictwo Rolnicze i Leśne. Warszawa, 2: 235-244. Lovkova M.Ya., Buzuk G.N., Sokolova S.M. 2006. Regulatory role of elements in the formation and accumulation of alkaloids in Papaver somniferum L. seedlings. Applied Biochemistry and Microbiology, 42 (4): 420-423. Mărculescu A., Bobit D. 2001. Studies on morphine content of Papaver somniferum L. Rouman Biotechnological, 5: 403-409. Muśnicki Cz. 2003. Mak siewny. W: Szczególowa upawa roślin. Praca zbiorowa pod red. Z. Jasińskiej i A. Koteckiego. Wydawnictwo AR Wrocław, 2: 463-472. Németh É., Bernáth J., Sztefanov A., Petheő F. 2002. New results of poppy (Papaver somniferum L.) breeding for low alkaloid content in Hungary. Acta Horticulturae, 576: 151-158. Nowakowska J. 2002. Mutageneza i jej zastosowanie w badaniach nad roślinami oleistymi. Rośliny Oleiste Oilseed Crops, XXIII (2): 547-559. Osorio J., Fernandez-Martinez J., Mancha M., Garces R. 1995. Mutant sunflowers with high concentration of saturated fatty acids in the oil. Crop Sci., 35: 739-742. Prajapati S., Bajpai S., Gupta M.M., Kumar S. 2001. The floral androcarpel organ (ACO) mutation permits high alkaloid yields in opium poppy Papaver somniferum. Current Science, 81, 8, 25: 1109-1112. Rakow G. 1973. Selektion auf Linol- und Linolensäuregehalt in Rapssamen nach mutagener Behandlung. Z. Pflanzenzüchtung, 69: 62-82. Rogalska S., Małuszyńska J., Olszewska M.J. 1999. Podstawy cytogenetyki roślin. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa: 1-265. Ruebenbauer T., Müller H.W. 1985. Ogólna hodowla roślin. PWN, Warszawa: 152-167. Rumińska A. 1973. Leksykon roślin leczniczych. PWN, Warszawa: 93-101.
204 Magdalena Walkowiak Sharma J.R., Lai R.K., Gupta A.P., Mistra H.O., Pant V., Singh N.K., Pandey V. 1999. Development of no-narcotic (opiumless and alkaloid-free) opium poppy, Papaver somniferum. Plant Breeding, 118; 449 452. Shukla S., Yadav H.K., Rastogi A., Mishra B.K., Sindh S.P. 2010. Alkaloid diversity in relation to breeding for specific alkaloids in opium poppy (Papaver somniferum L.). Czech J. Genet. Plant Breed., 46 (4): 164-169. Singh D.V., Prajapati S., Bajpai S., Verma R.K., Gupta M.M, Kumar S. 2000. Simultaneous determination of important alkaloids in Papaver somniferum using reversed phase high performance liquid chromatography. J. Liq. Chrom. & Rel. Technol, 23 (11): 1757-1764. Snyder L., Champness W. 1997. Molecular Genetics of Bacteria. Washington, DC: ASM Press. Sodkiewicz T. 2000. Zmienność u soi (Glycine max L. Merrill) indukowana mutagenem chemicznym. Rośliny Oleiste Oilseed Crops, XXI (2): 539-546. Spasibionek S., Byczyńska B., Krzymański J. 2000. Mutanty rzepaku ozimego podwójnie ulepszonego o zmienionym składzie kwasów tłuszczowych. Rośliny Oleiste Oilseed Crops, XXI (3): 715-724. Yadav H.K., Shukla S., Singh S.P. 2006. Genetic variability and interrelationship among opium and its alkaloids in opium poppy (Papaver somniferum L.). Euphytica, 150: 207-214. Yadav H.K., Shukla S., Singh S.P. 2009. Genetic combining ability estimates in the F1 and F2 generations for yield, its component traits and alkaloid content in opium poppy (Papaver somniferum L.). Euphytica, 168 (1): 23-32. Vašák J. 2010. Mák. Kolektiv autorů pod vedenim Jana Vašáka. Praha: 5-337. Vlk R., Kosek Z. 2009. Výkonnost odrůd máku výsledky z pokusů 2007-08. In: Sdruženi Český Mák informuje, 8. Makom občasnik. Sborných seminářů Mak v roce 2009, ČZU v Praze: 23-28. Węgleński P. 1998.Genetyka molekularna. Praca zbiorowa pod red. P. Węgleńskiego. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa: 248-279.