Dyrekcja E Bezpieczeństwo Żywności: zdrowie roślin, zdrowie i dobrostan zwierząt, sprawy międzynarodowe E1 Zdrowie roślin. Projekt wytycznych

Transkrypt

1 KOMISJA EUROPEJSKA DYREKCJA GENERALNA DS. ZDROWIA I OCHRONY KONSUMENTA Dyrekcja E Bezpieczeństwo Żywności: zdrowie roślin, zdrowie i dobrostan zwierząt, sprawy międzynarodowe E1 Zdrowie roślin 7199/VI/99 rev. 5 05/07/2001 Projekt wytycznych Wytyczne dot. ustalenia Dawki Referencyjnej dla Narażenia Ostrego (niekoniecznie reprezentuje poglądy służb Komisji) Niniejszy dokument sporządzono jako dokument roboczy Służb Komisji, który został opracowany we współpracy z Państwami Członkowskimi. Dokument ten nie wprowadza wiążących skutków prawnych oraz nie podważa żadnych działań podejmowanych przez dowolne Państwo Członkowskie w ramach założeń wdrożeniowych określonych w załącznikach II, III i VI do Dyrektywy Rady 91/414/EWG, ani prawa precedensowego powstałego w oparciu o ten przepis. Niniejszy dokument nie wyklucza również możliwości nadania przez Europejski Trybunał Sprawiedliwości dowolnemu przepisowi rygoru natychmiastowej wykonalności w Państwach Członkowskich.

2 Przedmowa Publikacja Światowej Organizacji Zdrowia z roku 1989 Wytyczne dot. przewidywania spożycia pozostałości pestycydów (WHO, 1989) była podstawą szacowania ryzyka konsumenckiego w kwestii pozostałości pestycydów przez wiele lat. Ostatnio pojawiły się obawy, że ostre skutki toksyczne mogą czasem mieć miejsce po spożyciu żywności zawierającej pozostałości pewnych pestycydów. JMPR z 1994r. (FAO/WHO, 1994) dotyczyło sytuacji, w których ADI ustalono na podstawie badań podprzewlekłych lub długoterminowych, co najprawdopodobniej nie było odpowiednim wyznacznikiem toksykologicznym dla szacowania ryzyka stwarzanego przez krótkotrwałe narażenie na silnie toksyczne pozostałości. W 1997r., na spotkaniu ECCO dyskutowano, w części dotyczącej metabolizmu i toksykologii ssaków, Dawkę Referencyjną dla Narażenia Ostrego (ARfD) jako nowe pojęcie, oraz zdecydowano, że wymaganych jest więcej wytycznych w kwestii ustalenia i stosowania tej nowej wartości progowej. Na spotkaniu ECCO w 1998r. dyskutowano jako pierwszą niemiecką wstępną propozycję ustalenia wartości ARfD. Propozycja ta oparta była na zrewidowanym dokumencie pochodzącym od ACP (AAHL/3/98) oraz rekomendacji JMPR z 1998r. w Rzymie (FAO/WHO, 1998). Poprawiona wersja niemieckiej propozycji ustalenia wartości ARfD została przekazana przez zespół ECCO Państwom Członkowskim w celu skomentowania w 1999r. Kwestia ARfD została ponownie poruszona przez Komitet Praw Człowieka na jego trzydziestej drugiej sesji, a JMPR w 2000r. (FAO/WHO 2000) poproszono o dalsze rozwinięcie tej sprawy. Państwowe agencje kontroli oraz Unia Europejska również odniosły się do tej kwestii. Propozycja oparta jest na rekomendacjach, podanych na spotkaniu SCP w dniu 11 maja 1999r. Zawiera ona komentarze od wielu Państw Członkowskich UE oraz rekomendacje JMPR z 2000r. w Genewie, jak również doświadczenia ze spotkań ECCO w latach 1999 i 2000, na których dyskutowano o wielkości ARfD dla ponad 30 pestycydów. Dokument ten reprezentuje najnowsze osiągnięcia obecnej wiedzy i będzie uaktualniany w miarę pojawiania się nowych danych i/lub nowej polityki. Dlatego też niniejszy dokument nie powinien być prawnie wiążący. Wytyczne zawarte w niniejszym dokumencie przeznaczone są do użytku przez Komisję Europejską oraz Państwa Członkowskie w ramach Stałej Komisji ds. Zdrowia Roślin w celu ustalenia dawki referencyjnej dla narażenia ostrego przy włączaniu substancji aktywnych do Aneksu I Dyrektywy 91/414/EEC. Wytyczne są też przeznaczone do użytku przez aplikantów, przy składaniu naukowo uzasadnionych propozycji dotyczących poziomów dawek referencyjnych dla narażenia ostrego na podstawie wszelkich istotnych informacji toksykologicznych, wedle wymogów Dyrektywy 91/414/EEC. Samo stosowanie ARfD jest jednak częścią procesu oceny ryzyka i podejmowania decyzji przy rejestracji Produktów Ochrony Roślin na szczeblu Państwa Członkowskiego, dlatego też nie jest opisane w niniejszym dokumencie. Poniższe punkty dotyczące ustalania ARfD wymagają dalszego przedyskutowania przez SCP: Konieczność wypracowania formalnego zdania KE dotyczącego stosowania danych pochodzących z badań na ludziach. Potrzeba przeprowadzenia nie tylko oceny ryzyka toksykologicznego kompletu danych, ale też oszacowania ostrego spożycia opartego na danych o pozostałościach oraz spożyciu. Na podstawie wstępnego projektu protokołu powinny zostać sporządzone konkretne wytyczne OECD dla projektu odpowiedniego badania na zwierzętach, mających na celu ustalenie ARfD (Załącznik I).

3 Rozdział 1 WSTĘP 1.1 Dla oszacowania ryzyka zdrowotnego po podprzewlekłym lub przewlekłym wystawieniu na działanie pestycydów ustalono ADI. Jako że ADI jest zwykle oparte na poziomach NOAEL obserwowanych w trakcie badań trwających całe życie lub podprzewlekłych, oraz że różnica między NOAEL a LOAEL może być znaczna, może to wprowadzić dodatkowy margines bezpieczeństwa, bowiem pojedyncze przekroczenie poziomu ADI nie musi oznaczać realnego zagrożenia dla zdrowia ludzkiego, jeżeli ADI nie pozostanie przekroczone przez długi okres czasu. 1.2 Pewne pestycydy mogą jednak stanowić ostre zagrożenie, więc takie przekroczenia są z toksykologicznego punktu widzenia istotne. W szacowaniu ryzyka pozostałości w żywności oraz wodzie pitnej, standardową praktyką powinno być rozważenie ustalania dawki referencyjnej dla narażenia ostrego (ARfD) dla wszystkich związków. Jako że skutki ostre mogą pojawić się po jednej dawce, skutkiem wystawienia na działanie wyższe niż ARfD będzie obniżenie marginesu bezpieczeństwa. 1.3 ARfD związku chemicznego została zdefiniowana przez JMPR w roku 1998 jako szacunkowa ilość substancji w żywności lub wodzie pitnej, wyrażona na podstawie masy ciała, która może zostać spożyta w przeciągu krótkiego okresu czasu, zwykle podczas jednego posiłku lub jednego dnia, bez wystąpienia ryzyka dla konsumenta, możliwego do oceny na podstawie wszelkich faktów znanych w czasie badania (FAO/WHO, 1998). 1.4 Następujące kategorie ostrzeżeń toksykologicznych powinny wskazywać na potrzebę ustalenia ARfD (FAO/WHO, 2000). i. Działanie zabójcze po podaniu drogą doustną pojedynczej, niewielkiej dawki ii. Wpływ na rozwój organizmu, za wyjątkiem, kiedy jest on wyraźnym skutkiem zatrucia podczas życie płodowego iii. Objawy kliniczne, inne skutki farmakologiczne, lub skutki na organach docelowych obserwowane wcześnie podczas badań przy zastosowaniu wielokrotnie powtarzanych, wliczając w to wpływ na zachowanie lub na układ trawienny, naczyniowo-sercowy lub oddechowy. iv. Ostra neurotoksyczność, również w skutek działania związków fosforoorganicznych oraz karbaminianów. v. Zmiany hormonalne lub inne zmiany biochemiczne, zaobserwowane podczas badań z użyciem wielokrotnie powtarzanych, które mogą zostać wywołane pojedynczą dawką. 1.5 Jeżeli nie występuje zagrożenie toksykologiczne odnośnie skutków ostrych, i w związku z tym nie jest uznane za konieczne ustalenie ARfD, podstawy takiej decyzji powinny zostać wyraźnie podane. 1.6 Chociaż ustalenie ARfD opiera się w znacznym stopniu na ocenie eksperckiej, potrzebne jest elastyczne podejście do zagadnienia, które musi być opisane możliwie przejrzyście. Może wystąpić konieczność zweryfikowania ARfD jeżeli pojawią się nowe dane. Rozdział 2 CHARAKTERYSTYKA ZAGROŻENIA Ogólne ustalenia dotyczące wypracowania ARfD 2.1 Celem tego rozdziału jest dostarczenie krótkich wytycznych dotyczących ogólnych aspektów charakterystyki zagrożenia. Podstawowymi krokami charakterystyki zagrożenia są: opis profilu toksykologicznego substancji; identyfikacja istotnych efektów krytycznych u najbardziej istotnych i wrażliwych gatunków; oraz ocena reakcji na dawkę i identyfikacja progowych wielkości dawek dla efektów krytycznych. 2.2 Dokładna informacja odnośnie wymagań dotyczących danych toksykologicznych i metabolicznych oraz metod testowych służących włączeniu substancji aktywnej do Aneksu I, oraz dotyczących wniosku o przyznanie zezwolenia środkowi ochrony roślin, zawarta jest w Dyrektywie Komisji 94/79/EC. ARfD ustala się na podstawie informacji o właściwościach toksykologicznych substancji aktywnej. Badania toksykologiczne oraz metaboliczne, wymagane do włączenia substancji aktywnej do Aneksu I Dyrektywy 91/414/EEC, są podane w jej Aneksie II. 2.3 Dla większości toksykologicznych parametrów docelowych jest ogólnie przyjęte, że istnieje próg, poniżej którego nie ma miejsca żaden efekt toksyczny. Najwyższy poziom dawki przy którym nie występują żadne statystycznie lub biologicznie znaczące wzrosty częstotliwości i intensywności jakichkolwiek skutków, pomiędzy narażoną populacją a jej wydzieloną grupa kontrolną, jest zwykle określany jako NOAEL (poziom bez obserwowanego działania szkodliwego). Zazwyczaj ARfD jest oparta głównie na NOAEL.

