Folia Medica. Lodziensia. Lódzkie Towarzystwo Naukowe

Transkrypt

1 Folia Medica Lodziensia tom 42 numer Lódzkie Towarzystwo Naukowe

2 Redakcja Naczelna Wydawnictw Łódzkiego Towarzystwa Naukowego Krystyna Czyżewska, Henryk Piekarski, Edward Karasiński, ŁÓDZKIE Wanda M. Krajewska TOWARZYSTWO (Redaktor Naczelny), NAUKOWE Jan Szymczak Łódź, ul. M. Curie-Skłodowskiej 11 tel (42) ; Łódź, ul. M. tel./fax Curie-Skłodowskiej (42) tel ; tel./fax Naczelna Redakcja Wydawnictw Łódzkiego Towarzystwa Naukowego Sprzedaż wydawnictw: (042) , Wanda M. Krajewska, Sławomir Gala, Jan Szymczak, Edward Karasiński Folia Medica Lodziensia ADRES REDAKTORA NACZELNEGO: Katarzyna Winczyk Zakład Neuroendokrynologii, Łódź, ul. Sterlinga 3 Zakład Neuroendokrynologii, ul. Sterlinga 3, Łódź tel ; tel./fax ; katarzyna.winczyk@umed.lodz.pl tel./fax (42) ; katarzyna.winczyk@umed.lodz.pl KOMITET NAUKOWY (SCIENTIFIC COMMITEE) REDAKTOR Przewodniczący NACZELNY (Chairman): (EDITOR-IN-CHIEF) Marek Pawlikowski Członkowie (Members): Danuta Chlebna-Sokół Katarzyna (Łódź), Józef Winczyk Drzewoski (Łódź), Alina Gajewska (Warszawa), Kazimierz Jędrzejewski (Łódź), Marcin Kamiński (Katowice), Jarosław Kasprzak (Łódź), Radzisław Kordek (Łódź), Beata Kos-Kudła ZASTĘPCA (Zabrze), Jacek REDAKTORA Kuśmierek (Łódź), NACZELNEGO Andrzej Lewiński (ASSOCIATE (Łódź), Ludwik EDITOR) Malendowicz (Poznań), Dariusz Nowak (Łódź), Włodzimierz Olszewski Jerzy (Warszawa), Krzysztof Wranicz Marek Paradowski (Łódź), Andrzej Radek (Łódź), Lucyna Woźniak (Łódź), Krzysztof Zeman (Łódź) SEKRETARZ REDAKCJI (EDITORIAL SECRETARY) REDAKTOR Karolina NACZELNY Maluga-Beda (EDITOR-IN-CHIEF) SEKRETARZ TECHNICZNY Katarzyna(TECHNICAL Winczyk SECRETARY) ZASTĘPCA REDAKTORA Jacek NACZELNEGO Świętosławski(ASSOCIATE EDITOR) Jerzy Krzysztof Wranicz KOMITET NAUKOWY (SCIENIFIC COMITEE) SEKRETARZ Przewodniczący REDAKCJI (Chairman): (EDITORIAL Marek Pawlikowski SECRETARY) Karolina Beda-Maluga Członkowie (Members): Danuta Chlebna-Sokół (Łódź), Józef Drzewoski (Łódź), Kazimierz Jędrzejewski REDAK TOR (Łódź), JĘZYKOWY Marcin Kamiński ( LANGUAGE (Katowice), EDITOR Jarosław ) Kasprzak (Łódź), Radzisław Kordek (Łódź), Joanna Dyniak Kazimierz Kochman (Warszawa), Beata Kos-Kudła SEKRETARZ (Zabrze), TECHNICZNY Jacek Kuśmierek (TECHNICAL (Łódź), Andrzej SECRETARY) Lewiński (Łódź), Ludwik Malendowicz (Poznań), Jacek Dariusz Świętosławski Nowak (Łódź), Włodzimierz Olszewski (Warszawa), Daria Orszulak-Michalak (Łódź), Teresa Pajszczyk-Kieszkiewicz (Łódź), Marek Paradowski (Łódź), Andrzej Radek (Łódź), Magdalena Wochna-Sobańska PROJEKT RECENZENCI (Łódź), GRAFICZNY ( REVIEWERS Krzysztof Zeman - Hanna (Łódź) Stańska ) Ewa Balcerczak, Antoni Basta, Magdalena Bryś, Jan Chojnacki, Andrzej Kiejna, Jolanta Kunert-Radek, Wojciech Mielicki, Marek Mirowski, Marek Pawlikowski, Błażej Rubiś, Joanna Saluk, Mariusz Stępień, Janusz Szemraj Wydano z pomocą finansową Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego Czasopismo jest indeksowane w bazach Copernicus, Polsh Scientific Journal Database i znajduje się na liście ministerialnej czasopism punktowanych. Artykuły czasopisma w elektronicznej wersji są dostępne w bazach EBSCOhost i na portalach e-publikacje Nauki Polskiej oraz IBUK. Copyright Wydanie byi, Łódzkie wersja pierwotna Towarzystwo drukowana Naukowe Printed in Poland Copyright by Łódzkie Towarzystwo Naukowe Wyd. Printed I Nakład in Poland 200 egz. DRUK: GRAFIX tel./fax (42) Projekt okładki - Hanna grafix@grafix-poligrafia.pl Stańska Nakład 100 egz. ISSN Druk: 2K Łódź sp. z o.o., ul. Płocka 35/43, 2k@2k.com.pl, ISSN

3 Spis treści Paulina Młudzik i Marek Mirowski Charakterystyka i znaczenie proteinaz cysteinowych w procesie nowotworzenia The characterization and importance of cysteine proteases in cancer development Rafał Świechowski, Ewa Balcerczak, Marta Żebrowska, Agnieszka Jeleń Ocena ekspresji genu ABCC1 kodującego białko MRP1 u osób chorych na depresję Evaluation of ABCC1 gene expression, encoding MRP1, in patients with depression Leszek Smorąg, Irena Jeżowska-Smorąg, Antoni Florkowski, Krzysztof Zboralski, Marian Macander, Ireneusz Gądek, Bartosz Wilk, Piotr Wierzbiński Jakość życia i depresyjność u kobiet z rozpoznaniem raka trzonu macicy i raka jajnika analiza porównawcza Quality of life and depression in women diagnosed with uterus cancer and ovarian cancer comparative analysis Damian Jacenik i Adam I. Cygankiewicz Znaczenie receptora estrogenów oddziałującego z białkami G w fizjologii i patofizjologii Involvement of G-protein Coupled Estrogen Receptor in physiology and physiopathology Joanna Nowak, Joanna Szczecińska, Karolina Beda-Maluga, Katarzyna Winczyk Ocena czynności hormonalnej przysadki po operacji somatotropinoma Assessment of pituitary hormonal function after somatotropinoma surgery

4 Helena Szczepańska, Zbigniew Kowalczyk, Aleksandra Sałagacka-Kubiak, Ewa Balcerczak Ocena zmian stężenia leptyny i greliny, parametrów antropometrycznych oraz laboratoryjnych przed i po implantacji balonu żołądkowego Assessment of changes in leptin and ghrelin levels, anthropometric and laboratory parameters before and after implantation of the gastric balloon

