Stres oksydacyjny u szczurów eksponowanych na etanol i dym tytoniowy

Transkrypt

1 PRACE ORYGINALNE Ewa IGNATOWICZ 1 Katarzyna BOLT 1 Maksymilian KULZA 2 Monika SEÑCZUK-PRZYBY OWSKA 2 Ewa FLOREK 2 Stres oksydacyjny u szczurów eksponowanych na etanol i dym tytoniowy Oxidative stress in rats exposed to ethanol and tobacco smoke 1 Katedra Biochemii Farmaceutycznej, im. Karola Marcinkowskiego, Poznañ Kierownik: Prof. dr hab. Wanda Baer-Dubowska 2 Laboratorium Badañ Œrodowiskowych, Katedra i Zak³ad Toksykologii, im. Karola Marcinkowskiego, Poznañ Kierownik Laboratorium: Prof. dr hab. Ewa Florek Dodatkowe s³owa kluczowe: dym tytoniowy uzale nienie od alkoholu stres oksydacyjny paraoksonaza 1 Additional key words: tobacco smoke alcohol dependency oxidative stress paraoxonase 1 W niniejszej pracy oceniono wp³yw dymu tytoniowego i etanolu u samców szczurów uzale nionych i nieuzale - nionych od etanolu na wybrane parametry stresu oksydacyjnego: aktywnoœæ paraoksonazy 1 (PON1) i zdolnoœæ redukcji kationu elazowego (FRAP). Zwierzêta uzale nione i nieuzale nione od etanolu w ró ny sposób reaguj¹ na dym tytoniowy i etanol: u szczurów nieuzale nionych obserwuje siê wyraÿniejsze zmiany w poziomach badanych parametrów, co mo e sugerowaæ ich wiêksz¹ wra liwoœæ na badane ksenobiotyki. W w¹trobie zwierz¹t uzale nionych od etanolu aktywnoœæ PON1 jest prawie dwukrotnie wy sza ni w w¹trobie szczurów nieuzale nionych. Wartoœæ bezwzglêdna FRAP jest wy sza w p³ucach ni w w¹trobie. Po godz. od zakoñczenia doœwiadczenia ekspozycja wy³¹cznie na dym tytoniowy powoduje: spadek aktywnoœci PON1 w w¹trobie obu porównywanych grup szczurów, wzrost wartoœci FRAP w p³ucach i w¹trobie szczurów nieuzale nionych. Po godz. od zakoñczenia doœwiadczenia jednorazowa dawka etanolu powoduje: spadek wartoœci FRAP w p³ucach szczurów nieuzale nionych. Po godz. od zakoñczenia doœwiadczenia ekspozycja na dym tytoniowy i jednorazowa dawka etanolu powoduje: wzrost aktywnoœci PON1 w w¹trobie i p³ucach szczurów nieuzale nionych oraz spadek wartoœci FRAP w w¹trobie i p³ucach szczurów nieuzale nionych. W w¹trobie zwierz¹t nieuzale - nionych aktywnoœæ PON1 jest ujemnie skorelowana z wartoœci¹ FRAP. In the current study the effect of tobacco smoke and ethanol in male rats was assessed on the basis of paraoxonase 1 (PON1) activity and Fe (III)-reducing potential (FRAP) Animals non addicted to ethanol express more distinct changes in levels of the tested parameters upon exposure to smoke and ethanol than their addicted counterparts. In the liver of the addicted animals the PON1 activity is almost twice as high as in the non addicted rats. Twenty four hrs after the experiment completion exposition to tobacco smoke only resulted in PON1 activity decrease in both animal groups and in increase in FRAP value in the liver and in the lungs of the non addicted rats. Twenty four hrs after the experiment completion a single dose of ethanol results in decrease in the FRAP value in the lungs of the non addicted rats. Twenty four hrs after the experiment completion exposition to tobacco smoke and a single dose of ethanol resulted in the rise in the PON1 activity in the liver and the lungs of the non addicted rats and decrease in the FRAP value in the liver and the lungs of the non addicted rats. In the liver of the non addicted animals PON1 activity is inversely correlated with the FRAP value. Adres do korespondencji: Dr farm. Ewa Ignatowicz Katedra Biochemii Farmaceutycznej im. Karola Marcinkowskiego Poznañ, ul. Œwiêcickiego 4 Tel./faks: eignato@ump.edu.pl Wstêp Palenie tytoniu i nadu ywanie alkoholu stanowi¹ powa ny spo³eczny problem zdrowotny. Badania przeprowadzone w populacji alkoholików wykaza³y, e 80-95% z nich pali papierosy. W populacji tej szerz¹ siê patologie wywo³ane stresem oksydacyjnym, m. in. choroby uk³adu oddechowego, sercowo-naczyniowego i niektóre postaci raka [4]. Dym tytoniowy w fazie gazowej i cz¹stkowej zawiera ponad 400 zwi¹zków chemicznych o zró nicowanym wp³ywie na ywe organizmy, wystêpuj¹ w nim, m.in. metabolity nikotyny, metale ciê kie, tlenek wêgla i izotopy promieniotwórcze. Wiele z tych substancji ma dzia³anie dra ni¹ce (formaldehyd, amoniak, chlorowodór), prozapalne (reaktywne formy tlenu i tlenki azotu) i rakotwórcze (nitrozoaminy, policykliczne wêglowodory aromatyczne) [12,14]. Wch³oniête w p³ucach sk³adniki dymu papierosowego przedostaj¹ siê do serca, nerek, w¹troby i mózgu oraz innych narz¹dów dobrze ukrwionych (np. ³o yska) [12]. Tlenek wêgla bezpoœrednio dzia³a szkodliwie poprzez wi¹zanie siê z hemoglobin¹. Metabolizm sk³adników dymu tytoniowego sk³ada siê z 709

