Szczegółowe omówienie rozprawy doktorskiej

Transkrypt

1 Prof. dr hab. inż. Wojciech Wróblewski Warszawa, 19 maja 2017 r. Zakład Mikrobioanalityki Wydział Chemiczny, Politechnika Warszawska Noakowskiego 3, Warszawa tel./fax: R E C E N Z J A rozprawy doktorskiej mgr inż. Zofii Iskierko Chemical sensors with molecularly imprinted polymers as recognition units for determination of selected compounds of health importance Biomarkery są z powodzeniem wykorzystywane do wczesnej diagnostyki jak również monitorowania skutków terapii wielu chorób nowotworowych, neurologicznych, układu krążenia czy immunologicznych. Do wykrywania i oznaczania biomarkerów w płynach fizjologicznych i tkankach stosowane są obecnie zaawansowane techniki spektroskopowe, chromatograficzne (często w połączeniu ze spektrometrią mas), elektroforetyczne oraz testy immunoenzymatyczne ELISA. Innym podejściem do analizy tego typu związków jest użycie sensorów chemicznych i biosensorów prostych i tanich narzędzi analitycznych przydatnych w szybkiej diagnostyce medycznej. Ze względu na konieczność analizy próbek o małych objętościach, ważnym aspektem w tego typu aplikacjach jest miniaturyzacja sensorów. Konstrukcja sensorów chemicznych oparta jest przede wszystkim na projektowaniu odpowiednich warstw receptorowych, a prowadzone od lat badania w tej dziedzinie obejmują syntezę nowych receptorów rozpoznających cząsteczki wybranych analitów i decydujących w największym stopniu o czułości i selektywności sensorów. Wysoką czułość i selektywność czujników chemicznych, zwłaszcza w stosunku do dużych molekuł peptydów czy fragmentów kwasów nukleinowych, można osiągnąć stosując metodę wdrukowywania molekularnego (ang. molecular imprinting, MIP). Metoda ta umożliwia otrzymanie selektywnych, cienkich warstw polimerów z lukami molekularnymi dopasowanymi do cząsteczek analitu (szablonu) pod względem wielkości i kształtu, zawierającymi odpowiednio zorientowane centra wiążące. Przedstawiona do recenzji rozprawa doktorska mgr inż. Zofii Iskierko, zatytułowana Chemical sensors with molecularly imprinted polymers as recognition units for determination of selected compounds of health importance, wykonana pod kierunkiem prof. dr hab. Włodzimierza Kutnera (promotor pomocniczy - dr inż. Krzysztof Noworyta), wpisuje się w opisany powyżej nurt badawczy. Doktorantka przedstawiła opracowanie sensorów elektrochemicznych tranzystorów polowych z rozszerzoną bramką, czułych na biomarkery istotne dla prawidłowego funkcjonowania organizmu ludzkiego, w których zastosowała selektywne warstwy polimerów wdrukowanych molekularnie jako warstwy receptorowe. Przedstawiona