4 2.4 W standardowym pakiecie dostępnych badań nad toksykologią ssaków dotyczących aktywnej substancji pestycydu istnieje szeroka gama typów badań nad licznymi parametrami docelowymi, stosujących zróżnicowane okresy narażenia. Większość dostępnych wyników badań osiągnięto stosując narażenie drogą doustną. ARfD jest wartością graniczną dla narażenia drogą doustną i jako taka powinna być ustalana na podstawie danych pochodzących z badań stosujących narażanie drogą doustną. 2.5 Przy identyfikacji efektu krytycznego po pojedynczym narażeniu, powinna być brana pod uwagę jakość przeprowadzenia eksperymentu, rodzaje, miejsce oraz nasilenie, jak również okres prowadzenia badania. Krytyczny skutek szkodliwy można zdefiniować jako najwyraźniejszy efekt szkodliwy, mający miejsce po pojedynczym narażeniu przy zastosowaniu najniższej dawki mającej skutki ostre w organie docelowym. 2.6 Komplet danych był początkowo wymagany przez Artykuł 13 (1) Dyrektywy 91/414/EEC, w celu ustalenia ADI oraz AOEL. Niestety, dostępne protokoły badań nie obejmują zarówno parametrów docelowych, jak i okresu badań istotnych dla ustalenia konkretnej ARfD. Uznano, że obecne toksykologiczne bazy danych nie są zaprojektowane, aby spełniać to zadanie, oraz nie zawierają konkretnych badań odnośnie parametrów docelowych oraz okresów badań koniecznych przy dokładnym ustalaniu ARfD. 2.7 Odnośnie badań dostępnych lub wymaganych do rejestracji pestycydów, jest niemal niemożliwe przewidzieć krytyczne skutki ostre po jednej lub zaledwie kilku dawkach, które powinny zostać podane w celu ustalenia konkretnej ARfD. Dlatego też, za wyjątkiem kilku konkretnych związków (mianowicie inhibitorów cholinesterazy i kilku innych) ARfD były zwykle ustalane na podstawie badań wykorzystujących wielokrotne dawkowanie, w skutek czego większość z nich jest konserwatywna. 2.8 Generalnie, ARfD może być ustalone jedynie, gdy istnieje już ADI oraz mogą być spełnione Kryteria do włączenia Substancji Aktywnych do Aneksu I Dyrektywy Rady 91/414/EEC. W zasadnie nie będzie możliwe ustalenie ARfD jeżeli nie istnieje dawka progowa. 2.9 Przy badaniu na zwierzętach, należy rozważyć, czy skutki na których oparty jest NOAEL mogą odnosić się do ludzi. Jest to często trudne do oszacowania, trzeba więc przyjąć założenie, że NOAEL u najbardziej wrażliwego gatunku zwierzęcia odnosi się także do ludzi jeżeli nie ma danych, które temu przeczą Generalnie, większość danych będzie pozyskiwana z badań nad zwierzętami, mogą być jednak dostępne dane pochodzące od ludzi. Z perspektywy naukowej, należy bardzo poważnie rozważyć etyczne aspekty prowadzenia badań na ludziach w celu przyznania pozwolenia pestycydom. Należy też ustalić status etyczny badań na ludziach zanim zostaną one wzięte pod uwagę. Toksykologiczne parametry docelowe w Aneksie II Dyrektywy 91/414/EWG przy ustalaniu ARfD 2.11 Dyrektywa 91/414/EEC nie wymaga badań specjalnie zaprojektowanych do ustalenia ARfD. Dla wszystkich substancji aktywnych, wszystkie badania w toksykologicznej bazie danych muszą być w tym procesie uwzględnione, jednak najbardziej istotnymi badaniami będą zwykle badania krótkoterminowe (28 lub 90 dniowe), z użyciem wielu dawek, oraz rozwojowe. Badania nad ostrą neurotoksycznością nie są wymagane przez 91/414/EEC, lecz gdy są one dostępne, często są najbardziej istotne dla ustalenia ARfD. AIIA5.1: Badania ADME 2.12 Te toksykokinetyczne badania mogą dostarczyć ważnych podstawowych informacji na temat przyjmowania drogą doustną, rozmieszczenia, akumulacji, metabolizmu oraz wydalania danej substancji. Dlatego też, te podstawowe dane (np. wartości szczytowe osocza, przyjmowanie drogą doustną, dane o bioakumulacji) mogą pełnić rolę dodatkowych dowodów, jeżeli istnieją wątpliwości dotyczące ostrego przyjmowania jednej lub kilku dawek związku podstawowego lub jego metabolitów Dane dotyczące toksykokinetyki porównawczej u ludzi i zwierząt mogą okazać się użyteczne w odniesieniu do opartego na eksperymentach udoskonalenia czynnika oceny zmienności międzygatunkowej. AIIA5.2: Ostra toksyczność po narażeniu drogą doustną 2.14 Te oparte na jednej dawce badania mają na celu identyfikację poziomów wywołujących śmierć lub poważne oznaki zatrucia, głównie dla celów klasyfikacji i oznaczenia. Generalnie, badania te mają ograniczoną przydatność przy ocenie organów docelowych. Chociaż zdarza się, że badania nad śmiertelnością lub działaniem ostrym substancji zawierają dane o istotnych objawach klinicznych oraz/lub konkretnych skutkach, zwykle nie nadają się one do ustalenia NOAEL dla efektów krytycznych w takiej formie, w jakiej są obecnie przeprowadzane. Dlatego też, nie istnieją tak naprawdę w bazie

5 danych badania odpowiednie do oceny ostrego zagrożenia dla skutków ostrych po przyjęciu jednej lub kilku dawek, które są najbardziej odpowiednie dla wyznaczenia dawki referencyjnej dla narażenia ostrego W przyszłości, preferowane będą badania z zastosowaniem narażania drogą doustna, z ograniczoną liczbą poziomu dawek i zwierząt zgodnie z wytycznymi OECD 420, 423 lub 425, dla ustalenia przybliżonej LD50. Te alternatywy dla LD50 opierają się bardziej na obserwacji objawów i skutków niż na śmiertelności, mogą więc być bardziej przydatne przy wyznaczaniu ARfD. AIIA5.3: Badania podostre 2.16 Przed rozpoczęciem 90 dniowych badań, często są wykonywane zakresowe podostre badania wykorzystujące narażenie drogą doustną. Badania te będą stosowały dawkowanie w krótkich okresach czasu, takich jak 14 dni, do najwyżej 28 dni, w celu ustalenia w szczególności dawki maksymalnej, a czasem również NOAEL, które mogłyby być wykorzystane w dalszych badaniach. Dlatego też zwykle wykorzystywane są niewielkie liczby zwierząt oraz duże przerwy między dawkami, które nie są odpowiednie do ustalania wartości progowych Badania podostre mogą stanowić jedne z najodpowiedniejszych źródeł danych dla ustalania ARfD, w szczególności jeżeli konieczne jest zmierzenie istotnych ostrych toksycznych parametrów docelowych. Muszą one być jednak odpowiednio zaprojektowane (np. w zgodzie z OECD 407). AIIA55.3: Badania podprzewlekłe 2.18 Zwykle bada się dwa różne gatunki (szczur, pies) po wielokrotnym dawkowaniu drogą doustną, w paszy lub bezpośrednim, trwającym najczęściej 90 dni. Wykonywane są szerokie badania histopatologiczne, chemiczne i hematologiczne, więc badania te z dużym prawdopodobieństwem mogą objąć kluczowe parametry docelowe. Jednak obserwowane skutki są wynikami narażania na wielokrotne dawkowanie (co jest znacznie większą ilością niż jedna lub kilka dawek) Najczęściej stosowane są badania podprzewlekłej toksyczności, nie są one jednak najbardziej odpowiednim rodzajem standardowych badań mających na celu ustalenie ARfD. Czasami te same wielkości dawek są stosowane w badaniach z których określane/wyznaczane jest ADI. Takie badania powinny być stosowane do wyznaczania ARfD, jeżeli może być udowodnione, że nie istnieje żadna istotna różnica między skutkami ostrymi a podprzewlekłymi, lub kiedy brakuje danych ostrych, gdyż daje to konserwatywne oszacowanie pierwszego stopnia. Dodatkowo, mogą wystąpić przypadki, w których obserwacje z początkowego stadium badań przy użyciu wielokrotnie powtarzanych są wynikiem ostrego narażenia. AIIA5.4: Badania genotoksyczne 2.20 Badania te mają na celu identyfikację skutków genotoksycznych głównie in vitro są one raczej mało przydatne przy ustalaniu ARfD Istnieje niewielka liczba testów in vivo (np. badanie mikrojądrowe) w których podawane są pojedyncze, silne dawki, badana liczba parametrów końcowych jest jednak zbyt ograniczona dla ustalania ARfD. Jeżeli został wyznaczony odpowiedni parametr końcowy z NOAEL, takie badania genotoksyczne in vivo mogą być uznane za przydatne przy ustalaniu ARfD. AIIA5.A: Badania przewlekłości/kancerogenezy 2.22 Przewlekłe badania toksyczności są najpowszechniej stosowanymi standardowymi badaniami wykorzystywanymi do wyznaczania ADI. Badania takie mogą być wykorzystane do ustalania ARfD, jeżeli może być udowodnione, że nie ma różnicy między skutkami ostrymi, podprzewlekłymi i przewlekłymi. Generalnie, wszystkie aspekty istotne dla ustalenia ARfD powinny być sprawdzone poprzez bardziej odpowiednie badania krótkoterminowe Mimo, że ARfD jest rutynowo oparta na odpowiednim NOAEL pochodzącym z konkretnego zestawu krótkoterminowych badań toksyczności, może być czasami właściwe zastosowanie wyższego NOAEL, zwłaszcza gdy badania przewlekłe wskazują na wyższy NOAEL niż badania krótkoterminowe z powodu różnic w doborze wielkości dawek. AII5.6: Badania wielopokoleniowe

