ĆWICZENIE 1 i 2: ANALIZA PRZECIWUTLENIACZY W PRODUKTACH ŻYWNOŚCIOWYCH. Metody oznaczania przeciwutleniaczy

Transkrypt

1 część teoretyczna ĆWICZEIE 1 i 2: AALIZA PRZECIWUTLEIACZY W PRODUKTACH ŻYWOŚCIOWYCH Metody oznaczania przeciwutleniaczy Znaczne zróżnicowanie w budowie, funkcji i pochodzeniu utleniaczy i reaktywnych form tlenu, wymusiło powstanie licznych metod badawczych. ie jest bowiem możliwe analizowanie tym samym sposobem tak różnych związków jak enzymy, duże białka, niskocząsteczkowe przeciwutleniacze czy hormony. Z drugiej strony te rozmaite antyoksydanty mogą oddziaływać w odmienny sposób, w zależności od rodnika czy utleniacza, środowiska reakcji i obecności lub braku innych substancji. Przeciwutleniacz wyspecjalizowany w zmiataniu tlenu singletowego może nie działać na rodniki peroksylowe i odwrotnie. Właśnie z powodu tak licznych i różnorodnych mechanizmów, jak również zróżnicowania środowiska reakcji nie ma możliwości, by jedna metoda mogła dokładnie opisywać wszystkie źródła rodników i/lub przeciwutleniaczy. Jak dotąd nie ma jednej, pełnej klasyfikacji stosowanych technik pomiarowych. Większość badań opiera się na ocenie aktywności czy tzw. pojemności antyoksydacyjnej, będącej sumą właściwości poszczególnych związków zawartych w badanym materiale. Inne metody oceniają przeciwutleniacze ilościowo i jakościowo, nie uwzględniając ich aktywności. Wszystkie metody służące do oceny przeciwutleniaczy, zarówno ich ilości, jak i aktywności, można podzielić na: chromatograficzne: - na płaszczyznach - chromatografia bibułowa i cienkowarstwowa (TLC), - na kolumnach - chromatografia cieczowa (HPLC) i gazowa (GC), spektrofotometryczne, kolorymetryczne, elektrochemiczne: - woltamperometria cykliczna (CV), - spektroelektrochemia, elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR). Antyoksydanty mogą inaktywować wolne rodniki na dwa sposoby, przez transfer atomu wodoru (HAT) lub pojedynczego elektronu (SET). W związku z tym metody określające pojemność antyoksydacyjną można też podzielić na odpowiednie dwie grupy: 1) metody oparte o mechanizm HAT (np. ORAC, TRAP) mierzą zdolność przeciwutleniacza (AH) do wygaszania rodników poprzez oddanie wodoru:

2 część teoretyczna AH X A XH (1) Tego typu reakcje zachodzą szybko i zależą od ph, rozpuszczalnika oraz obecności innych substancji redukujących, np. metali, które mogą zawyżać wynik, 2) metody oparte o mechanizm SET (np. FRAP, CUPRAC) wykrywają zdolność antyoksydanta do przeniesienia e i zredukowania rodnika czy jonów metali: X AH X AH (2) H2 O AH A H3O (3) X H3O XH H 2O (4) Me III AH AH Me II (5) Są to reakcje zachodzące powoli, zależne od ph i obecności jonów metali. Istnieją jednak metody, których nie można jednoznacznie zakwalifikować do żadnej z powyższych grup (TEAC, DPPH, metoda Folina-Ciocalteu). iezależnie od przyjętego podziału najczęściej wykorzystywane są metody chromatograficzne i spektrofotometryczne. Szerokie zastosowanie w badaniach glikozydów flawonoidowych znalazła chromatografia, która pozwala nie tylko na stwierdzenie obecności związku w próbce, lecz także na wnioskowanie o jego ilości. Zasadnicze znaczenie dla dobrego rozdziału ma dobór odpowiedniej fazy ruchomej i adsorbenta. W skład