OZNACZANIE TOKSYN SINICOWYCH W WODZIE METODĄ SPE-HPLC

Transkrypt

1 OZNACZANIE TOKSYN SINICOWYCH W WODZIE METODĄ SPE-HPLC Toksyny sinicowe (cyjanotoksyny) są zróżnicowaną pod względem chemicznym, jak i toksykologicznym grupą toksyn naturalnych. Pomimo tego, że występują w środowisku wodnym okazuje się, że są bardziej niebezpieczne dla ssaków lądowych niż dla flory i fauny wodnej. Dotychczasowa wiedza na temat działania toksyn produkowanych przez sinice pochodzi głownie z testów na zwierzętach laboratoryjnych oraz izolowanych liniach komórek ssaków. Związki te można podzielić ze względu na charakter toksycznego oddziaływania na dwie klasy: biotoksyny (hepatotoksyny, neurotoksyny) i cytotoksyny (m.in. dermatotoksyny) oraz toksyny o nierozpoznanej do końca toksyczności oraz charakterze oddziaływania na organizm ludzi i zwierząt. Hepatotoksyny należą do najniebezpieczniejszych trucizn w przyrodzie. Konsekwencją ostrego zatrucia tymi substancjami jest szybko postępująca degradacja wątroby, powodująca masowe krwotoki wewnątrzwątrobowe, co w konsekwencji prowadzi do śmierci całego organizmu. Intoksykowane zwierzęta umierają w charakterystycznym letargu, poprzedzonym silnym przekrwieniem wątroby oraz jej silnym obrzękiem a także szokiem krwotocznym. Organotropizm i specyficzność komórkowa tej grupy toksyn wiąże się z selektywnym systemem transportu kwasów żółciowych, występujących tylko w hepatocytach. Długotrwałe spożywanie wody oraz pożywienia skażonego tego typu toksynami może dawać takie objawy kliniczne jak wysypka, gorączka, wymioty i biegunka oraz ostra dysfunkcja wątroby spowodowana jej przewlekłym uszkodzeniem. Istnieją także dowody na genotoksyczność tego typu toksyn, a zatem mogą być one silnymi promotorami raka wątroby, przy długotrwałej ekspozycji na tego typu toksyny, nawet przy niewielkich ich stężeniach w wodzie pitnej i pokarmie. Ta ich aktywność łączona jest z powszechnym występowaniem nowotworów wątroby u mieszkańców niektórych prowincji w Chinach, gdzie woda używana do celów pitnych pobierana jest ze zbiorników powierzchniowych zanieczyszczonych metabolitami cyjanobakterii. Toksyny tej grupy są cyklicznymi oligopeptydami o ciężarze cząsteczkowym w granicach Da i toksyczności ostrej w granicach µg na kilogram masy ciała (LD 50 ). Są one syntezowane za pośrednictwem specyficznych syntetaz peptydowych, których budowa i obecność grup funkcyjnych determinują skład i sekwencję aminokwasów w toksynach, a co za tym idzie ich aktywność biologiczną. 1

2 Charakterystycznym elementem budowy tych związków, odpowiedzialnym za ich toksyczne działanie jest kwas (2S,3S,8S,9S,4E,6E)-3-amino-9-metoksy-2,6,8- trimetylo-10-fenylodeka-4,6-dienowy, w skrócie nazywany Adda. Pierwszym wyizolowanym związkiem z tej grupy była mikrocystyna-lr, której strukturę określił w 1988 r. Rinehart. Rys. 1. Mikrocystyna-LR Ekstrakcja do fazy stałej (SPE - z ang. solid phase extraction) jest metodą stosowaną do szybkiego i wygodnego przygotowania próbki: oddzielenia badanego składnika, zatężenia lub oczyszczenia próbki, która ma być dalej analizowana, np. metodą HPLC lub GC. Jest ona prowadzona na specjalnych kolumnach szklanych lub polipropylenowych, których budowę przedstawia Rys. 2. wlot kolumny obudowa kolumny zbiornik na próbkę filtry polietylenowe sorbent Rys. 2. Budowa kolumny do SPE wypływ eluentu 2