6 2.24 Zaobserwowane skutki negatywne przy toksyczności rodziców oraz zdolnościach rozrodczych są związane z wielokrotnym przyjmowaniem substancji i mogą mieć konserwatywny wpływ na ARfD. Pewien wpływ na rozrodczość może mieć też jednak pojedyncza dawka podana w krytycznym momencie Badania te są unikatowe, jako że sprawdzają pewne parametry docelowe szczególnie u potomstwa ale też czasem u zwierząt ciężarnych/karmiących. Dlatego też, ten jedyny typ badań standardowych, który sprawdza wszelkie dowody na zwiększone skutki/podatność w tej podgrupie, powinien być dokładnie rozważony przed zastosowaniem do wyznaczania ARfD. AII5.6: Badania rozwojowe/teratologiczne 2.26 Badania te generalnie stosują bezpośrednie podanie dawki przez około 10 do 15 dni podczas ciąży. Głównym celem jest zbadanie skutków u płodu i matki. Wszelkie skutki u płodu mogą być uznane za spowodowane jedną lub kilkoma dawkami, jednak nie jest to zwykle udowodnione standardowymi badaniami. W związku ze stosunkowo krótkim okresem narażania, wszelkie zauważone skutki mogą być istotne dla oszacowania ARfD, zwłaszcza jeżeli najbardziej krytycznym skutkiem jest toksyczność rozwojowa Parametry zbadane dla nierozrodczych parametrów docelowych u matek są często bardzo ograniczone i tylko szacunkowe u jednej płci. Czasami stosuje się okres około 4 do 6 dni przed uśmierceniem, w którym dawkowanie jest wstrzymane. Na skutki krytyczne może mieć wpływ zwiększona podatność u ciężarnych zwierząt, istotna głównie u tej konkretnej subpopulacji Jeżeli został zbadany krytyczny parametr docelowy i został ustalony NOAEL, badania te mogą być zastosowane do wyznaczenia ARfD dla wrażliwej subpopulacji (np. kobiety w ciąży) oraz nienarodzonego potomstwa. AIIA5.7: Badania opóźnionej neurotoksyczności 2.29 Te badania z zastosowaniem pojedynczej lub wielokrotnie powtarzanych mają na celu identyfikację krytycznych skutków neurotoksycznych dla konkretnych substancji (np. związków fosforoorganicznych). Zgodnie z Wytycznymi testowymi OECD 418 i 419, testy te są przeprowadzane na kurach. Dla większości pestycydów, opóźniona neurotoksyczność nie jest efektem krytycznym. Dlatego też testy te są raczej mało istotne przy wyznaczaniu ARfD. AIIA5.7: Badania neurotoksyczności 2.30 Różne pestycydy mają konkretne właściwości neurotoksyczne, które mogą się ujawnić jako konkretne zmiany behawioralne (patrz też objawy kliniczne) lub konkretne zmiany neuropatologiczne. Jeżeli neurotoksyczność jest najbardziej krytycznym skutkiem, będą najprawdopodobniej dostępne badania nad ostrą lub rozwojową neurotoksycznością przeprowadzone na szczurach. Badania takie są wysoce istotne dla ustalenia ARfD Badania ostrej neurotoksyczności są niezwykle użyteczne nawet w przypadku substancji nie wykazujących działania neurotoksycznego, jako że biorą one pod szczegółową uwagę zachowanie, objawy oraz szereg organów. AIIA5.8: Badania mechanistyczne 2.32 Te testy (np. zakłócanie stanu hormonalnego, profilu wprowadzania enzymów) wykonywane są w celu wyjaśnienia mechanizmów skutków docelowych. Zwykle stosuje się wielokrotne dawkowanie oraz liczne okresy badań, w celu poznania skutków czasowych oraz zidentyfikowania NOAEL. Znaczenie tych badań dla człowieka musi zostać rozpatrzone osobno dla każdego przypadku, nie istnieje bowiem żaden standardowy wzór takich badań. AIIA5.9: Badania na ludzkich ochotnikach 2.33 Badania prowadzone na ludziach mogą być bardzo przydatne w ustalaniu ARfD. Prowadzenie nowych badań jest jednak dopuszczalne jedynie, gdy odbywają się one zgodnie z wszelkimi państwowymi i międzynarodowymi konwencjami etyki (Anonim, 1998) Badania te mogą być dostępne dla związków o dobrze poznanym i odwracalnym mechanizmie toksyczności (np. związki fosforoorganiczne oraz karbaminiany owadobójcze), który może być monitorowany technikami nieinwazyjnymi lub przez pobieranie próbek krwi. Badania nad związkami podobnymi, o zastosowaniu medycznym, mogą okazać się przydatne. Wielokrotne dawkowanie, przez 2

7 lub więcej tygodni, jest często stosowane, a liczne okresy badania dostarczają informacji o przebiegu oraz danych o odwracalności. Badania te są wyjątkowo istotne dla ustalania ARfD, zwłaszcza jeżeli efekty krytyczne są badane po podaniu jednej lub kilku dawek. Jednak niektóre ze starszych badań są wątpliwej jakości Badania na ludzkich ochotnikach mogą rozwiać wątpliwości ekstrapolacji międzygatunkowej oraz zwykle mierzą skutki w krótkich okresach czasu. Narażanie ludzi na działanie pestycydów tylko w celu obniżenia współczynnika zagrożenia jest jednak niedopuszczalne. Jeżeli odpowiednie parametry docelowe zostały określone po jednej lub kilku dawkach, mogą one być uznane za najodpowiedniejsze badania dla ustalenia ARfD. Rozdział 3 EKSTRAPOLACJA Z DANYCH O TOKSYCZNOŚĆI NA ARfD Pojedyncze i wielokrotne narażenia 3.1 Brany pod uwagę produkt żywnościowy może być owocem, który jest zjadany w krótkim czasie, a spożycie dawki ostrej może nastąpić jednorazowo (jeden posiłek lub danie) lub być rozłożone na cały dzień. Dlatego też może się okazać konieczne, przy występowaniu określonych istotnych skutków, porównanie podania jednorazowego z podaniem tej samej dawki podzielonej na wiele dawek przyjmowanych w ciągu jednego dnia. Zwłaszcza, jeżeli ważną rolę odgrywa szybka odwracalność, może być konieczny specjalny projekt badania (podanie bezpośrednie drogą doustną jednego dnia lub spożycie w pożywieniu w ciągu doby) dla takiego scenariusza narażenia. 3.2 W przypadku określonych celów możliwe jest, że efekt krytyczny obserwowany po pojedynczym narażeniu może się zmienić po wielokrotnym narażeniu przez pojawienie się mechanizmów przystosowawczych, np. wydzielanie enzymów metabolizujących lub mechanizmów naprawczych. Takie zagadnienia mechanistyczne muszą być brane pod uwagę, jeżeli skutki występujące po pojedynczej dawce miałyby być ekstrapolowane na dawkowanie wielokrotne i vice versa. Bezpośrednie podanie a spożycie 3.3 Podanie bezpośrednie było krytykowane w związku z jego przydatnością wobec narażania ludzi, bowiem ten sposób dawkowania skutkuje dużą dawką w układzie trawiennym, podczas gdy narażenie przez spożycie w żywności wykazuje stopniowe narażenie w pewnych ramach czasowych. Dla większości substancji, podanie bezpośrednie może być jednak traktowane jako najgorsze z możliwych narażenie ostre w porównaniu z narażeniem przez spożycie. Poza tym, zjedzenie zatrutego jabłka można uznać za narażenie podobne do bezpośredniego podania. 3.4 W przypadku pewnych pestycydów fosforoorganicznych, które skutkują przedłużonym wstrzymaniem AChE, pewna dawka rozłożona na kilka mniejszych i podana w ciągu jednego dnia może doprowadzić do większego wstrzymania AChE niż pojedyncza, duża dawka. W takich przypadkach, dawkowanie bezpośrednie drogą doustną nie może być uznawane za przypadek najgorszy. 3.5 Możliwa różnica wartości ARfD oparta na różnicach wynikających ze sposobu podania (bezpośrednie drogą doustną lub w pożywieniu) jest stosunkowo niewielka w porównaniu do innych wątpliwości, takich jak trafność NOAEL oraz stosowanie czynników oceny. Dlatego też dawkowanie bezpośrednie drogą doustną uznawane jest za ważny sposób na ustalenie ARfD, chyba, że dostępne informacje temu przeczą (np. kinetyka lub użycie niewłaściwych/specyficznych substancji pomocniczych). Różnice gatunkowe 3.6 U różnych gatunków, ta sama substancja może wykazywać różne skutki lub cele krytyczne po pojedynczym i wielokrotnym narażeniu. Większość badań toksykologicznych wymaganych dla pestycydów wykonywana jest na szczurach. Psy muszą być użyte jako drugi gatunek po okresie narażenia podprzewlekłego. Myszy są przedmiotem badań zwykle tylko przy długotrwałych analizach biologicznych, natomiast królików używa się jedynie przy badaniach toksyczności rozwojowej jako drugiego gatunku. Do badania ostrej opóźnionej neurtoksyczności mogą być użyte tylko kury. 3.7 W idealnym przypadku, ARfD powinna być oparta na konkretnych badaniach nad najbardziej wrażliwym gatunkiem. Jeżeli konkretna ARfD nie może być ustalona i jest oparta na badaniach nad innym gatunkiem, musi to być wzięte pod uwagę i wyjaśnione jako część procesu decyzyjnego. Różne podgrupy populacyjne 3.8 Na potrzeby oceny ostrego ryzyka żywieniowego mogą być brane pod uwagę różne podgrupy populacyjne. Jednak w większości przypadków, dostępne są jedynie badania toksyczności u dorosłych,