fazy ruchomej wchodzą najczęściej następujące rozpuszczalniki: woda, kwas octowy, n-butanol, octan etylu, kwas mrówkowy, benzen, keton metyloetylowy, chloroform, aceton. Rozdzielanie substancji na cienkich warstwach wykonuje się niekiedy wielokrotnie, rozwijając chromatogram w tej samej lub różnych fazach ruchomych. W celu rozpoznania związków stosuje się wzorzec o znanej wartości czasu retencji. Po dokonaniu rozdziału na cienkiej warstwie, można zlokalizowaną substancję wyeluować odpowiednim rozpuszczalnikiem i oznaczyć ilościowo. W wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) fazą ruchomą jest ciecz, przepływająca pod wysokim ciśnieniem poprzez warstwę złoża w kolumnie. Identyfikację i oznaczanie składników umożliwiają detektory reagujące na zmiany zachodzące w składzie fazy ruchomej podczas wymywania z kolumny składników mieszanin. Dobór rozpuszczalników zależy od właściwości badanego flawonoidu i stosowanego układu detekcyjnego, niekiedy stosuje się fazę ruchomą, o składzie zmieniającym się podczas procesu chromatograficznego (elucja gradientowa). Fazy ruchome w chromatografii cieczowej, w odróżnieniu od gazowej, są ważnym elementem zmiennym, dostarczającym wielu możliwości doboru najkorzystniejszych warunków rozdziału. Chromatografia cieczowa znalazła zastosowanie w analizie jakościowej i ilościowej flawonoidów. W chromatografii gazowej (GC) fazą ruchomą jest gaz. Badania jakościowe prowadzi się na podstawie porównania czasu retencji substancji badanej i wzorcowej. Do oznaczania zawartości stosuje się najczęściej metodę wzorca wewnętrznego, która eliminuje błędy przy wprowadzaniu próbki na kolumnę. Metody spektrofotometryczne są przydatne do oznaczania czystych substancji, natomiast metodami kolorymetrycznymi można oceniać zawartość lub aktywność flawonoidów w ekstraktach po wstępnym oczyszczeniu. Do tej grupy należą m.in. metody:

3 część teoretyczna Christa-Műllera, w której zawartość flawonoidów oznacza się poprzez pomiar natężenia zabarwienia powstałego w wyniku reakcji flawonoidu z trójchlorkiem antymonu, tlenochlorkiem cyrkonu, octanem uranylowym, azotanem berylu, kwasem borowym lub chlorkiem glinowym, Folina-Ciocalteu'a, gdzie flawonoidy tworzą barwny kompleks z odczynnikiem Folina-Ciocalteu'a (mieszanina wolframianu sodowego, molibdenianu sodowego i siarczanu litu w środowisku kwasu fosforowego i solnego) dając zielono-niebieską barwę; po utlenieniu kompleks oznacza się spektrofotometrycznie przy długości fali od 750 nm do 784 nm, opierające się na reakcjach wygaszania syntetycznych wolnych rodników (ABTS, DPPH, DMPD); barwny aktywny rodnik ulega redukcji przez antyoksydanty obecne w badanej próbce, do bezbarwnych związków, co ilościowo mierzy się spektrofotometrem przy długości fali 734, 515 i 505 nm odpowiednio dla w/w rodników, FRAP, polegająca na pomiarze zdolności do redukcji jonu żelazowego 2,4,6- tripirydylo-s-triazyny (TPTZ); związek żelaza (III) w reakcji z antyoksydantem daje barwny produktu, który oznacza się przy długości fali 593 nm, TRAP, w której przeciwutleniacz redukuje rodnik ABAP, CUPRAC, w której jony miedzi (II) ulegają pod wpływem antyoksydantów redukcji do jonów miedzi (I); analizę spektrofotometryczną wykonuje się