5 Folia Medica Lodziensia, 2015, 42/2: Charakterystyka i znaczenie proteinaz cysteinowych w procesie nowotworzenia The characterization and importance of cysteine proteases in cancer development PAULINA MŁUDZIK i MAREK MIROWSKI Zakład Biochemii Farmaceutycznej i Diagnostyki Molekularnej z Pracownią Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki, Międzywydziałowa Katedra Diagnostyki Laboratoryjnej i Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, Uniwersytet Medyczny w Łodzi Streszczenie Proteinazy cysteinowe, nazywane również proteinazami tiolowymi lub sulfhydrolowymi, to enzymy odpowiedzialne za katalizowanie reakcji hydrolizy wiązań peptydowych w białkach. Biorą udział w licznych procesach fizjologicznych oraz patologicznych. Ich nieprawidłowa aktywność może prowadzić do wielu stanów chorobowych, w tym rozwoju nowotworów. Zaangażowane są one w proces kancerogenezy na wielu poziomach uczestniczą w inwazji, transformacji nowotworowej, angiogenenezie, apoptozie i powstawaniu przerzutów. Najlepiej scharakteryzowanymi proteinazami cysteinowymi są, należące do rodziny papainy, lizosomalne katepsyny. Dotychczas poznano 11 ludzkich katepsyn cysteinowych: B, L, H, S, K, F, V, X, W, O i C. Biorą one udział w aktywacji wielu proenzymów i prohormonów, pośredniczą w prezentacji antygenu MHC II, przebudowie kości, procesie reprodukcji oraz apoptozie. Badania nad udziałem proteinaz cysteinowych w procesie kancerogenezy wykazały podwyższoną ekspresję mrna lub aktywność enzymatyczną katepsyn w wielu ludzkich nowotworach np. raku piersi, płuc, mózgu, żołądkowo jelitowym, głowy, szyi oraz czerniaku. Do grupy proteinaz cysteinowych należy również prokoagulant nowotworowy, którego struktura, jak i pełnione przez niego funkcje są wciąż przedmiotem badań wielu naukowców. Podwyższony poziom aktywności, jak i stężenia antygenu Adres do korespondencji: prof. dr hab. n. farm. Marek Mirowski; Zakład Biochemii Farmaceutycznej i Diagnostyki Molekularnej z Pracownią Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki; Międzywydziałowa Katedra Diagnostyki Laboratoryjnej i Molekularnej; Wydział Farmaceutyczny; Uniwersytet Medyczny w Łodzi; ul. Muszyńskiego 1; Łódź; tel./fax: ; e mail: marek.mirowski@umed.lodz.pl

6 94 Charakterystyka i znaczenie proteinaz cysteinowych w procesie nowotworzenia prokoagulanta nowotworowego w surowicy krwi osób z chorobą nowotworową oraz w pooperacyjnym materiale tkankowym w stosunku do wartości obserwowanych u ludzi zdrowych, świadczy o możliwości wykorzystania tego czynnika w diagnostyce onkologicznej. Liczne badania przedkliniczne dowiodły, że zatrzymanie proliferacji oraz obniżenie potencjału metastatycznego komórek nowotworowych jest prawdopodobne przy użyciu inhibitorów proteinaz cysteinowych. Daje to duże nadzieje na możliwość zastosowania ich w terapii przeciwnowotworowej. Słowa kluczowe: proteinazy cysteinowe, katepsyny, prokoagulant nowotworowy, kancerogeneza. Abstract Cysteine proteases also known as thiol or sulfhydryl proteases are enzymes responsible for catalyzing the hydrolysis of peptide bonds in proteins. They take part in many physiological and pathological processes. Their abnormal activity can lead to a number of disease states including tumor growth. They are involved in the process of carcinogenesis at multiple levels they participate in the invasion, transformation, angiogenesis, apoptosis and metastasis. The best characterised cysteine proteases are the lysosomal cathepsins, that belong to the papain family. So far 11 cysteine cathepsins have been identified: B, L, H, S, K, F, V, X, W, O and C. They take part in the activation of many proenzymes and prohormones, MHC II mediated antigen presentation, bone remodeling, reproduction and apoptosis. Research on the role of cysteine proteases in carcinogenesis showed elevated expression of mrna or enzymatic activity of cathepsins in many human cancers, eg. breast, lung, brain, gastrointestinal tract, head and neck and melanoma. Cancer procoagulant also belongs to the group of cysteine proteases, however its structure and functions are still the subject of research for many scientists. Elevated levels of activity and concentrations of cancer procoagulant in the serum and tissues from patients with cancer disease compared to those observed in healthy people, provides the possibility of using this factor in the diagnosis of cancer. Many preclinical studies have shown that achieving a stop proliferation and reducing the metastatic potential of tumor cells is possible with the use of cysteine proteinases inhibitors. That gives great hope for the possibility of their application in anticancer therapy.

7 Paulina Młudzik i Marek Mirowski 95 Key words: cysteine proteases, cathepsin, cancer procoagulant, cancerogenesis. Wstęp Nowotwory należą do jednych z najgroźniejszych chorób współczesnej cywilizacji. Mimo dużego postępu medycyny oraz sięgania po coraz nowocześniejsze metody diagnostyki i terapii wciąż stanowią poważny problem. Czas działa na niekorzyść pacjenta, stąd wczesne wykrycie i zastosowanie odpowiednio dobranej terapii daje większą szansę na wyleczenie i przeżycie. Dlatego, tak bardzo istotne jest nieustanne zgłębianie wiedzy na temat nowotworów oraz wdrażanie nowych metod szybkiej diagnostyki i skutecznego leczenia. Współcześnie, diagnostyka chorób nowotworowych związana jest z zastosowaniem badań obrazowych, patomorfologicznych, a także laboratoryj nych. W laboratoriach medycznych oznaczanych jest wiele markerów nowotworowych, jednak wciąż trwają badania nad wykryciem nowych parametrów swoistych dla danej choroby. Jeden z badanych parametrów stanowią proteinazy cysteinowe. Wykazano bowiem, iż oznaczanie aktywności proteinaz cysteinowych oraz ich inhibitorów może być pomocne w diagnostyce i monitorowaniu przebiegu chorób nowotworowych [1 3]. Ogólna charakterystyka enzymów z grupy proteinaz cysteinowych Proteinazy cysteinowe, inaczej nazywane również proteinazami tiolowymi lub sulfhydrylowymi, stanowią podklasę enzymów proteolitycznych, odpowiedzialnych za katalizowanie reakcji hydrolizy wiązań peptydowych w białkach. Nazwa proteinaz cysteinowych ściśle związana jest z katalityczną funkcją grupy tiolowej cysteiny ( SH), znajdującej się w centrum aktywnym enzymu (w bezpośrednim sąsiedztwie pierścienia imidazolowego His), która uczestniczy w hydrolizie wiązań peptydowych poprzez atak nukleofilowy na występujący w nich węgiel karbonylowy. Aktywność proteinaz regulowana jest przez ich inhibitory. Proteinazy cysteinowe to białka o masie cząsteczkowej ok kda. Syntetyzowane są jako nieaktywne proenzymy, aktywowane