8 lub czasem ciężarnych, zwierząt. W standardowym pakiecie danych dot. pestycydów nie ma odpowiedniej bazy danych służących ustaleniu różnych ARfD w odniesieniu do różnych podgrup populacyjnych. Dlatego też jest niepożądane z punktu widzenia regulacji istnienie więcej niż jednej ARfD dla jednej substancji oraz przestrzeganie konceptu ADI; powinna być ustalona tylko jedna ARfD, stosowana wobec wszystkich podgrup. 3.9 Jeżeli wymagane jest wzięcie pod uwagę konkretnych subpopulacji na podstawie profilu toksykologicznego, mogą być badane konkretne podgrupy (np. różnice między osobnikami młodymi a dorosłymi, lub ciężarnymi a nieródkami). Na spotkaniu w York w 1998r. miała miejsce dyskusja plenarna dot. potrzeby określenia dodatkowego czynnika bezpieczeństwa wobec dzieci poniżej 6 roku życia. Zdecydowano, że dopóki baza danych jest odpowiednia, nie należy rutynowo stosować żadnych dodatkowych czynników. Czynniki oceny 3.10 Aby przełożyć krytyczny NOAEL na ARfD, muszą być zastosowane czynniki oceny biorące pod uwagę wątpliwości ekstrapolacji danych o toksyczności na narażoną populację ludzką. Dla zachowania jasności niniejszego dokumentu, termin czynnik oceny używany jest jako ogólny termin obejmujący wszelkie czynniki wyznaczone w literaturze, takie jak czynnik bezpieczeństwa, czynnik niepewności, czynnik ekstrapolacji, czynnik przystosowawczy itp Obecnie, ocena ryzyka dla nienowotworowych toksycznych parametrów końcowych oparta jest na założeniu istnienia wartości progowej i stosuje standardowe domyślne czynniki niepewności. Są one oparte na 10-krotnym czynniku różnorodności międzygatunkowej oraz na 10-krotnym czynniku różnorodności międzyosobniczej przy ocenie ryzyka dla ogólnej populacji. Dla większości ARfD został zaproponowany na spotkaniach niezależnych ekspertów ECCO, dotyczących Toksykologii Ssaków, ogólny, 100-krotny czynnik oceny Aby dane toksykokinetyczne lub mechanistyczne mogły mieć wpływ ilościowy na ocenę ryzyka, przy braku pełnego, opartego na biologii modelu dawka-odpowiedź, zarekomendowano dopracowanie obecnej procedury stosowania 10-krotnych czynników dla różnic międzygatunkowych oraz różnorodności wśród ludzi (IPCS). Podział każdego z 10-krotnych czynników na część toksykokinetyczną i toksykodynamiczną pozwoliłby na zastąpienie części czynników domyślnych istotnymi, chemicznymi i konkretnymi danymi, jeżeli takie byłyby dostępne. Dlatego też, wartości te zostały dodatkowo podzielone na podstawie rozróżnienia między toksykokinetyką a toksykodynamiką zarówno dla ekstrapolacji ze zwierząt na ludzi (odp. 2.5 i 4.0), jak i dla różnic międzyludzkich (odp i 3.16). Pełny opis sposobu ich wyznaczenia zawarty jest w IPCS EHC 210 (IPCS, 1999) Modelowanie farmakokinetyczne oparte na fizjologii może się okazać wartościowe przy wyznaczaniu odpowiedniego czynnika. Należy wziąć pod uwagę, że kiedy badany parametr docelowy dla skutku ostrego podatny jest na zwrotną interakcję związku z celem farmakologicznym, takim jak receptor lub kanał jonowy, raczej koncentracja substancji, a nie całkowite narażenie, powinna określać powagę skutku. Byłoby możliwe zredukowanie czynnika oceny ze zwyczajowych domyślnych 100. Wyznaczenie ARfD byłoby szczególnie przydatne do ustalania i stosowania czynników dostosowawczych dla konkretnych chemikaliów, które mogłyby zastąpić domyślny czynnik niepewności. Jednak stopień, w jakim czynnik niepewności powinien zostać w takich okolicznościach zmniejszony jeszcze nie został określony (FAO/WHO 2000) Przedyskutowanie i rozważenie wszelkich dostępnych danych jest istotnym elementem przy ostatecznym wyborze ogólnego czynnika oceny. Podstawa dla proponowanego ogólnego czynnika oceny musi być wyraźnie podana. Kluczowymi czynnikami są: a) różnice międzygatunkowe w reakcji toksycznej na związek chemiczny b) różnice wewnątrzgatunkowe (międzyosobnicze) w reakcji toksycznej na związek chemiczny c) jakość/zakres danych o toksyczności a) Różnice międzygatunkowe 3.15 Jeżeli NOAEL oparty jest na danych pochodzących z badań na zwierzętach, zwykle stosowany jest 10- krotny czynnik. Jeżeli krytyczny NOAEL oparty jest na udokumentowanych danych pochodzących z badań na ludziach, może być stosowany czynnik jednokrotny; jeżeli występują poważne ograniczenia danych pochodzących z badań na ludziach, określających krytyczny NOAEL, powinien być stosowany czynnik wyższy od jednego. W specjalnych przypadkach, gdy istnieją dane pozwalające na bardziej wiarygodne porównanie zwierzęcej i ludzkiej wrażliwości dla toksykologicznego skutku krytycznego danej substancji, powinno się wziąć pod uwagę udoskonalenie standardowego 10-krotnego czynnika międzygatunkowego.

9 3.16 Renwick (1993) poddaje analizie dane dotyczące różnic międzygatunkowych oraz zróżnicowania ludzi w toksykokinetyce oraz toksykodynamice dla ograniczonej liczby związków chemicznych. Dane te wskazują na większą potencjalną różnorodność w zakresie kinetyki niż dynamiki, zaproponowano więc wyższy czynnik dla różnorodności kinetycznej. W oparciu o tę analizę, zaproponowano podział standardowego 10-krotnego czynnika wewnątrzgatunkowego na czynnik 4-krotny ( ) dla toksykokinetyki oraz 2.5 ( ) dla toksykodynamiki (IPCS, 1999). b) Różnice wewnątrzgatunkowe (międzyosobnicze) 3.17 Zaleca się, aby przestrzegane było obecne, ostrożne podejście, stosowane na spotkaniach ECCO Toksykologia Ssaków, polegające na używaniu 10- krotnego czynnika, chyba, że zaistnieje przekonywujące uzasadnienie naukowe umożliwiające użycie niższego czynnika Po weryfikacji dokonanej na potrzeby Grupy Zadaniowej WHO do spraw kryteriów zdrowia środowiska dla wartości wytycznych dotyczących granic narażenia ludzi (IPCS, 1994), uznano, że baza danych analizowana przez Renwicka (1993) była niewystarczająca dla uzasadnienia nierównego podziału 10- krotnego czynnika zróżnicowania ludzi, dlatego też czynnik ten został podzielony równo na dwa czynniki (3.16 lub 3.2) każdy. Ten równy podział czynnika zróżnicowania ludzi został później poparty obszerniejszą analizą (Renwick & Lazarus, 1998) odpowiednich parametrów kinetycznych dla 60 związków chemicznych u ludzi, oraz danych skutku koncentracji dla 49 skutków związanych ze związkami chemicznymi. c) Jakość/zakres danych o toksyczności 3.19 Jeżeli istniejące dostępne dane o toksyczności krótkoterminowej są niepełne, ustalenie ARfD może wciąż być możliwe, jednak w tym przypadku ARfD pozostaje na tym samym poziomie co ADI. Taka sytuacja może mieć miejsce gdy, na przykład, żadne z dostępnych badań nie oceniło danego ostrego skutku krytycznego i wobec tego potrzebne są dodatkowe dane.

10 Rozdział 4 REKOMENDOWANE WYZNACZANIE DAWKI REFERENCYJNEJ DLA NARAŻENIA OSTREGO Wyznaczenie Dawki Referencyjnej dla Narażenia Ostrego 4.1 Zaleca się, aby ARfD była ustalana krok po kroku, biorąc pod uwagę typ udostępnionych przez producenta na potrzeby wyznaczenia ARfD danych toksykologicznych. Proponowane są następujące logiczne kroki: - Rozważenie profilu toksyczności i określenie, czy mogą wystąpić istotne skutki ostre. - Jeżeli skutki ostre są nieistotne, przyznanie ARfD nie jest konieczne. - Jeżeli skutki ostre są istotne, wyznaczenie ARfD najlepiej, jak to możliwe przy użyciu dostępnych danych - Jeżeli przeprowadzane są badania podprzewlekłe, przewlekłe lub inne z zastosowaniem wielokrotnie powtarzanych, w celu wyznaczenia ARfD, należy dodać komentarz, że wartość może być konserwatywna. - Jeżeli ARfD jest wyznaczana na podstawie tych samych badań co ADI, a narażenie ostre może być wyższe niż ADI, dodatkowe dane mogą umożliwić uściślenie. 4.2 Trzy podstawowe możliwości to: i. Nie przyznana, nie ma takiej konieczności ii. Wyznaczona na podstawie odpowiednich badań charakteryzujących konkretne, ostre zagrożenie iii. Wyznaczona na podstawie tych samych badań co ADI. i) Nie przyznanie ARfD 4.3 Jeżeli, na podstawie profilu toksykologicznego, jest uznane za mało prawdopodobne, że dany pestycyd może stanowić ostre zagrożenie, ARfD nie będzie wyznaczana. Powinno to być wyraźnie podane w raporcie oceny. W takich przypadkach, ostre pobranie pozostałości może przekraczać ADI przez wiele dni. Dążenie do zidentyfikowania kategorii pestycydów nie wymagających zwykle ARfD wydaje się słuszne. Jednak bazując na dotychczasowych badaniach nie można podać żadnych jasnych wytycznych w tym zakresie. 4.4 Następujące czynniki mogą mieć znaczenie dla poparcia wniosku płynącego z otrzymanych danych toksykologicznych, wg którego nie istnieją zagrożenia dotyczące ostrego pobrania jednej lub kilku dawek, i wobec tego nie jest konieczne ustalanie dawki referencyjnej dla narażenia ostrego: pestycyd wykazał bardzo niską ostrą toksyczność przy narażeniu drogą doustną (np. nie stwierdzono żadnych objawów klinicznych ani zgonów przy dawce granicznej dla testowania ostrego LD50) profil toksykologiczny był oparty jedynie na np. łagodnych skutkach, które nie mają znaczenia dla ostrego pobrania (np. przystosowawcze powiększenie wątroby, chroniczny ubytek masy ciała, zmniejszone przyjmowanie pożywienia); oraz profil toksykologiczny nie zawiera innych ostrzeżeń o ostrej toksyczności. 4.5 Na liście parametrów docelowych odnośnie Wpływu na zdrowie ludzi i zwierząt powinien zostać umieszczony następujący punkt: ARfD Nie przyznano (nie zachodzi potrzeba z powodu... [patrz wyżej].) 4.6 Następujące czynniki mogą mieć znaczenie dla poparcia wniosku płynącego z podanych danych o pozostałościach, wg którego nie istnieją obawy dotyczące ostrego pobrania jednej lub kilku dawek, i wobec tego nie jest konieczne ustalanie dawki referencyjnej dla narażenia ostrego przy obecnych zastosowaniach: odpowiednie stosowanie substancji nie może skutkować pozostałościami w żywności lub paszy (np. trutki na gryzonie); lub dostępne dane potwierdzają, że w danej kategorii zastosowań nie mogą pojawić się pozostałości w żywności lub paszy; lub nie będą wykrywalne żadne pozostałości dla wszelkich z zamierzonych zastosowań (np. herbicydy); lub profil toksyczności wskazuje, że ARfD wyznaczona na podstawie badań ostrych lub przy użyciu wielokrotnie powtarzanych byłaby znacznie wyższa od najwyższej liczby szacunkowej, która może być pobrana z normalnym jedzeniem. 4.7 Na liście parametrów docelowych odnośnie Wpływu na zdrowie ludzi i zwierząt powinien zostać umieszczony następujący punkt:

