MAKROLIDY POLIENOWE. mgr inż. Paweł Szczeblewski Katedra Technologii Leków i Biochemii. Gdańsk, 2015 r.

Transkrypt

1

2 MAKROLIDY POLIENOWE mgr inż. Paweł Szczeblewski Katedra Technologii Leków i Biochemii Gdańsk, 2015 r.

3 UKŁADOWE INFEKCJE GRZYBOWE. POWAŻNE WYZWANIE DLA WSPÓŁCZESNEJ CHEMOTERAPII.

4 TROCHĘ STATYSTYKI Ok. 8% dodatnich posiewów krwi spowodowane jest przez grzyby z rodzaju Candida. Najwyższa, 40% umieralność. Kandidemia występuje z częstością 8/ osób; u dzieci poniżej 1 roku życia 75/ krotny wzrost w porównaniu z latami 80. Częstośd zachorowań na grzybice układowe w latach

5 TROCHĘ STATYSTYKI Ponad 90% chorych na AIDS cierpi na kandidiazę jamy ustnej i gardła. 5-50% poważnych zakażeń w grupie osób uzależnionych od dożylnego wstrzykiwania narkotyków. Analiza chorób, w przebiegu których doszło do kandidiazy.

6 DLACZEGO? Pierwotne i wtórne niedobory odporności; Choroby nowotworowe; Długotrwałe leczenie antybiotykami o szerokim spektrum działania; Immunosupresja po transplantacji organów, szpiku kostnego; Neutropenia w wyniku stosowania sterydo- i chemioterapii.

7 SKUTECZNĄ TERAPIĘ UKŁADOWYCH INFEKCJI GRZYBOWYCH UTRUDNIAJĄ DWA GŁÓWNE PROBLEMY: 1. Niska selektywność działania leków przeciwgrzybowych, uwarunkowana bliskim pokrewieństwem na poziomie molekularnym eukariotycznych komórek ssaków i patogenów grzybowych. Drzewo życia.

8 SKUTECZNĄ TERAPIĘ UKŁADOWYCH INFEKCJI GRZYBOWYCH UTRUDNIAJĄ DWA GŁÓWNE PROBLEMY: 2. Oporność szczepów grzybowych, przede wszystkim oporność wielolekowa (MDR, ang. Multidrug Resistance ). Główne mechanizmy oporności lekowej w komórkach grzybów.

9 WSPÓŁCZESNE ORĘŻE W WALCE Z GRZYBAMI: Makrolidy polienowe Fluoropirymidyny Azole Alliloaminy Morfoliny Echinokandyny

10 PRZYCZAJONY TYGRYS, UKRYTY SMOK

11 BRAK CHEMOTERAPEUTYKU PRZECIWGRZYBOWEGO O POŻĄDANYCH CECHACH SKŁANIA DO INTENSYWNYCH POSZUKIWAŃ NOWYCH, ULEPSZONYCH PREPARATÓW. Różnorodne strategie, koncentrujące się zasadniczo na: poszukiwaniu nowych celów molekularnych dla chemoterapeutyków przeciwgrzybowych i projektowaniu związków wykorzystujących te cele; opracowaniu nowych form leku; poprawie właściwości znanych związków, na drodze racjonalnych modyfikacji ich struktury.

12

13 NASUWA SIĘ WIĘC ISTOTNE PYTANIE

14 NASUWA SIĘ WIĘC ISTOTNE PYTANIE KTÓRE ZWIĄZKI SĄ NAJBARDZIEJ OBIECUJĄCE W NOWYCH ROZWIĄZANIACH DLA CHEMOTERAPII? I DLACZEGO TO WŁAŚNIE MAKROLIDY POLIENOWE?

15 DLACZEGO WŁAŚNIE MAKROLIDY POLIENOWE? Wysoka aktywność przeciwgrzybowa Szerokie spektrum działania Działanie fungicydowe (grzybobójcze), a nie fungistatyczne Brak zdolności do indukowania szczepów opornych Aktywność względem szczepów opornych, w tym szczepów z opornością wielolekową (MDR) zarówno z ekspresją białek transportowych z nadrodziny ABC jak i MFS.