2 tematyka mieści się w obszarze zainteresowań badawczych zespołu prof. Włodzimierza Kutnera, tj. projektowanie sensorów chemicznych wykorzystujących warstwy polimerów wdrukowanych molekularnie, w Zakładzie Fizykochemii Kompleksów Supra-molekularnych Instytutu Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk w Warszawie, z wynikami o znaczącej pozycji w literaturze światowej. Praca doktorska została zredagowana w języku angielskim, ma tradycyjny układ i składa się z 5 rozdziałów. Pierwszy rozdział, poprzedzony krótkim wstępem, przedstawia zagadnienia istotne z punktu widzenia prowadzonych badań. Kolejne rozdziały prezentują stosowaną metodykę badawczą i techniki pomiarowe oraz szczegółowy opis rezultatów uzyskanych dla kolejnych opracowywanych sensorów. Pracę kończą 2 krótkie rozdziały podsumowujące otrzymane wyniki oraz perspektywy dalszych badań w tym kierunku. Układ, zarówno części literaturowej jak i eksperymentalnej, jest logiczny i przejrzysty a nieliczne błędy redakcyjne czy skróty myślowe nie wpływają na ich czytelność. Praca obejmuje 114 stron maszynopisu, z 52 rysunkami oraz 13 tabelami; w tekście znajduje się 206 odnośników do literatury zebranych w ostatnim rozdziale. Praca doktorska poprzedzona została wykazem dorobku naukowego Doktorantki (w tym publikacji i projektów naukowych ściśle związanych z realizacją pracy doktorskiej), listą użytych w tekście skrótów i symboli oraz streszczeniem pracy w języku polskim i angielskim. Szczegółowe omówienie rozprawy doktorskiej Rozprawę doktorską rozpoczyna krótki wstęp, w którym Doktorantka przedstawiła obszar swoich zainteresowań badawczych, cel pracy doktorskiej oraz układ całości pracy. Część literaturowa (rozdział 1) obejmuje charakterystykę wybranych biomarkerów, takich chorób jak: ostra niewydolność nerek, cukrzycowa choroba nerek, artretyzm, fenyloketonuria (tj. inozyny, ludzkiej lipokaliny-2, D- i L-fenyloalaniny). Dalej zawiera szczegółowy opis metodyki wdrukowywania molekularnego oraz właściwości i zastosowania tego typu warstw w rozpoznawaniu cząsteczek biomarkerów. Ze względu na tematykę rozprawy, rozdział 1 kończy przegląd literaturowy sensorów wykorzystujących tranzystory polowe i selektywne warstwy receptorowe wykonane metodą MIP, czułych na związki ważne z punktu widzenia diagnostyki chorób metabolicznych. Część eksperymentalną pracy doktorskiej rozpoczyna rozdział 2, w którym Doktorantka zebrała stosowane odczynniki/aparaturę, omówiła procedury przygotowania poszczególnych warstw polimerów wdrukowanych molekularnie oraz metodykę prowadzonych pomiarów. W dalszej części przedstawione zostały podstawy technik instrumentalnych stosowanych w trakcie badań (woltamperometria, mikrograwimetria, spektrofotometria UV-Vis, spektroskopia odbiciowo-absorpcyjna w podczerwieni, mikroskopia sił atomowych, skaningowa mikroskopia elektronowa, rentgenowska dyfraktometria proszkowa). 2

3 W rozdziale 3 przedstawione zostały wyniki badań własnych, przy czym schemat kolejnych podrozdziałów, opisujących opracowanie sensorów chemicznych EG-FET czułych na poszczególne biomarkery, jest podobny. Przygotowanie warstw receptorowych sensorów poprzedzone było odpowiednim doborem monomerów funkcyjnych (pochodnych tiofenu) oraz modelowaniem kwantowo-chemicznym oddziaływań pomiędzy analitami a monomerami funkcyjnymi, wykorzystującym teorię funkcjonału gęstości (ang. density functional theory). Następnie na drodze polimeryzacji elektrochemicznej wybranych monomerów funkcyjnych i sieciujących (w obecności analitów), osadzane były odpowiednie warstwy MIP na planarnych elektrodach złotych (w przypadku sensorów lipokaliny, zastosowano dodatkowe rozwinięcie powierzchni elektrody budując w pierwszej kolejności szkielet metaloorganiczny MOF ang. metal-organic framework). Morfologia osadzanych warstw była obrazowana za pomocą mikroskopii sił atomowych, skaningowej mikroskopii elektronowej (strukturę warstw MOF zbadano za pomocą rentgenowskiej dyfraktometrii proszkowej). Cząsteczki analitów usuwano, po przeprowadzeniu etapu elektropolimeryzacji, otrzymując selektywne luki molekularne, co zostało potwierdzone w badaniach spektroskopowych i prądowych. Elektrody złote modyfikowane warstwami MIP stanowiły warstwy receptorowe sensorów po podłączeniu do bramki komercyjnego tranzystora MOSFET (w tym wypadku przetwornika). Najważniejszym etapem było określenie parametrów pracy opracowanych sensorów EG-FET wyznaczono ich czułość, selektywność, granicę wykrywalności, a w przypadku sensorów fenyloalaniny, również ich enancjoselektywność (parametry pracy porównywano z czujnikami z tzw. warstwami NIP, otrzymanymi w wyniku elektropolimeryzacji monomerów funkcyjnych bez cząsteczek szablonu). Warto podkreślić, że warstwy receptorowe o takim samym składzie zostały też wykorzystane w konstrukcji miniaturowych sensorów masowych (kwarcowych mikrowag QMB). Na podstawie uzyskanych wyników (głównie granicy wykrywalności i selektywności sensorów EG-FET) Doktorantka stwierdziła, że opracowane zminiaturyzowane urządzenia analityczne mogą być stosowane w diagnostyce medycznej do selektywnego wykrywania i oznaczania wybranych analitów w ludzkich płynach ustrojowych (wykazano nieznaczny wpływ typowych interferentów). Rezultaty potwierdziły efektywność metody wdrukowania molekularnego (na podstawie wartości współczynnika wdrukowania) oraz korzystny wpływ rozwinięcia powierzchni sensorów z zastosowaniem materiałów metaloorganicznych MOF. Rozprawę doktorską kończą krótkie rozdziały poświęcone: podsumowaniu uzyskanych wyników prac eksperymentalnych oraz wskazaniu nowego kierunku badań, który będzie realizowany przez Doktorantkę w ramach projektu i stypendium Marie Curie (opracowanie sensorów wykorzystujących polimery wdrukowywane molekularnie, czułych na gluten). 3