przy długości fali 450 nm, ORAC, oceniająca zdolność antyutleniacza do opóźniania fluorescencji R-fikoerytryny, indukowanej przez AAPH, długość fali wzbudzającej to 540 nm, a emisji 570 nm. Do oceny aktywności przeciwutleniającej służą także metody elektrochemiczne. Wykorzystują one prąd jaki powstaje w czasie elektrochemicznej reakcji tlenu na elektrodzie. Przeciwutleniacze, reagując z tlenem i jego pochodnymi, zmniejszają natężenie tego prądu. Istnieje kilka wariantów elektrochemicznego pomiaru aktywności antyoksydacyjnej. ajważniejsze z nich, cykliczna woltametria (CV) i różnicowa woltametria pulsowa (DPV), pozwalają na pomiar siły działania przeciwutleniaczy zawartych w badanych próbkach za pomocą specjalnej szklanej elektrody węglowej. Zróżnicowanie ph pozwala na selektywną ocenę samych flawonoidów (ph=7,5) lub flawonoidów i kwasów fenolowych (ph=2,0). Zaletą tych metod jest to, że nie wymagają żadnych dodatkowych odczynników. Szklana elektroda węglowa jest najlepszą do tych celów, gdyż antyoksydanty fenolowe utleniają się na niej przy podobnych potencjałach jak na elektrodach metalicznych, jednak bez zakłóceń interferencyjnych związanych z utlenianiem etanolu. Do technik oceniających zawartość związków przeciwutleniających należy zaliczyć również wszystkie oznaczenia poszczególnych antyoksydantów, a więc metody analizy witaminy C, tokoferoli, antocyjanin itd. Wyżej wymienione metody służą do analizy ilościowej lub jakościowej przeciwutleniaczy oraz oceny ich aktywności. Odmienne podejście do problemu reprezentuje następna technika. Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) pozwala na wykrycie związków posiadających niesparowane elektrony (paramagnetyków), czyli będących wolnymi rodnikami. Badanie polega na wprowadzeniu próbki w

4 część teoretyczna zmienne pole magnetyczne, po czym niesparowane elektrony orientują się równolegle lub antyrównolegle względem kierunku pola (rozszczepienie poziomów energetycznych to tzw. efekt Zeemana) i następuje absorpcja doprowadzonego promieniowania o częstości pasującej do różnicy energii tych orientacji. Warunki pomiaru można zmienić poprzez zmianę indukcji pola magnetycznego, natomiast jego częstotliwość pozostaje stała. Badania przeprowadza się zazwyczaj w temp. ciekłego azotu 77 o K, gdyż przedłuża to czas życia wolnych rodników. Pochłonięcie energii może zostać zmienione, odpowiednio przekształcone przez układ odbiorczy spektrometru elektronowego rezonansu paramagnetycznego i wyświetlone na ekranie, bądź zapisane przez układ rejestrujący. Otrzymywane widma są porównywane ze wzorcem zewnętrznym, którym najczęściej jest DPPH i analizowane przez programy komputerowe. Metoda EPR posiada szereg zalet wobec innych spektroskopii promieniowania elektromagnetycznego: jest to metoda specyficzna dla wolnych rodników, inne substancje nie mają żadnego udziału w rejestrowanym sygnale, energia stosowanych do napromieniania próbki mikrofal jest niewielka, zatem i możliwość powstania uszkodzeń analizowanej próbki przez sam pomiar jest znikoma, objętość badanej próbki to zaledwie około 200µl, możliwe są pomiary próbek nieprzezroczystych, sygnał wolnych rodników w tle jest znikomy, pozwala to w sposób niezaburzony obserwować