11 ARfD Nie przyznano (nie zachodzi potrzeba w związku z obecnymi zastosowaniami) (ii) Ustalenie konkretnej ARfD 4.8 Jeżeli zaobserwowano konkretne ostre skutki toksyczne, i są możliwe krótkotrwałe pobrania przekraczające ADI, może być konieczne wyznaczenie konkretnej ARfD. W takim wypadku ARfD musi być skojarzona z konkretnym skutkiem. 4.9 Jeżeli zostało ustalone, że ARfD powinna być wyznaczona, ale nie istnieją dane pozwalające na ustalenie dokładnej wartości, będzie przyznana wartość bardziej konserwatywna, na podstawie dostępnych informacji, z zaznaczeniem typu badań uznanych za konieczne do uściślenia oceny Z powodu ochrony praw zwierząt, nie powinno się wymagać przeprowadzenia nowych badań ostrych mających na celu uściślenie oceny, jeżeli zostało ustalone w oparciu o badania długo- lub krótkoterminowe, że pobranie nie przekracza ARfD. Jeżeli jednak szacunkowe pobrania krótkoterminowe wyraźnie przekraczają ARfD, mogą być konieczne i/lub przeprowadzone dodatkowe badania Konkretne badania mające na celu ustalenie dokładnej wartości ARfD będą podjęte jedynie po przeprowadzeniu innych wymaganych badań. W tej sytuacji, należy w pełni udokumentować i zrozumieć profil toksykologiczny substancji aktywnej. Dzięki temu, znane będą najbardziej wrażliwe gatunki oraz istotne toksykologiczne parametry docelowe substancji aktywnej, będzie więc możliwe przeprowadzenie konkretnych badań w celu sprawdzenia tych parametrów docelowych Wzór protokołu badań dla badań na zwierzętach mających na celu ustalenie ARfD był proponowany na JMPR w 2000r. (FAO/WHO 2000). Dla tego celu powinna powstać konkretna wytyczna OECD, oparta na tej propozycji, prezentowanej w Załączniku I Na liście parametrów docelowych odnośnie Wpływu na zdrowie ludzi i zwierząt powinien zostać umieszczony następujący punkt: ARfD x.xx mg/kg masy ciała, w oparciu o badania ABCD (iii) Zastosowanie ADI jako odpowiedniego dla ARfD 4.14 W przypadku, gdy niemożliwe jest ustalenie konkretnej ARfD na podstawie dostępnej bazy danych toksykologicznych, a wydaje się konieczne oszacowanie ostrego ryzyka żywieniowego, należy użyć ADI do ustalenia np. bardziej konserwatywnej ARfD, opartej na skutkach długoterminowych. Z powodu ochrony praw zwierząt, konkretne badania ostre mające na celu ustalenie ARfD nie będą wymagane, jeżeli szacunkowe krótkoterminowe pobrania nie przekraczają ADI Jeżeli nie występują żadne istotne/poważne różnice pomiędzy krytycznymi parametrami docelowymi zidentyfikowanymi na podstawie badań toksyczności ostrej oraz przy użyciu wielokrotnie powtarzanych, ARfD powinna być ustalona na podstawie najniższego istotnego poziomu dawki pochodzącego z badań toksyczności podprzewlekłej lub przewlekłej dla odpowiedniego parametru docelowego, na którym zwykle oparte byłoby ADI Jeżeli najniższe NOAEL pochodzące z badań ostrych, długoterminowych i krótkoterminowych pozostają na porównywalnym poziomie dawki, i gdy możliwe jest wyciągnięcie wniosku, że nie istnieją istotne różnice w skutkach krytycznych, wtedy należy z pragmatycznych powodów stosować ADI jako szacunkową ocenę ryzyka pochodzącego od ostrego pobrania. W takich przypadkach, nie jest dozwolone przekroczenie ADI, również na krótki okres czasu albo przy pojedynczym spożyciu Na liście parametrów docelowych odnośnie Wpływu na zdrowie ludzi i zwierząt powinien zostać umieszczony następujący punkt: ARfD Prawdopodobnie podobny rząd wielkości co ADI (x.xx mg/kg masy ciała)

12 Rozdział 5 PODSUMOWANIE I WNIOSKI OGÓLNE 5.1 ARfD związku chemicznego została zdefiniowana przez JMPR w roku 1998 jako szacunkowa ilość substancji w żywności lub wodzie pitnej, wyrażona na podstawie masy ciała, która może zostać spożyta w przeciągu krótkiego okresu czasu, zwykle podczas jednego posiłku lub jednego dnia, bez wystąpienia ryzyka dla konsumenta możliwego do oceny na podstawie wszelkich faktów znanych w czasie badania (FAO/WHO, 1998). 5.2 Należy rozważyć ustalenie ARfD dla wszystkich pestycydów. To jednak wymaga nie tylko oceny ryzyka toksykologicznego komletu danych, lecz także oceny ostrego pobrania w żywności, w oparciu o dane o pozostałościach i o pobraniu w żywności. Ta informacja pochodząca z oceny pozostałości jest niezwykle istotna dla prawidłowego oszacowania ARfD. 5.3 Ustalenie najbardziej istotnego parametru końcowego poprzez najbardziej odpowiednie badania przy zastosowaniu najbardziej odpowiedniego czynnika bezpieczeństwa wymaga rozpatrzenia każdego przypadku z osobna. Odpowiedni parametr końcowy dla ustalenia ARfD powinien być oparty o ocenę ekspercką, wynikającą z dokładnego zapoznania się z pakietem ADME oraz toksykologii ssaków, wraz z informacjami o prawdopodobnym mechanizmem toksyczności. W pewnych przypadkach, na podstawie mechanizmu działania może być rozpoznany potencjalnie istotny parametr docelowy. Dane in vivo pochodzące od ludzi mogą być niezwykle użyteczne jeżeli są pozyskiwane w odpowiedni i etyczny sposób (Anonim, 1998). 5.4 Standardowy komplet badań toksykologicznych nad ssakami dotyczących pestycydów może nie zawierać badań, odpowiednich dla ustalenia ARfD. W wielu przypadkach, dostępne protokoły badań nie obejmują zarówno parametrów końcowych, jak i opisu czasu badań, bezpośrednio istotnych dla ustalenia rygorystycznej ARfD (AAHL/3/98). Jednak gdzie tylko to będzie możliwe, dążyć do ustalenia najlepszej wartości szacunkowej dla ARfD na podstawie dostępnych danych; jedynie w wyjątkowych przypadkach należy żądać dodatkowych badań. 5.5 Zaleca się, aby ARfD była ustalana krok po kroku, biorąc pod uwagę typ udostępnionych przez producenta danych toksykologicznych na potrzeby wyznaczenia ARfD. Trzy podstawowe możliwości to: i. Nie przyznana, nie ma takiej konieczności ii. Wyznaczona na podstawie odpowiednich badań charakteryzujących konkretne ostre zagrożenie iii. Wyznaczona na podstawie tych samych badań, co ADI. 5.6 Jeżeli pestycyd nie stanowi ostrego zagrożenia, lub jeżeli jego zastosowania nie mogą skutkować pojawieniem się pozostałości, lub jeżeli dane nie wykazują żadnych pozostałości w żywności lub paszy, nie jest wymagane ustalanie ARfD. W takich przypadkach należy wyraźnie opisać proces wnioskowania. PIŚMIENNICTWO Anonym, 1998: Report of the International Conference on Pesticide Residues Variability and Acute Dietary Risk Assessment, York, December 1998 ACP 247/96: UK technical policy on the consumer risk assessment of pesticide residues. Advisory Committee on Pesticides, September AAHL/3/98: UK technical policy on the consumer risk assessment of pesticide residues. Advisory Committee on Pesticides, January FAO/WHO, 1994: Pesticide Residues in Food , Report of the JMPR, FAO Plant Production and Protection Paper 127, FAO Rome FAO/WHO, 1995: Pesticide Residues in Food , Report of the JMPR, FAO Plant Production and Protection Paper 127, FAO Rome FAO/WHO, 1997: Pesticide Residues in Food , Report of the JMPR, FAO Plant Production and Protection Paper 145, FAO Rome FAO/WHO, 2000: Pesticide Residues in Food , Report of the JMPR, FAO Plant Production and Protection Paper, FAO Geneva

13 IPCS (1994). Assessing Human Health Risks of Chemicals: Derivation of Guidance Values for Health-Based Exposure Limits, Environmental Health Criteria, 170, World Health Organization, Geneva. IPCS (1999). Principles for Assessment of Risk to Human Health from Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria, 210, World Health Organization, Geneva. Renwick, A.G. (1993). Data-derived safety factors for the evaluation of food additives and environmental contaminants. Food Addit. Contamin. 10, Renwick, A.G. and Lazarus, N.R. (1998). Human variability and noncancer risk assessment - an analysis of the default uncertainty factor. Regul. Toxicol. Pharmacol. 27, WHO, 1989: WHO Guidelines for Predicting Dietary Intakes of Pesticide Residues. Report prepared by the Joint UNEP/FAO/WHO Food Contamination Monitoring Programme in collaboration with the Codex Committee on Pesticide Residues. World Health Organisation, Geneva. WHO, 1997: Guidelines for Predicting Dietary Intakes of Pesticide Residues (revised). Prepared by GEMS/Food in collaboration with the Codex Committee on Pesticide Residues. World Health Organisation, Geneva.