8 96 Charakterystyka i znaczenie proteinaz cysteinowych w procesie nowotworzenia na drodze ograniczonej proteolizy. Najwyższą aktywność wykazują w lekko kwaśnym ph równym 4,0 6,5 [1]. W warunkach fizjologicznych zlokalizowane są wewnątrzkomórkowo. Enzymy te uczestniczą w obrocie metabolicznym wielu białek zarówno endo, jaki i egzogennych [2]. Ich głównym zadaniem jest nieselektywna degradacja białek. Proteinazy cysteinowe cechują się dużą różnorodnością strukturalną i funkcjonalną, biorą udział w wielu procesach fizjologicznych oraz patologicznych. Ich działanie przyczynia się do powstawania charakterystycznych zmian w komórce takich, jak na przykład reorganizacja cytoplazmy i chromatyny jądrowej. Pośredniczą one, między innymi, w procesie apoptozy (kaspazy), degradacji lizosomalnej (katepsyny B, H, L, S, C, K), prezentacji antygenu (katepsyna B), a także mogą być zaangażowane w wirulencję niektórych patogenów (stafopaina). Aktywują wiele proenzymów, prohormonów i neuroprzekaźników. Uczestniczą w procesach zapłodnienia, rozwoju płodu, proliferacji oraz różnicowaniu się komórek [3]. Klasyfikacja proteinaz cysteinowych Według bazy danych MEROPS (wydanie 9.8) [4] proteinazy cysteinowe zostały podzielone, w oparciu o homologię sekwencji i podobieństwo trójwymiarowej struktury, na 11 klas zwanych klanami, w tym jeden klan niesklasyfikowany. W każdym z klanów stworzono dodatkowy podział proteinaz (Ryc. 1), grupując je na rodziny. Jak dotąd, najlepiej poznany i scharakteryzowany został klan CA, w którym najważniejsza dla organizmu ludzkiego jest rodzina papainy i kalpainy [5]. Do rodziny papain zaklasyfikowane zostały enzymy najbardziej rozpowszechnione i najdokładniej zbadane. Należą tu, między innymi, papaina, inne proteazy roślinne np. chymopapaina, karikaina, bromelaina, aktynidyna, ficyna oraz lizosomalne katepsyny. Proteinazami cysteinowymi o największym znaczeniu dla organizmu ludzkiego są katepsyny lizosomalne, kalpainy oraz kaspazy (Tabela 1) [1].

9 Paulina Młudzik i Marek Mirowski 97 Ryc. 1. Klasyfikacja peptydaz [4]. Fig. 1. The classification of peptidases [4]. Tabela 1. Klasyfikacja proteinaz cysteinowych na podstawie bazy danych MEROPS [4]. Table 1. The MEROPS classification of cysteine proteinases [4]. Klan Rodzina Przykład proteinaz CA np. C1 Papaina C2 Kalpainy CD np. C14 Kaspazy CE np. C48 Peptydazy Ulp1 CF C15 Peptydaza pyroglutamylowa CL np. C60 Sortaza A CM C18 Peptydaza wirusa zapalenia wątroby typu C CN C9 Sindbis virus type nsp2 peptidase CO C40 Dipeptydylopeptydaza VI CP C97 DeSI 1 peptidase CQ C53 Pestivirus Npro peptidase niesklasyfikowany np. C27 Peptydaza wirusa różyczki (Rubella virus)

10 98 Charakterystyka i znaczenie proteinaz cysteinowych w procesie nowotworzenia Prokoagulant nowotworowy (ang. cancer procoagulant CP) Prokoagulant nowotworowy (EC ) jest proteinazą cysteinową niezaklasyfikowaną do żadnej z przedstawionych wcześniej nadrodzin [6]. Jak dotąd, jest on wciąż nie w pełni scharakteryzowanym białkiem i nadal trwają badania nad lepszym poznaniem jego struktury oraz pełnionych przez niego funkcji. O istnieniu tego enzymu, jako pierwsi, donieśli w 1975 roku Gordon i wsp. Białko to nazwano prokoagulantem nowotworowym, ponieważ zostało wykryte w ekstrakcie z tkanki nowotworowej oraz wykazywało zdolność do bezpośredniej aktywacji czynnika X osoczowego układu krzepnięcia krwi [7]. Prokoagulant nowotworowy jest jednołańcuchową proteinazą cysteinową o masie cząsteczkowej 68 kda i punkcie izoelektrycznym 4,8, składającą się z 674 aminokwasów, z których znaczną większość stanowią: seryna (19,1%), glicyna (18,7%), kwas glutaminowy (12,5%), lizyna (8,1%), asparagina (7,1%). Do dziś nie udało się poznać sekwencji aminokwasów oraz genu kodującego to białko [8]. Cząsteczka CP nie zawiera węglowodanów, nie wykazano w niej również obecności reszt kwasu γ karboksyglutaminowego (Gla) [9]. Analizując budowę cząsteczki CP, wykazano obecność miejsc wiążących jony metali o wysokim powinowactwie do wapnia i magnezu oraz miejsc o wysokim powinowactwie do manganu i kadmu. Do aktywacji CP niezbędna jest obecność w środowisku reakcji jonów wapniowych Ca 2+, których najkorzystniejsze stężenie wynosi ok. 7 mmol/l przy ph w zakresie 6,9 7,2. Aktywność prokoagulanta nowotworowego wzrasta także przy udziale jonów Mg 2+, Mn 2+ i Cd 2+. Hamujące działanie w stosunku do tego enzymu wykazują natomiast jony Fe 2+, Zn 2+, Sn 2+ i Cu 2+. Jony metali dwuwartościowych odpowiadają za prawidłową strukturę przestrzenną cząsteczki prokoagulanta, zapewniającą jego aktywność [6]. Aktywność prokoagulacyjna CP może być hamowana specyficznie lub niespecyficznie przez wiele inhibitorów np.: chlorek rtęci, jodoacetamid, ketony peptydylodiazometylowe, fenylometylosulfofluorek, leupeptynę, antypainę, sole peptydylu [8] oraz E 64 (hamujący aktywność prokoagulanta w sposób kompetycyjny czyli odwracalny) [10]. Aktywność CP nie jest hamowana przez naturalnie występujące proteinazowe inhibitory osoczowe takie, jak α1 antytrypsyna, α1 antychymotrypsyna, α2 makro globulina, antytrombina III czy cystatyna, będąca silnym inhibitorem proteinaz