2 reakcji I fazy (utlenianie, redukcja, hydroliza), zale nych od cytochromu P450 i II fazy (sprzêganie z substancjami endogennymi). P³uca, tkanka pierwszego kontaktu z dymem tytoniowym, s¹ najbardziej nara one na jego toksyczne dzia³anie. Oddzia³ywanie to w znacznym stopniu zale y od RFT zawartych bezpoœrednio w dymie i powstaj¹cych poœrednio w tkance dziêki reakcjom metali, wielopierœcieniowych wêglowodorów aromatycznych, nitrozoamin oraz aktywacji makrofagów przez cz¹stki py³ów [,8,27]. Spo yty alkohol etylowy (etanol) jest prawie ca³kowicie metabolizowany w w¹trobie i z tego powodu narz¹d ten jest najbardziej nara ony na toksyczne oddzia³ywanie etanolu i jego metabolitów. W mniejszym stopniu efekty toksyczne obserwowane s¹ w b³onie œluzowej o³¹dka, trzustki oraz w uk³adzie nerwowym. W¹trobowy metabolizm etanolu regulowany jest g³ównie przez dehydrogenazê alkoholow¹ (ADH) i dehydrogenazê aldehydow¹ (ALDH). W wyniku reakcji katalizowanej przez ADH powstaje aldehyd octowy, który ulega nastêpnie utlenieniu przez ALDH do kwasu octowego i te dwa metabolity odpowiadaj¹ za bezpoœredni¹ toksycznoœæ etanolu. Aldehyd octowy ³atwo reaguje z grupami funkcyjnymi bia³ek, zmieniaj¹c ich strukturê, funkcjê i aktywnoœæ biologiczn¹ [22]. Konsekwencj¹ w¹trobowego utleniania etanolu jest zaburzenie równowagi oksydoredukcyjnej w komórkach, co uniemo liwia utlenianie wytwarzanego kwasu mlekowego i prowadzi do stopniowego rozwoju kwasicy metabolicznej. Etanol jest tak e utleniany przez enzymy obecne w mikrosomach i peroksysomach hepatocytów. Wœród nich wyodrêbniæ mo na izoformê CYP 2E1 cytochromu P450 (dawniej okreœlana jako mikrosomalny system utleniaj¹cy etanol - MEOS) [1]. Wielokrotne spo ywanie etanolu znacz¹co indukuje aktywnoœæ tej izoformy P450, czego skutkiem jest tak e aktywacja przemian wielu ksenobiotyków do bardziej toksycznych metabolitów. Niewielkie znaczenie w utlenianiu etanolu ma równie oksydaza ksantynowa oraz katalaza, której aktywnoœæ zale y g³ównie od dostêpnoœci nadtlenku wodoru []. Reakcjom katalizowanym przez ALDH, oksydazê ksantynow¹ i system MEOS towarzyszy powstawanie reaktywnych form tlenu (RFT): nadtlenku wodoru, anionorodnika ponadtlenkowego i rodnika hydroksylowego. Przewlek³e nadu ywanie etanolu prowadzi ponadto do zmian morfologicznych w obrêbie b³on mitochondrialnych, które s¹ przyczyn¹ zwiêkszonego wytwarzania RFT w ³añcuchu oddechowym [5,1,22]. Spo ywanie etanolu prowadzi do osoczowej hiperlipidemii i wywo³uje st³uszczenie w¹troby, w tych warunkach zachodzi nasilona peroksydacja lipidów i wynikaj¹ca z niej synteza toksycznych produktów o charakterze aldehydów [1]. Hepatotoksyczne metabolity etanolu prowadz¹ do wzrostu przepuszczalnoœci bariery jelitowej dla bakterii Gram ujemnych, co zwiêksza iloœæ wydzielanych przez drobnoustroje endotoksyn, stymuluj¹cych makrofagi w¹troby do uwalniania cytokin i prostaglandyn prozapalnych oraz RFT [7]. Przewlek³e nadu ywanie etanolu wp³ywa równie na wzrost tkankowego poziomu jonów elaza(ii), czego konsekwencj¹ jest zwiêkszenie syntezy najaktywniejszej RFT, rodnika hydroksylowego [11]. Stres oksydacyjny niszcz¹cy komórki i tkanki wskutek bezpoœredniego i poœredniego dzia³ania RFT, uwalnianych w wyniku spo ywania alkoholu jest czêœciowo redukowany dziêki aktywnoœci endogennych mechanizmów obronnych. Do ich zadañ nale y prewencja - uniemo liwienie reakcji RFT ze sk³adnikami komórkowymi, hamowanie ³añcuchowych reakcji wolnorodnikowych i eliminacja lub naprawa oksydacyjnie zmienionych cz¹steczek [17,8]. Szczególne w³aœciwoœci prewencyjne posiadaj¹ enzymy antyoksydacyjne (katalaza, dysmutaza ponadtlenkowa i peroksydazy) i bia³ka (albumina, ceruloplazmina, ferrytyna i transferyna) oraz szereg substancji drobnocz¹steczkowych (witaminy A, E, C, zredukowany glutation, kwas moczowy) [,18,8]. U osób pal¹cych tytoñ i nadu ywaj¹cych alkoholu opisano charakterystyczn¹ tkankow¹ i narz¹dow¹ dystrybucjê mechanizmów obronnych oraz patologie bêd¹ce wynikiem nasilonego stresu oksydacyjnego [21]. Znacz¹cy udzia³ stresu oksydacyjnego w patogenezie mia d ycy i zwiêkszona zapadalnoœæ na choroby, bêd¹ce powik³aniami mia d ycy, obserwowana u osób pal¹cych i nadu ywaj¹cych etanolu, zwróci³y uwagê na rolê paraoksonazy-1 (PON1) w zapobieganiu reakcjom utleniania. PON1 jest enzymem zwi¹zanym z osoczow¹ cz¹steczk¹ lipoprotein o du ej gêstoœci (HDL) i wykazano jej dzia³anie przeciwmia d ycowe, polegaj¹ce na zahamowaniu peroksydacji lipidów [0,,5]. Palenie tytoniu, nadu ywanie alkoholu i inne przyczyny stresu oksydacyjnego zmniejszaj¹ aktywnoœæ PON1, a przywraca j¹ dieta obfituj¹ca w antyoksydanty [4,10,28]. Celem podjêtych badañ by³a ocena aktywnoœci