4 Ocena merytoryczna rozprawy doktorskiej Tematyka pracy doktorskiej jest ciekawa i ważna z punktu widzenia konstrukcji tanich zminiaturyzowanych sensorów, zapewniających szybką i wiarygodną diagnostykę medyczną. Z uwagi jednak na obowiązek krytycznego podejścia do ocenianej pracy, chciałbym przedstawić uwagi ogólne i szczegółowe dotyczące poszczególnych części rozprawy. Po pierwsze dobór i układ zagadnień omówionych w części literaturowej (rozdział 1) uważam za trafny i czytelny. Autorka przedstawiła zwięźle problematykę rozpoznawania biomarkerów z użyciem warstw wdrukowanych molekularnie. Analiza opracowanych do tej pory sensorów wykorzystujących tranzystory polowe FET oraz warstwy receptorowe MIP nakreśliła stan wiedzy w tej dziedzinie i uzasadniła celowość podjętych przez Doktorantkę prac badawczych. Po drugie na szczególne podkreślenie w części doświadczalnej zasługuje zaproponowana interdyscyplinarna metodyka badawcza, która doprowadziła do osiągnięcia ambitnego celu. Nowatorstwo i atrakcyjność stosowanej metodyki wynika z połączenia następujących elementów: metody wdrukowywania molekularnego, dzięki której otrzymywane polimerowe warstwy receptorowe charakteryzują się wysoką selektywnością w stosunku do analitu/szablonu (także enancjoselektywnością); procedura ta była optymalizowana za pomocą modelowania oddziaływań pomiędzy analitami a monomerami funkcyjnymi, doboru odpowiednich monomerów funkcyjnych pochodnych tiofenu, prowadzących do osadzania w drodze elektropolimeryzacji polimerów przewodzących; przewodnictwo takich warstw jest wynikiem między innymi oddziaływań z cząsteczkami obdarzonymi ładunkiem i zapewnia właściwe przekształcanie równowag jonowych na granicy faz na sygnał elektryczny (czego Doktorantka nie podkreśliła w pracy), konfiguracji EG-FET, która prowadzi do poprawy stabilności tranzystorów polowych (w stosunku do klasycznych ISFETów) i umożliwia konstrukcję sensorów o niższej granicy wykrywalności niż porównywalne elektrody jonoselektywne (ponadto w stosowanym w pracy trybie pomiarowym, czułość sensorów może być w prosty sposób regulowana za pomocą odpowiedniej polaryzacji elektrody odniesienia zmianę V G). Umiejętna integracja powyższych elementów, przy właściwie zaplanowanych etapach prac badawczych i starannej kontroli efektywności ich wykonania (za pomocą odpowiednio dobranych technik elektrochemicznych i spektroskopowych) doprowadziła do opracowania miniaturowych sensorów czułych i selektywnych na wybrane biomarkery. Parametry pracy skonstruowanych sensorów EG-FET są obiecujące, choć wymagają jeszcze pewnych prac optymalizacyjnych w celu poprawy np. stabilności sygnału (na co wskazuje rys ) czy uzupełnienia o ważne informacje dotyczące pozostałych parametrów metrologicznych. 4