11 Paulina Młudzik i Marek Mirowski 99 cysteinowych [8]. Udowodniono także, że większość inhibitorów prokoagulanta (z wyjątkiem jonów rtęci), wykazuje skuteczniejsze działanie w obecności jonów CN oraz niewielkiego stężenia cysteiny dostarczającej wolne grupy sulfhydrylowe ( SH) do środowiska reakcji [6]. Pierwszym źródłem wyizolowanego CP były ekstrakty z guzów V2 królika, później obecność prokoagulanta wykryto także w ludzkich rakach nerki, okrężnicy, sutka i pochwy. Następnie, aktywność CP opisano także w płynie owodniowym i ekstraktach z błon płodowych człowieka, które stanowią obecnie główne źródło prokoagulanta. Enzym ten występuje również w ekstraktach z komórek wielu różnych typów nowotworów oraz w lizatach komórek transformowanych. Prokoagulant wykazuje aktywność nie tylko w guzach litych, ale i w ekstraktach z komórek blastycznych ostrej białaczki nielimfatycznej oraz ostrej białaczki limfoblastycznej [6]. Jak dotąd, nie stwierdzono obecności prokoagulanta nowotworowego w żadnej prawidłowej tkance (poza błonami płodowymi) [11]. Funkcja, jaką pełni prokoagulant w rozwoju choroby nowotworowej, nie została jeszcze do końca wyjaśniona, jednak uważa się, że odgrywa on w tym procesie istotną rolę. Może spełniać funkcję czynnika wzrostowego dla komórek nowotworowych lub w inny sposób wpływać na ich wzrost. Prokoagulant nowotworowy, poprzez aktywację czynnika X, odpowiedzialny jest także za zaburzenia układu krzepnięcia krwi w chorobie nowotworowej. Stwierdzono, że CP odpowiedzialny jest za nasilanie adhezji płytek krwi do kolagenu i fibrynogenu oraz za indukcję kaskady kwasu arachidonowego i wytwarzanie wolnych rodników w płytkach krwi [6]. W wielu badaniach wykazano, iż poziom aktywności, jak i stężenie antygenu prokoagulanta nowotworowego jest podwyższone w surowicy krwi oraz w tkankach rakowych osób z chorobą nowotworową w stosunku do wartości obserwowanych u ludzi zdrowych, co świadczy o możliwości wykorzystania tego czynnika w diagnostyce onkologicznej [12]. Zauważono również, że poziom aktywności CP wzrasta wprost proporcjonalnie do stopnia zaawansowania choroby, a wzrost ten jest zauważalny już w jej początkowych stadiach. Sugeruje to możliwość wykorzystania prokoagulanta jako markera wczesnych zmian nowotworowych. Za wykorzystaniem CP w diagnostyce onkologicznej przemawia także fakt, iż obserwowano znaczny spadek aktywności tego enzymu w trakcie remisji

12 100 Charakterystyka i znaczenie proteinaz cysteinowych w procesie nowotworzenia choroby oraz po całkowitej resekcji złośliwego guza, podczas gdy nieradykalne usunięcie zmiany nowotworowej nie powodowało istotnego obniżenia aktywności CP [7]. Proteinazy cysteinowe i ich inhibitory w nowotworach Wiele przeprowadzonych badań potwierdziło istotny udział proteinaz cysteinowych w procesie nowotworzenia i przerzutowania [13]. Enzymy proteolityczne współdziałają ze sobą, prowadząc do degradacji struktur macierzy pozakomórkowej i błony podstawnej otaczającej nowotwór, ułatwiając w ten sposób komórkom nowotworowym proliferację i rozsiewanie. W progresji nowotworów najlepiej poznana i opisana została rola katepsyny B i L. Udowodniono udział katepsyny L w transformacji nowotworowej oraz katepsyny B i L w angiogenezie, inwazji i powstawaniu przerzutów. Enzymy te uczestniczą w kaskadzie enzymów proteolitycznych wpływając na aktywność aktywatora plazminogenu typu urokinazy (u PA) oraz same mają zdolność degradacji kolagenu IV, fibronektyny, laminy i proteoglikanów budujących struktury pozakomórkowe. Stwierdzono, że komórki nowotworowe wydzielają oraz eksponują na swojej powierzchni prokatepsyny B i L, które zostają aktywowane przez katepsynę D i przekształcają prekursory aktywatora plazminogenu (pro upa) i kolagenaz do postaci aktywnych. W konsekwencji, dochodzi do wzrostu potencjału proteolitycznego w otoczeniu guza oraz zmiany struktury białek macierzy międzykomórkowej (kolagenu IV, laminy, fibronektyny, elastyny) prowadzącej do przerwania ciągłości błony komórkowej, co pozwala na rozsiewanie komórek do sąsiednich tkanek. Procesy te regulowane są przez inhibitory aktywatora plazminogenu, metaloproteaz i proteinaz cysteinowych. Zachwianie równowagi enzym inhibitor może być jedną z przyczyn rozwoju choroby nowotworowej. Zwiększona ekspresja katepsyny B i L obserwowana zarówno w tkankach nowotworowych, jak i surowicy pacjentów, często skorelowana jest dodatnio ze stopniem zaawansowania choroby i wiąże się z większą agresywnością guza gotowością do naciekania i tworzenia przerzutów. Katepsyna B bierze udział w procesie inwazji nowotworowej, przyczyniając się do powstawania przerzutów nowotworów złośliwych [14]. Badania nad udziałem proteinaz cysteinowych

13 Paulina Młudzik i Marek Mirowski 101 w procesie kancerogenezy oparte są głównie na oznaczeniu poziomu ekspresji mrna, stężenia oraz aktywności enzymu. W wielu chorobach nowotworowych występuje wzrost stężenia proteinaz cysteinowych (Tabela 2). Podwyższoną ekspresję mrna kodującego katepsyny wykazano w wielu nowotworach człowieka, w tym w raku piersi [15], płuc [16, 17], mózgu [18], żołądka, jelit [19], głowy i szyi [20] oraz czerniaku [21]. Wzrost ekspresji katepsyny B odnotowano w komórkach guzów m.in. mózgu, tarczycy i okrężnicy, a także w zmianach przedrakowych. Analizując natomiast stężenie białka i aktywność enzymatyczną katepsyny B, ich podwyższone wartości wykryto u pacjentów z nowotworem mózgu, płuc, piersi, żołądka, tarczycy, szyjki macicy, jajnika i innych narządów [22]. Wyższy poziom aktywności katepsyny B obserwowany jest głównie na obrzeżach guza, gdzie enzym ten, dzięki swoim właściwościom proteolitycznym, przyczynia się do degradacji białek macierzy pozakomórkowej (ang. extracellular matrix ECM). Pozwala to komórkom nowotworowym na atakowanie pobliskich tkanek, a także tworzenie przerzutów odległych. Do powstania odległych wtórnych ognisk nowotworowych konieczne jest przedostanie się komórek nowotworowych z guza pierwotnego do naczyń krwionośnych i chłonnych po wcześniejszym pokonaniu błony podstawnej [22]. Katepsyna B zaangażowana jest również w angiogenezę, czyli proces tworzenia nowych naczyń krwionośnych w obrębie guza, które umożliwiają transport substancji odżywczych i produktów przemiany materii, pozwalając na szybki wzrost nowotworu. Proces ten jest efektem oddziaływań elementów znajdujących się na powierzchni komórek śródbłonkowych ze składnikami macierzy pozakomórkowej. Przez komórki nowotworowe wytwarzane są proteazy mające zdolność do trawienia białek ECM i błony podstawnej, co umożliwia przemieszczanie się komórek śródbłonka, które tworzą nowe naczynia. Główną rolę odgrywają w tym procesie metaloproteinazy. Katepsyna B bierze pośredni udział w tworzeniu naczyń guza poprzez degradację i inaktywację inhibitorów metaloproteinaz [23]. Poza katepsyną B, w chorobach nowotworowych udział biorą również katepsyna H, S i L2. Katepsyna L2 nie ulega ekspresji w prawidłowych komórkach sutka oraz jelita grubego, pojawia się natomiast w komórkach nowotworowych tych organów [14]. Proteinazy cysteinowe mogą również powodować uodpornienie komórek nowotworowych na działanie układu immunologicznego.