PON1 i zdolnoœci redukcji jonów elaza(iii) (FRAP) u szczurów eksponowanych na etanol i dym tytoniowy. Wybrana metoda FRAP nale y do grupy technik pozwalaj¹cych na iloœciow¹ analizê potencja- ³u antyoksydacyjnego tkanek, zale nego od przeciwutleniaczy o ró nej strukturze chemicznej, a wykazuj¹cych ten sam mechanizm dzia³ania. Materia³ i metodyka Badanie przeprowadzono na samcach szczurów szczepu Wistar, o masie cia³a g, hodowanych w Katedrze Toksykologii Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu. Szczury podczas przebiegu eksperymentu mia³y nieograniczony dostêp do wody i paszy (LAB-H). Zapewniono im standardowe warunki wilgotnoœci (50-60%), oœwietlenia (12/12 h) i temperatury (20-22 o C). Eksperyment przeprowadzono na 26 szczurach nieuzale nionych od etanolu (grupa A) i 26 szczurach uzale - nionych od etanolu (grupa B). Ka d¹ z grup podzielono na podgrupy: 1. zwierzêta poddane ekspozycji na dym tytoniowy w stê eniu (w przeliczeniu na tlenek wêgla) 1500 mg/m powietrza przez 5 dni, po 6 godzin dziennie (grupy A1 i ); 2. zwierzêta, którym podano jednorazowo sond¹ do o³¹dkowo roztwór 10% alkoholu etylowego w dawce 2 g/kg m.c. (grupy A2 i );. zwierzêta poddane ekspozycji na dym tytoniowy w stê eniu 1500 mg/m CO przez 5 dni po 6 godzin dziennie, po czym podano jednorazowo etanol w dawce 2 g/kg m.c. (grupy A i ) Materia³em do badañ by³y homogenaty w¹troby i p³uc. Tkanki uzyskano po uœpieniu szczurów przez domiêœniowe podanie ksylazyny (40 mg/kg m.c.) z ketamin¹ (5 mg/kg m.c.), po up³ywie, 5 i godzin od zakoñczenia ekspozycji na dym tytoniowy (podgrupa 1) i po up³ywie, 5, godzin od podania alkoholu etylowego (podgrupa 2 i ). Na potrzeby badañ uzyskano zgodê Lokalnej Komisji Etycznej Do Spraw Doœwiadczeñ na Zwierzêtach (uchwa³a z dnia , nr 2/2008). Aktywnoœæ aryloesterazow¹ PON1 oznaczono kinetycznie, mierz¹c w czasie 1 min. i przy d³ugoœci fali 270 nm przyrost stê enia fenolu w reakcji homogenatów z substratem, octanem fenylu [2]. Pomiaru dokonano tylko w w¹trobie, gdy tkanka p³ucna nie jest siedliskiem tej przemiany enzymatycznej. Oznaczenie FRAP polega³o na pomiarze absorbancji barwnego kompleksu jonów elaza (II) z 2,4,6-tripirydylo-S-triazyn¹ [1]. Stê enie bia³ka oznaczono metod¹ Lowry [26]. Obliczenia statystyczne: Na podstawie uzyskanych wyników obliczono: œredni¹ arytmetyczn¹, odchylenie standardowe i wspó³czynnik korelacji (r). Ocena statystyczna wyników polega³a na analizie ró nic miêdzy œrednimi wartoœciami dwóch grup szczurów (uzale nionych i nieuzale nionych od etanolu) przy u yciu testu t-studenta (program INSTAT). Wyniki Porównano aktywnoœæ PON1 i FRAP w grupach szczurów uzale nionych i nieuzale nionych od alkoholu, w zale noœci od czasu, jaki up³yn¹³ od zakoñczenia ekspozycji i w zale noœci od czynnika toksycznego. Aktywnoœæ PON1 w w¹trobie, w zale - noœci od czasu od zakoñczenia doœwiadczenia, u szczurów nie uzale nionych od etanolu (grupa A) i uzale nionych (grupa B), przedstawia tabela I. U zwierz¹t poddanych ekspozycji na dym tytoniowy (grupa A1) zaobserwowano niewielki spadek aktywnoœci PON1, skorelowany z up³ywem czasu od zakoñczenia eksperymentu (r=-0,9620), podobny efekt wyst¹pi³ u szczurów uzale nionych od etanolu, z grup (r=-0,817) i (szczury, którym podano jednorazowo etanol, r=- 0,808). U zwierz¹t, którym podano jednorazowo etanol (grupa A2) wyst¹pi³y przeciwnie skierowane zmiany aktywnoœci PON1: stopniowy, choæ nie znamienny statystycznie wzrost w w¹trobie w ci¹gu doby (r=- 0,9725) od zakoñczenia doœwiadczenia. W w¹trobie szczurów eksponowanych na dym tytoniowy, którym nastêpnie podano jednorazowo etanol (grupa A) zaobserwowano znamienny wzrost aktywnoœci PON1 mierzonej po godz. od zakoñczenia eksperymentu w stosunku do wyników otrzymanych po i 5 godz. U szczurów eksponowanych na dym tytoniowy, którym nastêpnie podano jednorazowo etanol (grupa ), w w¹trobie, aktywnoœæ PON1 nie ró ni siê znamiennie w poszczególnych punktach czasowych. Analizuj¹c uzyskane wyniki w zale noœci od zastosowanego czynnika toksycznego, stwierdzono, e w w¹trobie zwierz¹t eksponowanych na dym tytoniowy (grupa A1) wyniki aktywnoœci PON1 s¹ najwy sze, statystycznie znamienne w stosunku do wartoœci otrzymanych u zwierz¹t z grupy A2 i A, w i 5 godz. od zakoñczenia doœwiadczenia. Natomiast w godz. od zakoñczenia eksperymentu, najwy szy i statystycznie znamienny wynik aktywnoœci PON1 stwierdzono u zwierz¹t nara onych na dym tytoniowy i etanol (grupa A), w stosunku do grupy A1 i A2. W w¹trobie zwierz¹t z grupy zaobserwowano statystycznie istotne, najni sze wyniki aktywnoœci PON1 w stosunku do wyników u zwierz¹t z grupy 710 E. Ignatowicz i wsp.