16 MAKROLIDY POLIENOWE

17 MAKROLIDY Związki chemiczne, zawierające w swojej strukturze makrocykliczny lakton (cykliczny ester). Makrolidy wykazują aktywność przeciwbakteryjną lub przeciwgrzybową. WYRÓŻNIAMY: Makrolidy niepolienowe Makrolidy polienowe

18 MAKROLIDY NIEPOLIENOWE Ich laktonowy pierścień może być dwunasto-, czternasto- lub szesnastoczłonowy. Antybiotyki o działaniu przeciwbakteryjnym, bakteriostatycznym. Znakomita skuteczność w leczeniu zakażeń dróg oddechowych. Stosowane także w leczeniu nietypowych zakażeń dróg moczowo-płciowych. Obok β-laktamów jest to najszerzej stosowana grupa antybiotyków. Rys.4. Stereostruktura roksytromycyny. Rys.4. Stereostruktura erytromycyny A. Rys.4. Stereostruktura spiramycyny.

19 MAKROLIDY POLIENOWE W skład pierścienia makrolaktonowego wchodzi fragment polienowy (sprzężone wiązania podwójne). Wykazują silne działanie przeciwgrzybowe.

20 KLASYFIKACJA MAKROLIDÓW POLIENOWYCH W oparciu o podobieństwa i różnice w budowie chemicznej wyróżniamy różne kryteria klasyfikacji makrolidów polienowych: 1. Ilość sprzężonych wiązań podwójnych 2. Wielkość pierścienia makrolaktonowego 3. Obecność glikozydowo związanego cukru 4. Obecność reszty aromatycznej STRUKTURA CHEMICZNA, A EFEKT BIOLOGICZNY

21 WPŁYW STRUKTURY CHEMICZNEJ NA WŁAŚCIWOŚCI BIOLOGICZNE CZĄSTECZKI 1. Polieny o małym pierścieniu makrolaktonowym, niezawierające reszty cukrowej: Antybiotyki wywołujące nieodwracalne zmiany w przepuszczalności błony, pogłębiające się z upływem czasu i wzrostem stężenia antybiotyku. Powodują natychmiastowe, głębokie uszkodzenie błony plazmatycznej. Cechuje je brak selektywności, działają wyłącznie jako związki powierzchniowo czynne (detergenty). OH OH OH OH OH R1 R2 OH O O HO CH 3 CH 3 OH Eurocydyna. Flawofungina.

22 WPŁYW STRUKTURY CHEMICZNEJ NA WŁAŚCIWOŚCI BIOLOGICZNE CZĄSTECZKI 2. Polieny o małym pierścieniu makrolaktonowym z glikozydowo związaną resztą cukrową: Stosowane w infekcjach powierzchniowych (ang. topical infections) W mniejszym lub większym stopniu wykazują elementy selektywności, gdyż obecność cukru w cząsteczce sprawia, że działają one jako związek kanałotwórczy, jednakże w miarę wzrostu stężenia czy upływu czasu przeważa funkcja detergentu. Rimocydyna. Pimarycyna (Natamycyna).

23 WPŁYW STRUKTURY CHEMICZNEJ NA WŁAŚCIWOŚCI BIOLOGICZNE CZĄSTECZKI 3. Polieny o dużym pierścieniu makrolaktonowym, ale o fleksyjnej strukturze, z glikozydowo związaną resztą cukrową: Inaczej zwane dieno-tetraenami. Wykazują działanie podobne do mniejszych makrolidów, jednakże kanał transbłonowy tworzy się na dłużej, a tendencja do działania detergentowego jest osłabiona. Nystatyna A1. Amfoterycyna A.

24 WPŁYW STRUKTURY CHEMICZNEJ NA WŁAŚCIWOŚCI BIOLOGICZNE CZĄSTECZKI 4. Polieny o dużym pierścieniu makrolaktonowym i sztywnej strukturze, z glikozydowo związaną resztą cukrową: Najważniejsza i najbardziej interesująca grupa makrolidów polienowych Dopiero te związki stwarzają warunki do specyficznego wiązania się ze sterolami Stereostruktura Amfoterycyny B.