14 Załącznik 1 PROPONOWANE WYTYCZNE TESTOWE BADANIA Z UŻYCIEM POJEDYNCZEJ DAWKI PODAWANEJ DROGĄ DOUSTNĄ (Do zastosowania tylko przy wyznaczaniu ARfD dla pozostałości pestycydów w żywności i wodzie pitnej) A. Wstęp Narażenie na pewne substancje zawarte w żywności lub wodzie pitnej może mieć miejsce w krótkim okresie czasu, np. podczas jednego posiłku lub w ciągu jednego dnia. Spożycie pozostałości pestycydów zawartych w produktach rolnych jest właśnie takim narażeniem. Czasami profil toksykologiczny substancji chemicznej wywołuje obawy co do potencjalnego ryzyka wynikającego z takiego narażenia w szczególności u niemowląt i dzieci. Jako standardową procedurę przy ocenie ryzyka pozostałości w żywności i wodzie pitnej, należy rozważyć ustalenie dawki referencyjnej dla narażenia ostrego (ARfD) 1 dla wszystkich związków chemicznych. Decyzja o przeprowadzeniu takich badań musi być jednak podjęta osobno dla każdego przypadku. Konkretne badania mające na celu ustalenie dokładnej wartości ARfD będą podjęte jedynie po przeprowadzeniu innych wymaganych badań. W tej sytuacji, należy w pełni udokumentować i zrozumieć profil toksykologiczny substancji aktywnej. Dzięki temu, znane będą najbardziej wrażliwe gatunki oraz istotne toksykologiczne parametry docelowe substancji aktywnej, będzie więc możliwe przeprowadzenie konkretnych badań w celu sprawdzenia tych parametrów docelowych. Badania takie byłyby wykonywane jedynie po ustaleniu, na podstawie istniejącej bazy danych toksykologicznych, że mogą mieć miejsce skutki ostre. Generalnie potrzebne jest elastyczne podejście do problemu, zależne od gatunku i obserwowanego, oraz/lub spodziewanego skutku dla danego związku chemicznego. Badanie byłoby zaprojektowane tak, by zawierało ocenę parametrów końcowych, które zostały zidentyfikowane jako istotne w toku badań z użyciem akceptowalnego poziomu wielokrotnie powtarzanych i innych badań kluczowych nad testowaną substancją. Taka ukierunkowana ocena zapewniłaby największą wydajność projektowania i prowadzenia badań, oraz usprawniałaby wykorzystanie zwierząt i innych zasobów w badaniach. Wyszczególniono liczne kategorie zagrożeń toksykologicznych, które uzasadniają potrzebę ustalenia ARfD (FAO/WHO 2000). Zalicza się do nich: Działanie zabójcze po podaniu drogą doustną pojedynczej, niewielkiej dawki Wpływ na rozwój organizmu, za wyjątkiem, kiedy jest on wyraźnym skutkiem zatrucia podczas życie płodowego Objawy kliniczne, inne skutki farmakologiczne, lub skutki na organach docelowych obserwowane wcześnie podczas badań przy zastosowaniu wielokrotnie powtarzanych, wliczając w to wpływ na zachowanie lub na układ trawienny, naczyniowo-sercowy lub oddechowy. Ostra neurotoksyczność, również w skutek działania związków fosforoorganicznych oraz karbaminianów. Zmiany hormonalne lub inne zmiany biochemiczne, zaobserwowane podczas badań z użyciem wielokrotnie powtarzanych, które mogą zostać wywołane pojedynczą dawką. B. Cel Niniejsze badania dostarczają danych o możliwych zagrożeniach dla zdrowia mogących powstać po pojedynczym narażeniu na substancję testową. Dane z niniejszych badań dostarczają użytecznych informacji dla 1 ARfD związku chemicznego została zdefiniowana jako szacunkowa ilość substancji w żywności lub wodzie pitnej, wyrażona na podstawie liczby miligramów na kilogram masy ciała, która może zostać spożyta w przeciągu krótkiego okresu czasu, zwykle podczas jednego posiłku lub jednego dnia, bez wystąpienia ryzyka dla konsumenta możliwego do oceny na podstawie wszelkich faktów znanych w czasie badania (WHO, 1997).

15 ustalenia ARfD, która może być stosowana do szacowania ostrych zagrożeń żywieniowych niemowląt, dzieci i innych członków populacji. Metoda testu zawiera istotne elementy baterii testowej ostrej neurotoksyczności, która obejmuje pojedyncze narażenia na substancję, oraz elementy badań toksyczności z użyciem wielokrotnie powtarzanych na gryzoniach i innych zwierzętach (tzn. 28 dniowe, 90 dniowe oraz chroniczne), które mogą być zastosowane w stosunku do chemikaliów, gdy taka informacja jest wymagana do zrozumienia konsekwencji narażeń długoterminowych. Obejmuje pojedyncze narażenia na poziomach wielokrotnie powtarzanych, które są minimalnie toksyczne lub NOAEL. Celem badań jest ustalenie najbardziej odpowiedniego NOAEL, wobec którego stosuje się czynniki bezpieczeństwa w celu ustalenia ARfD. C. Podstawowe założenia testu Testowana substancja podawana jest drogą doustną w pojedynczej dawce licznym grupom zwierząt doświadczalnych, jeden poziom dawki na grupę. Utrzymywana jest też grupa kontrolna. Zwierzęta są dokładnie badane każdego dnia na okoliczność wystąpienia objawów toksyczności, włącznie z uśmierceniem grup dodatkowych po upływie jednego z dwóch okresów czasu (24 godziny i przynajmniej 14 dni po narażeniu). Zwierzęta, które padną lub zostaną uśmiercone wcześniej, są poddawane sekcji zwłok, a na zakończenie okresu testowego każdej z podgrup uśmiercane są pozostałe zwierzęta. D. Opis metody 1. Wybór gatunku zwierząt Gryzoń: preferowanym gatunkiem gryzonia jest szczur, choć czasami może się okazać, że mysz jest bardziej wrażliwa od szczura, lub stanowi lepszy model dla człowieka. Powinny być wykorzystane powszechnie stosowane szczepy zdrowych zwierząt. Samice powinny być nieródkami i nie powinny być ciężarne. Przy badaniu nad zwierzętami dorosłymi, podawanie dawek powinno następować gdy zwierzęta są w wieku od 8 do 10 tygodni. Mogą jednak zajść okoliczności, w których wskazane jest określenie czy istnieją związane z wiekiem różnice we wrażliwości na substancję. W takich przypadkach, powinno być więcej niż jedna grup badanych zwierząt jedna grupa, u której podanie dawek miało miejsce w wieku 8 10 tygodni, oraz pozostałe(a), u których podanie dawek ma miejsce we wcześniejszym okresie życia poporodowego. W momencie rozpoczęcia badania, zróżnicowanie masy wśród wykorzystanych zwierząt powinno być minimalne i nie powinno przekroczyć 20% średniej masy u obu płci. Idealnie, zwierzęta wykorzystane do niniejszych badań powinny pochodzić z tego samego szczepu i źródła, co te zwierzęta, które były użyte do badań z zastosowaniem wielokrotnie powtarzanych dawek i innych badań kluczowych, które tworzą bazę danych toksykologicznych testowanej substancji. Jeżeli istniejąca baza danych toksyczności, wliczając w to minimalnie 90 dniowe badanie podostre z zastosowaniem wielokrotnie powtarzanych dawek, wskazuje że pies (lub mysz) jest znacznie bardziej wrażliwy od szczura, i nie istnieje inna informacja wskazująca, który gatunek jest bardziej odpowiedni dla oceny zagrożenia zdrowia u ludzi, w takich przypadkach mogą być użyte grupy psów lub myszy. Jeżeli preferowanym gatunkiem gryzonia jest mysz, należy zastosować zasady jak u szczura. Inne zwierzę: Jeżeli wybranym gatunkiem jest pies, musi być wybrana konkretna rasa; często używany jest beagle. Powinny być użyte młode, dorosłe osobniki. Dawkowanie powinno się zacząć po okresie aklimatyzacji (zalecane jest przynajmniej 5 dni), najlepiej w wieku 4 6 miesięcy, nie później jednak niż 9 miesięcy. W momencie rozpoczęcia badania, zróżnicowanie masy wśród użytych zwierząt powinno być minimalne i nie powinno przekroczyć 20% średniej masy u obu płci. Samice powinny być nieródkami i nie powinny być ciężarne. 2. Warunki przetrzymywania i karmienia Gryzonie: Temperatura w pomieszczeniu dla zwierząt doświadczalnych powinna wynosić +22 stopnie C (+/- 3 stopnie C). Chociaż względna wilgotność powietrza powinna wynosić minimum 30%, i najlepiej nie przekraczać 70% w sytuacjach innych niż sprzątanie pomieszczenia, idealna wilgotność to 50 60%. Oświetlenie powinno być sztuczne, w sekwencji 12 godzin ciemności, 12 godzin światła. Może być stosowane zwykła karma laboratoryjna, z nieograniczonym dostępem do wody pitnej. Gryzonie mogą być trzymane osobno, lub w niewielkich grupach osobników tej samej płci; w przypadku trzymania grup, w jednej klatce nie powinno być trzymanych więcej niż pięć zwierząt. Psy: Zaleca się trzymanie każdego zwierzęcia osobno. W każdym przypadku, liczba zwierząt w klatce nie może ograniczać wyraźniej obserwacji każdego zwierzęcia. Może być stosowana zwykła karma laboratoryjna, z nieograniczonym dostępem do wody pitnej.