3 Tabela I Aktywnoœæ PON1 [nmol fenolu/mg bia³ka] w w¹trobie zwierz¹t nieuzale nionych (grupa A) i uzale nionych (grupa B) od etanolu. A1, - zwierzêta eksponowane wy³¹cznie na dym tytoniowy; A2, - zwierzêta, którym podano jednorazow¹ dawkê etanolu 2 g/kg m.c.; A, - zwierzêta poddane ekspozycji na dym tytoniowy, którym podano jednorazowo etanol w dawce 2g/kg m.c. PON1 activity [nmol phenol/mg protein] in the liver of animals non-addicted (group A) and addicted to ethanol (group B). A1, - animals exposed only to tobacco smoke, A2, - animals exposed to a single dose of ethanol 2 g/kg body mass, A, - animals exposed to tobacco smoke and a single dose of ethanol 2 g/kg body mass. Czas po zakoñczeniu ekspozycji [h] Tabela III Zale noœæ aktywnoœci PON1 i FRAP w w¹trobie zwierz¹t nie uzale nionych (A) i uzale nionych od etanolu (B). Relationship of PON1 and FRAP activity in the liver of animals non-addicted (A) and addicted to ethanol (B). i, niezale nie od czasu, jaki min¹³ od zakoñczenia doœwiadczenia. Porównuj¹c uzyskane wyniki pomiêdzy poszczególnymi grupami zwierz¹t nieuzale nionych i uzale nionych od etanolu wykazano, e aktywnoœæ PON1 w w¹trobie jest co najmniej dwukrotnie wy sza u szczurów uzale nionych ( i ) niezale nie od czasu, jaki up³yn¹³ od zakoñczenia doœwiadczenia, w odniesieniu do odpowiednich grup zwierz¹t nieuzale nionych. W w¹trobie którym nastêpnie podano jednorazowo etanol, zaobserwowano znamiennie wy sze wyniki aktywnoœci PON1 u szczurów uzale nionych od etanolu () w i 5 godz. od A A1 A2 A a 22,0±64,47 159,7±11,02 158,7±9,87 70,±94,59 882,±121,14 40,7±82, ,7±16,65 179,7±18,15 166,0±20,07 645,0±66,69 805,7±149,87 6,7±2,71 221,1±47,2 221,7±18,15 465,7±109,04 600,0±8,19 761,±144,22 411,±8,46 Objaœnienia: a œrednie arytmetyczne ± odchylenie standardowe, n= Tabela II Wielkoœæ FRAP w w¹trobie i p³ucach zwierz¹t nieuzale nionych (grupa A) i uzale nionych (grupa B) od etanolu. A1, - zwierzêta eksponowane wy³¹cznie na dym tytoniowy; A2, - zwierzêta, którym podano jednorazow¹ dawkê etanolu 2 g/kg m.c.; A, - zwierzêta poddane ekspozycji na dym tytoniowy, którym podano jednorazowo etanol w dawce 2g/kg m.c. FRAP values in the liver and lungs of non-addicted (group A) and addicted to ethanol (group B) animals. A1, - animals exposed only to tobacco smoke, A2, - animals exposed to a single dose of ethanol 2 g/kg body mass, A, - animals exposed to tobacco smoke and a single dose of ethanol 2 g/kg body mass Czas po zakoñczeniu ekspozycji [h] w¹troba p³uca A A1 A2 A a 0,017±0,0010 0,020±0,006 0,025±0,0027 0,018±0,001 0,019±0,005 0,017±0, ,016±0,0016 0,017±0,002 0,0±0,000 0,020±0,0088 0,027±0,008 0,019±0, ±0,0041 0,017±0,0014 0,016±0,002 0,015±0,0026 0,0±0,005 0,020±0,005 0,047±0,0101 0,09±0,0054 0,041±0,0049 0,068±0,0125 0,050±0,0046 0,01±0, ,04±0,0005 0,08±0,0054 0,051±0,0071 0,061±0,0151 0,051±0,0052 0,042±0,0165 0,072±0,0075 0,028±0,004 0,0±0,004 0,044±0,0151 0,046±0,0179 0,028±0,0112 Objaœnienia: a œrednie arytmetyczne ± odchylenie standardowe, n= Rodzaj grupy 1 2 wspó³czynnik r A - 0,9014 A - 0,8001 A - 0,9961 0,519-0,989 0,8041 zakoñczenia doœwiadczenia, w porównaniu z wynikiem uzyskanym w grupie A. Wyniki oznaczeñ potencja³u antyoksydacyjnego FRAP w w¹trobie i p³ucach zwierz¹t nieuzale nionych (grupa A) i uzale nionych (grupa B) od etanolu zawarte s¹ w tabeli II. Po godz. od zakoñczenia doœwiadczenia w w¹trobie i p³ucach zwierz¹t eksponowanych na dym tytoniowy (A1) zaobserwowano znamienny wzrost wartoœci FRAP w odniesieniu do wartoœci we wczeœniejszych punktach czasowych. U zwierz¹t z grupy zaobserwowano stopniowy, chocia nie znamienny statystycznie, spadek wartoœci FRAP w p³ucach, szczególnie po godz. od zakoñczenia doœwiadczenia (r =-0,9806). W w¹trobie zwierz¹t, którym podano etanol (A2), pomimo trendu malej¹cego (wspó³czynnik korelacji r=-0,68) wartoœci FRAP po, 5 i godz. nie ró ni¹ siê znamiennie. W p³ucach zwierz¹t z grupy A2 wyst¹pi³ znamienny spadek wartoœci FRAP mierzony po godz., w stosunku do wyników z i 5 godz. po zakoñczeniu doœwiadczenia. W w¹trobie zwierz¹t z grupy A potencja³ antyoksydacyjny po godz. znamiennie zmniejsza siê w stosunku do wczeœniej uzyskanych wartoœci FRAP. W p³ucach zwierz¹t z tej grupy zaobserwowano znamienny spadek FRAP po godz., w stosunku do wartoœci po i 5 godz. W w¹trobie zwierz¹t eksponowanych na dym tytoniowy (grupa ), zwierz¹t, którym B B podano jednorazowo etanol (grupa ) i którym nastêpnie podano jednorazowo etanol (grupa ) nie stwierdzono znamiennych