25 HEPTAENY CZĘŚD HYDROFOBOWA CZĘŚD HYDROFILOWA POLARNA GŁOWA Struktura chemiczna Amfoterycyny B.

26 Makrolidy polienowe wykazują powinowactwo do steroli zawartych w błonie komórkowej, z punktu widzenia chemoterapii należy więc zwrócić uwagę na ergosterol zawarty w komórce grzybowej i cholesterol występujący w komórce ludzkiej.

27 MECHANIZM DZIAŁANIA HEPTAENÓW Wyróżniamy trzy typy interakcji międzycząsteczkowych: Odziaływania hydrofobowe Van der Waalsa, sieć wiązań wodorowych z udziałem sprotonowanej reszty aminowej cukru, anionem karboksylanowym makrolidu i grupą hydoksylową sterolu w pozycji 3 β, oddziaływania π-elektronowe między chromoforem (duży potencjał elektrostatyczny), a wiązaniami podwójnymi w sterolach.

28

29 MECHANIZM DZIAŁANIA HEPTAENÓW: Proponowany model tworzenia się półkanału.

30 DYFUZJA LATERALNA PRZESTRZEŃ POZAKOMÓRKOWA CYTOPLAZMA Model błony komórkowej dwuwarstwa lipidowa.

31 FORMOWANIE SIĘ LETALNEGO KANAŁU K + PRZESTRZEŃ POZAKOMÓRKOWA CYTOPLAZMA Model błony komórkowej dwuwarstwa lipidowa.

32 SAMO WYTWORZENIE KANAŁU NIE PROWADZI DO ŚMIERCI KOMÓRKI! Kluczowy staje się proces tworzenia ATP! 1. Fosforylacja oksydatywna 2. Cykl Embdena-Meyerhofa-Parnasa

33 PORÓWNAJMY NAJLEPSZE Z NAJLEPSZYCH: Heptaeny niearomatyczne: Wysoka aktywność przeciwgrzybowa Średnia selektywna toksyczność in vitro. Współczynnik farmakologiczny MTD MCD = 3 4 (AmB). Heptaeny aromatyczne: Bardzo wysoka aktywność przeciwgrzybowa. Wysoka selektywna toksyczność in vitro. Spodziewany niski współczynnik farmakologiczny (względu na wysoką toksyczność na zwierzętach) Stereostruktura amfoterycyny B. Stereostruktura kandycydyny D.

34 PORÓWNAJMY NAJLEPSZE Z NAJLEPSZYCH DANE IN VITRO: DANE IN VIVO: Aktywność przeciwgrzybowa Aktywność hemolityczna Wskaźnik selektywności in vitro Toksyczność ostra Antybiotyk S.cerevisiae ATCC 9763 MIC [µg/ml] Ludzkie krwinki czerwone (RBC) H 50 [µg/ml] Si myszy LD 50 [mg/kg wagi ciała], iv Hetaeny niearomatyczne Amfoterycyna B Kandydyna Mykoheptyna Heptaeny aromatyczne Kandycydyna D Gedamycyna Wacydyna A Cybulska et al., Mol. Pharmacol., 24, , 1983 Omura, Macrolide Antibiotics, 459, 1984

35 WSZYSTKO FAJNIE, ALE SKĄD WZIĄĆ TE MAKROLIDY?

36 MAKROLIDY POLIENOWE SĄ BIOSYNTETYZOWANE PRZEZ Z PROMIENIOWCE GLEBOWE (STREPTOMYCES) Streptomyces rimosus Streptomyces griseus

37 Otrzymane z brzeczki pofermentacyjnej poprzez ekstrakcję butanolem stanowią (biały-żółty) amorficzny preparat.

38 JAK WIĘKSZOŚĆ ZWIĄZKÓW NATURALNYCH SĄ WRAŻLIWE NA DZIAŁANIE CZYNNIKÓW ZEWNĘTRZNYCH: Temperatura > 45 C Ultradźwięki Światło Tlen ph powinno zawierać się w zakresie: 4.5 < ph < 8.5

39 INNY PROBLEM: W większości syntetyzowane są w postaci kompleksów antybiotyków o zbliżonej budowie chemicznej. W przypadku aromatycznych makrolidów polienowych zmiany strukturalne zachodzą jedynie w obrębie części hydrofilowej antybiotyku.