5 Pomimo jednak oryginalnego podejścia do rozwiązania problemu naukowego i właściwie przeprowadzonych badań, na co wskazuje prezentowany w części doświadczalnej materiał, pewien niedosyt budzi kompletność, opis i dyskusja uzyskanych wyników (dotyczy to głównie parametrów pracy sensorów EG-FET). Poniżej przedstawiam swoje uwagi/pytania ogólne do całej rozprawy i dalej szczegółowy komentarz do poszczególnych części rozdziału 3: 1. Mechanizm generowania sygnału poszczególnych sensorów jest oczywisty, jeśli w warunkach pomiaru cząsteczki analitów były obdarzone ładunkiem wiemy jednak o tym tylko w przypadku pomiarów z użyciem czujników fenyloalaniny, 2. Doktorantka nie podaje informacji na temat zmian i kontroli ph roztworu w trakcie eksperymentów (wahania ph mogą mieć wpływ na sygnał sensorów), 3. W każdej części rozdziału 3 brakuje dyskusji na temat przydatności poszczególnych czujników w diagnostyce medycznej; jeżeli taka użyteczność jest oceniania to jedynie na podstawie granicy wykrywalności i selektywności sensorów (nie była wyznaczana granica oznaczalności i odpowiedzi dynamiczne sensorów zmiany sygnału w czasie w trakcie skokowego zwiększania stężenia analitu za wyjątkiem czujnika inozyny), 4. Brakuje informacji dotyczących parametrów pracy sensorów: czasu odpowiedzi, czasu życia, powtarzalności i odtwarzalności; ponadto odpowiedzi dynamiczne sensorów w znacznym stopniu pomogłyby w ocenie jakości sensorów (patrz jedyny rys ). Uwagi szczegółowe do części doświadczalnej: 1. Rozdział 3.1 czy oddziaływania grupy boronowej z diolem (rybozą) ograniczają się jedynie do wiązań wodorowych (tzn. nie tworzą się cykliczne estry)? 2. Rozdział 3.1 rysunek nie potwierdza raczej wniosku o możliwości praktycznego zastosowania sensora do oznaczania inozyny w stanach chorobowych (czujnik zaczyna odpowiadać sensownie powyżej 7,5 µm); jak na podstawie rysunku wyznaczono krzywą kalibracji prezentowaną na rysunku 3.1-8? 3. Rozdział 3.2 sensory wykazywały znacznie wyższą czułość, przy porównywalnej granicy wykrywalności, dla V G = 2.0V; dlaczego nie wyznaczono parametrów pracy czujników (krzywej kalibracji, selektywności) w takich warunkach? 4. Rozdział 4 w części tej brakuje pogłębionej dyskusji i krytycznej analizy otrzymanych wyników, które umożliwiłyby np. sformułowanie wniosków wskazujących perspektywy dalszych badań i możliwości optymalizacji parametrów pracy czujników. 5

6 Podsumowanie recenzji Rozprawa doktorska mgr inż. Zofii Iskierko przedstawia dużą wartość pod względem poznawczym a także aplikacyjnym. Oryginalne wyniki wskazują na potencjalne możliwości konstrukcji i zastosowania sensorów typu EG-FET, wykorzystujących selektywne warstwy polimerów wdrukowanych molekularnie, do oznaczania ważnych w diagnostyce medycznej biomarkerów. Zaletą takich urządzeń byłby niewątpliwie niski koszt i stosunkowo prosta metoda ich wytwarzania, przy wysokiej selektywności rozpoznawania cząsteczek analitu. Podsumowując uważam, że założenia prac badawczych zostały zrealizowane a praca doktorska mgr inż. Zofii Iskierko stanowi nowość naukową w dziedzinie projektowania miniaturowych sensorów elektrochemicznych. O wysokim poziomie naukowym badań świadczy opublikowanie wyników w czasopismach z listy filadelfijskiego Instytutu Informacji Naukowej (5 artykułów o łącznym IF = 34.1). Rozprawa została starannie zredagowana a uwagi przedstawione powyżej nie zmieniają mojej wysokiej oceny pracy. Na tej podstawie stwierdzam, że rozprawa doktorska spełnia kryteria określone w art. 13 Ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. Nr 65 poz. 595 ze zm. w Dz. U. z 2005 r. Nr 164 poz. 1365) i wnoszę o jej przyjęcie i dopuszczenie do publicznej obrony. 6