statystycznie ró nic pomiêdzy wynikami w poszczególnych punktach czasowych. W p³ucach zwierz¹t z grupy i nie zaobserwowano statystycznie znamiennych ró - nic wartoœci FRAP w poszczególnych punktach czasowych. W w¹trobie szczurów nieuzale nionych najni sz¹ wartoœæ FRAP stwierdzono w grupie A1, w godz. od zakoñczenia doœwiadczenia, znamiennie ni sz¹ w stosunku do wyniku u zwierz¹t z grupy A. Podobnie kszta³tuj¹ siê wyniki w w¹trobie w 5 godz. od zakoñczenia eksperymentu. Natomiast po godz. wartoœæ FRAP jest znamiennie wy sza u zwierz¹t z grupy A1 w stosunku do wyników u zwierz¹t z pozosta³ych grup. Niezale nie od czasu od zakoñczenia doœwiadczenia, najwy sz¹ wartoœæ FRAP zaobserwowano u szczurów z grupy w stosunku do zwierz¹t z grupy i (statystycznie znamienn¹ po godz.). W p³ucach zwierz¹t uzale nionych najwy sz¹ wartoœæ FRAP stwierdzono w grupie A1; po godz. przewy sza ona dwukrotnie wyniki uzyskane w grupach A2 i A. W godz. od zakoñczenia doœwiadczenia w p³ucach zwierz¹t grupy stwierdzono najwy sz¹ wartoœæ FRAP, a najni sz¹ u zwierz¹t z grupy, statystycznie znamienn¹ w porównaniu z wynikiem w grupach i. Podobnie kszta³tuj¹ siê wyniki w 5 godz. od zakoñczenia sekcji. W godz. najni sz¹ wartoœæ FRAP zaobserwowano u zwierz¹t z grupy, jednak bez cech znamiennoœci statystycznej w porównaniu z wynikami w grupach i. Porównanie wartoœci stanu antyoksydacyjnego w w¹trobie zwierz¹t eksponowanych na dym tytoniowy (grupy A1 i ) wykaza³o, e tylko po godz. od zakoñczenia doœwiadczenia poziom FRAP by³ znamiennie ni szy w grupie. U szczurów, którym podano jednorazowo etanol (A2 i ), po godz. wynik by³ znamiennie ni - szy w grupie A2. W w¹trobie zwierz¹t eksponowanych na dym tytoniowy, którym nastêpnie podano jednorazowo etanol (A i ) zaobserwowano znamiennie wy sze wyniki FRAP u szczurów z grupy A w i 5 godz. od zakoñczenia doœwiadczenia a w godz. - nieznacznie ni sze w stosunku do zwierz¹t z grupy A. W p³ucach zwierz¹t uzale nionych od etanolu, eksponowanych na dym tytoniowy (grupa ), w godz. od zakoñczenia doœwiadczenia stwierdzono znamiennie ni sz¹ wartoœæ FRAP, w porównaniu do wyniku uzyskanego w analogicznej grupie zwierz¹t nie uzale nionych od etanolu (grupa A1). W p³ucach szczurów, którym podano jednorazowo etanol, zaobserwowano wy sze wyniki wartoœci FRAP w grupie w porównaniu z wynikami w grupie A2, znamiennie ró ne w 5 godz. po zakoñczeniu doœwiadczenia. W p³ucach którym nastêpnie podano jednorazowo etanol (A i ) nie stwierdzono statystycznie istotnych ró nic wartoœci FRAP w poszczególnych punktach czasowych. Obliczono wspó³czynnik korelacji r pomiêdzy aktywnoœci¹ PON1 i wartoœci¹ 711

4 FRAP w w¹trobie zwierz¹t z grup A1, A2 i A oraz, i (tabela III). Uzyskane wyniki wspó³czynnika r wskazuj¹ na odwrotn¹ zale noœæ aktywnoœci PON1 i FRAP. Omówienie Palenie i nadmierne spo ycie alkoholu s¹ czynnikami ryzyka chorób uk³adów sercowo-naczyniowego i oddechowego oraz niektórych postaci raka, np. p³uc i prze³yku. Dym tytoniowy i etanol indukuj¹ stres oksydacyjny w organizmie, zwiêkszaj¹c produkcjê RFT i hamuj¹c aktywnoœæ endogennego systemu antyoksydacyjnego []. Konsekwencj¹ zachwiania równowagi miêdzy procesem wytwarzania RFT, a ich usuwaniem z organizmu s¹ liczne uszkodzenia sk³adników komórkowych m.in. peroksydacja lipidów, utlenianie bia³ek i wêglowodanów oraz modyfikacje oksydacyjne DNA [,,25, 6,8]. W niniejszej pracy oceniono wp³yw dymu tytoniowego i etanolu u samców szczurów uzale nionych i nieuzale nionych od etanolu na wybrane parametry stresu oksydacyjnego: aktywnoœæ paraoksonazy 1 i zdolnoœæ redukcji kationu elazowego (FRAP) w homogenatach w¹troby i p³uc. Paraoksonaza 1 jest enzymem, który chroni lipoproteiny osocza przed utlenieniem i rozk³ada nadtlenek wodoru [,9]. Wyniki badañ, przeprowadzonych u palaczy wskazuj¹, e dym tytoniowy obni a aktywnoœæ paraoksonazy 1 w surowicy [4]. W niniejszej pracy w homogenatach w¹troby zwierz¹t uzale nionych (grupa ) i nieuzale nionych od etanolu (grupa A1), eksponowanych na dym tytoniowy aktywnoœæ PON1 spada wraz z up³ywem czasu od zakoñczenia doœwiadczenia. U samców z grupy aktywnoœæ PON1 jest ponad dwukrotnie wy sza ni w odpowiadaj¹cej grupie zwierz¹t nieuzale nionych. Uzale nienie od etanolu zwi¹zane jest z powtarzaj¹c¹ siê ekspozycj¹ i wy sza aktywnoœæ PON1 u takich zwierz¹t mo e byæ odzwierciedleniem adaptacji organizmu do nasilonego stresu oksydacyjnego i stymulacji obrony antyoksydacyjnej. Ekspozycja na dodatkowy ksenobiotyk, dym tytoniowy, zmniejsza aktywnoœæ tej obrony w czasie od zakoñczenia doœwiadczenia. Rao i wsp. opisali podwy - szenie aktywnoœci PON1 u szczurów otrzymuj¹cych ma³e dawki etanolu i obni enie u zwierz¹t otrzymuj¹cych wysokie dawki. Zmianom aktywnoœci towarzyszy³y odpowiednio wzrosty i spadki poziomu mrna dla PON1 [2]. Takie zachowanie siê aktywnoœci PON1 mog¹ potwierdzaæ wyniki uzyskane w niniejszej pracy u zwierz¹t uzale nionych i nieuzale nionych od etanolu, które otrzyma³y jednorazowo dawkê tego ksenobiotyku (grupy i A2). W grupie A2 (pojedyncza, ma³a dawka etanolu) aktywnoœæ PON1 nieznacznie wzrasta w miarê up³ywu czasu od zakoñczenia doœwiadczenia, a w grupie (skumulowana dawka etanolu) aktywnoœæ PON1 wykazuje tendencjê malej¹c¹ w czasie. U zwierz¹t uzale nionych i eksponowanych na dym, którym podano jednorazowo etanol (grupa ), aktywnoœæ PON1 w czasie pozostaje na zbli onym poziomie i wartoœæ ta jest prawie dwukrotnie ni sza ni w grupach (uzale nienie + jednorazowa dawka etanolu) i (uzale nienie + dym tytoniowy). Mo na wiêc przypuszczaæ, e jednoczesne dzia³anie obu ksenobiotyków u zwierz¹t uzale nionych os³abia obronê antyoksydacyjn¹ w w¹trobie. W odpowiadaj¹cej grupie zwierz¹t nieuzale nionych (A) po up³ywie godz. od zakoñczenia doœwiadczenia, aktywnoœæ PON1 znamiennie wzrasta w stosunku do wczeœniej uzyskanych wyników, co mo e œwiadczyæ o pobudzeniu mechanizmów obrony antyoksydacyjnej pod wp³ywem jednoczesnego dzia³ania etanolu i dymu. Oznaczenie ca³kowitej zdolnoœci antyoksydacyjnej, polegaj¹cej na redukcji jonów elaza (III) umo liwia ocenê stê enia endogennych antyoksydantów w w¹trobie i p³ucach szczurów. Antyoksydanty, wykazuj¹ce zró nicowane mechanizmy dzia³ania, s¹ niezbêdne w ochronie organizmu przed RFT. W metodzie FRAP, zastosowanej w niniejszej pracy, aktywnoœæ antyoksydacyjna zale y od stê enia kwasu moczowego i askorbinowego. Szczury metabolizuj¹ kwas moczowy do allantoiny, a tak e aktywnie syntetyzuj¹ kwas askorbinowy, wiêc potencja³ antyoksydacyjny jest wypadkow¹ prawid³owych przemian w organizmie zwierzêcia i wp³ywu stresu oksydacyjnego [7]. W niniejszej pracy w p³ucach szczurów nieuzale nionych od etanolu, eksponowanych na dym tytoniowy (grupa A1) stwierdzono znaczny wzrost wartoœci FRAP po godz. od zakoñczenia doœwiadczenia, w porównaniu z wynikami uzyskanymi po i 5 godz. P³uca s¹ narz¹dem pierwszego kontaktu organizmu z dymem tytoniowym. W wyniku nara enia na sk³adniki dymu dochodzi do aktywacji obrony antyoksydacyjnej w p³ucach poprzez wzrost stê enia zredukowanego glutationu, witaminy C i E, wzrost aktywnoœci dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy na skutek mobilizacji tych antyoksydantów z innych narz¹dów do p³uc [15,19,27,1]. Wzrost potencja³u antyoksydacyjnego w p³ucach szczurów eksponowanych na dym stwierdzono wykonuj¹c pomiary redukcji kationorodnika 2,2`-azionobis(- etylobenzotiazolino-6-sulfonianu) [16]. W niniejszej pracy w p³ucach szczurów nieuzale nionych od etanolu, pod wp³ywem dymu tytoniowego (grupa A1) w ci¹gu godz. od zakoñczenia doœwiadczenia równie dochodzi do wzrostu aktywnoœci antyoksydacyjnej, mierzonej jako FRAP. W w¹trobie zwierz¹t tej grupy obserwuje siê podobny trend, jednak wartoœci te s¹ prawie dwukrotnie ni sze. Natomiast u szczurów uzale - nionych od etanolu i poddanych ekspozycji na dym tytoniowy (grupa ) wartoœæ FRAP w p³ucach maleje w czasie od zakoñczenia doœwiadczenia, chocia spadek ten nie ma cech znamiennoœci statystycznej, a w w¹trobie nie stwierdza siê istotnych ró nic pomiêdzy wynikami w poszczególnych punktach czasowych. Mo liwe, e u zwierz¹t z tej grupy sta³e nara enie na etanol prowadzi do wyczerpania puli dostêpnych antyoksydantów i braku mo liwoœci przesuniêcia ich z w¹troby do p³uc pod wp³ywem dodatkowej ekspozycji na dym tytoniowy. Wartoœæ FRAP w p³ucach szczurów nie uzale nionych, którym podano jednorazowo etanol (grupa A2) znamiennie maleje wraz z czasem od zakoñczenia doœwiadczenia, a w grupie (szczury uzale nione) wyniki w poszczególnych punktach czasowych pozostaj¹ na zbli onym poziomie, chocia wartoœci bezwzglêdne FRAP s¹ wy sze w grupie. P³uca nie s¹ tkank¹ bezpoœrednio metabolizuj¹c¹ etanol, jednak ekspozycja na ten ksenobiotyk wp³ywa na poziom wyk³adników stresu oksydacyjnego w tej tkance: po 4 tygodniach zaobserwowano wzrost poziomu produktów peroksydacji lipidów i nadtlenku wodoru a zwiêkszenie poziomu wolnych grup -SH mo e byæ traktowane jako reakcja kompensacyjna [2]. Stwierdzone w niniejszej pracy obni enie FRAP, parametru, który