upatrzone substancje wolnorodnikowe. Poważnym utrudnieniem obserwacji bezpośredniej wolnych rodników może być ich bardzo krótki czas życia. Aby ominąć ten problem stosowane są tzw. pułapki spinowe (T). Są to związki diamagnetyczne, które dzięki obecności wiązań typu O, z łatwością wchodzą w reakcję z nietrwałym rodnikiem tworząc trwałe addukty spinowe: R T R T (6) Czynniki wpływające na zafałszowania wyników Jak dotąd nie ma jednej uniwersalnej i idealnej metody oznaczania aktywności przeciwutleniającej. Pomimo tego, że większość z nich jest prosta, interpretacja wyników bywa skomplikowana, np. kiedy analizowane próbki mają pokrywające się widma. DPPH ma stosunkowo mały zasięg liniowy, ponadto istnieje wiele antyoksydantów reagujących szybko z rodnikami propylowymi, ale wolno bądź wcale z DPPH. Przy jego użyciu można oznaczyć tylko związki hydrofobowe w przeciwieństwie do metody z zastosowaniem rodnika ABTS, która oznacza zarówno hydrofobowe, jak i hydrofilowe. W metodzie Folina-Ciocalteu'a czynnikiem, który najbardziej wpływa na zafałszowania jest mieszanie się substancji, szczególnie cukrów, aromatycznych amin, dwutlenku siarki, kwasu askorbinowego i kwasów organicznych. Dlatego

5 część teoretyczna należy wprowadzać korekty. Dodatkowo niefenolowe substancje organiczne (adenina, adenozyna, alanina, anilina, kwas aminobenzoesowy, kwas askorbinowy, benzaldehyd, kreatynina, cysteina, cytozyna, dimetyloalanina, EDTA, fruktoza, guanina, glicyna, histamina, histydyna, uracyl, kwas olejowy, tryptofan, białka, sacharoza), jak i nieorganiczne (hydrazyna, siarczan amonu, siarczan manganu, fosforan sodu) reagujące z odczynnikiem Folina dają w efekcie zawyżony wynik końcowy aktywności przeciwutleniającej. iektóre metody opierają się na założeniu, że reakcje redoks przebiegają tak szybko, że wszystkie kompletne reakcje zachodzą w przeciągu 4 do 6 minut. W rzeczywistości to nie zawsze jest prawda. Szybko reagujące fenole, które wiążą żelazo i rozbijają niższe związki najlepiej analizować w krótkim czasie (ok. 4 min). Jednakże, niektóre polifenole reagują nieco wolniej i potrzebują dłuższego czasu reakcji dla wykrycia (ok. 30 min). Źle dobrany czas reakcji również powoduje, że wyniki są obarczone błędem. ie wszystkimi metodami można oznaczyć te same przeciwutleniacze. Metoda FRAP nie mierzy np. glutationu. Wykrywa się go za pomocą oznaczenia TRAP, opierającego się na fazie opóźnienia, zakładając, że wszystkie przeciwutleniacze ją wykazują i że jej długość jest proporcjonalna do aktywności przeciwutleniającej. Jednakże, nie wszystkie antyoksydanty posiadają oczywistą fazę opóźnienia. Ponadto wartość otrzymana na podstawie samej fazy obniża rzeczywisty wynik. Skróty: ORAC - Oxygen radical absorption capacity TRAP - Total reactive antioxidant potential FRAP - Ferric reducing ability of plasma albo Ferric reducing antioxidant power CUPRAC - Cupric reducing antioxidant capacity TEAC - Trolox equivalent antioxidant capacity VCEAC - Vitamin C equivalent antioxidant capacity AAPH - 2,2'-azo-bis-2-amidinopropane dihydrochloride ABAP - 2,2'-azo-bis-2-amidinopropane ABTS+ - 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) DMPD,-dimethyl-p-phenylenediamine DPPH - 2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl

6 ĆWICZEIE 1 i 2: AALIZA PRZECIWUTLEIACZY W PRODUKTACH Cel ćwiczenia ŻYWOŚCIOWYCH 1. Ocena aktywności antyoksydacyjnej wybranych produktów metodą ABTS i DPPH 2. Oznaczanie ogólnej zawartości polifenoli metodą kolorymetryczną z odczynnikiem Folin-Ciocalteu Przygotowanie ekstraktów z owoców 1. Porcję zliofilizowanych owoców przełożyć szczypczykami do zbiornika młynka laboratoryjnego (do około połowy objętości pojemnika) i zmielić (2 x 12 sekund) 2. Do suchej i czystej kolby stożkowej (50 ml) ze szlifem odważyć po dokładnie 0,500 g rozdrobnionego liofilizatu i natychmiast zalać 25 ml metanolu 3. Do kolby włożyć mieszadełko, zatkać korkiem i pozostawić na 2h na mieszadle magnetycznym (500 rpm) 4. Przesączyć całość przez sączek do czystej probówki wirowniczej, dopełnić do 25 ml (po doprowadzeniu do temp. pokojowej) i zwirować (3000 obr/min, 10 minut, 20ºC) 5. adsącz zebrać do czystej, zakręcanej probówki na 15 ml 6. Do czasu analizy przechowywać w zamrażarce Analiza ABTS Roztwór podstawowy ABTS* (7 mm ABTS, 2.45 mm K 2 S 2 O 8 ) 1. Przygotowanie 4,9 mm roztworu nadsiarczanu potasu K 2 S 2 O 8 : odważyć 0,132 g (dokładnie!) K 2 S 2 O 8 przenieść ilościowo do kolbki miarowej na 100 ml dopełnić do kreski wodą redestylowaną dokładnie wymieszać, aż do całkowitego rozpuszczenia (30 minut na mieszadle magnetycznym) roztwór jest stabilny 1 dzień

7 2. Przygotowanie PBS, ph 7,4: Do czystej butelki 500 ml wsypać 2 tabletki PBS Dopełnić do około 400 ml wodą redestylowaną, Co jakiś czas mieszać, aż do całkowitego rozpuszczenia (około 2-3 godzin) 3. Przygotowanie ABTS* do zakręcanej probówki na 15 ml odmierzyć pipetą automatyczną 1,3 ml 4,9 mm roztworu K 2 S 2 O 8 dodać 1 tabletkę ABTS (2,2 -azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) nie dotykać palcami!!! dodać 1,3 ml wody podwójnie destylowanej zakręcić probówkę, dokładnie wymieszać owinąć szczelnie folią aluminiową odstawić na 16 h w temperaturze pokojowej, w ciemnym miejscu Roztwór podstawowy ma mieć kolor ciemnozielony. Przechowywać w lodówce, nie zamrażać! Roztwór roboczy ABTS (ABTS 0.7 ) Rozcieńczyć za pomocą PBS roztwór ABTS* tak, by jego absorbancja przy 734 nm wynosiła A = 0,7 ± 0,02 (najlepiej gdy A jest bliższe 0,72). Przygotować taką ilość roztworu ABTS 0,7 by wystarczyła do analizy wszystkich próbek i wykonania krzywej standardowej (licząc po 1 ml na każdy punkt pomiarowy). Gotowy roztwór przechowywać w butelce z ciemnego szkła ze szlifem. Metoda ta pozwala na ilościową ocenę zmiatania wolnych rodników na podstawie zdolności składnika do wygaszania stabilnego rodnika ABTS. Kwas 2,2 -azyno-bis (3-etylenobenzotiazolinowy) (rys. 1.) jest syntetycznym kationorodnikiem, rozpuszczalnym w wodnych i organicznych roztworach, pozwalającym na pomiar przeciwutleniaczy zarówno hydrofilowych, jak i hydrofobowych. Jest on wrażliwy na światło i musi być przetrzymywany w ciemności. W przeciwieństwie do DPPH rodnik ten nie jest dostępny w formie aktywnej. W handlu występuje pod postacią nieaktywnej soli dwuamonowej i generuje się go albo poprzez reakcję chemiczną (np. z dwutlenkiem manganu, nadsiarczanem potasu, ABAP) lub enzymatyczną (z peroksydazą, mioglobiną, hemoglobiną).