16 3. Przygotowanie zwierząt W badaniu standardowym, zdrowe, młode dorosłe osobniki są losowo przydzielane do grup kontrolnych i testowych. Klatki powinny być tak umieszczone, aby zminimalizować możliwe skutki wynikające z ich rozmieszczenia. Każde ze zwierząt jest osobno identyfikowane. Zwierzęta są trzymane w swoich klatkach co najmniej 5 dni przed rozpoczęciem badań w celu umożliwienia im aklimatyzacji do warunków laboratoryjnych. Gdy standardowe badanie jest rozszerzane w celu oceny narażenia w okresie karmienia mlekiem matki, zwierzęta (matki i potomstwo) muszą być traktowane w sposób określony przez OECD TG 416 (wielopokoleniowe badania rozrodczości). 4. Przygotowanie dawek 1. Liczba i płeć zwierząt a. Z przyczyn technicznych, testowany związek (oraz środek kontrolny, jeżeli jest potrzebny) powinien być podawany bezpośrednio drogą doustną gryzoniom, psom w kapsułce. ARfD jest jednak stworzona w celu ochrony konsumentów żywności, dlatego też dodanie substancji testowanej do pożywienia zwierząt może być bardziej odpowiednie jako symulacja potencjalnej toksyczności ostrej u ludzi, następującej poprzez narażenie przez pozostałości w pożywieniu, od zastosowania dużej dawki bezpośredniej. Co więcej, pies zjada, dzienną porcję pożywienia w ciągu godziny. Dlatego też, w przypadkach, w których ustalona jest wielkość dziennej porcji karmy dla psów, podanie poprzez pokarm jest porównywalne z dużą dawką w podaną w kapsułce. b. Tam, gdzie jest to konieczne, testowana substancja powinna być rozpuszczona lub zawieszona w odpowiedniej substancji pomocniczej. Zaleca się, aby w miarę możliwości stosować przede wszystkim roztwory wodne, następnie roztwory/emulsje olejowe (np. na oleju kukurydzianym), a następnie możliwe roztwory w innych substancjach. Dla substancji pomocniczych innych niż woda, musi być znana ich charakterystyka toksyczności. Należy zapewnić równomierne rozmieszczenie testowanej substancji w substancji pomocniczej. E. Postępowanie Gryzoń: Powinno być użytych przynajmniej 20 osobników (10 samców i 10 samic) na każdy poziom dawki, wliczając w to grupę kontrolną. Minimum 10 osobników z każdej płci na każdą grupę poziomu dawki powinno być użytych do oceny po upływie 24 godzin. Minimum 5 samców i 5 samic z każdego poziomu dawki powinno być użytych do oceny po upływie 14 dni po zakończeniu badania. Pies: Powinno być użytych Przynajmniej 8 osobników (4 samce i 4 samice) na każdy poziom dawki, wliczając w to grupę kontrolną. Minimum 4 osobniki z każdej płci na każdą grupę poziomu dawki powinny być użyte do oceny po upływie 24 godzin. Minimum 2 samce i 2 samice z każdego poziomu dawki powinny być użyte do oceny po upływie 14 dni po zakończeniu badania. Jeżeli istniejące dane pokazują, że jedna z płci jest wyraźnie i stale bardziej wrażliwa od drugiej, projekt badania może być zmodyfikowany, aby przetestować jedynie tę płeć, z odpowiednią redukcją liczby zwierząt potrzebnych do badania. 2.Dawkowanie a. generalnie powinny być zastosowane trzy grupy testowe i jedna kontrolna. Poziomy dawek powinny być określone uwzględniając wszelkie dane o toksyczności, kinetyce i toksykokinetyce, dostępne dla badanego związku lub materiały związane. Jako minimum, powinny być dostępne dane z badań 90 dniowych podprzewlekłych, z zastosowaniem wielokrotnie powtarzanych dawek. Wyniki badań rozwojowych prenatalnych oraz badań wielopokoleniowej toksyczności rozrodczej również mogą okazać się pomocne w doborze dawki. Najwyższy poziom dawki powinien zostać określony mając na uwadze wywołanie skutków toksycznych, a nie śmierci lub poważnego cierpienia. Następnie powinna być dobrana sekwencja malejących poziomów dawek w celu wykazania reakcji na daną dawkę oraz NOAEL przy najniższym poziomie dawki. b. Oprócz faktu otrzymywania substancji kontrolnej zamiast testowej, zwierzęta w grupie kontrolnej powinny być traktowane identycznie jak te w grupach testowych. Jeżeli do podawania testowanej substancji używana jest substancja pomocnicza, grupa

17 kontrolna powinna otrzymywać substancję pomocniczą w największej stosowanej ilości. c. Kiedy istnieją dowody pochodzące z badań z wykorzystaniem wielokrotnie powtarzanych dawek, że skutek toksykodynamiczny testowanej substancji jest kumulatywny (np. nieodwracalne wstrzymanie acetylocholinesterazy), odpowiednim może być podzielenie dawki (tzn. 2 lub 3 części dawki podane w ciągu 24 godzin). 3. Podawanie dawek Nie głodzone gryzonie otrzymują testowaną substancję bezpośrednio drogą doustną lub w pokarmie. Należy tego dokonać przy użyciu pojedynczej dawki z zastosowaniem przewodu żołądkowego lub odpowiedniej kaniuli. Maksymalna objętość płynu, która może być jednorazowo podana zależy od wielkości zwierzęcia doświadczalnego. Objętość nie powinna przekraczać 1 ml/100g masy ciała, za wyjątkiem stosowania roztworów wodnych, gdzie może być zastosowane 2 ml/100g mc. Za wyjątkiem substancji drażniących lub żrących, które wykazują wzmożone skutki przy wyższym stężeniu, różnorodność objętości powinna być ograniczona przez zmiany stężenia w celu zapewnienia stałej objętości przy wszystkich poziomach dawki. Jeżeli podanie następuje przez pokarm, pojedyncza dawka powinna być zjedzona w całości w ciągu przynajmniej 4 godzin [konieczne uaktualnienie].. Nie głodzonym psom należy podać dawkę w kapsułce żelatynowej lub w dziennej porcji pokarmu, która zostanie zjedzona w całości w ciągu jednej godziny. 4. Obserwacje kliniczne a. W zależności od profilu toksykokinetycznego i toksykologicznego substancji, okres obserwacji może trwać do 14 dni. Zwierzęta należące do grupy uśmiercanej w trakcie badania mają być uśmiercone najpóźniej 24 godziny post applicationem lub po zjedzeniu całej dawki zawartej w pokarmie [konieczne uaktualnienie]. b. Obserwacji ogólnych należy dokonywać co najmniej raz dziennie, najlepiej o tych samych porach każdego dnia. Należy zarejestrować stan zdrowia zwierzęcia. Wszystkie zwierzęta muszą być obserwowane przynajmniej dwa razy dziennie, jeżeli istnieje możliwość wystąpienia skutków śmiertelnych lub zachorowań. c. Jednorazowo przed narażeniem na testowaną substancję (w celu umożliwienia porównania u poszczególnych osobników) oraz w ustalonych momentach po narażeniu, należy dokonywać szczegółowych obserwacji klinicznych u wszystkich zwierząt. Pełne badania kliniczne powinny mieć miejsce: w czasie szczytowego działania substancji oraz 0.5, 1, 2, 4 i 24 godziny po podaniu dawki. Podgrupa 14 dniowa powinna być poddawana obserwacjom klinicznym codziennie po upływie pierwszych 24 godzin. Obserwacje te powinny być wykonywane poza klatką, na standardowym wybiegu, najlepiej o tej samej porze każdego dnia. Obserwacje powinny być dokładnie rejestrowane, najlepiej przy użyciu systemu ocen wyraźnie opisanego przez laboratorium przeprowadzające badanie. Należy powziąć starania w celu zapewnienia jak najmniejszych różnic w warunkach badania, oraz prowadzenia obserwacji przez osoby nieświadome badań. Rejestrowane zmiany powinny obejmować, ale nie ograniczać się do, zmiany w sierści, skórze, oczach, śluzówkach, występowanie wydzielin oraz wydalania, oraz aktywność wegetatywną (np. łzawienie oczu, piloerekcja, wielkość źrenic, nietypowe oddychanie). Zmiany chodu, pozy, reakcji na kontakt z człowiekiem, oraz występowanie ruchów klonicznych lub tonicznych, stereotypy (np. przesadne mycie się, chodzenie w kółko) lub dziwaczne zachowania (np. samookaleczenie, chodzenie tyłem) również powinny być zarejestrowane.