14 102 Charakterystyka i znaczenie proteinaz cysteinowych w procesie nowotworzenia Tabela 2. Zmiany stężeń proteinaz cysteinowych w chorobach nowotworowych Table 2. Changes in the concentration of cysteine proteases in cancer disease Choroba Katepsyna Materiał Zmiana stężenia Rak piersi B, L Tkanka guza i komórki nowotworowe H Tkanka guza i surowica Rak jajnika Rak pęcherza moczowego Rak prostaty B Tkanka guza i surowica L surowica B Osocze, mocz L Mocz B, H, S Tkanka guza i komórki nowotworowe L Tkanka guza Rak jelita grubego B, H, L Tkanka guza Rak żołądka B,L Tkanka guza Rak trzustki B, H Tkanka guza Rak płuc B, L, S Tkanka guza H Tkanka guza H Surowica Rak mózgu B, L, H Tkanka guza Rak głowy i szyi Czerniak B, L Tkanka guza H Tkanka guza B, H Surowica B, L, H Tkanka guza

15 Paulina Młudzik i Marek Mirowski 103 Potwierdzeniem tego stwierdzenia jest fakt, że występująca na powierzchni komórek czerniaka prokatepsyna L chroni je przed lizą, poprzez degradację czynnika C3 komplementu, dzięki czemu komórki nabywają zdolność do przerzutowania [24]. Udowodniono również, że obecność proteinaz cysteinowych w błonie komórek nowotworowych przyspiesza agregację trombocytów indukowaną przez guz [25]. Podjęto próby wyjaśnienia potencjalnych mechanizmów prowadzących do wzrostu aktywności proteinaz cysteinowych w nowotworach. Przyczyną nadmiernej ekspresji tego enzymu może być amplifikacja genu. Mechanizm ten zaobserwowano w przypadku gruczolakoraka przełyku, gdzie w badanych próbkach stwierdzono 4 20 krotną amplifikację genu kodującego katepsynę B. Poziom ekspresji proteinaz cysteinowych może być także zależny od cząsteczek zaangażowanych w przekazywanie sygnałów stymulujących wzrost i pro liferację komórek. Wykazano podwyższoną ekspresję genu katepsyny B w linii ludzkich komórek białaczki promielocytowej HL 60 pod wpływem retinoidów, estrów forbolu i kalcytriolu. Kolejną przyczyną wzrostu syntezy proteinaz cysteinowych może być również zwiększenie stabilności ich mrna, o czym świadczy fakt, iż niekiedy podwyższonemu stężeniu i aktywności katepsyny B nie towarzyszy wzrost stężenia jej transkryptu [14]. W wielu badaniach udowodniono antynowotworowe działanie inhibitorów proteinaz cysteinowych. Przeprowadzone próby przedkliniczne wykazały, że zahamowanie aktywności proteinaz cysteinowych przy użyciu ich inhibitorów spowalnia wzrost guza poprzez blokowanie angiogenezy i inwazji. Osiągnięcie znacznej regresji guza, zwłaszcza w późnym stadium choroby, oraz wydłużenie czasu przeżycia pacjenta możliwe jest przy połączeniu leczenia inhibitorami proteinaz cysteinowych z dodatkową terapią skierowaną przeciwko komórkom nowotworowym np. chemioterapią lub radioterapią. Dowiedziono jednak, iż włączenie do leczenia inhibitorów proteinaz cysteinowych znacznie zwiększa skuteczność tradycyjnych terapii przeciwnowotworowych [26]. Najczęściej używanym w badaniach inhibitorem proteinaz cysteinowych jest E 64, przy użyciu którego możliwe było zahamowanie proliferacji komórek nowotworu naskórka oraz powstrzymanie inwazji nowotworu pęcherza moczowego, jajnika i płuc.

16 104 Charakterystyka i znaczenie proteinaz cysteinowych w procesie nowotworzenia Hamował on ponadto degradację laminy oraz obniżał potencjał metastatyczny komórek nowotworowych. Podobne rezultaty przyniosło wykorzystanie inhibitorów bardziej specyficznych względem poszczególnych katepsyn [5]. Podsumowanie Przedstawione doniesienia dają dużą nadzieję nie tylko na możliwość wykorzystania proteinaz cysteinowych i ich inhibitorów w diagnozowaniu, prognozowaniu przebiegu choroby, ale również na podejmowanie prób ich wykorzystywania w poszukiwaniu nowych terapii antynowotworowych. Praca zrealizowana w ramach działań statutowych Zakładu Biochemii Farmaceutycznej i Diagnostyki Molekularnej 503/ / Piśmiennictwo 1. Grzonka Z, Jankowska E, Kasprzykowski F, Kasprzykowska R, Łankiewicz L, Wiczak W i wsp. Structural studies of cysteine proteases and their inhibitors. Acta Biochem Pol. 2001; 48: Wyrwińska A, Torliński L. Proteazy cysteinowe i cystatyny w chorobach nowotworowych. Część I. Diagnostyczna i prognostyczna wartość oznaczania cystatyn i/lub proteaz cysteinowych. Nowiny Lekarskie. 2003; 72: Rzychon M, Chmiel D, Stec Niemczyk J. Modes of inhibition of cysteine proteases. Acta Biochem Pol. 2004; 51: (data dostępu ). 5. Stoka V, Turk B, Turk V. Lysosomal Cysteine Proteases: Structural Features and their Role in apoptosis. IUBMB Life. 2005; 57: Kamocka M, Mielicki W. Prokoagulant nowotworowy: charakterystyka biochemiczna oraz wpływ na rozwój choroby nowotworowej. Postępy Biochemii. 2003; 49: Szajda S, Snarska J, Skrzydlewski Z, Zwierz K. Nowotworowy prokoagulant (CP) w chirurgicznej diagnostyce onkologicznej. Współczesna Onkologia. 2005; 9: Mielicki W. Biochemistry of cancer procoagulant. Haemostasis. 2001; 3: 8 10.

17 Paulina Młudzik i Marek Mirowski Kaplińska K, Mielicki WP. Direct analysis reveals an absence of g carboxyglutamic acid in cancer procoagulant from human tissue. Blood Coagulation and Fibrynolysis 2009; 20: Mielicki W, Sobolewska M. Cancer Procoagulant (EC ): The kinetics of its inhibition by E 64 and Modulation of the Activity by Cadmium, Copper and Tin Ions. Cancer Research Therapy and Control. 2001; 11: Gordon S. G, Mielicki W. Cancer procoagulant: a factor X activator, tumor marker and growth factor from malignant tissue. Blood Coagul Fibrinolysis. 1997; 8: Mielicki W, Tenderenda M, Wierzbicki R. Usefulness of polyclonal antibody for detection of cancer procoagulant (EC ) in extracts from human malignant tissue. Biomedical Letters. 1997; 56: Berdowska I, Siewiński M, Zarzycki Reich A, Jarmułowicz J, Noga L. Activity of cysteine protease inhibitors in human brain tumors. Med Sci Monit. 2001; 7: Berdowska I, Siewiński M. Rola katepsyn cysteinowych oraz ich inhibitorów w procesach fizjologicznych i nowotworowych. Postępy Biochemii. 2000; 46: Yano M, Hirai K, Naito Z, Yokoyama M, Ishiwata T, Shiraki Y. Expression of cathepsin B and cystatin C in human breast cancer. Surg Today. 2001; 31: Ebert W, Knoch H, Werle B, Trefz G, Muley Th, Spiess E. Prognostic value of increased lung tumor tissue cathepsin B. Anticancer Res. 1994; 14: Schweiger A, Staib A, Werle B. Cysteine proteinase cathepsin H in tumours and sera of lung cancer patients: relation to prognosis and cigarette smoking. Br J Cancer. 2000; 82: Sivaparvathi M, Sawaya R, Wang SW, Rayford A, Yamamoto M, Liotta L i wsp. Overexpression and localization of cathepsin B during the progression of human gliomas. Clin Exp Metastasis. 1995; 13: Berdowska I. Cysteine proteases as disease markers. Clin Chim Acta. 2004; 342: Strojan P, Budihna M, Smid L, Svetic B, Vrhovec I, Kos J i wsp. Prognostic significance of cysteine proteinases cathepsins B and L and their endogenous inhibitors stefins A and B in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck. Clin Cancer Res. 2000; 6: Frohlich E, Schlagenhauff B, Mohrle M, Weber E, KlessenC, Rassner G. Activity, expression, and transcription rate of the cathepsins B, D, H, and L in cutaneous malignant melanoma. Cancer 2001; 91:

18 106 Charakterystyka i znaczenie proteinaz cysteinowych w procesie nowotworzenia 22. Poręba W, Gawlik K, Gutowicz J. Katepsyna B a proces inwazji nowotworowej. Postępy Biochemii. 2002; 48: Smolarczyk K, Błasiak J. Rola proteaz w progresji nowotworów. J Oncol. 2001; 51: Mai J, Finley R, Waisman D, Sloane B. Human Procathepsin B Interacts with the Annexin II Tetramer on the Surface of Tumor Cells. J Biol Chem. 2000; 275: Alexander B, Pechet L, Kliman A. Proteolysis, fibrynolysis and coagulaton significance in thrombolytic therapy. Circulation. 1962; 26: Palermo C, Joyce J. Cysteine cathepsin proteases as pharmacological targets in cancer. Trends Pharmacol Sci. 2008; 29:

19 Folia Medica Lodziensia, 2015, 42/2: Ocena ekspresji genu ABCC1 kodującego białko MRP1 u osób chorych na depresję Evaluation of ABCC1 gene expression, encoding MRP1, in patients with depression RAFAŁ ŚWIECHOWSKI, EWA BALCERCZAK, MARTA ŻEBROWSKA, AGNIESZKA JELEŃ Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki, Zakładu Biochemii Farmaceutycznej i Diagnostyki Molekularnej, Międzywydziałowej Katedry Diagnostyki Laboratoryjnej i Molekularnej, Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Streszczenie Wstęp: Według Światowej Organizacji Zdrowia depresja jest najczęściej występującym zaburzeniem psychicznym. Ponad 350 milionów ludzi na całym świecie cierpi na tę chorobę, co czyni ją czwartym z najważniejszych obecnie problemów zdrowotnych. Białko oporności wielolekowej 1 (MRP1), kodowane przez gen ABCC1, jest elementem współtworzącym barierę krew mózg oraz krew płyn mózgowo rdzeniowy. Zmiana ekspresji genu ABCC1 może wpłynąć na biodostępność leków antydepresyjnych, a tym samym na skuteczność farmakoterapii. Celem pracy była ocena ekspresji genu ABCC1 u pacjentów chorych na depresję. Materiał i metody: Badaniu poddano 32 próby RNA wyizolowane z leukocytów krwi obwodowej pacjentów chorych na depresję, leczonych w szpitalu im. Babińskiego w Łodzi. Ekspresja badanego genu została oceniona przy użyciu techniki Real time PCR. Wyniki: Na podstawie analizy jakościowej wykazano ekspresję genu ABCC1 w 30 próbach, a genu referencyjnego GAPDH w 32 próbach. Wszystkie 32 próby poddano analizie ilościowej. Poziom ekspresji genu ABCC1 względem genu GAPDH we wszystkich 32 przypadkach był wysoce zróżnicowany. Wykazano przeciętną, dodatnią, istotną statystycznie korelację (r = 0,3988) pomiędzy wiekiem pacjentów, a względnym poziom ekspresji genu ABCC1. Adres do korespondencji: dr hab. prof. nadzw. UM Ewa Balcerczak; Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki; Zakład Biochemii Farmaceutycznej i Diagnostyki Molekularnej; Międzywydziałowa Katedra Diagnostyki Laboratoryjnej i Molekularnej; Uniwersytet Medyczny w Łodzi; ul. Muszyńskiego 1, Łódź; tel/fax: ; ewa.balcerczak@umed.lodz.pl

20 108 Ekspresja genu ABCC1 u chorych na depresję Wnioski: Względny poziom ekspresji genu ABCC1 jest tym wyższy, im wyższy jest wiek pacjentów w grupie badanej. Uzyskane w pracy wyniki badań wymagają potwierdzenia na większej grupie pacjentów. Słowa kluczowe: depresja, ABCC1, MRP1, farmakogenetyka, ekspresja genu. Abstract Introduction: According to the World Health Organization, depression is the most common mental disorder. Over 350 million people suffer from this disease, making it the fourth most important health problem in the world. Multidrug resistance protein 1 (MRP1), encoded by ABCC1 gene is co creating the blood brain barrier and blood cerebrospinal fluid barrier. Changes in the expression of ABCC1 can influence the bioavailability of antidepressants, and thereby, determine the efficacy of the treatment. The aim of the study was to evaluate ABCC1 gene expression in patients with depression. Material and methods: We analyzed 32 samples of RNA isolated from the leukocytes of peripheral blood, derived from Babinski Hospital patients suffering from recurrent depressive episodes. The investigated gene expression was assessed using the technique of Real time PCR. Results: On the basis of qualitative analysis, ABCC1 gene expression has been shown in 30 samples, and the GAPDH gene expression in 32 samples. All 32 samples were quantitatively analyzed. The level of ABCC1 gene expression relative to GAPDH gene was variable among all 32 cases. An average, positive and significant correlation (r = ) between age of the patients and the relative expression level of ABCC1 has been shown. Conclusions: The relative level of gene expression increases with the age of the patients with depression. The obtained results require confirmation in a larger group of patients. Key words: major depression, ABCC1 gene, MRP1, pharmacogenetics, gene expression.

21 Rafał Świechowski i wsp. 109 Wstęp Depresja to choroba, którą zaliczamy do najczęstszych zaburzeń psychicznych. Występuje na całym świecie zarówno u dzieci, jak i osób dorosłych. Jest to ciężka choroba, która wymaga leczenia farmakologicznego i terapeutycznego [1]. Zaburzenia depresyjne zaliczamy do grupy zaburzeń afektywnych, które charakteryzują się obniżonym nastrojem oraz współ towarzyszącą anhedonią, brakiem energii, spadkiem aktywności ruchowej, zaburzeniami snu, uczuciem lęku, myślami samobójczymi oraz wieloma innymi [2]. Według szacunkowych danych Światowej Organizacji Zdrowia (ang. World Health Organization WHO) na całym świecie jest ponad 350 milionów chorych na depresję. Z przeprowadzonych pod koniec lat 90 tych ankiet wynika, że około 4 10% populacji ogólnej przeżyło przynajmniej jeden epizod depresyjny w ciągu roku poprzedzającego wypełnienie ankiety [3]. Przewiduje się, że w 2020 roku, zaburzenia depresyjne będą drugą, zaraz po chorobie niedokrwiennej serca, przyczyną odczuwania niepełnosprawności przez chorych, podczas gdy aktualnie zajmują czwarte miejsce [4]. Mniej niż 30% chorych na zaburzenia lękowe i depresyjne poszukuje pomocy u lekarzy [5]. Natomiast nieleczona choroba o ciężkim przebiegu może prowadzić do samobójstwa. Szacuje się, że około 20 25% kobiet i 12% mężczyzn przynajmniej raz w swoim życiu przejdzie epizod depresyjny [3]. Wśród czynników predysponujących do rozwoju depresji wyróżnia się: długotrwały stres, występowanie przewlekłych chorób, złą sytuację materialną, konflikty rodzinne oraz brak wsparcia ze strony społeczeństwa. Dodatkowo sugeruje się, iż wpływ na rozwój tej choroby mogą mieć czynniki genetyczne. Badania na bliźniętach monozygotycznych oraz dizygotycznych wykazały, że dziedziczność choroby kształtowała się odpowiednio na poziomie 40 60% oraz 25% [3]. Etiopatogeneza choroby opiera się na kilku teoretycznych modelach takich, jak: model biologiczny, model psychodynamiczny czy też model poznawczo behawioralny. Jednakże, najbardziej prawdopodobne wydają się być teorie z zakresu modelu biologicznego [6]. Liczne doniesienia naukowe dostarczają informacji, iż w przebiegu zaburzeń depresyjnych dochodzi do zaburzeń neuroprzekaźnictwa w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Hipoteza