40 METODY ROZDZIELANIA/ IZOLACJI POSZCZEGÓLNYCH ANTYBIOTYKÓW Z ICH KOMPLEKSÓW: Preparatywna średniociśnieniowa chromatografia cieczowa (PLC) Ekstrakcja przeciwprądowa (CCD) Aparat do ekstarkcji przeciwprądowej Aparat Craiga.

41 KIEDY TEORIA SPOTYKA FAKTY...

42 MISJA KANDYCYDYNA

43 PROBLEMY ZWIĄZANE Z KOMPLEKSOWĄ NATURĄ KANDYCYDYNY: Analiza Kandycydyny metodą CCD ujawniła obecność dziewięciu składników, oznaczonych literami od A do I. At least three candicidin components could be separated on TLC plates HPLC analysis indicated the number of four to five components Wiadomości Chemiczne, 1968 J. Antibiot., 1972 J. Chromatogr., 1974 Rys.5. Chromatogram semipreparatywnego rozdzielenia kompleksu OMeNAc kandycydyn. Warunki: kolumna LiChrospher 100 RP18e, 10 µm, 250x10 mm. Eluent: 68% metanol/ 32% woda v/v; przy objętościowym natężeniu przepływu ω=6,25 ml/min. Monitorowana dł. fali λ=380 nm, temperatura pokojowa.

44 TRUDNY PROBLEM ROZDZIELCZY CZY CHEMICZNA TRANSFORMACJA KATALIZOWANA NA KOLUMNIE C18? Rys.6. Chromatogram rozdzielania frakcji 1 w warunkach analitycznych. Warunki: kolumna LiChrospher 100 RP18e, 10 µm, 250x4 mm. Eluent: 70% metanol/ 30% woda v/v; przy objętościowym natężeniu przepływu ω=1 ml/min. Monitorowana dł. fali λ=380 nm, temperatura pokojowa.

45 mau DALSZE BADANIA STRUKTURALNE Rys.9. Literaturowe widmo UV-Vis kandycydyny w metanolu. 150 Rys.7. Fragment widma DQF-COSY otrzymany dla frakcji Wavelenght [nm] Rys.10. Literaturowe widmo UV-Vis amfoterycyny B w metanolu. Rys.8. Widmo UV-Vis frakcji 1 w metanolu.

46 Jednostki odpowiedzi detektora [%] CHROMATOGRAM LC-MS KOMPLEKSU KANDYCYDYN: Kandycydyna D M=1108,6 95 Kandycydyna P M=1110, Kandycydyna K M=1092, Czas [min] Rys.11. Chromatogram LC-MS rozdzielania kompleksu Kandycydyn w warunkach analitycznych Warunki: kolumna Agilent Eclipse XDB-C18, 125x4,6 mm, dp=5µm, eluent: 38% ACN/ 62% CH3COOEt (5,5mmol, ph=4,5), v/v, objętościowe natężenie przepływu ω=0,6 ml/min, temperatura pokojowa, monitorowana dł. fali λ=380 nm.

47 Response units [%] mau mau Wavelenght [nm] Wavelenght [nm] P M=1110,6 D M=1108,6 Ptrans M=1110,6 K M=1092,4 Dtrans M=1108,6 Fresh Candicidin sample Candicidin sample after 24 h Ktrans M=1092, Time [min] Fig.14. Chromatogram LC-MS kompleksu Kandycydyn świeżo po przygotowaniu analitu i po czasie 24 godz. ekspozycji na czynniki zewnętrzne Warunki: kolumna Agilent Eclipse XDB-C18, 125x4,6 mm, dp=5µm, eluent: 38% ACN/ 62% CH 3 COOEt (5,5mmol, ph=4,5), v/v, objętościowe natężenie przepływu ω=0,6 ml/min, temperatura pokojowa, monitorowana dł. fali λ=380 nm.