8 Et S SO 3 H S HO 3 S Et Rys. 1. Budowa chemiczna rodnika ABTS Krzywa standardowa Troloxu dla ABTS 1. W probówkach typu Eppendorf przygotować rozcieńczenia 1 mm roztworu Troloxu w PBS zgodnie z poniższą tabelą Lp Stężenie końcowe standardu [mg/100 ml] Objętość PBS [μl] , , , Objętość 1mM Troloxu [μl] 2. Do 7 kuwet odmierzyć po 1 ml ABTS Ustawić spektrofotometr: Single Component Analysis; liczba standardów 6, wpisać kolejno stężenia standardów (wg tabeli powyżej); długość fali 734 nm; zero, non-intercept; czas pomiaru 0,2 sek; liczba powtórzeń: 3 4. Ustawić blank w aparacie: PBS 5. Dodać do pierwszej kuwety 100 l roztworu Troloxu z probówki nr 1 i równocześnie włączyć stoper, dokładnie wymieszać (przepipetować) zawartość kuwety (uważać, żeby nie powstały żadne pęcherzyki powietrza!) 6. Po 30 sekundach dodać do kolejnej kuwety 100 l roztworu z probówki nr 2 itd. 7. W chwili, kiedy stoper pokaże dokładnie 6 minut odczytać absorbancję pierwszej kuwety (należy 3-krotnie kliknąć w pole standardu żeby spektrofotometr przeczytał absorbancję 3 razy i wyciągnął średnią) 8. Po 30 sekundach (na stoperze 6:30) odczytać w analogiczny sposób absorbancję roztworu w następnej kuwecie itd. 9. Po odczytaniu A wszystkich roztworów Troloxu wykreślić krzywą wzorcową.

9 Pomiar próbek metodą ABTS 1. W probówkach typu Eppendorf przygotować kolejne rozcieńczenia (dwu-, pięcio-, dziesięcio-, pięćdziesięcio- i stukrotne) ekstraktów owocowych w PBS. 2. Do kuwet odmierzyć po 1 ml ABTS Ustawić blank w aparacie: PBS 4. Dodać do pierwszej kuwety 100 l pierwszego badanego ekstraktu i równocześnie włączyć stoper, dokładnie wymieszać (przepipetować) zawartość kuwety (uważać, żeby nie powstały żadne pęcherzyki powietrza), 5. Zmierzyć absorbancję próbek (w 6. minucie), na podstawie krzywej wyliczyć aktywność przeciwutleniającą badanych ekstraktów (w mg Troloxu/ 100 ml ekstraktu). Wyciągnąć wnioski i zamieścić je w sprawozdaniu. Analiza DPPH Przygotowanie roztworu 1. Odważyć 0,012g DPPH w naczyńku wagowym, przenieść ilościowo do kolby miarowej na 100 ml uwaga: DPPH słabo się rozpuszcza, kryształki mogą zatykać końcówkę pipety i powodować jej zalanie! 2. Dopełnić do kreski czystym etanolem (do 100 ml) 3. Odstawić na mieszadło magnetyczne na co najmniej 1 godzinę 4. Po całkowitym rozpuszczeniu DPPH przenieść roztwór do butelki z ciemnego szkła. Roztwór ma kolor ciemno fioletowy! W oznaczeniu metodą DPPH przeciwutleniacze obecne w badanej próbce redukują stabilny rodnik azotowy 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl (DPPH) powodując spadek absorbancji mierzonej przy długości fali 517 nm (rys.2.). Roztwór aktywnego rodnika ma barwę purpurową, a jego odbarwienie świadczy o tym, że niesparowany dotąd elektron został sparowany.