nie odzwierciedla stê enia zwi¹zków tiolowych wskazuje, e etanol wyczerpuje p³ucne zasoby antyoksydantów o innych mechanizmach dzia³ania. W w¹trobie zwierz¹t z grup A2 i wyniki potencja³u antyoksydacyjnego nie zmieniaj¹ siê istotnie z up³ywem czasu od zakoñczenia doœwiadczenia, pomimo malej¹cego trendu obserwowanego w grupie A2. Mo na wiêc wnioskowaæ, e jednorazowa dawka etanolu nie wp³ywa na potencja³ antyoksydacyjny w¹troby, zarówno u zwierz¹t uzale nionych, jak i nieuzale nionych od tego ksenobiotyku. Jednak e porównanie wartoœci FRAP w w¹trobie i p³ucach pomiêdzy grupami A2 i wskazuje, e zwierzêta, które nie mia³y wczeœniej kontaktu z etanolem s¹ bardziej podatne na jego szkodliwe dzia³anie, ni szczury uzale nione. ¹czna ekspozycja na dym i etanol znamiennie obni a wartoœci FRAP w w¹trobie szczurów z grupy A w czasie od zakoñczenia doœwiadczenia, natomiast w grupie wyniki nie ró ni¹ siê znamiennie w czasie. Mo e to wskazywaæ na fakt, ze uzale - nienie od etanolu utrzymuje sta³y poziom potencja³u antyoksydacyjnego, który nie zmienia siê pod wp³ywem ekspozycji na ksenobiotyk o innej drodze wch³aniania, a zwierzêta nieuzale nione s¹ bardziej wra liwe na po³¹czone pro-oksydacyjne dzia³anie dymu tytoniowego i etanolu. W p³ucach zwierz¹t z grupy poziom FRAP nie zmienia siê istotnie w czasie od zakoñczenia doœwiadczenia, natomiast u szczurów z grupy A po 5 godz. obserwowany jest wzrost FRAP i znamienny spadek po godz. od zakoñczenia eksperymentu. Mo na to wyjaœniæ pobudzaj¹cym wp³ywem dymu tytoniowego na potencja³ antyoksydacyjny p³uc, hamowanym przez metabolizm etanolu. Przedstawione wyniki aktywnoœci PON1 i potencja³u antyoksydacyjnego FRAP sugeruj¹ odwrotn¹ zale noœæ pomiêdzy tymi parametrami w niektórych grupach badanych zwierz¹t, co zosta³o poparte obliczeniami wspó³czynnika korelacji r. WyraŸna ujemna korelacja pomiêdzy aktywnoœci¹ PON1 i FRAP wystêpuje w w¹trobie szczurów nieuzale nionych (grupa A), bez wzglêdu na zastosowany ksenobiotyk. Mo na przypuszczaæ, e zwierzêta, które nie mia³y wczeœniej kontaktu z etanolem sprawniej uruchamiaj¹ zró nicowane mechanizmy obrony antyoksydacyjnej w stosunku do zwierz¹t uzale nionych, co mo e wynikaæ z ich wiêkszych rezerw metabolicznych. Wnioski 1. W w¹trobie zwierz¹t uzale nionych od etanolu aktywnoœæ PON1 jest prawie dwukrotnie wy sza ni w w¹trobie szczurów 712 E. Ignatowicz i wsp.

5 nieuzale nionych, co mo e odzwierciedlaæ adaptacjê organizmu do nasilonego stresu oksydacyjnego. 2. Potencja³ antyoksydacyjny polegaj¹cy na redukcji jonów elazowych (FRAP) jest wy szy w p³ucach ni w w¹trobie.. W w¹trobie zwierz¹t nieuzale nionych aktywnoœæ PON1 jest ujemnie skorelowana z wartoœci¹ FRAP. 4. Ekspozycja wy³¹cznie na dym tytoniowy mobilizuje obronê antyoksydacyjn¹ w p³ucach zwierz¹t nieuzale nionych, czego nie obserwuje siê u zwierz¹t uzale nionych od etanolu. 5. Jednorazowa dawka etanolu nie wp³ywa na potencja³ antyoksydacyjny w w¹trobie obu grup zwierz¹t. Chocia p³uca nie s¹ narz¹dem docelowym w metabolizmie etanolu, to w tkance tej obserwuje siê zmiany wartoœci FRAP. 6. ¹czna ekspozycja na dym tytoniowy i etanol indukuje aktywnoœæ PON1 u zwierz¹t nieuzale nionych, a obni a FRAP. 7. Zwierzêta, które nie mia³y wczeœniej kontaktu z alkoholem etylowym w wiêkszym stopniu reaguj¹ zmianami endogennej obrony antyoksydacyjnej w porównaniu ze zwierzêtami uzale nionymi od etanolu. Piœmiennictwo 1. Arnous A., Makris D.P., Kefalas P.: Correlation of pigment and flavanol content with antioxidant properties in selected aged regional wines from Greece. J. Food Comp. Anal. 2002, 15, Aviram M., Rosenblat M., Billecka S. et al.: Human serum paraoxonase (PON1) is inactivated by oxidized low density lipoprotein and preserved by antioxidants. Free Rad. Biol. Med. 1999, 26, Bartosz G.: Druga twarz tlenu - wolne rodniki w przyrodzie. PWN, Warszawa, Boemi M., Sirolla C., Testa R. et al.: Smoking is associated with reduced serum levels of the antioxidant enzyme, paraoxonase, in type 2 diabetic patients. Diabetic Medicine 2004, 21, Cahill A., Cunningham C.C., Adachi M. et al.: Effects of alcohol and oxidative stress on liver pathology: the role of the mitochondriom. Alcohol Clin. Exp. Res. 2002, 26, Cao H., Girard-Globa A., Berthezene F., Moulin P.: Paraoxonase protection of LDL against peroxidation is independent of its esterase activity towards paraoxon and is unaffected by the Q R genetic polymorphism. J. Lipid Res. 1999, 40, Cao G., Prior R.L.: Comparison of different analytical methods for assessing total antioxidant capacity of human serum. Clin. Chem. 1998, 44, Chrostowska-Wynimko J.: Wp³yw palenia tytoniu na mechanizmy komórkowe w uk³adzie oddechowym. Pneumonol. Alergol. Pol., 2008, 76, Codandabany U.: Erythrocyte lipid peroxidation and antioxidants in cigarette smokers. Cell Biochem. Funct. 