48 A MODEL SCALE CIS-TRANS OMeNAc CANDICIDIN D ALL TRANS OMeNAc CANDICIDIN D Fig.4. Chromatogram of OMeNAc Candicidin complex. Conditions: LiChrosorb Si60, 7µm, 250x4 mm. Mobile phase composition: chloroform - methanol water, 5:0,4:0,035, v/v/v; at a flow rate of 1 ml/min. Detection at 380 nm, rt.

49 AND SCALING UP TO SEMIPREPARATIVE CONDITIONS CIS-TRANS OMeNAc CANDICIDIN D ALL TRANS OMeNAc CANDICIDIN D Fig.5. Chromatogram of derivatized Candicidin complex separation in a preparative scale. Conditions: LiChrosorb Si60, 7µm, 250x10 mm. Mobile phase composition: chloroform - methanol water, 5:0,4:0,035, v/v/v; at a flow rate of 6,25 ml/min. Detection at 380 nm, rt.

50 A PROBLEM ENCOUNTERED: Chromatographic performance of the column decreases with a number of separations. Decreased retention times (probably due to the modification of the stationary phase by polyene macrolides or other polar components). FIRST SEPARATION ON A COLUMN THIRD SEPARATION ON A COLUMN FIFTH SEPARATION ON A COLUMN Fig.6. A comparison of semipreparative separations of derivatized candicidin complex.

51 RESULTS: More than 80 mg of derivatized Candicidin complex (purity ca. 40% )was injected into a column. 1,73 mg of derivatized all trans Candicidin D was obtained. 2D NMR experiments: DQF-COSY, ROESY, TOCSY, HSQC, edited HSQC and HMBC in a 700 MHz spectrometer were carried out. An intepretation of data is in progress.

52 DZIĘKUJĘ

53 Najwazniejsze heptaeny aromatyczne i niearomatycze dzięki o sztywności pierścienia i wielkości. 3 typy działań: kompleksy van der waalsa, siec wiazan wodorowych ze sterolem, oddziaływania elektronowe miedzy chromoform (duzy elektrostatyczny potencjał) a podwójnymi w sterolach. Dopiero te duże związki stwarzają warunki do tego by wykazywać powinowactwo speczywiczne do wiązania się ze sterolami. Oba sterole różnią się elementami struktury, może być preferowane powinowactwo do ergosterolu niż cholesterolu. Na jakiej zasadzie? W ergosterolu jest drugie podwójne wiązanie. specyficznie wiązanie ze sterolem wymusza budowę kanału, ponieważ tworzy się kanal, to potem brakuje na działanie detergentowe. Nowotwory i grzyby ten sam poziom trudności w chemoterapii bo tu i tu eukariota. Leki będą toksyczne, nie ma opcji.

54 kanał okołó 10 A, tyle co jon potasu uwodniony, wiec jony uciekają z komórki, wychodzi potas, elktroobojetna wymiana wychodzi kation wchodzi anion. Kom ludzka nastawiona na tworzenie ATP na drodze oksydatywnej fosforylacyji, a nie potrafi przeżyć przez wytwarzanie fosforylacji substratowej (czyli grzyb może z powodzeniem może rosnąć przy tlenie, mechanizm ksydatywnej, ale bez telnu tez może cyklu Embdena-Meyerhofffa-Parnasa degradacja glukozy, w której bierze udział 3-4 enzymy (charakteryzują się tym, ze maja absolutna konieczność tworzenia kompleksu z jonem potasu, bez tego sa nieaktywne) i komórka grzyba ginie z głodu niemoznosc tworzenia ATP. od glukozy do alkoholu do kwasu mlecznego ). U człowieka tez jest ale maly udział wiec umrze, szcszegolnie w mózgu. Dowod na cykl embdena.. Wysilek fizyczny wymaga dużej ilości energii metabolicznej do ruszania miesni, ale jeżeli ten ruch jest silniejszy niż możliwości, to nie starczy dopływu tlenu do miesni, atp nie idzie, ale leci degradacja glukozy w cyklu beztlenowym do kwasu mlekowego, a wiadomo, ze jeżeli leciutko spadnie ph w mięśniu to spadek tego ph jest odbierane przez mozg jako ból.

55 Niewyekspolatowana grupa heptaenow aromatycznych kanał 100 nm, 50 nm ma amfoterycyna, wiec trzeba dwie