22 110 Ekspresja genu ABCC1 u chorych na depresję katecholaminowa i hipoteza serotoninowa traktują kolejno o niedoborze katecholamin takich, jak noradrenalina i dopamina oraz niedoborze serotoniny. Za teorią tą przemawiają wyniki badań neurochemicznych, neuroobrazowych, a ostatnio także genetyczno molekularnych [6]. Współczesna diagnostyka i rozpoznanie zaburzeń depresyjnych oparte jest na kryteriach przygotowanych w ramach klasyfikacji ICD 10 oraz amerykań skiego systemu DSM V [6]. W celu potwierdzenia rozpoznania czy oceny nasilenia objawów, stosowane są różne testy psychometryczne, z których najpopularniejsze to: Inwentarz depresji Becka (ang. Beck Depression Inventory) czy skala depresji Hamiltona (ang. Hamilton Depression Rating Scale HDRS). Złotym standardem w diagnostyce i ocenie nasilenia zaburzeń depresyjnych jest skala depresji Hamiltona. Test występuje w dwóch wersjach różniących się liczbą pytań (17 lub 21). Każde zagadnienie punktowane jest od 0 4 w zależności od stopnia nasilenia objawu [7]. Wynik określany jest na podstawie sumy uzyskanych punktów. Zakres testu składającego się z 17 pytań przedstawia się następująco: 0 7 brak zaburzeń depresyjnych, 8 12 łagodna depresja, depresja o nasileniu umiarkowanym, ciężka depresja, bardzo ciężka depresja [7]. Współczesne metody terapii pozwalają w znaczący sposób złagodzić objawy choroby lub całkowicie je zniwelować. Większość pacjentów leczona jest w warunkach ambulatoryjnych. Obligatoryjnym wskazaniem do wprowadzenia leczenia szpitalnego jest znaczne nasilenie objawów choroby, które w swym stopniu mogą stanowić realne zagrożenie dla zdrowia i życia pacjenta [6]. W leczeniu depresji stosuje się następujące grupy leków: leki hamujące selektywnie wychwyt serotoniny, trójpierścieniowe leki przeciwdepresyjne, względnie selektywne inhibitory wychwytu noradrenaliny i serotoniny, inhibitory wychwytu serotoniny hamujące receptor 5 HT2, inhibitory wychwytu zwrotnego noradrenaliny i dopaminy [6]. Leczenie farmakologiczne jest najczęściej wybieraną metodą zwalczania objawów depresji, jednakże pierwszy schemat leczenia daje pozytywną odpowiedź tylko u 50% pacjentów [8]. Zwykle, warunkiem skutecznego leczenia staje się ścisłe

23 Rafał Świechowski i wsp. 111 dopasowanie terapii farmakologicznej do potrzeb konkretnego pacjenta. Zmiany w terapii najczęściej dotyczą dawki, rodzaju leku i kombinacji różnych antydepresantów. Mimo to, zdarza się, że długoterminowe leczenie może nie przynosić oczekiwanych efektów. Przyczyną takiego stanu może być depresja lekooporna (ang. treatment resistant depression TRD). Termin depresji lekoopornej jest używany w psychiatrii klinicznej w celu opisania przypadków osób chorych na dużą depresję, u których nie występuje efekt terapeutyczny pomimo stosowania różnych schematów leczenia farmakologicznego [9]. Odnosząc się do statystyk, jeden na trzech pacjentów leczących się na depresję nie zauważy pozytywnych skutków leczenia antydepresantem dobranym na początku terapii. Jak wynika ze wstępnych obserwacji, większa część poddawanych leczeniu osób uzyskuje mierny efekt terapeutyczny, a około 20% z nich w dalszym ciągu będzie przejawiała symptomy na dwa lata po rozpoznaniu choroby. Znaczna część chorych (15%) mimo agresywnej farmakoterapii i różnego podejścia psychoterapeutycznego, wciąż wykazuje znaczące objawy depresji [10]. Główną przeszkodą stojącą na drodze do osiągnięcia pożądanego efektu terapeutycznego jest oporność wielolekowa. Najczęstszą przyczyną tego zjawiska jest nadekspresja błonowych białek transportowych odpowiedzialnych za dystrybucję ksenobiotyków. Zmniejsza to biodostępność leku w komórce, tym samym uniemożliwiając osiągnięcie stężenia terapeutycznego. Badany gen ABCC1 zlokalizowany jest na krótkim ramieniu chromosomu 16 (16p13.1) i zbudowany jest z 31 eksonów kodujących białko oporności wielolekowej (ang. multidrug resistance associated protein 1 MRP1). ABCC1 należy do nadrodziny transporterów błonowych ABC. Białko MRP1 zostało zidentyfikowane w 1992 roku w linii komórkowej drobnokomórkowego raka płuc H69AR jako pierwsze białko należące do podrodziny ABCC [11]. MRP1 ma masę kda i zbudowane jest z łańcucha aminokwasów. Białko to posiada typową dla nadrodziny ABC budowę. Składa się z domen rozciągających się w błonie komórkowej (ang. membrane spanning domain MSD) i wewnątrzkomórkowych domen wiążących nukleotydy (ang. nucleotide binding domain NBD). MRP zaliczane jest do białek długich podrodziny ABCC ze względu na obecność dodatkowej domeny MSD0. Dodatkowa, trzecia domena MSD0 jest cechą charakterystyczną dla niektórych białek z podrodziny