18 5. Masa ciała i spożycie pokarmu/wody d. Obserwacje czynnościowe 1) Jeżeli użytym gatunkiem doświadczalnym jest szczur, powinny być ocenione reakcje sensoryczne na bodźce różnego typu (np. dźwiękowe, wzrokowe oraz proprioceptywne), siła chwytu oraz aktywność motoryczna, chyba, że istniejące dane, pochodzące z akceptowalnych badań nad testowaną substancją z zastosowaniem wielokrotnie powtarzanych dawek, zdecydowanie wykazują, że na parametry te testowana substancja nie wywiera wpływu. 2) Ocena ta powinna być przeprowadzona w szacunkowym okresie efektu szczytowego, tuż przed uśmierceniem 24 godzinnej podgrupy przeznaczonej do wcześniejszego uśmiercenia. Jeżeli efekt szczytowy trwa niemal 24 godziny, wtedy wystarczy obserwacja 24 godzinna lub efekt szczytowy. Jeżeli skutki są obserwowane dodatkowo tuż przed ostatecznym uśmierceniem podgrupy odwracalnej. 3) Elementy opisane w niniejszych Wytycznych mogą być połączone z badaniami ostrej neurotoksycznej baterii testowej, jeżeli ich wymogi nie są naruszane przez takie połączenie. Wszystkie zwierzęta powinny zostać zważone w dniu podania dawki oraz następnie każdego dnia. Pomiary spożycia pokarmu i wody pitnej powinny być wykonane każdego dnia w pierwszym tygodniu, oraz przy zakończeniu badań po 14 dniach. 6. Hematologia a. Oprócz przypadków, w których istniejące dane, pochodzące z akceptowalnych badań nad testowaną substancją z zastosowaniem wielokrotnie powtarzanych dawek, zdecydowanie wykazują, że celem nie jest układ hematopoetyczny, należy wykonać następujące badania hematologiczne tuż przed, lub jako część procedury uśmiercania zwierząt (tzn. przy wcześniejszym uśmiercaniu, oraz pod koniec okresu badania): homatokryty, stężenie hemoglobiny, liczba erytrocytów, całkowita i zmienna liczba leukocytów, liczba płytek krwi oraz pomiar potencjału/czasu krzepnięcia krwi. b. Próbki krwi powinny być pobierane z opisanego miejsca tuż przed uśmierceniem, lub jako część procedury uśmiercania zwierząt, oraz przechowywane w odpowiednich warunkach. 7. Biochemia kliniczna a. Oceny biochemii klinicznej w celu zbadania poważnych skutków toksycznych w tkankach, a konkretnie wątrobie i nerkach, należy wykonywać na podstawie próbek krwi wszystkich zwierząt tuż przed, lub jako część procedury uśmiercania zwierząt (oprócz tych z nich, które były w stanie agonii i/lub zostały uśmiercone wcześniej). Zalecane jest całonocne głodzenie zwierząt przed pobieraniem krwi. Jeżeli istniejące dane, pochodzące z akceptowalnych badań nad testowaną substancją z zastosowaniem wielokrotnie powtarzanych dawek, nie wykazują zdecydowanie, że na parametry te testowana substancja nie wywiera wpływu, należy wykonać następujące badania osocza lub surowicy: sód, potas, chlorek, glukoza, całkowity cholesterol, mocznik, kreatynina, całkowite białko i albumina, przynajmniej dwa enzymy wskazujące na skutki wątrobowe (takie jak aminotransferaza alaninowa, asparginian aminotransferazy, fosfataza alkaliczna, transpeptydaza gamma-glutamylowa, oraz dehydrogenaza sorbitolu). Pomiary dodatkowych enzymów (pochodzenia wątrobowego lub innych) oraz kwasów żółciowych mogą w pewnych okolicznościach dostarczyć wartościowych informacji. b. Badania moczu powinny być wykonane tuż przed uśmierceniem grupy przeznaczonej do wcześniejszego uśmiercenia, oraz jeżeli skutki są zauważalne - pod koniec badań, stosując pobór moczu o konkretnej porze. Jeżeli istniejące dane, pochodzące z akceptowalnych badań nad testowaną substancją z zastosowaniem wielokrotnie powtarzanych dawek, nie wykazują zdecydowanie, że na parametry te testowana substancja nie wywiera wpływu, należy zbadać następujące parametry: wygląd, objętość, osmolalność lub SG, ph, białko, glukoza, krew oraz komórki krwi. c. Dodatkowo, należy rozważyć przeprowadzenie badań nad markerami surowicy dot. ogólnych uszkodzeń tkanki. Inne badania, które powinny być wykonane, jeżeli znane właściwości testowanej substancji mogą wpływać na związane z nimi profile metaboliczne, obejmują: wapń, fosforany, triglicerydy po

19 głodówce, konkretne hormony, methemoglobina krwi, oraz cholinesteraza(y). Muszą one być rozpoznane dla chemikaliów pewnych klas lub w każdym przypadku z osobna. d. Jeżeli w wyniku innych badań, prowadzonych przy zastosowaniu specjalnych technik, zaobserwowano specyficzny skutek testowanej substancji, techniki te powinny być też użyte w niniejszych badaniach. Na przykład, wstrzymanie cholinesterazy w osoczu, krwinkach czerwonych, tkance nerwowej mózgu oraz obwodowej tkance nerwowej, powinny być zmierzone dla związków chemicznych o znanym działaniu wstrzymującym działanie tych enzymów. e. Należy określić zmienne hematologiczne i biochemii klinicznej przed rozpoczęciem dawkowania. 9. Patologia a. Dokładna sekcja zwłok 1) Wszystkie badane zwierzęta muszą być poddane pełnej, dokładnej i szczegółowej sekcji zwłok, obejmującej dokładne zbadanie zewnętrznej powierzchni ciała, wszystkich otworów, oraz jamy czaszki, jamy klatki piersiowej, jamy brzusznej oraz ich zawartości. Jeżeli istniejące dane, pochodzące z akceptowalnych badań nad testowaną substancją z zastosowaniem wielokrotnie powtarzanych dawek, nie wykazują zdecydowanie, że na tkanki te testowana substancja nie wywiera wpływu, wątroba, nerki, nadnercza, jądra, najądrza, jajniki, macica, grasica, śledziona, mózg oraz serce wszystkich zwierząt (oprócz tych z nich, które były w agonii i/lub zostały uśmiercone wcześniej) powinny być odpowiednio oczyszczone z wszelkich przywierających tkanek, i zważone jak najszybciej po usunięciu, aby uniknąć wysychania. 2) Jeżeli istniejące dane, pochodzące z akceptowalnych badań nad testowaną substancją z zastosowaniem wielokrotnie powtarzanych dawek, nie wykazują zdecydowanie, że na tkanki te testowana substancja nie wywiera wpływu, następujące tkanki należy zachować przy użyciu najbardziej odpowiedniej metody konserwacji dla danego typu tkanki, mając też na uwadze planowane badania histopatologiczne: wszystkie wykazujące poważne zmiany patologiczne, mózg (obszary reprezentatywne, takie jak mózg właściwy, móżdżek oraz most), rdzeń kręgowy, żołądek, jelita grube i cienkie (włącznie z kępkami Peyera), wątroba, nerki, nadnercza, śledziona, serce, grasica, tarczyca, tchawica oraz płuca (zachowane przez napełnienie środkiem utrwalającym i zanurzenie w płynie), jajniki, jądra, najądrza, dodatkowe organy płciowe (np. prostata, gruczoły pęcherzykowe), jajnik i macica, pęcherz moczowy, węzły chłonne (najlepiej jeden węzeł chłonny obejmujący miejsce przyjęcia dawki, oraz drugi, odległy od miejsca przyjęcia dawki, w celu objęcia skutków systemowych), nerw obwodowy (kulszowy lub goleniowy) najlepiej w niewielkiej odległości od mięśnia, oko oraz fragment szpiku kostnego (lub, ewentualnie, świeżo odessany szpik kostny). Wyniki badań klinicznych i innych mogą uzasadniać badanie innych tkanek. Należy również zachować wszelkie organy, o których wiadomo w oparciu o znane właściwości testowanej substancji, że mogą być organami docelowymi. b. Histopatologia 1) Jeżeli istniejące dane, pochodzące z akceptowalnych badań nad testowaną substancją z zastosowaniem wielokrotnie powtarzanych, nie wykazują zdecydowanie, że na tkanki te testowana substancja nie wywiera wpływu, powinny zostać przeprowadzone pełne badania histopatologiczne na zachowanych organach i tkankach zwierząt z grupy kontrolnej oraz grup którym podano wysokie dawki w ramach badania głównego, oraz grup dodatkowych, przeznaczonych do wcześniejszego uśmiercenia. Badania te powinny objąć też zwierzęta z innych grup dawkowania, jeżeli obserwowane są zmiany związane z dawkowaniem w grupie wysokich dawek. 2) Należy zbadać wszystkie poważne zmiany patologiczne. F. Dane i raportowanie 1. Należy przedstawić dane indywidualne. Dodatkowo, wszelkie dane należy podsumować w formie tabel, pokazujących, dla każdej z grup testowych, liczbę zwierząt przy rozpoczęciu testów, liczbę zwierząt które padły podczas trwania badań lub uśmierconych z przyczyn humanitarnych wraz z czasem śmierci lub uśmiercenia, liczbę wykazujących objawy toksyczności, opis zaobserwowanych objawów toksyczności wraz z czasem pojawienia się i trwania, oraz powaga

20 wszelkich skutków toksycznych, liczbę zwierząt wykazujących zmiany patologiczne, rodzaje zmian patologicznych oraz odsetek zwierząt wykazujących każdy rodzaj zmiany patologicznej. 2. Tam, gdzie to możliwe, wyniki liczbowe powinny zostać ocenione przy użyciu odpowiedniej i ogólnie przyjętej metody statystycznej. Metoda statystyczna powinna zostać wybrana w czasie planowania badań. G. Sprawozdanie z testu Sprawozdanie z testu musi zawierać następujące informacje: 1. Uzasadnienie specyficznego planu badania (np. wybór gatunku i płci, dobór dawki, wybór parametru docelowego) 2. Testowana substancja a. Właściwości fizyczne, czystość i właściwości fizykochemiczne b. Dane identyfikacyjne 3. Substancja pomocnicza (jeżeli dotyczy): uzasadnienie wyboru, jeżeli inna niż woda 4. Zwierzę doświadczalne a. Użyty gatunek/szczep b. Liczba, płeć i wiek zwierząt c. Pochodzenie, warunki przetrzymywania, dieta, itp. d. Masa każdego zwierzęcia na początku testu 5. Warunki testowania a. Dawki b. Szczegółowy opis formy testowanej substancji c. Szczegółowy opis podawania testowanej substancji d. Szczegółowy opis jakości wody i pokarmu 6. Wyniki a. Masa ciała/zmiany masy ciała b. Spożycie pokarmu c. Dane o reakcjach toksycznych wg płci oraz poziomu dawki, z objawami toksyczności włącznie d. Rodzaj, powaga oraz trwanie obserwacji klinicznych (odwracalne czy nie) e. Ocena neurologiczna (w zależności od użytego gatunku) np. aktywność sensoryczna, siła chwytu oraz aktywność motoryczna u gryzonia f. Testy hematologiczne z odpowiednimi wartościami sprzed badania g. Kliniczne testy biochemiczne z odpowiednimi wartościami sprzed badania h. Masa ciała po 24 godzinach (wszystkie zwierzęta), 7 dniach (obydwie grupy dodatkowe) oraz po 14 dniach (pozostała grupa dodatkowa) lub w chwili nieplanowanej śmierci. i. Wyniki sekcji zwłok j. Szczegółowy opis wyników badania histopatologicznego k. Zastosowanie mechanizmów statystycznych wobec wyników, jeśli dotyczy l. Analizy potwierdzające stężenie testowanej substancji w roztworze stosowanym do podawania 7. Omówienie wyników 8. Wnioski