2000, 18, Costa L.G., Vitalone A., Cole T.B., Furlong C.E.: Modulation of paraoxonase (PON1) activity. Biochem. Pharmacol. 2005, 69, Cylwik B., Chrostek L., Szmitkowski M.: Wp³yw alkoholu na mechanizmy regulacyjne metabolizmu elaza. Pol. Merk. Lek. 2008, 25, Czoga³a J., Goniewicz M.., Czubek A. et al.: Jak naprawdê pali palacz? - wyniki wstêpne badañ topografii palenia populacji palaczy w Polsce. Przegl. Lek. 2008, 65, Das S. K., Vasudevan D.M.: Alcohol-induced oxidative stress. Life Sci. 2007, 81, Florek E.: Co tkwi w dymie? Poradnik Aptekarski, 2006, Florek E., Ignatowicz E., Wrzosek J., Piekoszewski W.: Effect of rutin on total antioxidant status of rats expose to cigarette smoke. Pharmacol. Rep. 2005, 57, Florek E., Ignatowicz E., Piekoszewski W.: Effect of pregnancy and tobacco smoke on the antioxidant activity of rutin in an animal model. Pharmacol. Rep. 2009, 61, Ga³ecka E., Mrowicka M., Malinowska K., Ga³ecki P.: Wybrane substancje nieenzymatyczne uczestnicz¹ce w procesie obrony przed nadmiernym wytwarzaniem wolnych rodników. Pol. Merk. Lek. 2008, 25, Ga³ecka E., Jacewicz R., Mrowicka M. et al.: Enzymy antyoksydacyjne - budowa, w³aœciwoœci, funkcje. Pol. Merk. Lek. 2008, 25, Handelman G.J., Packer L., Cross C.E.: Destruction of tocopherols, carotenoids, and retinol in human plasma by cigarette smoke. Am. J. Clin. Nutr. 1996, 6, Hartmann A., Agurell E., Beevers C., et al.: Recommendations for conducting the in vivo alkaline comet assay. Mutagenesis. 200, 18, Ignatowicz E., Florek E., Bolt K.: Stres oksydacyjny indukowany przez dym tytoniowy i etanol. Przegl. Lek. 2011, 68, 10 przyjête do druku. 22. Jelski W., Chrostek L., Szmitowski M.: Biochemiczne podstawy alkoholowego uszkodzenia w¹troby. Pol. Merk. Lek. 2006, 21, Jurczyk A.P., Barzdo M., Jankowska B. et al.: Influence of selected alcohols on oxidative stress parameters in rat lungs. Problems of Forensic Sciences, 200, 55, 50.. Kohen R., Nyska A.: Oxidation of biological systems: oxidative stress phenomena, antioxidants, redox reactions, and methods for their quantification. Toxicol. Pathol. 2002, 0, Kulbacka J., Saczko J., Chwi³kowska A.: Stres oksydacyjny w procesach uszkodzenia komórek. Pol. Merk. Lek. 2009, 27, Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L.: Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951, 19, MacNee W.: Oxidative stress and chronic obstructive pulmonary disease. Eur. Respir. Mon. 2006, 8, Otocka-Kmiecik A., Or³owska-Majdak M.: The role of genetic (PON1 polymorphism) and environmental factors, especially physical activity, in antioxidant function of paraoxonase. Post. Hig. Med. Doœw. 2009, 6, Pasupathi P., Saravanan G., Chinnaswamy P. et al.: Effect of chronic smoking on lipid peroxidation and antioxidant status in gastric carcinoma patients. Indian J. Gastroenterol. 2009, 28, Podrez E.: Anti-oxidant properties of high-density lipoprotein and atherosclerosis. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2010, 7, Rahman I., MacNee W.: Lung glutathione and oxidative stress: implications in cigarette smoke-induced airway disease. Am. Physiol. Soc. 1999, 277, Rao M.N., Marmillot P., Gong M. et al.: Light, but not heavy alcohol drinking, stimulates paraoxonase by upregulating liver mrna in rats and humans. Metabolism 200, 52, Rosenblat M., Aviram M.: Paraoxonases role in the prevention of cardiovascular diseases. Biofactors 2009, 5, Sacewicz M.: Alkohol a palenie tytoniu. Alkohol i Nauka, 1999, 2, Sapian-Raczkowska B., Rabczyñski M., Adamiec R.: Paraoksonaza - wa ny enzym przemian lipidowych i potencjalny sprzymierzeniec w leczeniu przeciwmia d ycowym. Pol. Merk. Lek. 2010, 29, Valko M., Rhodes C.J., Moncol J. et al.: Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chem. Biol. Interact. 2006, 160, Waszkiewicz N., Szulc A.: Uszkodzenie odpornoœci w przebiegu ostrych i przewlek³ych zatruæ alkoholem. Pol. Merk. Lek. 2010, 29, Zab³ocka A., Janusz M.: Dwa oblicza wolnych rodników tlenowych. Postêpy Hig. Med. Doœw. 2008, 62, Zielaskowska J., Olszewska-S³onina D.: The polymorphism of paraoxonase and its effects in physiological and pathological processes. Adv. Clin. Exp. Med. 2006, 15,