10 . + RH H + R. O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 Rys. 2. Reakcja redukcji rodnika DPPH przez antyutleniacz Krzywa standardowa Troloxu dla DPPH 1. W probówkach typu Eppendorf przygotować rozcieńczenia 1 mm roztworu Troloxu w etanolu zgodnie z poniższą tabelą: Lp Stężenie końcowe standardu [mg/100ml] Objętość EtOH [ l] , , , , , Objętość 1 mm Troloxu [ l] 2. Do 6 kuwet odmierzyć po 0,6 ml EtOH 3. Do każdej z kuwet dodać po 0,2 ml przygotowanego roztworu DPPH nie dotykając końcówką do etanolu, po nałożeniu do wszystkich kuwet przepipetować tą końcówką zawartość wszystkich kuwet 4. Ustawić spektrofotometr: Single Component Analysis; liczba standardów 6, wpisać kolejno stężenia standardów (wg tabeli powyżej); długość fali 517 nm; zero, non-intercept; czas pomiaru 0,2 sek; liczba powtórzeń: 3 5. Ustawić w aparacie blank: EtOH

11 6. Dodać do pierwszej kuwety 200 l roztworu Troloxu z probówki nr 1 i równocześnie włączyć stoper, dokładnie wymieszać (przepipetować) zawartość kuwety (uważać, żeby nie powstały żadne pęcherzyki powietrza) 7. Po 30 sekundach dodać do kolejnej kuwety 200 l roztworu z probówki nr 2 itd. 8. W chwili, kiedy stoper pokaże dokładnie 10 minut odczytać absorbancję roztworu z pierwszej kuwety (należy 3-krotnie kliknąć w pole standardu żeby spektrofotometr zmierzył absorbancję 3 razy i wyciągnął średnią) 9. Po 30 sekundach (na stoperze 10:30) odczytać w analogiczny sposób A roztworu w następnej kuwecie itd. 10. Po odczytaniu A wszystkich roztworów Troloxu wykreślić krzywą wzorcową. Pomiar próbek metodą DPPH 1. W probówkach typu Eppendorf przygotować kolejne rozcieńczenia (dwu-, pięcio-, dziesięcio-, pięćdziesięcio- i stukrotne) badanych ekstraktów w wodzie redestylowanej. 2. Przygotować mieszaninę 0,6 ml EtOH i 0,2 ml DPPH w kuwecie, dokładnie przepipetować, żeby kolor był jednolity UWAGA: Dla ułatwienia i przyspieszenia pracy można przygotować sobie rozcieńczenie DPPH. W tym celu: odmierzyć w suchej, czystej kolbie miarowej dokładnie 25 ml roztworu DPPH, przelać ilościowo do kolby miarowej na 100 ml (wypłukiwać kolbę etanolem, aż etanol będzie całkiem bezbarwny), dopełnić kolbę do kreski etanolem (czyli do 100 ml). Wymieszać, aż kolor roztworu będzie jednolity. Przelać zawartość do 2 butelek z ciemnego szkła na 50 ml. Tak rozcieńczony roztwór dodajemy do kuwet w ilości 0,8 ml! 3. Odczytać blank: EtOH 4. Dodać do pierwszej kuwety 0,2 ml rozcieńczonego pierwszego badanego ekstraktu (ekstrakt nr 1) i równocześnie włączyć stoper, dokładnie wymieszać (przepipetować) zawartość kuwety (uważać, żeby nie powstały pęcherzyki powietrza!). Po 30 sekundach do drugiej kuwety dodać 0,2 ml kolejnego rozcieńczenia ekstraktu nr 1, po kolejnych 30 sekundach, do następnej kuwety, dodać 0,2 ml następnego rozcieńczenia itd. 5. Pomiar absorbancji roztworu w kuwecie wykonać dokładnie w 10 minut od dodania ekstraktu do kuwety, na podstawie krzywej wyliczyć aktywność przeciwutleniającą badanych ekstraktów (w mg Troloxu/ 100 ml ekstraktu). 6. Wyciągnąć wnioski i zamieścić je w sprawozdaniu.