3 Przez ostatnie lata ekstrakcja do fazy stałej zyskała wielu sympatyków wśród chemików-analityków i obecnie szybko wypiera tradycyjny sposób ekstrakcji cieczciecz stosowany dotychczas do wstępnego przygotowywania próbek w chromatografii, ponieważ zużywa mniej rozpuszczalników i jest mniej czasochłonna. SPE znajduje tysiące zastosowań do ekstrakcji analizowanych składników w laboratoriach farmakologicznych, klinicznych i biomedycznych, toksykologicznych oraz analizy środowiskowej. Technika właściwego przygotowania próbki ma na celu ułatwienie analizy poprzez zagęszczenie badanego składnika i usunięcie zanieczyszczeń, które mogą przeszkadzać w analizie. Metoda ekstrakcji do fazy stałej spełnia te wymagania, ponieważ: eliminuje zanieczyszczenia z próbki i zabezpiecza przyrządy przed zanieczyszczeniem ich cząstkami stałymi zatęża analizowany składnik i przez to zwiększa czułość metody uł atwia szybkie i skuteczne, jednoczesne przygotowywanie różnych próbek (ręcznie lub automatycznie) umożliwia zmianę rozpuszczalnika lub buforu przed analizą daje wysoką wydajność rozdzielenia - po ekstrakcji uzyskuje się ilościowo badany składnik o bardzo niskim stopniu zanieczyszczenia daje stałe, powtarzalne wyniki (przy odpowiednim doborze warunków ekstrakcji i zachowaniu tych samych właściwości sorbentu) Przygotowanie próbki za pomocą SPE na ogół składa się z czterech podstawowych etapów (Rys.3). Rys. 3. Etapy postępowania przy ekstrakcji do fazy stałej

4 Celem ćwiczenia jest chromatograficzne oznaczenie zawartości mikrocystyny- LR w badanej próbie wody oraz zapoznanie się z techniką wzbogacania prób metodą ekstrakcji do fazy stałej. Odczynniki metanol, acetonitryl, octan amonu, woda o czystości do HPLC. Aparatura i sprzęt laboratoryjny chromatograf HP 1050 z detektorem UV-Vis 1 szt. kolumna chromatograficzna ze złożem C18 1 szt. zestaw do ekstrakcji SPE z kolumnami i dyskami ekstrakcyjnymi do SPE 1 szt. Wykonanie ćwiczenia 1. Przygotowanie próbek do analizy metodą SPE Kolumienki lub dyski ekstrakcyjne z wypełnieniem C18 kondycjonować wstępnie zgodnie z procedurą podaną przez prowadzącego zajęcia. Określone objętości prób zawierających mikrocystynę-lr przepuszczać przez złoże ekstrakcyjne z prędkością 2-3 cm 3 /min., stosując układ SPE-12G firmy J.T. Baker. Złoże przemyć 10 cm 3 wody destylowanej, a następnie roztworami podanymi przez prowadzącego zajęcia. Zaadsorbowaną mikrocystynę-lr wymyć ze złoża za pomocą 10 cm 3 roztworu wymywającego. Zebraną frakcję odparować do sucha. Następnie próbę rozpuścić w buforze do analizy HPLC, przefiltrować przez filtr typu Millex i przenieść do wialki. 2. Oznaczanie mikrocystyny-lr metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej Wzbogacone i oczyszczone próby oznaczyć metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconych fazach (RP-HPLC). Rozdział prowadzić z użyciem mieszaniny acetonitrylu i roztworu octanu amonu w stosunku objętościowym 26:74 przy szybkości przepływu 1,0 cm 3 /min. Detekcję mikrocystyny-lr przeprowadzić przy długości fali 240 nm. 4

5 Opracowanie wyników Z otrzymanych danych chromatograficznych i wykresu zależności pola piku od stężenia mikrocystyny-lr (Rys. 4) odczytać zawartość toksyny w badanych próbach. Wyniki podać w µg/dm 3 wody P pow = 1,234. C - 0,347 r 2 = 0,9998; r = 0,9999 P pow śr C [mg/cm 3 ] Rys. 4. Wykres zależności pola piku od stężenia mikrocystyny-lr Zielone przerywane linie wskazują przedział ufności krzywej dla poziomu prawdopodobieństwa 95 % 5