24 112 Ekspresja genu ABCC1 u chorych na depresję ABCC. Domeny NBD odpowiedzialne są za wiązanie i hydrolizę ATP, domeny MSD1 i MSD2 odpowiadają za swoiste wiązanie substratu [11]. Funkcje domeny MSD0 nie są do końca poznane. Białko MRP1 występuje w prawie wszystkich tkankach organizmu. Jego wysoki poziom występuje w płucach, śledzionie, jądrach, nerkach, łożysku, pęcherzu moczowym i prostacie. Natomiast, niski poziom lub brak białka cechuje tkanki jelita cienkiego i okrężnicy oraz niektóre komórki krwi obwodowej. Najwyższy poziom MRP1 wykazują komórki tworzące barierę krew mózg i krew płyn mózgowo rdzeniowy [12]. W warunkach prawidłowych MRP1 zabezpiecza tkanki organizmu przed niekorzystnym działaniem niektórych ksenobiotyków i metabolitów. Sam proces polega na aktywnym wyrzucaniu substancji szkodliwych z wewnętrznego środowiska komórki. Obecność MRP1 w tkankach mózgu i barierze krew mózg, chroni narząd przed szkodliwymi substancjami [12]. Jednakże, wraz z substancjami szkodliwymi, transporter usuwa także potencjalne leki. Bowiem wśród wielu substratów transportowanych przez MRP1 możemy wyróżnić także leki o działaniu przeciwdepresyjnym. Na wydajność działania tego transportera mogą wpływać: polimorfizmy genu ABCC1 oraz poziom jego ekspresji. Zatem, zbyt duża ilość/aktywność MRP1 może uniemożliwić osiągnięcie terapeutycznego stężenia leków przeciwdepresyjnych doprowadzając tym samym do braku efektywności stosowanej farmakoterapii. Celem niniejszej pracy była ocena ekspresji genu ABCC1 u pacjentów z depresją. Materiał Materiał badany stanowiły 32 próby RNA (21 kobiet; 11 mężczyzn; średnia wieku w momencie zdiagnozowania choroby: 48 lat) wyizolowane z leukocytów krwi obwodowej pobranej od pacjentów ze zdiagnozowanym zaburzeniem depresyjnym nawracającym, leczonych w szpitalu psychiatrycz nym im. J. Babińskiego w Łodzi. Pacjenci zostali zakwalifikowani do badania na podstawie kryteriów włączających ICD 10 (F ; F33.0 F33.8). Stopień nasilenia objawów został oszacowany na podstawie kwestionariusza Hamiltona. U pacjentów zastosowano leczenie pojedynczym antydepresantem

25 Rafał Świechowski i wsp. 113 lub ich kombinacją: inhibitory zwrotnego wychwytu serotoniny, kwas walproinowy, mianseryna, kwetiapina, doksepina, wenlafaksyna, mirtazapina, agomelatyna, lewomepromazyna. Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej oraz zostało zaakceptowane przez Komisję Bioetyczną (RNN/566/08/KB). Metody Izolacja RNA Izolacja RNA została przeprowadzona z użyciem zestawu do izolacji RNA Total RNA (A&A Biotechnology). Stężenie oraz czystość wyizolowanego materiału określono spektrofotometrycznie. Otrzymane próby RNA przechowywano do czasu dalszych analiz w temperaturze 80 C. Reakcja odwrotnej transkrypcji (ang. reverse transcription RT) Reakcję odwrotnej transkrypcji przeprowadzono zgodnie z protokołem High Capacity cdna Reverse Transcription Kits Protocol (Applied Biosystems). Końcowe stężenie RNA w mieszaninie reakcyjnej wynosiło 0,02 µg/µl. Próby zsyntetyzowanego cdna przechowywano w temperaturze 20 C. Jako gen referencyjny wykorzystano gen GAPDH, kodujący dehydrogenazę aldehydu 3 fosfoglicerynowego. Reakcja PCR (ang. polymerase chain reaction) Gen badany amplifikowany był przy użyciu zestawu dla trudnej matrycy KAPA2G Robust Hot Start PCR kit (KapaBiosystems). Mieszanina reakcyjna składała się z: 5,5 µl 5x buforu reakcyjnego GC z jonami MgCl 2, 5 µl 5x Enhancera, 0,5 µl mieszaniny dntp (stężenie wyjściowe 10 mm), 0,7 µl startera F (ABCC1 5 CTTCTGCACATTCATGGTC3 ; GAPDH 5`TGGTATCGTGGAAGGACTCATGAC3`) 0,7 µl startera R (ABCC1 5 GTCTTACTCATTGCAGG 3 ; GAPDH 5`ATGCCAGTGAG CTTCCCGTTCAGC3`), 0,1 µl polimerazy KAPA2G Robust Hot Start DNA Polymerase (stężenie wyjściowe 5 uu/µl), 1 µl materiału badanego cdna

26 114 Ekspresja genu ABCC1 u chorych na depresję i 11,5 µl wody destylowanej. W każdej serii oznaczeń wykonano kontrolę negatywną, do której zamiast cdna dodawano 1 µl wody destylowanej. Produkty reakcji PCR oceniano za pomocą elektroforezy w 2% żelu agarozowym. PCR w czasie rzeczywistym (ang. real time polymerase chain reaction Real Time PCR) Ilościową analizę ekspresji genu badanego ABCC1 względem genu referencyjnego GAPDH przeprowadzono zgodnie z protokołem SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix (Sigma Aldrich). Mieszanina reakcyjna zawierała: 7,5 µl SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix, po 0,7 µl startera F i R, 1 µl cdna oraz wodę destylowaną do końcowej objętości 16 µl. Reakcje dla genu badanego oraz genu referencyjnego prowadzono w oddzielnych probówkach. Do analizy każdego z genów dołączano kontrolę negatywną, w której zamiast cdna dodawano do mieszaniny reakcyjnej 1 µl wody destylowanej. Każdą z badanych prób analizowano w trzech powtórzeniach. Następnie zarówno dla genu ABCC1, jak i GAPDH wyliczano średnią wartość Ct (ang. treshold cycle). Do wyliczenia zmiany poziomu ekspresji genu wykorzystano względną metodę ΔΔ Ct. Analiza statystyczna Wszystkie analizy statystyczne zostały przeprowadzone za pomocą programu STATISTICA 12 (StatSoft Inc.). Aby ocenić zależność/korelację pomiędzy: płcią pacjentów a względnym poziomem ekspresji ABCC1 wykorzystano test U Manna Whitney`a wiekiem, stopniem ciężkości objawów; efektem leczenia a względnym poziomem ekspresji ABCC1 wykorzystano nieparametryczne macierze korelacji porządku rang Spearmana. We wszystkich testach za istotną statystycznie przyjęto wartość p<0,05. W tabeli 1 przedstawiono statystykę opisową dla grupy pacjentów z depresją.

27 Rafał Świechowski i wsp. 115 Tabela 1. Statystyki opisowe dla grupy badanej. Table 1. Descriptive statistics for all examined patients. Badana cecha Średnia Mediana Minimum Maksimum SD Wiek 47, ,90 HDRS ,56 Efekt leczenia 15, ,52 R 4,65 0,49 0,03 33,97 8,44 HDRS1 odpowiada liczbie punktów w skali Hamiltona przed leczeniem. Efekt leczenia przedstawiony został w postaci różnicy punktów w skali Hamiltona przed leczeniem i po leczeniu. R to względny poziom ekspresji genu ABCC1. HDRS1 corresponds to the number of points on the Hamilton scale before treatment. The treatment effect is presented as the difference of points in the Hamilton scale before and after treatment. R is the relative expression level of ABCC1 Wyniki W pierwszej kolejności przeprowadzono jakościową ocenę. Analiza jakościowa wykazała obecność ekspresji genu referencyjnego GAPDH we wszystkich 32 próbach badanych. Natomiast, gen badany ABCC1 był obecny w 30 próbach. Do analizy ilościowej włączono wszystkie próby wykazujące jakościowo ekspresję genu metabolizmu podstawowego. Poziom ekspresji genu ABCC1 względem genu GAPDH we wszystkich 32 przypadkach był wysoce zróżnicowany (Ryc. 1).