12 Oznaczenie zawartości polifenoli ogółem Wykonanie krzywej wzorcowej 1. Z roztworu standardowego (+)katechiny o stężeniu 50 mg/100 cm 3 (w metanolu) przygotować rozcieńczenia do krzywej wzorcowej. 2. W tym celu do kolby miarowej na 25 cm 3 dodać: 0,5; 1,25; 2,5; 3,75; 5 cm 3 standardowego roztworu katechiny i dopełnić metanolem do kreski. 3. astępnie z każdej kolby pobrać 2,5 cm 3 do kolb miarowych na 25 cm 3 i dopełnić wodą redestylowaną. 4. Z tak przygotowanych roztworów do kolb stożkowych przenieść po 5 cm 3 roztworu, dodać 0,25 cm 3 odczynnika Folina-Ciocalteau (rozcieńczonego wcześniej wodą redestylowaną w stosunku 1:1 v/v) oraz 0,5 cm 3 7% roztworu a 2 CO 3. Zamieszać i pozostawić w ciemności na 30 min. 5. Po tym czasie zmierzyć absorbancję w spektrofotometrze przy długości fali λ = 760 nm (blank = metanol). Wykreślić krzywą wzorcową. Badanie właściwe 1. Przygotować rozcieńczenia ekstraktu wyjściowego: 2-, 5- i 10-krotne z użyciem metanolu. astępnie pobrać 2,5 cm 3 przenieść do kolb miarowych o pojemności 25 cm 3 i dopełnić wodą. 2. Z tak przygotowanych roztworów pobrać 5 cm 3, dodać 0,25 cm 3 odczynnika Folina Ciocalteau (1:1) oraz 0,5 cm 3 7% a 2 CO 3. Wymieszać i pozostawić na 30 min. w ciemności. 3. Zmierzyć absorbancję w spektrofotometrze przy długości fali λ = 760 nm (blank = metanol). 4. Z krzywej wzorcowej odczytać zawartość polifenoli ogółem wyrażoną w mg katechiny/100 ml ekstraktu. 5. Wyciągnąć wnioski i zamieścić je wraz z wynikami w sprawozdaniu.

13 piśmiennictwo Piśmiennictwo 1. Apak R., Güclü K.G., Özyürek M., Karademir S.E.: ovel total antioxidant capacity index for dietary polyphenols and vitamins C and E, using their cupric iron reducing capability in the presence of neocuproine: CUPRAC method, J. Argic. Food Chem. 2004, 52, Arnao M.B.: Some methodological problems in the determination of antioxidant activity using chromogen radicals: a practical case, Trends Food Sci. Technol. 2000, 11, Arts M.J.T.J., Haenen G.R.M.M., Voss H.P., Bast A.: Antioxidant capacity of reaction products limits the applicability of the Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) assay, Food Chem. Toxicol. 2004, 42, Bartosz G.: Druga twarz tlenu. Warszawa. Wydawnictwo naukowe PW, Korotkova E.I., Karbainov A.Y., Shevchuk A.V.: Study of antioxidant properties by voltammetry, J. Electroanal. Chem. 2002, 518, Miller.J., Rice-Evans C.A., Davies M.J., Gopinathan V., Milner A.: A novel method for measuring the antioxidant capacity, 1993, 84, Miller.J., Rice-Evans C.A.: Factors influencing the antioxidant activity determined by the ABTS + radical cation assay, Free Radical Res. 1997, 26, Prior R. L., Wu X., Schaich K.: Standarized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, Re R., Pellegrini., Porteggente A., Pannala A., Yang M., Rice-Evans C.: Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic. Res., 1999, 26 (9/10), Sanchez-Moreno C.: Review: Methods used to evaluate the free radical scavenging activity in foods and biological systems, Food Sci. Tech. Int. 2002, 8 (3), Schlesier K., Harwat M., Böhm V., Bitsch R.: Assessment of antioxidant activity by using different in vitro methods. Free Radic. Res., 2002, 36 (20), Swain T., Hillis W.E.: The phenolic constituents of Prunus domestica. I. The quantitative analysis of phenolic constituents; J. Sci. Food. Agric. 1959, 10;